雙水相萃取分離純化α-澱粉酶的方法
2023-05-29 00:28:26
專利名稱：雙水相萃取分離純化α-澱粉酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離純化α 「澱粉酶的方法。
背景技術：
真菌α -澱粉酶是由麴黴屬微生物發酵產生的一種α _澱粉酶。與細菌α _澱粉酶不同的是，真菌α-澱粉酶的最適作用溫度為55°C左右，超過60°C開始失活；其水解澱粉的產物主要是高含量的麥芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖。而細菌α-澱粉酶最適作用溫度高(中溫α-澱粉酶70 80°C，耐高溫α-澱粉酶為95 105°C )，水解澱粉的主要產物是糊精。因此，細菌α-澱粉酶只能用於發酵工業，而真菌α-澱粉酶則廣泛地應用於澱粉糖漿、低聚糖、啤酒、烘焙食品、麵製品等的生產，具有十分廣闊的市場前景。目前採用硫酸銨鹽析法、離心噴霧乾燥法等分離澱粉酶的方法存在樣品回收率低、分離材料或設備昂貴、樣品處理量小、單一方法分離純度低的問題；而且經硫酸銨鹽析法分離方法得到的α-澱粉酶含有較多雜質，效價低，且不能直接應用於食品工業中。
發明內容
本發明是為了解決目前採用硫酸銨鹽析法、離心噴霧乾燥法等分離澱粉酶的方法存在樣品回收率低、分離材料或設備昂貴、樣品處理量小、單一方法分離純度低的問題，以及經硫酸銨鹽析法分離方法得到的α-澱粉酶含有較多雜質，效價低，且不能直接應用於食品工業中的缺陷，而提供的一種雙水相萃取分離純化α-澱粉酶的方法。雙水相萃取分離α -澱粉酶按以下步驟進行一、製備真菌α -澱粉酶粗酶液；二、配製PEG/(NH4)2SO4雙水相，PEG/(NH4)2S04雙水相按重量百分比由34%的聚乙二醇1500、24%的(NH4)2SCV20%的NaCl和餘量的去離子水組成；三、按真菌α-澱粉酶粗酶液與PEG/(NH4)2SO4雙水相1 1的重量比均勻混合， 再調節PH值為6. 5，然後室溫靜置2min，收集PEG/(NH4)2SO4雙水相中的上層液相；四、將收集的PEG/ (NH4)2S04雙水相的上層液相與質量濃度為35%的(NH4)2S04水溶液構成雙水相純化體系，進行反向萃取，取雙水相純化體系的下相液透析濃縮，即得到 α-澱粉酶。本發明方法能夠更高效的分離純化α-澱粉酶，α-澱粉酶的酶回收率達85%以上；而且成本低廉、可適用於大規模產業化生產。本發明方法所獲得的α-澱粉酶純度高達98%以上、雜質少，所以可用於食品工業。
具體實施例方式本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式雙水相萃取分離α -澱粉酶按以下步驟進行一、製備真菌α -澱粉酶粗酶液；二、配製PEG/(NH 4)2SO4雙水相，PEG/(NH4)2S04雙水相按重量百分比由34%的聚乙二醇1500(PEG1500)、24%的(NH4)2S04、20%的NaCl和餘量的去離子水組成；三、按真菌α-澱粉酶粗酶液與PEG/(NH4)2SO4雙水相1 1的重量比均勻混合， 再調節PH值為6. 5，然後室溫靜置2min，收集PEG/(NH4)2SO4雙水相中的上層液相；四、將收集的PEG/ (NH4)2S04雙水相的上層液相與質量濃度為35%的(NH4)2S04水溶液構成雙水相純化體系，進行反向萃取，取雙水相純化體系的下相液透析濃縮，即得到 α-澱粉酶。本實施方式方法可適用於不同發酵α -澱粉酶的真菌，具有適用性廣的特點。通過正交試驗證明各種因素對試驗影響的主次順序為聚乙二醇1500(PEG1500) 的濃度> (NH4)2SO4的濃度> !1值> NaCl的濃度。雖然固定(NH4)2SO4濃度不變、再調節 PH值為7.0的條件下，隨著PEG1500濃度的增加，上層液相中α -澱粉酶的含量逐漸升高， 當PEG/(NH4)2SO4I水相中PEG1500濃度達到70% (W/W)時上層液相中α -澱粉酶的含量為83.371%。但是，由於PEG的濃度過高，其疏水性增加，α -澱粉酶有向下層液相分配的趨勢，對下一步驟的純化造成不利，影響α-澱粉酶的實際回收率。本實施方式降低了 PEG1500的濃度，卻通過合理的控制(NH4)2SO4的濃度、ρΗ值及 NaCl的濃度提高了 α -澱粉酶的酶回收率。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中用米麴黴 2197、米麴黴ZLA16、米麴黴ZLB35、米麴黴ZLC06、米麴黴ZLD14、米麴黴ZLE09或米麴黴 ZLF13發酵真菌α-澱粉酶粗酶液。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二的不同點是步驟四中取雙水相純化體系的下相液，裝透析袋用PEG6000透析濃縮。其它步驟及參數與實施方式一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式雙水相萃取分離α -澱粉酶按以下步驟進行一、製備真菌α -澱粉酶粗酶液將28°C察式培養基培養4天的米麴黴ZLE09菌體用生理鹽水洗脫兩次，合併洗脫液；再將洗脫液放置於28°C、300r/min的搖床中進行孢子打散30min，製成單孢子懸液，調整單孢子濃度為108(^11/!^，然後將經過單孢子濃度調整的單孢子懸液以2.5% (V/V)的接種量接於發酵培養基(發酵培養基按蛋白腖2g、NaCl lg、牛肉膏lg、可溶性澱粉0.4g和蒸餾水200mL的比例組成，發酵培養基ρΗ值為7. 0)中，再置於28°C、180r/min環境中培養 4天，之後在8000r/min的離心條件下，離心20min、棄去菌體，即得到真菌α -澱粉酶粗酶液；二、配製PEG/(NH4)2SO4雙水相，PEG/(NH4)2S04雙水相按重量百分比由34%的聚乙二醇1500(PEG1500)、24%的(NH4)2S04、20%的NaCl和餘量的去離子水組成；三、按真菌α-澱粉酶粗酶液與PEG/(NH4)2SO4雙水相1 1的重量比均勻混合， 再調節PH值為6. 5，然後室溫靜置2min，收集PEG/(NH4)2SO4雙水相中的上層液相；四、將收集的PEG/ (NH4) 2S04雙水相的上層液相與質量濃度為35 %的(NH4) 2S04 水溶液構成雙水相純化體系，進行反向萃取，取雙水相純化體系的下相液，裝透析袋用PEG6000透析濃縮，即得到α-澱粉酶。α -澱粉酶酶活力的測定方法在IOmL的試管中加入2. 5mL pH6. 0的NaH2PO4-檸檬酸緩衝液和ImL質量濃度為 0.5%的可溶性澱粉溶液，60°C水浴預熱IOmin後，加入η倍稀釋的真菌α -澱粉酶粗酶液 5mL，60°C水浴保溫5min後，加入ImL 0. lmol/L的H2SO4終止反應，得到反應液。吸取2mL反應液與0.5mL 0.5%稀碘液顯色，測定OD62tl值。與澱粉梯度標準曲線對照得反應液澱粉濃度後計算酶活力。酶活力單位定義(U/mL)在pH6.0、溫度60°C，5min水解可溶性澱粉Img 所需的酶量為1個酶活力單位。酶活力的計算公式(0· 1% -C&) XnXlOOO0.1%:底物濃度 Cfi 反應液澱粉濃度η 稀釋倍數1000 置換係數α -澱粉酶的酶回收率的測定方法步驟三分相後讀取上下液相的體積(Vt——上層液相體積和Vb——下層液相體積，mL)，用吸管吸取上層液相和下層液相液體各2mL於IOmL試管中，根據α -澱粉酶酶活力的測定方法進行酶活的測定(Ut——上層液相中α-澱粉酶酶活力和Ub——下層液相中 α -澱粉酶酶活力，U/mL)。相比R = Vt/Vb，分配係數Ka = Ut/Ub，α -澱粉酶的酶回收率 Yt = RXKa/(1+R) X 100%經檢測本實施方式的α -澱粉酶的酶回收率為85. 315%，所獲得的α -澱粉酶純度高達98% [RZ(酶的純度)=A360A420 = 3. 2]以上、雜質少。本實施方式PEG/(NH4)2SO4I水相中PEG1500的濃度為34%，降低了 PEG1500的使用量，並大幅提高了 α-澱粉酶的酶回收率。
具體實施方式
五本實施方式雙水相萃取分離α -澱粉酶按以下步驟進行一、製備真菌α -澱粉酶粗酶液將28°C察式培養基培養4天的米麴黴ZLF13菌體用生理鹽水洗脫兩次，合併洗脫液；再將洗脫液放置於28°C、300r/min的搖床中進行孢子打散30min，製成單孢子懸液，調整單孢子濃度為108(^11/!^，然後將經過單孢子濃度調整的單孢子懸液以2.5% (V/V)的接種量接於發酵培養基(發酵培養基按蛋白腖2g、NaCl lg、牛肉膏lg、可溶性澱粉0.4g和蒸餾水200mL的比例組成，發酵培養基pH值為7. 0)中，再置於28°C、180r/min環境中培養 4天，之後在8000r/min的離心條件下，離心20min、棄去菌體，即得到真菌α -澱粉酶粗酶液；二、配製PEG/(NH4)2SO4雙水相，PEG/(NH4)2S04雙水相按重量百分比由34%的聚乙二醇1500(PEG1500)、24%的(NH4)2S04、20%的NaCl和餘量的去離子水組成；三、按真菌α-澱粉酶粗酶液與PEG/(NH4)2SO4雙水相1 1的重量比均勻混合， 再調節PH值為6. 5，然後室溫靜置2min，收集PEG/(NH4)2SO4雙水相中的上層液相；四、將收集的PEG/ (NH4) 2S04雙水相的上層液相與質量濃度為35 %的(NH4) 2S04 水溶液構成雙水相純化體系，進行反向萃取，取雙水相純化體系的下相液，裝透析袋用 PEG6000透析濃縮，即得到α-澱粉酶。
α -澱粉酶酶活力的測定方法在IOmL的試 管中加入2. 5mL pH6. 0的NaH2PO4-檸檬酸緩衝液和ImL質量濃度為 0.5%的可溶性澱粉溶液，60°C水浴預熱IOmin後，加入η倍稀釋的真菌α -澱粉酶粗酶液 5mL，60°C水浴保溫5min後，加入ImL 0. lmol/L的H2SO4終止反應，得到反應液。吸取2mL反應液與0.5mL 0.5%稀碘液顯色，測定OD62tl值。與澱粉梯度標準曲線對照得反應液澱粉濃度後計算酶活力。酶活力單位定義(U/mL)在pH6.0、溫度60°C，5min水解可溶性澱粉Img 所需的酶量為1個酶活力單位。酶活力的計算公式(0· 1% -C&) XnXlOOO0.1%:底物濃度Cfi 反應液澱粉濃度η:稀釋倍數1000 置換係數α -澱粉酶的酶回收率的測定方法步驟三分相後讀取上下液相的體積(Vt——上層液相體積和Vb——下層液相體積，mL)，用吸管吸取上層液相和下層液相液體各2mL於IOmL試管中，根據α -澱粉酶酶活力的測定方法進行酶活的測定(Ut——上層液相中α-澱粉酶酶活力和Ub——下層液相中 α -澱粉酶酶活力，U/mL)。相比R = Vt/Vb，分配係數Ka = Ut/Ub，α -澱粉酶的酶回收率 Yt = RXKa/(1+R) X 100%經檢測本實施方式的α -澱粉酶的酶回收率為85. 124%，所獲得的α -澱粉酶純度高達98% [RZ(酶的純度)=A360A420 = 3. 2]以上、雜質少。本實施方式PEG/(NH4)2SO4I水相中PEG1500的濃度為34%，降低了 PEG1500的使用量，並大幅提高了 α-澱粉酶的酶回收率。
權利要求
1.雙水相萃取分離純化α-澱粉酶的方法，其特徵在於雙水相萃取分離α-澱粉酶按以下步驟進行一、製備真菌α-澱粉酶粗酶液；二、配製PEG/(NH4)2SO4雙水相，PEG/(NH4)2SO4雙水相按重量百分比由34%的聚乙二醇 1500、24%的(NH4)2S04、20%的NaCl和餘量的去離子水組成；三、按真菌α-澱粉酶粗酶液與PEG/(NH4)2SO4雙水相1 1的重量比均勻混合，再調節PH值為6. 5，然後室溫靜置2min，收集PEG/(NH4)2SO4雙水相中的上層液相；四、將收集的PEG/(NH4)2SO4雙水相的上層液相與質量濃度為35%的(NH4)2SO4水溶液構成雙水相純化體系，進行反向萃取，取雙水相純化體系的下相液透析濃縮，即得到α 「澱粉酶。
2.根據權利要求1所述的雙水相萃取分離純化α-澱粉酶的方法，其特徵在於步驟一中用米麴黴2197、米麴黴ZLA16、米麴黴ZLB35、米麴黴ZLC06、米麴黴ZLD14、米麴黴ZLE09 或米麴黴ZLF13發酵真菌α -澱粉酶粗酶液。
3.根據權利要求1或2所述的雙水相萃取分離純化α-澱粉酶的方法，其特徵在於步驟四中取雙水相純化體系的下相液，裝透析袋用PEG6000透析濃縮。
全文摘要
雙水相萃取分離純化α-澱粉酶的方法，它涉及一種分離純化α-澱粉酶的方法。它解決了目前採用硫酸銨鹽析法、離心噴霧乾燥法等分離澱粉酶的方法存在樣品回收率低、分離材料或設備昂貴、樣品處理量小、單一方法分離純度低的問題，以及經硫酸銨鹽析法分離方法得到的α-澱粉酶含有較多雜質，效價低，且不能直接應用於食品工業中的缺陷。雙水相萃取分離純化α-澱粉酶的方法一、製備真菌α-澱粉酶粗酶液；二、配製PEG/(NH4)2SO4雙水相；三、萃取；四、純化。本發明方法用於分離純化α-澱粉酶。
文檔編號C12N9/30GK102220300SQ20111015549
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者凌宏志, 宋剛, 平文祥, 葛菁萍, 董海麗 申請人:黑龍江大學