一種多癌風險易感性突變位點及其應用和製備的試劑盒的製作方法

2023-06-28 00:23:31

專利名稱：一種多癌風險易感性突變位點及其應用和製備的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬腫瘤分子遺傳學領域，涉及一種多癌風險易感性突變位點及其應用和製備的試劑盒。
背景技術：
腫瘤是一種多基因複雜性疾病，其發生是環境因素與腫瘤遺傳易感因素共同作用的結果。基因突變是導致不同個體對腫瘤遺傳易感存在差異的重要原因。瘤基因與抑瘤基因的突變、線粒體DNA突變以及不穩定性三核苷酸重複序列的動態突變等均與腫瘤的遺傳易感性相關。如果瘤基因與抑瘤基因的突變，存在家族與人群聚集性，可顯著提高患腫瘤的風險，那麼對於這些突變位點在健康或腫瘤人群中進行篩查，無疑能對具有腫瘤遺傳易感傾向的人群起到的風險預警和早期診斷的作用。傳統的突變檢測方法是採用一些已有的成熟技術，如DNA測序、限制性酶切片段長度多態性(RFLP)、單鏈構象多態性(SSCP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等。 這些技術雖在某種程度上能完成對突變位點的檢測，但由於它們必須通過凝膠電泳進行檢測，因此，距快速、高效、自動化的檢測目標還相差甚遠。傳統的RFLP只能檢測到突變的一部分，測序技術既費時費力，又不易實現自動化，而且DNA鏈的二級結構還容易造成人工假相，使測序結果出現偏差，不適宜於突變的檢測；SSCP則很難滿足自動化的需要，難以大規模開展工作。因此，這些方法均未被廣泛採用。DNA晶片技術是近年來新開發的一種DNA序列變異檢測工具，但如果涉及的突變位點不多時，用高通量DNA晶片則因成本較高也不適且。才目比之下，變個生高效液才目色i普(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)在突變檢測上具有較大的優勢。DHPLC是一種在SSCP和DGGE基礎上發展起來的新的高通量篩選DNA序列變異的技術，其原理是通過HPLC在部分變性的條件下將發生錯配的異源雜合雙鏈DNA與完全匹配的同源雙鏈DNA分離開來。該技術可以自動檢測單鹼基替代及小片段核苷酸的插入或缺失，還可分離分析大小相近而序列存在差異的DNA，是一種高性價比的檢測技術。與傳統的雜合雙鏈分析技術相比較，上樣前PCR 產物不需要酶切、純化，可直接進行分析，同時過柱不需要灌膠、上樣、電泳等繁瑣的跑膠過程，該技術花時短，分析一個樣品一般僅需5分鐘，不需使用放射性同位素，自動化程度高， 大大降低了交叉汙染的機率、減少了工作量和成本。因此具有高通量、自動化、快速、檢出率高、重複性好、檢測DNA片段大小範圍廣等優點。運用DHPLC技術的WAVE核苷酸片段分析系統可以快速、自動化地進行分析。目前國內外，DHPLC技術已在基因分型分析、腫瘤的突變檢測、地中海貧血的基因診斷等方面得到了廣泛的應用。當前DHPLC儀器和技術已經在各地市級醫院非常普及，也是該試劑盒得以推廣的重要保證。

發明內容
本發明的目的在於通過研究與多種腫瘤發生相關的突變，從而提供一種多癌風險易感性突變位點及其應用和製備的試劑盒。可用於正常人群腫瘤遺傳易感性的篩查，起到風險預警、早期診斷的作用。一種多癌風險易感性突變位點，位於人TSC22D2基因的ATG上遊_91bp，T > C，其基因型包括陰性基因型tt和多癌易感風險基因型tc或CC。—種多癌風險易感性突變位點應用於製備檢測多癌風險易感性試劑，所述的多癌風險易感性突變位點位於人TSC22D2基因的ATG上遊_91bp，T > C，其基因型包括陰性基因型tt和多癌易感風險基因型tc或cc。所述的試劑包括DNA測序試劑、限制性酶切片段長度多態性試劑、單鏈構象多態性試劑、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交試劑或變性高效液相色譜試劑。最適合為變性高效液相色譜試劑。所述試劑中含有針對突變位點設計的引物序列L 5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3『R 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3『。一種檢測多癌風險易感性的突變篩查試劑盒，包括DNA抽提試劑，PCR試劑和 DHPLC檢測用試劑，在PCR試劑中包含針對人TSC22D2基因ATG上遊_91bp，T > C突變位點設計的上下遊引物，L :5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3『 ；R 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3『； 在DHPLC檢測用試劑中，包括所述突變位點基因型為tt的陰性基因組DNA。發明人通過對湖南罕見多癌家系的研究證實TSC22D2基因(Homo sapiens TSC22 domain family,member 2，基因存取號NM_014779. 2，基因存取號來源為NCBI資料庫)調控區存在c. -91T > C突變位點在家系中與致病單體型共分離。TSC22D2基因屬於TSC22結構域家族，其基因家族成員還有TSC22D1、TSC22D3、TSC22D4。目前對TSC22D1的研究提示，該基因家族可能參與TGF β信號通路，該通路與腫瘤的抑制密切相關。在多種腫瘤中TSC22D1 的mRNA表達下調，也表明其與惡性細胞增生有關。因此我們推測，TSC22D2作為基因家族成員之一，可能由於具有相同的結構域而具有相同或類似的功能。通過對當地500例正常人群進行該位點的突變篩查，其結果均為陰性。上述遺傳學證據都提示，該基因及其突變可能與多種腫瘤的疾病發生相關，針對該位點進行人群中的基因分型可以起到患癌風險預測的作用。考慮到人群中大量樣本為陰性，本發明的發明人在傳統DHPLC方法上進行改進， 不是將單純樣本PCR產物上DHPLC儀進行檢測，而是採取將待測樣本PCR產物與陰性對照的樣本DNA等量混合，變性後上DHPLC檢測。這樣DNA雙鏈經變性後打開，如果有突變的話， 緩慢復性後重新結合的雙鏈中就會出現異源鏈，從而在DHPLC圖中出現雙峰。混合法可以減少的DHPLC次數並提高一次DHPLC的判別效能。可以只用一次DHPLC就區分風險易感人群和正常人群。為適應DHPLC方法快速檢測該突變，本發明提供一種用於檢測人類多癌風險易感風險性的診斷試劑盒。該試劑盒包括常規DNA抽提試劑，PCR試劑和DHPLC檢測用試劑。在 PCR試劑中包括常規PCR試劑，如高保真Taq酶、MgCl2+緩衝液、PCR專用去離子水等之外， 還包括待測突變位點c. -91Τ > C的上下遊PCR引物，引物分別針對突變位點上遊300bp和下遊300bp各600bp範圍的片段而設計，產物大小在200 300bp之間。在DHPLC檢測用試劑中，除包含常規HPLC試劑外，還包括所述突變位點的陰性對照基因組DNA。
所述引物具體核苷酸序列如下LEFT PRIMER 5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3『RIGHT PRIMER 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3'本發明試劑盒的使用方法為(1)用枸櫞酸鈉抗凝管收集待測個體外周血樣本， 抽提基因組DNA (大於50ng/樣本)；( 用本發明試劑盒進行PCR擴增，得到產物特異目的條帶；( 取PCR產物與陰性純合子DNA等量混合，用變性高效液相色譜系統進行檢測，區分多癌風險易感陰性和陽性結果。本發明的優點為本發明首次發現位於人類染色體3q25. 1的TSC22D2基因ATG上遊-91bp存在突變T > C(c. -91T > C)，該突變在多癌家系中與致病單體型共分離，並且在當地大樣本(500例)正常人群中驗證為陰性。因此在此基礎上提出一種通過該突變呈現的不同基因型來製備檢測人類多癌易感風險性的試劑，以及製備得到的試劑盒，並且經臨床實驗研究證實，本發明的檢測試劑盒具有良好靈敏性、穩定性和特異性，提高了單次DHPLC 的判別效能，更加適合含有大量陰性樣本的篩查。用本發明的試劑盒對正常人群進行腫瘤遺傳易感性的篩查，能有效起到風險預警、早期診斷的作用。


圖1 本發明中研究的多癌家系圖譜；圖2 已收集到的多癌家系圖譜；圖3 用GeneHunter軟體對MS結果進行單點、多點的參數和非參連鎖分析的LOD 值圖；圖4 瓊脂糖凝膠電泳得到特異目的條帶；圖5 本發明突變位點在家系中的測序結果圖；圖6 本發明突變位點在家系中與致病單體型共分離的單體型圖；圖7 本發明突變位點在正常人群大規模測序的部分測序結果圖。
具體實施例方式以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。實施例1 前期研究發現3明4-26與多癌家繫緊密連鎖前期研究中，發明人在湖南發現一個罕見多癌大家系，有六代超過103人。其中患者15人，存活有10人，涉及多種良惡性腫瘤，多癌家系圖譜參見圖1。為了定位與疾病連鎖的染色體區段，我們首先採用了高通量SNP晶片(Affymetrix公司Human Mapping 500K SNP Array)進行全基因組掃描和分型，通過Merlin軟體進行單點參數連鎖分析，在 3明4-3明6得到了 LOD值大於2的區域。後來進一步針對該區域採用微衛星進行精細定位， 通過Genehunter軟體進行多點非參連鎖分析時，最大LOD值達到了 10. 674(p = 0. 00195)， 定位於D3S1584 D3S3710之間，證實了該區段確實與疾病位點密切連鎖(參見圖2)。在進一步用Cyrillic軟體進行的單體型分析中，也發現有典型的單體型區間 (D3S1555-D3S3575)與疾病共分離。而後，發明人對該區段感興趣的Refseq gene展開了突變篩查工作，首先鎖定了一些可能與腫瘤發生發展密切關聯的基因。針對這些基因的外顯子及內外顯子交界、啟動子區進行測序，最終在基因TSC22D2的ATG上遊_91bp發現突變T> C(c. -91T > C)在家系中與致病單體型共分離，即家系中致病單體型攜帶者該位點的基因型均為tc雜合，系外正常或家系內致病單體型非攜帶者的基因型均為tt純合(參見圖 4、圖幻，隨後該位點在當地大樣本(500例)正常人群中驗證為陰性(參見圖6)，從遺傳學上證實該位點為多癌家系的致病基因和致病突變，與多種腫瘤的發生存在關聯。提示該突變與腫瘤的風險易感相關，可作為腫瘤風險預測的分子靶標。實施例2 腫瘤風險易感突變篩查試劑盒的製備(一 )針對突變位點的引物設計1.模板序列的選取模板序列來自UCSC資料庫(http://Renome.ucsc. edu/)，針對突變位點上下遊各 300bp選取，以保證PCR產物在合適的片段範圍便於檢測。2.引物設計PCR引物設計有3條基本原則首先引物要跟模板緊密結合，其次引物與引物之間不能有穩定的二聚體或髮夾結構存在，再次引物不能在別的非目的位點引起DNA聚合反應 (即錯配)。具體考慮因素包括引物長度(primer length)、產物長度(product length)、 序列 Tm 值(melting temperature) > AG 值(internal stability)、引物二聚體及髮夾結構(duplex formation and hairpin)、錯誤弓丨發位點(false priming site)、弓丨物及產物 GC含量(composition)等。在考慮了以上因素後，採用在線軟體I^rimerf (http //frodo. wi.mit.edu/)設計引物，我們在諸多輸出引物結果中選擇了一對最合適的兩對引物。具體引物序列如下針對TSC22D2 (c. -91T > C)的引物序列LEFT PRIMER 5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3『RIGHT PRIMER 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3'3.引物特異性檢測為了驗證引物的特異性，進一步在UCSC Blat資料庫中進行序列比對(http:// Renome. ucsc. edu/cRi-bin/hRBlat ？ command = start)。在輸出的結果中剛好只有引物所在染色體正反鏈位置上的兩條序列比對上，就說明該對引物的特異性很好，可以初步選為本發明突變篩查試劑盒的引物序列。發明人用PCR實驗和跑膠進一步確認了所選擇引物的特異性，選擇的引物出現特異性目的帶(參見圖5)，其產物大小為347bp，退火溫度為53°C。本發明突變篩查試劑盒的製備通過前期實驗證實，具校正功能的DNA聚合酶比 Taq聚合酶更適合於DHPLC突變分析。因此，我們選擇了 TaKaRa公司具有校正功能的高保真DNA聚合酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase作為突變篩查試劑盒的PCR酶。本發明突變篩查試劑盒的核心組分包括如下(I)DNA抽提試劑TaKaRa公司全血基因組抽提試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3. 0)O) PCR相關試劑今Markerl上下遊引物乾粉(各20D) 2支今Marker2上下遊引物乾粉(各20D) 2支今高保真DNA 聚合酶 PrimeSTAR HS DNAPolymerase 100 μ 1
今5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) :1ml X 2今dNTP Mixture (各 2. 5mM) :800 μ 1今突變位點的陰性對照(純合子tt)Blood gDNA(50ng/y 1) :100μ 1X2今MiniQ 超純水5ml(3) DHPLC所需的常規試劑今Buffer A :0. ITEAA 溶液；今Buffer B :0. ITEAA 溶液；今Buffer C :Wash Solution ；今 Buffer D Storage Solution (75% acetonitrile)；今DNA 分子量標準IOObp DNA ladder (100 至 600bp 的 Marker)，參照片段 (bp)600500 400 300 200 100主要溶液今紅細胞裂解液；今白細胞裂解液今TE (IOmM Tris+lmM EDTA)今飽和NaCl 5M今6M凝膠加樣緩衝液今5M電泳緩衝液(TBE)引物人工合成。通過測序方法篩查突變位點為陰性的純合子(tt)個體，並採用全血基因組抽提試劑盒提取其外周血gDNA，跑膠呈均一條帶，測吸光度OD值在1. 8左右為質量合格，將其作為陰性對照DNA。另外根據引物的Tm值，在Tm上下五度範圍，採用梯度PCR摸索得到引物的最佳退火溫度，推薦退火溫度為53°C。實施例3 本發明突變篩查試劑盒的使用步驟
步驟1血液樣本的採集和gDNA的抽提血液樣本的採集與處理使用德國格雷那公司VACUETTE (非可替)5ml EDTA 抗凝管，採集待測個體外周血樣本5ml，4°C保存，兩周內抽提gDNA。如果不立即抽提gDNA， 可以將抗凝管放至冰箱-20。C保存，待收集了多個樣本後一起抽提。gDNA抽提使用TaKafci公司全血基因組抽提試劑盒(Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver. 3. 0)提取Blood gDNA(步驟詳見產品說明書)。取2 μ 1 DNA樣本跑膠，同時取2μ 1 gDNA樣本稀釋到100μ 1，測吸光度值，按照公式DNA濃度=吸光度值X 稀釋倍數X40(單位為ng/μ 或yg/ml)計算抽提的DNA濃度，取250ng稀釋為50ng/ μ 1(共50 μ 1)待用，餘下樣本_80°C保存。步驟2PCR擴增(1)引物稀釋將突變篩查試劑盒中的裝有乾粉引物的離心管取出，常溫點離，按照說明配製5X弓丨物原液(50μΜ)，再按照1 5稀釋一部分為IX引物工作液(10 μ Μ)， 待用。引物原液於_20°C保存，引物工作液於4°C保存。O) PCR 體系按下列組分配製PCR反應液
權利要求
1.一種多癌風險易感性突變位點，其特徵在於所述的突變位點位於人TSC22D2基因的ATG上遊-91bp，T > C，其基因型包括陰性基因型tt和多癌易感風險基因型tc或cc。
2.一種多癌風險易感性突變位點的應用方法，其特徵在於應用於製備檢測多癌風險易感性試劑，所述的多癌風險易感性突變位點位於人TSC22D2基因的ATG上遊_91bp，T > C，其基因型包括陰性基因型tt和多癌易感風險基因型tc或cc。
3.根據權利要求2所述的應用方法，其特徵在於所述的試劑包括DNA測序試劑、限制性酶切片段長度多態性試劑、單鏈構象多態性試劑、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交試劑或變性高效液相色譜試劑。
4.根據權利要求2或3所述的應用方法，其特徵在於所述的試劑為變性高效液相色譜試劑。
5.如權利要求4所述的應用方法，其特徵在於所述試劑中含有針對突變位點設計的引物序列L 5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3『R 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3『。
6.一種檢測多癌風險易感性的突變篩查試劑盒，包括DNA抽提試劑，PCR試劑和DHPLC檢測用試劑，其特徵在於在PCR試劑中包含針對人TSC22D2基因ATG上遊-9 Ibp，T > C 突變位點設計的上下遊引物，L 5 『 -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3 『 ；R 5 『 -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3 『；在DHPLC檢測用試劑中，包括所述突變位點基因型為tt的陰性基因組DNA。
全文摘要
本發明公開了一種多癌風險易感性突變位點及其應用和製備的試劑盒。本發明通過研究證實，多癌家系染色體3q24-26區域與疾病位點緊密連鎖，基因突變篩查進一步證實人TSC22D2基因的ATG上遊-91bp T＞C突變(c.-91T＞C)在多癌家系中與致病單體型共分離，通過在當地正常人群大規模測序驗證，該突變為陰性。從而提出針對該突變位點的基因型可用於腫瘤遺傳易感人群的篩查，用於腫瘤患病風險預測。並研製了相關的突變篩查試劑盒。該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、高通量等優點，與傳統的測序方法相比，無需PCR產物的純化，減少了交差汙染等人為因素的幹擾，同時節省了大量的人力、財力和物力。
文檔編號C12Q1/68GK102311952SQ20111027777
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者曾朝陽, 李桂源, 熊煒, 肖嵐, 譚世明 申請人:中南大學