雙苯並異唑酮類化合物及其合成和應用的製作方法

2023-05-29 02:59:56

專利名稱：雙苯並異唑酮類化合物及其合成和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及雙苯並異唑酮類化合物，合成方法和含有其的藥物組合物，以及雙苯並異唑酮類化合物的藥學用途，尤其在製備抗腫瘤、抗病毒和抗菌藥物中的應用。
背景技術：
近二十年來，硒的生物化學研究取得一系列重要突破和進展，有機硒化合物在生命科學方面的特徵及其廣泛的藥理作用日益受到重視。研究表明，有機硒化合物在抗炎、抗氧化、抗腫瘤和治療心腦血管疾病方面有明顯的作用，並能對免疫系統進行調節。代表性的有機硒藥物依布硒啉(Ebselen)已進入III期臨床研究。
依布硒啉，即2-苯基-1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮(INNEbselen)，是國外開發中的抗炎新藥，其特點是低毒並具有廣泛的藥理活性，為活性氧相關疾病的治療提供了一個很有前途的手段，並為有機硒藥物的發展展示了廣闊的前景。理論認為該化合物是模擬穀胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)最成功的小分子有機硒化合物，可催化GSH還原分解各種有機氫過氧化物。
其類似物苯並異噻唑酮是較強的抗氧化劑，同時也是一種很好的殺菌劑，對細菌、真菌均有抑制作用，具有較為廣泛的生物功能特點。它不僅可殺菌同時還可以抑制血小板聚集防止血栓的形成，抗動脈粥樣硬化，防止心臟病的發作。在抗炎活性與其含硒類似物Ebselen的作用相似。異噻唑酮對逆轉錄病毒還有很好的抑制作用。但雙苯並異唑酮類化合物合成及其應用如雙異噻唑酮的對稱結構；雙異碲唑酮的對稱結構；異噻唑酮與異硒唑酮的不對稱結構；異噻唑酮與異碲唑酮的不對稱結構；異硒唑酮與異碲唑酮的不對稱結構，尚未有人報導。在生物活性研究方面，如以上一系列雙苯並異唑酮類化合物的含硫、碲有機化合物的抗腫瘤、抗菌研究尚未見報導。
我們選擇苯並異硒唑酮作為基本母核，將硒替換成其同族元素硫，碲合成了相應的雙苯並異唑酮類化合物，並研究了其抗腫瘤、抗菌活性。

發明內容
本發明涉及以下通式的雙苯並異唑酮類化合物及其藥物學上可接受的鹽
其中R1和R2是相同或不同的，彼此獨立選自S，Se或Te；其中R是C1-C20線性或支化、飽和或不飽和的二價烴基，C6-C30亞芳基，C5-C20亞環烷基，C5-C20亞雜環基，含有碳環、雜環或芳環的C4-C30二價烴基，其中碳環、雜環或芳環可以位於鏈中或鏈端，有機基磺醯基，或羰基有機基羰基(有機基包括亞烷基、亞烯基、亞芳基、亞雜環基等)，所有這些基團是取代或未取代的，例如被酸基、酯基、羥基、氨基、滷素、醯胺基等取代，其碳鏈可以任意插入選自O、N和S中的一個或多個雜原子；其中R優選是(-CH2)n-，其中n是1-8；或-(C6H4)n-，其中n是1-3；或-(CH2)n-SS-(CH2)n-，其中n是1-3；或-(CH2)n-NH-(CH2)n-，其中n是1-3；或-C(＝O)-R』-C(＝O)-，其中R』是二價烴基，如亞烷基，亞烯基，亞芳基，亞環烷基或亞雜環基；或-(CH2)n-O-(CH2)n-，其中n是1-4。
尤其優選的是以下結構式的化合物 n＝2-8；R1＝R2或R1≠r2其中R1、r2＝S或Se或Te
n ＝1-3；R1＝R2或R1≠R2其中R1、R2＝S或Se或Te n ＝1-3；R1＝R2或R1≠R2其中R1、R2＝S或Se或Te本發明的另一個目的是提供上述通式化合物的製備方法，包括以下步驟讓以下結構式III和IV的化合物 與結構式H2N-R-NH2的化合物在-20℃到5℃的溫度下，在惰性溶劑中，在鹼性條件下，在惰性氣體保護下反應製得所需的化合物。
其中R1和R2是相同或不同的，彼此獨立選自S，Se或Te；其中R是C1-C20線性或支化、飽和或不飽和的二價烴基，C6-C30亞芳基，C5-C20亞環烷基，C5-C20亞雜環基，含有碳環、雜環或芳環的C4-C30二價烴基，其中碳環、雜環或芳環可以位於鏈中或鏈端，有機基磺醯基，或羰基有機基羰基，所有這些基團的碳鏈可以任意插入選自O、N和S中的一個或多個雜原子；其中R優選是(-CH2)n-，其中n是1-8；-(C6H4)n-，其中n是1-3；-(CH2)n-SS-(CH2)n-，其中n是1-3；-(CH2)n-NH-(CH2)n-，其中n是1-3；或-(CH2)n-O-(CH2)n-，其中n是1-4。
適宜的惰性溶劑包括例如四氫呋喃，二甲基甲醯胺，二甲基乙醯胺，二氯甲烷，乙醚等。
適合的鹼性條件例如為pH8-11。
按照上述方法，獲得了本發明結構式I和II的兩種異構體，這兩種異構體一般以1∶1的摩爾比共同存在。
本發明的又一個目的是提供上述通式化合物在製備抗腫瘤、抗病毒和抗菌藥物中的應用。
本發明的另一個目的是提供含有藥學有效量的上述通式(I)或(II)化合物與藥物學上可接受的賦形劑或載體或任選的添加劑如香味劑、甜味劑等組成的藥物組合物。其中通式(I)或(II)的化合物在藥物組合物中的含量例如可以為1-95％。
本發明的藥物組合物還可按常規技術製成膠囊、片劑、口服液、注射或輸液劑型，並根據需要製成控釋或緩釋系統給藥。
本發明的通式(I)或(II)的化合物可以獨自使用或以組合物的形式使用。
本發明的通式(I)或(II)的化合物的劑量根據病人年齡、體重、病程、疾病的輕重等因素來決定。例如，作為參考，在口服劑型的情況下，本發明的化合物的用量可以是0.1-10mg/kg/d，在注射劑型的情況下，本發明的化合物用量可以為0.1-5mg/kg/d。
具體實施例在以下實施例中，按照下述合成路線合成了以下化合物，應該指出的是，這些實施例僅用於例證的目的，不限制本發明的範圍。雖然只給出了本發明化合物的一種異構體形式，但在本文中還包括了其異構體形式。
化合物1，4-二[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]-苯的合成 化合物EIS1，2-二[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-乙烷的合成
化合物EIIS1，3-二[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-丙烷的合成 化合物EIIIS1，4-二[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-丁烷的合成 化合物EITe1，2-二[2-(1，2-苯並異碲唑-3(2H)-酮)]-乙烷的合成 化合物Ebs-11-[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-2-[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]乙烷的合成 化合物EsTe1-[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-2-[2-(1，2-苯並異碲唑-3(2H)-酮)]乙烷的合成 化合物EbTe1-[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]-2-[2-(1，2-苯並異碲唑-3(2H)-酮)]乙烷的合成 1，2-二[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)甲基]-二硫醚
1，4-二[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]-苯磺醯化合物 1，2-二[(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮-2-基)羰基]乙烷 實施例1 中間產物的合成中間產物1重氮鹽的合成 將含有18g鄰氨基苯甲酸和1∶1鹽酸51.4mL溶液用冰浴冷至小於5℃，攪拌下緩慢滴加入亞硝酸鈉溶液製得重氮鹽。
中間產物22-硒氯苯甲醯氯的合成
(1)2，2』-二硒化雙苯甲酸的製備在室溫氮氣保護下，向6g硒粉與50mL水混合的懸浮液中緩慢滴加硼氫化鉀水溶液。硒粉全部溶解，再加入等量6g硒粉，得到黑紅色溶液。室溫攪拌0.5小時，再加入氫氧化鈉水溶液，然後滴加入重氮鹽溶液。滴加完畢，升溫至60℃反應2小時，繼續反應3小時。加入1∶1鹽酸酸化，過濾水洗後將所得紅褐色固體加入到100mL碳酸鈉溶液中，除去不溶物。冷卻後再加入1mol/L的鹽酸至PH值小於1，減壓過濾，水洗後乾燥得49.6g淡黃色固體。即為2，2』-二硒化雙苯甲酸。
(2)2-硒氯苯甲醯氯的製備以6g，2，2-二硒化雙苯甲酸加30ml二氯亞碸混合，攪拌下加熱回流3小時之後旋蒸出多餘的二氯亞碸。剩下的物質用正己烷重結晶，得黃色固體3.4g，即為2-硒氯苯甲醯氯。
中間產物32-硫氯苯甲醯氯的合成
(1)2，2』-二硫化雙苯甲酸的製備在室溫氮氣保護下，向2.4g硫粉與50mL水混合的懸浮液中緩慢滴加硼氫化鉀水溶液。硫粉少部分溶解，再加入等量2.4g硫粉，室溫攪拌1小時45分鐘，溶液從無色變為黃綠色再變為黃色最後變為棕紅色，硫粉大部分溶解。再加入氫氧化鈉水溶液(20g氫氧化鈉+50mL水)，然後滴加入重氮鹽溶液，產生橙紅色氣泡，硫粉基本溶解。滴加完畢，升溫至60℃反應2小時，繼續反應3小時。加入1∶1鹽酸酸化，過濾水洗後將所得淺黃色固體加入到100mL碳酸鈉溶液中，除去不溶物。冷卻後再加入1mol/L的鹽酸至PH值小於1，減壓過濾，水洗後乾燥得47.6g白色固體。即為2，2』-二硫化雙苯甲酸。
(2)2-硫氯苯甲醯氯的製備以9.1g2，2-二硫化雙苯甲酸加59.34ml二氯亞碸混合，攪拌下加熱回流3小時之後旋蒸出多餘的二氯亞碸。剩下的物質用正己烷重結晶，得金黃色固體3.7g，即為2-硫氯苯甲醯氯。
中間產物42-碲氯苯甲醯氯的合成
(1)2，2』-二碲化雙苯甲酸的製備在室溫氮氣保護下，向4.85g碲粉與25mL水混合的懸浮液中緩慢滴加硼氫化鉀水溶液。碲粉部分溶解，溶液變黑又變澄清最後變為紫色。再加入等量4.85g碲粉，液面產生大量氣泡，最後氣泡消失，溶液變成黑紅色。再加入氫氧化鈉水溶液，然後滴加入重氮鹽溶液，生成白霧，黑色氣泡，溶液變為黑紅色。滴加完畢，升溫至60℃反應2小時，繼續反應3小時，得到深紫紅色溶液。加入1∶1鹽酸酸化，過濾水洗後將所得綠色粘稠固體加入到50mL碳酸鈉溶液中，除去不溶物。冷卻後再加入1mol/L的鹽酸至PH值小於1，減壓過濾，水洗後乾燥得12.7g黃色固體。即為2，2』-二碲化雙苯甲酸。
(2)2-碲氯苯甲醯氯的製備以6.0g2，2-二碲化雙苯甲酸加24.13ml二氯亞碸混合，攪拌下加熱回流3小時之後旋蒸出多餘的二氯亞碸。剩下的物質用苯重結晶，得金黃色固體5.2g，即為2-碲氯苯甲醯氯。
實施例2化合物EIS1，2-二[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-乙烷的合成向250ml三口瓶中加入12ml四氫呋喃、0.37ml乙二胺、3.44ml三乙胺，冰浴攪拌下通入氮氣。稱取2.2g硫氯固體放入小燒杯加53.5ml四氫呋喃，硫氯溶解，得到黃色透明溶液。將此溶液用滴液漏鬥滴入三口瓶，滴加速度較快。有淺黃色固體生成，溶液顏色變為黃色。瓶內有小的白色絮狀物漂浮。硫氯溶液滴加完畢反應三小時後，減壓過濾。得到黃色固體，水洗濾液呈黃色。重結晶，得到無色針狀晶體0.4g。產率23.0％，m.p.206℃。EI-MS(M+)328。
實施例3化合物EIIS1，3-二[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-丙烷的合成向250ml三口瓶中加入2.25ml四氫呋喃、0.41ml丙二胺、3.23ml三乙胺，冰浴攪拌下通入氮氣。稱取2.0g硫氯固體放入小燒杯加30ml四氫呋喃，硫氯溶解，得到黃色透明溶液。將此溶液用滴液漏鬥滴入三口瓶，滴加速度較快。有淺黃色粘稠固體生成，溶液顏色變為黃色。瓶內有小的白色絮狀物漂浮。硫氯溶液滴加完畢反應三小時後，減壓過濾。水洗得到白色固體，濾液呈黃色。重結晶，得到無色針狀晶體1g。產率60.6％，m.p.163℃。FAB-MS(M+)342。
實施例4化合物EIIIS1，4-二[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-丁烷的合成向250ml三口瓶中加入2.5ml四氫呋喃、0.43ml丁二胺、2.87ml三乙胺，冰浴攪拌下通入氮氣。稱取1.78g硫氯固體放入小燒杯加30ml四氫呋喃，硫氯溶解，得到黃色透明溶液。將此溶液用滴液漏鬥滴入三口瓶，滴加速度較快。有淺黃色粘稠固體生成，溶液顏色變為黃色。瓶內有小的白色絮狀物漂浮。硫氯溶液滴加完畢反應三小時後，減壓過濾。水洗得到白色固體，濾液呈黃色。重結晶，得到無色針狀晶體1.1g。產率64.3％，m.p.207℃。FAB-MS(M+1)357。
實施例5化合物EITe1，2-二[2-(1，2-苯並異碲唑-3(2H)-酮)]-乙烷的合成向250ml三口瓶中加入5.9ml四氫呋喃、0.18ml 乙二胺、1.68ml三乙胺，冰浴攪拌下通入氮氣。稱取1.6g碲氯固體放入小燒杯加26.5ml四氫呋喃，碲氯溶解，得到棕紅色溶液。將此溶液用滴液漏鬥滴入三口瓶，滴加速度較快。有黃色固體生成，溶液顏色變為黃色。瓶內有小的白色絮狀物漂浮。碲氯溶液滴加完畢反應三小時後，減壓過濾。得到黃色固體，濾液呈黃色。用蒸餾水洗滌固體數次，固體顏色變淺，濾液顏色為黃色。再用無水乙醚少量洗滌此固體產品，濾液顏色為黃綠色。水洗滌此固體產品，濾液顏色為黃綠色。產品乾燥得到1.2g，產率86.5％，m.p.203℃。FAB-MS(M+)523；1HNMRδ8～7.6(m，8H，ArH)，δ2.7(s，4H，-CH2-)。
實施例6化合物Ebs-11-[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-2-[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]乙烷的合成向250ml三口瓶中加入12ml四氫呋喃、0.37ml乙二胺、3.44ml三乙胺，冰浴攪拌下通入氮氣。稱取1.1g硫氯固體放入小燒杯加26.5ml四氫呋喃，硫氯溶解，得到黃色透明溶液。再稱取1.35g硒氯固體放入小燒杯加26.5ml四氫呋喃，硒氯溶解，得到棕色透明溶液。將以上兩種溶液用滴液漏鬥滴入三口瓶，同時滴加，且速度相同，滴加速度較快。有淺黃色固體生成，溶液顏色變為黃色。瓶內有小的白色絮狀物漂浮。溶液滴加完畢後繼續反應三小時，將反應液減壓過濾。得到淡黃色固體，濾液呈黃色。用蒸餾水洗滌固體數次，固體顏色變淺，濾液顏色為黃色。再用無水乙醚少量洗滌此固體產品，濾液顏色為黃綠色。最後用無水乙醚少量洗滌此固體產品，濾液顏色為黃綠色。產品乾燥得到1.8g，產率90.5％，m.p.268℃。EI-MS(M+)375；1HNMRδ8～7.3(m，8H，ArH)，δ4.3～3.3(s，4H，-CH2-)。
實施例7化合物EsTe1-[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-2-[2-(1，2-苯並異碲唑-3(2H)-酮)]乙烷的合成向250ml三口瓶中加入5.9ml四氫呋喃、0.18ml乙二胺、1.68ml三乙胺，冰浴攪拌下通入氮氣。稱取0.6g硫氯固體放入小燒杯加13.25ml四氫呋喃，硫氯溶解，得到黃色透明溶液。再稱取0.8g碲氯固體放入小燒杯加13.25ml四氫呋喃，碲氯溶解，得到棕色溶液。將以上兩種溶液用滴液漏鬥滴入三口瓶，同時滴加，且速度相同，滴加速度較快。有黃色固體生成，溶液顏色變為黃色。瓶內有小的白色絮狀物漂浮。溶液滴加完畢後繼續反應三小時，將反應液減壓過濾。得到黃色固體，濾液呈黃色。用蒸餾水洗滌固體數次，固體顏色變淺，濾液顏色為黃色。再用無水乙醚少量洗滌此固體產品，濾液顏色為黃色。最後用水少量洗滌此固體產品，濾液顏色為黃色。產品乾燥得到1.1g，產率89.4％，m.p.287℃。FAB-MS(M+K)463。
實施例8化合物EbTe1-[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]-2-[2-(1，2-苯並異碲唑-3(2H)-酮)]乙烷的合成向250ml三口瓶中加入5.9ml四氫呋喃、0.18ml乙二胺、1.68ml三乙胺，冰浴攪拌下通入氮氣。稱取0.68g硒氯固體放入小燒杯加13.25ml四氫呋喃，硒氯溶解，得到橙紅透明溶液。再稱取0.8g碲氯固體放入小燒杯加13.25ml四氫呋喃，碲氯溶解，得到棕色溶液。將以上兩種溶液用滴液漏鬥滴入三口瓶，同時滴加，且速度相同，滴加速度較快。有黃色固體生成，溶液顏色變為黃色。瓶內有小的白色絮狀物漂浮。溶液滴加完畢後繼續反應三小時，將反應液減壓過濾。得到黃色固體，濾液呈黃色。用蒸餾水洗滌固體數次，固體顏色變淺，濾液顏色為黃色。產品乾燥得到1.2g，產率95.23％，m.p.247℃。FAB-MS(M+)471；1HNMRδ8～7.3(m，8H，ArH)，δ4.0～2.9(s，4H，-CH2-)。
實施例91，4-二[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]-苯的合成0.38g苯胺，1.3ml三乙胺溶於10mlTHF中，冰浴通N2攪拌，1g硒氯溶於20mlTHF中，慢慢滴入苯胺溶液中，1h內滴完.繼續攪拌三小時以上.得黃色沉澱，過濾，用THF和乙醇洗滌沉澱，烘乾.母液濃縮後靜置結晶。產率5％，mp＞300℃；EI-MS(M+)474。
實施例101，2-二[2(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]-二硫醚的合成向250ml三口瓶中加入6.9ml四氫呋喃、1.18ml二硫醚二胺、1.68ml三乙胺，冰浴攪拌下通入氮氣。稱取1.6g硒氯固體放入小燒杯加26.5ml四氫呋喃，硒氯溶解，滴入三口瓶，有黃色固體生成，溶液顏色變為黃色。滴加完畢反應三小時後，減壓過濾。得到黃色固體，濾液呈黃色。用蒸餾水洗滌固體數次，固體顏色變淺。產品乾燥得到1.2g，產率76.5％，m.p.183℃。
實施例111，4-二[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]-苯磺醯的合成稱取1.6g硒氯固體放入小燒杯加26.5ml四氫呋喃，硒氯溶解。向250ml三口瓶中加入6.9ml四氫呋喃、與硒氯等摩爾量的4-氨基苯磺醯胺、1.68ml三乙胺，冰浴攪拌下通入氮氣。將硒氯滴入三口瓶，有黃色固體生成，溶液顏色變為黃色。滴加完畢反應三小時後，減壓過濾。得到黃色固體，濾液呈黃色。用蒸餾水洗滌固體數次，固體顏色變淺。熔點260℃-315℃實施例121，2-二[(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮-2-基)羰基]乙烷的合成稱取1.6g硒氯固體放入小燒杯加26.5ml四氫呋喃，硒氯溶解。向250ml三口瓶中加入6.9ml四氫呋喃、與硒氯等摩爾量的丁二醯胺、1.68ml三乙胺，冰浴攪拌下通入氮氣。將硒氯滴入三口瓶，有黃色固體生成，溶液顏色變為黃色。滴加完畢反應三小時後，減壓過濾。得到黃色固體，濾液呈黃色。用蒸餾水洗滌固體數次，固體顏色變淺。熔點280℃-320℃實施例13將本發明的上述化合物20mg，加入土溫80攪拌助溶後，加入注射用生理鹽水2ml，並使土溫80的最終濃度為0.1％，經過濾滅菌灌裝製成注射劑。
實施例14將本發明的上述化合物50mg與乳糖180mg，澱粉260mg，和硬脂酸鎂10mg混和均勻後，按常規工藝製成片劑。
本發明的化合物還可與其他藥學上可接受的賦形劑或載體按常規工藝製成口服液、膠囊或輸液等劑型，並可根據需要製成控釋或緩釋系統給藥。
實施例15化合物藥理活性研究一、上述合成化合物的體外抗腫瘤活性研究(一)體外細胞計數法觀察腫瘤細胞抑制率1.將本發明的化合物按如下方法配製藥液，在該方法中所使用的化合物為EbS-1 EIS EI Te 將上述三種化合物用DMSO溶解後，加入不含胎牛血清的1640培養基，將其稀釋成終濃度為50μM.L-1，500μM L-1的藥液，其中DMSO的最終含量少於0.1％(v/v)，且每個細胞孔的給藥體積為細胞懸液和藥液體積總和的1/10，即上述化合物的最終給藥濃度為5μM.L-1和50μM L-1。
2.細胞計數用96％酒精衝洗計數板後擦淨，另擦淨蓋片一張；把蓋片覆在計數板上面，使之微微移向一側，露出計數板臺面少許，把計數板平放在顯微鏡臺上，立即從計數板邊緣輕輕地加1-2滴的細胞懸液，使之充滿計數板和蓋片間空隙中。鏡下觀察可見細胞分散各處，健康細胞胞體完整，透明不著色，凡著色細胞均為不健康者。計算四角大方格內的細胞數，壓中線者只計算左線和上線者，右線和下線不計算在內。計數時間為給藥後24h、48h、72h。並按照公式1)-3)計算細胞數和化合物對細胞的抑制率。
1)細胞數/毫升原懸液＝4大格細胞總數/4×10000稀釋倍數2)細胞存活率％＝(加藥組細胞數/對照組細胞數)×1003)細胞增殖抑制率％＝[1-(加藥組細胞數/對照組細胞數)]×1003.實驗結果見表1和表2表1最終給藥濃度為5μM.L-1

表2最終給藥濃度為50μM.L-1

(二)SRB法和MTT法研究化合物對腫瘤細胞的生長抑制作用1.其中貼壁細胞採用SRB法，懸浮細胞採用MTT法來研究化合物對腫瘤細胞的生長抑制作用，所使用化合物藥液按上述方式配製。
2.SRB法取對數生長期的細胞(3-5×104cells/ml)，分別接種於96孔培養板中(180ul/孔)，置於37℃，5％CO2，飽和溼度的培養箱中培養24h後，加入20ul不同濃度的受試化合物，置於37℃，5％CO2，飽和溼度的培養箱中再分別繼續培養所需時間。細胞在加藥培養結束後，棄掉培養液，加入10％三氯醋酸(TCA)100ul並置於4℃冰箱，固定細胞1小時。棄掉細胞固定液後，用去離子水衝洗培養板小孔5遍。甩幹水後，將96孔板置於空氣中乾燥。每孔加入0.4％的SRB溶液(用1％HAC溶液配製)50μl，室溫放置10分鐘。棄掉多餘的SRB後，用1％的醋酸溶液衝洗96孔板5遍，去除未與蛋白結合的SRB。將96孔板甩幹後，置於空氣乾燥。每孔加入10mmol/L非緩衝Tris鹼液(PH10.5)150μl，完全溶解細胞結合的SRB。經平板搖床搖勻後，在TECAN SUNRISE Magellan 96 Well酶標儀(USA)的540nm處，測定每個小孔的OD值。
3.MTT法取對數生長期的細胞(3-5×104cells/ml)，分別接種於96孔培養板中(180ul/孔)，置於37℃，5％CO2，飽和溼度的培養箱中培養4-6h後，加入20ul不同濃度的受試化合物，置於37℃，5％CO2，飽和溼度的培養箱中再分別繼續培養所需時間。細胞在加藥培養結束後，每孔加入5mg/ml的MTT溶液(用滅菌1×PBS溶液配製)20μl，置於37℃，5％CO2，飽和溼度的培養箱中繼續培養4h。然後，將培養板置於離板機上，進行離心，3000r/min×30min。棄掉上清後，將培養板在避光的情況下，進行空氣乾燥。之後，每孔加入酸化異丙醇150μl，完全溶解活細胞生成的Formazan後，在TECAN SUNRISEMagellan 96 Well酶標儀(USA)的570nm處，測定每個小孔的OD值。
4.實驗結果的分析方法計算所用的測試孔OD值＝測試孔OD值-本底OD值(即完全培養基加MTT、SRB，無細胞)。重複孔的OD值為平均值±SD。
細胞存活率％＝(加藥細胞的OD值/對照細胞的OD值)×100
細胞增殖抑制率％＝[1-(加藥細胞的OD值/對照細胞的OD值)]×1005.本發明化合物對幾種腫瘤細胞的生長抑制作用結果小結

備註(1)上述各種腫瘤細胞來源於北京大學藥學院篩選中心。
(2)其中HL-60為人白血病細胞，也是懸浮培養細胞，Bel-7402為人肝癌細胞，Hela為人宮頸癌細胞，BGC823為人胃癌細胞，MDA-MB-435為人乳腺癌，PC-3MIE8為人前列腺癌。
二、本發明化合物的體外抗病毒活性研究
(一)EITe、EIIIS和EIIISe的體外抗病毒試驗HBV-DNA轉染人類肝癌細胞株Hep G2所建立的2.2.15細胞株能有效表達HBV複製的全部標誌，本實驗以2.2.15細胞株為靶細胞，通過檢測培養上清液中HBsAg和HBeAg的含量，檢測EITe、EIIIS和EIIISe的抗病毒作用，並觀察其他化合物的抗病毒作用。
將EITe、EIIIS和EIIISe加適量的DMSO溶解後，加入蒸餾水稀釋10倍後，製得所需濃度的化合物水溶液，經進行0.2um過濾除菌後對細胞給藥。
取生長良好狀態的2.2.15細胞，接種於24孔培養板，在37℃培養48小時後，換用含不同藥物濃度的培養液，每隔3天更換一次新鮮的含藥培養液(具體濃度見下表)，共兩次，給藥共計8天後收集上清液，-20℃保存，待檢HBeAg，同時測定藥物的細胞毒性。
上清液中HBsAg和HBeAg的檢測，於試驗8天時，吸取培養上清液採用ELISA測定(試劑盒購自英科新創科技有限公司)，按說明書所示方法檢測。抑制率(％)＝(對照孔A595-實驗孔A595)/(對照孔A595-2.1)×100％，ID50為HBeAg抑制率為50％時的藥物濃度。
通過MTT法測定細胞存活率以表徵藥物的細胞毒性。細胞存活率(％)＝實驗孔(A595-A650)/對照孔(A595-A650)×100％，CD50是實驗組存活細胞為對照組的50％時的藥物濃度。
用治療指數(Treaty IndexTI)評價受試藥物的抗-HBV活性，其中TI＝CD50/ID50。當TI＜1時，受試藥物為低效有毒，當1≤TI≤2時受試藥物有效有毒，當TI≥2.1時，受試藥物高效低毒，TI越大，則表明該藥物對HBV的抑制作用越強，細胞毒性小。本實驗對EITe、EIIIS和EIIISe的研究結果如下

結果分析EIIIS和EIIISe藥物HBsAg的TI＞2.1，說明二者藥物具有抑制細胞HBsAg的作用，而EITe的TI＜2.1，則可能無效。
三、上述合成化合物的體外抗菌研究將所合成一系列化合物送臨床藥理所進行臨床常見菌種抗菌活性實驗，所用測試方法是標準平皿二倍稀釋法(參考微生物檢驗技術，郭積燕 主編2001年)。實驗結果如下苯並異噻唑、苯並異碲唑衍生物的MIC結果 其中EbS-1對5株金黃色葡萄球菌的MIC值為8mg/L，具有抑菌作用。
權利要求
1.以下通式I或II的雙苯並異唑酮類化合物 其中R1和R2是相同或不同的，彼此獨立選自S，Se或Te；其中R是C1-C20線性或支化、飽和或不飽和的二價烴基，C6-C30亞芳基，C5-C20亞環烷基，C5-C20亞雜環基，含有碳環、雜環或芳環的C4-C30二價烴基，其中碳環、雜環或芳環可以位於鏈中或鏈端，有機基磺醯基，或羰基有機基羰基，所有這些基團是取代或未取代的，其碳鏈可以任意插入選自O、N和S中的一個或多個雜原子。
2.根據權利要求1的雙苯並異唑酮類化合物，其中R是(-CH2)n-，其中n是1-8；-(C6H4)n-，其中n是1-3；-(CH2)n-SS-(CH2)n-，其中n是1-3；-(CH2)n-NH-(CH2)n-，其中n是1-3；或-(CH2)n-O-(CH2)n-，其中n是1-4。
3.權利要求1-2任一所述的通式I或II化合物，選自1)1，2-二[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-乙烷；2)1，3-二[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-丙烷；3)1，4-二[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-丁烷；4)1，2-二[2-(1，2-苯並異碲唑-3(2H)-酮)]-乙烷；5)1-[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-2-[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]乙烷；6)1-[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-2-[2-(1，2-苯並異碲唑-3(2H)-酮)]乙烷；7)1-[2-(1，2-苯並異噻唑-3(2H)-酮)]-2-[2-(1，2-苯並異碲唑-3(2H)-酮)]乙烷；8)1-[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]-2-[2-(1，2-苯並異碲唑-3(2H)-酮)]乙烷；9)1，2-二[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)甲基]-二硫醚；10)1，4-二[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]-苯；11)1，4-二[2-(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮)]-苯磺醯；和12)1，2-二[(1，2-苯並異硒唑-3(2H)-酮-2-基)羰基]乙烷。
4.權利要求1所述的通式I或II化合物的製備方法，包括以下步驟將以下結構式III和IV的化合物 與結構式為H2N-R-NH2的化合物在-20℃到5℃的溫度下，在惰性溶劑中，在鹼性條件下，在惰性氣體保護下反應，其中R1和R2是相同或不同的，彼此獨立選自S，Se或Te；其中R是C1-C20線性或支化、飽和或不飽和的二價烴基，C6-C30亞芳基，C5-C20亞環烷基，C5-C20亞雜環基，含有碳環、雜環或芳環的C4-C30二價烴基，其中碳環、雜環或芳環可以位於鏈中或鏈端，有機基磺醯基，或羰基有機基羰基，所有這些基團的碳鏈可以任意插入選自O、N和S中的一個或多個雜原子。
5.根據權利要求4的製備方法，其中R是(-CH2)n-，其中n是1-8；-(C6H4)n-，其中n是1-3；-(CH2)n-SS-(CH2)n-，其中n是1-3；-(CH2)n-NH-(CH2)n-，其中n是1-3；或-(CH2)n-O-(CH2)n-，其中n是1-3。
6.權利要求1-3任一所述的通式I或II的化合物在製備抗腫瘤的藥物中的應用。
7.權利要求1-3任一所述的通式I或II的化合物在製備抗病毒藥物中的應用。
8.權利要求1-3任一所述的通式I或II的化合物在製備抗菌藥物中的應用。
9.一種用於抗腫瘤、抗病毒或抗菌的藥物組合物，其特徵在於含有藥學有效量的權利要求1-3任一所述的通式I和/或II的化合物和藥學上可接受的載體。
10.根據權利要求8所述的藥物組合物，其藥物劑型可選自片劑、膠囊、口服液、注射劑、輸液製劑或緩釋或控釋給藥系統。
全文摘要
本發明涉及雙苯並異唑酮類化合物的合成及其組合物的製備，以及雙苯並異唑酮類化合物的藥學用途，尤其在製備抗腫瘤、抗病毒和抗菌藥物中的應用。
文檔編號C07D275/03GK1594299SQ03156590
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月10日 優先權日2003年9月10日
發明者曾慧慧 申請人:北京大學藥學院