生產流感血凝素多價疫苗的方法

2023-05-29 01:55:56 2

專利名稱：生產流感血凝素多價疫苗的方法
背景技術：
一般來說，本發明屬於重組流感疫苗領域。
流感每年都發生，並且是世界範圍內顯著致病、致死的原因。兒童有最高的侵染率，而且對流感病毒在社會上的傳播負主要責任。老年人及有潛在健康問題的人對流感感染併發症和住院治療有較高的危險。只在美國，在1956和1988年間的七個流感季節內，每個感染季節由於肺炎和流感都有10,000多人死亡，有報告說2個季節中的每一個都有大於40,000人死亡(最新資料流感活動-美國及世界範圍，及1992-1993流感疫苗資料，致病致死周報，美國，健康及人類部門，公共健康服務中心，41/No.18315-323，1992)流感病毒是由2個表面糖蛋白，血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)組成的高度多型的顆粒。HA價導病毒與宿主細胞的結合及在病毒侵入細胞過程中病毒-細胞膜間的融合。流感病毒基因組由8條單鏈反義RNA片段組成，其中長度為第4的片段編碼HA基因。根據抗原差異流感病毒分為A、B和C型。流感A病毒通過包括亞型或型、地理來源、品系號及分離年代的命名法進行描述，如A/Beijing353/89。HA至少有13個亞型(H1-H13)，NA至少有9個亞型(N1-N9)。所有的亞型都發現於鳥中，但只有H1-H3和N1-N2發現於人類、豬和馬中(Murphy and Webster，「正粘病毒」，在《病毒學》中，編者Fields，B.N.，Knipe，D.M.，Chanock，R.M.，1091-1152(Raven出版社，紐約，1990))。
抗HA的抗體中和病毒並形成流感導致的感染的天然免疫的基礎(Clements，「流感疫苗」，在疫苗免疫學問題的新探索，編者RonaldW.Ellis，pp.129-150(Butterworth Heinemann，Stoneham，MA1992))。HA分子的抗原性變化造成了流感的頻繁爆發和利用免疫控制感染的局限性。
HA的三維結構以及與其細胞受體唾液酸的相互作用已被廣泛研究(Wilson，等，「在3A°解析度下流感病毒血凝素膜糖蛋白的結構」，自然，289366-378(1981)；Weis，等.，「與其受體唾液酸複合的流感病毒血凝素的結構」，自然，333426-431(1988)；Murphy andWebster，1990)。HA分子在病毒粒子中以三聚體形式存在。每一單體包括兩條鏈，HA1和HA2，由一個二硫鍵連接。受感染的宿主細胞產生一個分子量約為85,000的糖基化的多肽前體(HA0)，然後被裂解為HA1和HA2。
流感HA特異的中和IgG和IgA抗體的存在與其抗感染和疾病有關(Clements，1992)。滅活的完整病毒或部分純化的(分割的亞單位)流感疫苗以每株的HA含量標定。流感疫苗通常含有7到25微克從三種流感的每一種中得到的HA。
另一主要的表面糖蛋白NA在對流感的保護性抗體免疫和T-細胞應答中的作用還未確定。神經氨酸酶在純化和儲存過程中很不穩定(Murphy and Webster，1990)，並且目前的流感疫苗中NA的含量還沒有標準化。純化的HA而不是NA疫苗可以防止受流感攻擊的動物免於得病(Johansson，等.，「純化的流感病毒血凝素和神經氨酸酶在刺激抗體反應中是等價的但誘導相反類型的對感染的免疫」，病毒學雜誌，631239-1246(1989))。一種基於神經氨酸酶抗原的實驗性疫苗在對人的試驗中未發現有保護作用(Orga等，傳染病雜誌135499-506(1997))。
批准的流感疫苗由從兩種流感A亞型(H1N1和H3N2)和一種流感B亞型病毒得到的福馬林滅活的完整的或化學裂解的亞基製品組成。在每一流感季節之前，美國食品和藥品局疫苗和相關生物諮詢委員會為即將來臨的季節推薦一種三價流感疫苗的組合物。1992-93疫苗含有A/Texas/36/91-like(H1N1)，A/Beijing/353/89-like(H3N2)，和B/Panama/45/90病毒。FDA建議1993-94流感疫苗應包括相同的Texas和Panama株，以及一種新的流感ABeijmg株(A/Beijing/32/92)。
在每年流感季節之前，對高危人群接種疫苗是降低流感影響的最有效的措施。目前使用的疫苗的局限性包括低使用率、對老年人和兒童的效果差、產自雞蛋、抗原性改變以及副作用。
疾病防治中心(CDC)估計每年不到30％的流感易感個體接種了疫苗(MMWR，1992)。目前的滅活疫苗在疫苗的抗原和流行的流感病毒十分相近的情況下會對正常健康成年人產生高效的抗病保護性。在老年人中，對疾病的保護率要差得多，特別是對那些養老院中的老年人(Clements，1992)。在Powers和Belshe(傳染病雜誌167584-592(1993))的最近一項研究中，65歲或以上的受試者中不到30％觀察到對一種三價亞病毒粒子流感疫苗產生明顯抗體反應。
流感A和B疫苗的種子病毒在雞蛋尿囊腔複製成高效價的自然產生株。另外，流感A成分的病毒株是一種含有正確表面抗原基因的重配病毒。重配病毒是指由於病毒基因組的片段化而含有每一親本病毒株特徵的病毒。當不止一種流感病毒株侵染細胞時，這些病毒片段混合，產生含有來自雙親的各種基因分配的子代病毒。
使用目前完整的或割裂的流感疫苗的保護作用是短期的，並且隨著流行的流感病毒株的抗原漂變其保護性會逐漸消失。流感病毒產生抗原性漂變是對血凝素分子中具有胺基酸序列改變的病毒進行免疫選擇的結果。理想狀態下，疫苗病毒株與致病流感病毒株相符。但是，目前流感疫苗的生產過程因將病毒在具胚的雞蛋中繁殖而受到限制。不是所有的流感病毒株在雞蛋中都能很好地複製；因此病毒必須適應化或構建病毒重配子。與最初從感染個體分離的生長於哺乳動物細胞的流感病毒相比，產於雞蛋的流感病毒的血凝素出現廣泛的異源性(Wang，等.，病毒學171275-279(1989)；Rajakumar，等.，美國科學院學報874154-4158(1990))。在流感疫苗的選擇和生產過程中，HA的變化會產生具有抗原性明顯不同的病毒亞群的混合物。因此疫苗中的病毒會不同於流行株中的變種，導致低於最佳水平的保護。
有嚴重雞蛋過敏的人會對疫苗中殘留的雞蛋蛋白產生立即過敏反應。1976年的豬流感疫苗伴隨著Guillain-Barre綜合症頻率的增加。還未發現隨後的從其它流感病毒株製備的疫苗引起這一稀有疾病的發生。
一種不需在雞蛋中繁殖的生產流感疫苗的方法會產生更純的及引起有害免疫反應的可能性更小的產品。另外，純的疫苗製備物不需要病毒滅活或病毒膜組分的有機提取，因此避免抗原表面的變性和由疫苗中殘留化學物引起的安全顧慮。
另外，不需雞蛋繁殖生產的流感疫苗可以避免在雞蛋中適應和傳代引起的遺傳異質性。這樣會得到與流感病毒流行株更匹配的疫苗，產生更好的效果。
因此提供一種不需在雞蛋中複製的生產流感疫苗的方法是本發明的一個目標。
本發明的另一目的是提供一種迅速、花費有效、高度地生產流感疫苗的方法，它允許從流感的原始來源生產疫苗。
本發明概述本發明提供了利用杆狀病毒表達系統在昆蟲細胞中經表達製備重組流感血凝素蛋白的方法。所得到的蛋白在製備基於從具有流行潛力的流感病毒克隆的重組血凝素抗原混合物的多價流感疫苗中是有用的。重組血凝素蛋白是全長的、未裂解的(HAO)糖蛋白，包含在非變性條件下純化至95％或以上，優選為99％純度的HA1和HA2亞單位(HAO)。
還公開了一種利用特別設計的寡聚核苷酸探針和聚合酶鏈式反應(PCR)方法從流感A和B病毒克隆流感血凝素基因的方法。在優選的實施方案中，克隆的HA基因經刪除編碼天然疏水信號肽序列的核苷酸並代之以一條新的杆狀病毒信號肽進行修飾，產生一個編碼緊鄰血凝素的信號肽的序列。這種嵌合基因被引入杆狀病毒表達載體中，使得杆狀病毒多角體蛋白啟動子指導重組的HA蛋白在感染的昆蟲細胞中表達。18個胺基酸的杆狀病毒信號肽指導rHA的翻譯進入昆蟲細胞的糖基化途徑，而且它不存在於成熟的rHA糖蛋白中。在優選的實施方案中，設計了一種在信號肽和血凝素蛋白之間不編碼任何間插胺基酸的載體。
這種方法可以推廣到所有型的流感病毒，包括但不限於感染人類的流行性A(H1N1)亞型、A(H3N2)亞型和B型，以及感染其他哺乳動物和鳥類的流感病毒。
公開了一種有效提取和純化產於昆蟲細胞的重組HA蛋白的一般方法用於純化來源於A亞型和B型流感病毒的rHA蛋白。重組疫苗可以從流感的原始來源形成，例如從受感染個體的鼻分泌物，而不用是從適應和培養於雞蛋的病毒形成。這使得可以直接從流行流感病毒株快速形成疫苗，避免由病毒適應雞蛋培養而產生的問題以及病人對所產生的疫苗中的雞蛋汙染物產生的反應。
實施例證實了在含有從FDA為1993/1994和1994/1995流感流行季節推薦的三種流感病毒株純化的rHA抗原的免疫劑量形式中疫苗的配方和臨床效果。利用定量結合流感血凝素、阻斷流感病毒凝集血紅細胞的能力或中和流感病毒的抗體的試驗，測量了功能免疫性。在對易受流感感染的動物中或在人類的攻擊實驗中測量了rHA疫苗的保護性免疫應答。
附圖的簡要描述

圖1是從流感A株由純化的病毒RNA製品克隆HA基因，表達的rHA的純化以及rHA的生物學特性的圖解。
縮寫FDA，食品和藥品局；MDCK，Madin Darby狗腎；TPCK，甲苯磺醯苯丙氨醯氯甲酮；RNA，核糖核酸；cDNA，互補脫氧核糖核酸；HA，血凝素；FBS，胎牛血清；PCR，聚合酶鏈式反應；BV，杆狀病毒。
圖2是將圖1的方法用於克隆和表達流感A/Texas/36/91株的HA基因的更詳細的圖解。流感HA基因是從感染了流感A/Texas/36/91的MDCK細胞純化的RNA，利用逆轉錄酶和通用引物(SEQ ID N0.1)，接著經2輪PCR擴增和克隆獲得的。如圖所示，在第一輪PCR反應中，使用了5′末端引物SEQ ID NO.2和3′末端引物SEQ ID NO.3。在第二輪PCR反應中，使用了5′末端引物SEQ ID NO.4和3′末端引物SEQ ID NO.5。構建了一種杆狀病毒重組載體，該載體含有多角體蛋白啟動子和來源於杆狀病毒61K基因(分子量約為61,000的編碼信號肽的杆狀病毒基因)的信號肽序列，其後是完整的成熟HA蛋白的編碼序列。然後這一重組載體用於構建從本病毒株產生HA的杆狀病毒表達載體。
圖3是小鼠在第42天的抗HA免疫應答的圖示，n＝5，顯示了純rHA0-Fluzone_疫苗，rHA0鋁，在劑量為0.5μg(黑條帶)，0.1μg(陰影條帶)，0.02μg(點條帶)，0.004μg(空白帶)時的抗體滴度。
圖4a、4b和4c是用rHA或批准的三價疫苗，1994-1995配方免疫的小鼠抗HA的免疫應答，接種疫苗後的星期數對HAI A/Texas/36/91(圖4a)，HAI A/Shangdong/9/93(圖4b)，HAIB/Panama/45/90(圖4c)，rHA(菱形)和培養於雞蛋的FLUVIRON_減毒疫苗(方塊)的HIA滴度。
本發明的詳細描述描述製備重組流感疫苗的方法。利用培養的昆蟲細胞中的杆狀病毒表達載體生產從流感病毒得到的全長的、未被切割的(HA0)血凝素抗原，並在非變性條件下純化。將從流感A和/或流感B株純化得到的兩個或更多個血凝素抗原混合起來，產生多價流感疫苗。重組抗原可與一種輔助載體組合以增強效力。
利用重組DNA技術生產流感疫苗具有幾個優點重組DNA流感疫苗能在更安全和更嚴格控制的條件下進行生產；不需在雞蛋中感染流感來繁殖；重組HA蛋白能被更高度純化，實際上消除了由汙染蛋白引起的副作用；重組HA的純化過程不必包含病毒的滅活或有機提取病毒膜組分，因此避免了抗原的變性和疫苗中殘留化學物引起的其它安全顧慮；利用重組DNA技術生產HA避免了因在雞蛋中適應和傳代而產生的遺傳異源性，這會使疫苗更好地與流感流行株相匹配，導致其效力增強；重組方法還允許在該年的稍後時期進行病毒株選擇，使得有時間基於更可靠的流行病學數據進行選擇。
杆狀病毒表達系統杆狀病毒是Baculoviridae科的DNA病毒。已知這類病毒具有較狹窄的宿主範圍，主要局限於Lepidopteran種的昆蟲(蝴蝶和蛾)。杆狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)已成為杆狀病毒的原型，可在培養的敏感昆蟲細胞中高效複製。AcNPV有一條雙鏈閉合環狀DNA基因，約130,000bp，其宿主範圍、分子生物學及遺傳學特性都已比較清楚。
包括AcNPV的許多杆狀病毒在感染細胞的核內形成大的蛋白晶體包含體。一種稱為多角體蛋白的多肽約佔這些包含體蛋白質量的95％。在AcNPV病毒基因組中多角體蛋白基因以單拷貝存在。因為角體蛋白基因對病毒在培養細胞中的複製不是必需的，它可以很容易地被修飾用來表達外源基因。外源基因序列插入AcNPV基因中多角體蛋白啟動子序列3′端，使它受到多角體蛋白啟動子的轉錄控制。
利用杆狀病毒DNA和含有目的基因序列的嵌合質粒之間的同源重組構建表達外源基因的重組杆狀病毒。可以通過它們特殊的噬菌斑形態和噬斑純化成均一性的特徵檢測出重組病毒。
杆狀病毒特別適用於作為真核細胞克隆和表達載體。由它們的宿主範圍狹窄，只局限制於節肢動物的特性，因此通常是安全的。美國環境保護機構(EPA)已經同意使用三種杆狀病毒控制害蟲。在EPA實驗使用許可下，AcNPV已被用於作物許多年。
AcNPV野生型和重組病毒在各種昆蟲細胞，包括從秋季粘蟲Spodoptera furgiperda(Lepidoptera；Noctuidae)產生的連續細胞系中複製。S.frugiperda細胞的群體倍增時間為18到24小時，可在單層或游離的懸浮培養液中繁殖。
重組HA蛋白可在來自Lepidopteran種Spodoptera frugiperda的細胞中生產，但並不局限於此種細胞。其他可以被杆狀病毒感染的昆蟲細胞，如從Bombix mori、Galleria mellanoma、Trichplusia ni或Lamanthriadispar種得到的細胞，也可用作生產重組HA蛋白的合適的底物。
最優選的利用重組杆狀病毒生產蛋白的宿主細胞系是Sf900+。另一優選的利用重組杆狀病毒生產蛋白的宿主細胞系是Sf9。Sf900+和Sf9是從秋季粘蟲Spodoptera frugiperda(Lepidoptera；Noctuidae)產生的非轉化的、非致瘤的連續細胞系。Sf900+和Sf9細胞在28±2℃，不供應二氧化碳下繁殖。用於Sf9細胞的培養基是TNMFH，一種鹽、維生素、糖和胺基酸的簡單混合物，另加10％的胎牛血清。除了胎牛血清外，沒有其他動物衍生產品(即胰蛋白酶等)用於細胞繁殖。無血清的培養基(用作Sf900培養基，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)也可用於培養Sf9細胞，且優選用於Sf900+細胞的繁殖。
Sf9細胞的群體倍增時間為18到24小時，可在單層或懸浮培養液中繁殖。還沒有報導顯示S.frugiperda細胞支持任何已知的哺乳動物病毒的複製。
本領域的技術人員可以理解此表達載體不只局限於杆狀病毒表達系統。重組HA蛋白也可在其他表達載體如昆蟲痘病毒(昆蟲的痘病毒)、質型多角體病毒(CPV)以及用重組HA基因或組成型表達基因轉化的昆蟲細胞中表達。
流感病毒株的分離可從被疾病感染的個體中分離出一種或多種流感病毒株。優選的是，流感病毒株是被食品和藥物局(FDA)或CDC鑑定的在隨後的流感季節中有流行潛力的病毒株。本文描述的方法的優點是臨床樣品如受流感感染病人的鼻分泌物可用作病毒的直接原料。另外，這些也可從FDA或CDC得到。
流感病毒株的繁殖然後將病毒株在細胞中繁殖生產高病毒滴度，如Madin Darby狗腎(MDCK)細胞(可從美國典型培養物保藏中心獲得，保藏號為ATCCCCL34)。例如，在甲苯磺醯苯丙氨醯氯甲酮(TPCK)部分滅活的胰蛋白酶和能產生最高首代傳代病毒滴度的最佳胎牛血清濃度的存在下，感染MDCK細胞。以根據標準HA分析(Rosen，「血凝素與動物病毒」在《病毒學基礎技術》中編者K.Habel和N.P.Salzman，pp.276-28(學術出版社，紐約1969)，本文引用其教導)測定的低感染複數(0.1到0.5)用流感病毒株感染MDCK細胞。被感染細胞在33℃培育48小時，利用血凝活性分析檢測培養基中的病毒產量。能產生最高HA活性的條件被以後用來製備大批量流感病毒。
病毒的純化用已知的純化方法，如蔗糖密度梯度離心法，從培養基中純化從第一代產生的病毒顆粒。例如，在感染24到48小時後，離心流感感染的MDCK細胞的離心培養基收穫病毒。將所得的病毒沉澱重懸於緩衝液中，並通過蔗糖梯度緩衝液離心。在梯度的40-45％蔗糖區收穫流感病毒帶，用緩衝液稀釋，經過在100,000xg下離心沉澱。用緩衝液重懸純化的病毒沉澱，-70℃保存。
流感血凝素基因的克隆圖1顯示了克隆HA基因方法的概要。基本上，用要克隆的流感病毒株感染細胞。從細胞培養基中收穫病毒，分離出病毒RNA(對流感A株)或mRNA(對流感B株)。從純化的病毒顆粒中提取病毒RNA(-RNA)，用標準程序在甲醛瓊脂糖凝膠上分析。對流感A株病毒RNA用通用引物系統，或對流感B株mRNA用隨機引物合成cDNA。用對所有流感A和B病毒血凝素RNA片段都是同源的通用寡聚核苷酸引物(5′-AGCAAAAGCAGG-3′(SEQ ID NO.1))合成正標準互補DNA(cDNA)(Davis等.，「含流感病毒WSN株血凝素基因(HON1)的細菌克隆的構建和鑑定」基因，10205-218(1980))。設計出與流感血凝素基因5′和3′端保守區同源的引物。在5′和3′引物末端都含有血凝素基因內未發現的限制性酶切位點。
將合適的流感A或B引物和流感cDNA混合，用標準PCR程序擴增血凝素基因片段，所得的雙鏈DNA片段含有完整的編碼成熟血凝素的序列。用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增總HA基因，然後克隆到合適的細菌宿主如E.coli中。測定5′端序列以鑑定HA基因的信號肽，然後用PCR擴增不含信號肽的HA基因。其後將其亞克隆到含AcNPV多角體蛋白啟動子的質粒轉移載體中。所得的轉移載體含有以下5′-＞3′序列，來自杆狀病毒苜蓿銀紋夜蛾NPV的多角體蛋白啟動子，ATG翻譯起始密碼子，61K的杆狀病毒信號肽，成熟血凝素的編碼序列，天然血凝素翻譯終止密碼子，多角體蛋白RNA聚腺苷酸化信號，及側翼杆狀病毒DNA。
然後將含克隆的血凝素基因的純化的嵌合轉移質粒DNA與AcNPV野生型DNA混合，與鈣共沉澱，轉染進S.frugiperda細胞。根據噬菌斑形態選擇重組杆狀病毒，用附加的幾輪噬菌斑純化進行進一步純化。克隆的重組杆狀病毒進行血凝素表達篩選，其中一個杆狀病毒血凝素表達載體被選出生產主病毒庫。
流感病毒A株從純化的病毒RNA製品中克隆出來自流感病毒A株的HA基因。從含有1,000-2,000血凝素單位(HAU)的100-200微升純化的流感A病毒顆粒中提取病毒RNA。1HAU是在標準凝集分析中能凝集50％血紅細胞的病毒量(Rosen，1969)，用蛋白激酶K處理病毒顆粒以消化蛋白，然後用等體積苯酚和氯仿抽提病毒RNA，在tRNA載體的存在下用乙醇沉澱。重懸病毒RNA於緩衝液中，用不含RNA酶的DNA酶消化去除汙染DNA，然後重複提取和沉澱步驟。如Maniatis，等.，分子克隆實驗手冊.pp.86-96和366-367所述(冷泉港實驗室，冷泉港，紐約1982)，用甲醛瓊脂糖凝膠分析病毒RNA(vRNA)。
流感病毒B株從被流感病毒B株感染的細胞中提取的總信使RNA(mRNA)中克隆出來自流感病毒B株的HA基因。然後從感染細胞中提取總RNA。在硫氰酸胍的存在下裂解收穫細胞，純化細胞總RNA，如用PharmaciaBiotech Inc.(Piscataway，NJ)的RNA提取試劑盒。用寡聚(dT)-纖維素旋轉柱從細胞RNA中提取總mRNA，如用Pharmacia Biotech Inc.(Piscataway，NJ)的mRNA純化試劑盒。
昆蟲細胞中重組血凝素的表達和加工重組血凝素抗原在被AcNPV-血凝素載體感染的S.frugiperda細胞中高水平地表達。最初的基因產物是未加工的、全長血凝素(rHA0)，它並不分泌，只是附著在感染細胞的外周膜上。重組HA0是分子量為68,000的蛋白，具N-連接的糖基化，其聚糖為高甘露糖型，不同於在哺乳動物和鳥類細胞中病毒蛋白表達產生的聚糖。有證據顯示rHA0在翻譯後形成三聚體，聚焦在細胞質膜上。
HAO和其他蛋白的表達載體
HAO是一更好的疫苗，因為它比HAI/HA2複合物的穩定性更好，並在純化和保存的過程中能保持正確摺疊。這一優良的穩定性在B型病毒株中表現得特別明顯，這使其滴度比從商業獲得的減毒B病毒株高出約5倍。
如下面實施例中所述，當用限制性酶切位點將HA基因克隆到pMGS12時，HA成熟信號肽被去除，代之以杆狀病毒幾丁質酶信號肽，即61kD信號肽。由於HA基因與幾丁質酶信號肽通過切割位點連接，因此根據所選限制性位點的不同，成熟HAO蛋白和61kD信號肽之間有3到5個胺基酸。儘管對流感病毒A株沒有問題，但B株表達的帶有添加的幾個胺基酸的HAO不能正確摺疊。
已有兩種方法克服這一問題。第一種是使用另一種新載體pMGS3，它不編碼61kD信號肽。將具有原始信號肽的HAO克隆到這個載體上，然後表達。當用SDS-PAGE鑑定時，用此載體表達的B株HAO顯示出比在pMGS12上表達時更好的糖基化和加工。HAO摺疊得很好，能從數量上轉化成HA1/HA2。遺憾的是根據Western印跡檢測，其產量不高。第二種方法利用pMGS12的61kD信號肽指導不用限制性酶插入的HA基因的表達增加了產量。這一新載體包含61kD信號肽和HAO基因，不含編碼外來插入胺基酸的序列，被稱為pMGS27。
pMGS27可被用來在杆狀病毒表達系統中克隆和表達任何基因。目的基因不是通過限制性酶切和連接克隆到載體上，而是通過退火克隆到載體上。試劑是從Clontech在其PCR-指導克隆體系中得到的。pMGS27被設計成可在幾丁質酶信號肽編碼區末端線性化，用T4DNA聚合酶加dATP處理線性化的pMGS27，形成兩條長單鏈尾部。
以一對設計成產生用T4DNA聚合酶和dTTP處理PCR片段後與處理的pMGS27的尾部互補的單鏈尾部的寡核苷酸，用聚合酶鏈式反應(「PCR」)或反轉錄-PCR(「RT-PCR」)擴增目的基因。然後簡單的退火可將兩分子結合為適於轉化宿主的環狀質粒。除了比傳統限制性酶切-連接法將HA基因克隆到pMGS12更迅速和簡單外，pMGS27還具有重要的優點，它不產生由幾丁質酶信號肽和成熟HA蛋白之間產生的限制性酶切位點編碼的多餘的胺基酸。這些多餘胺基酸有時會帶來一些困難，使信號肽酶不能切除信號肽，或象在B株HA中那樣，所編碼的蛋白不能正確摺疊。
重組HA0的純化感染幾天後，可以用非變性、非離子去垢劑或其他本領域技術人員已知的用於從昆蟲細胞中純化重組蛋白的方法，包括但不限於親合或凝膠層析、抗體結合，從被AcNPV-血凝素感染的細胞的外周膜上選擇提取rHA0。進一步用DEAE離子交換和lentil凝集素親合層析或其他本領域技術人員已知的相應方法純化可溶於去垢劑的rHA0。
在優選的實施方案中，使用更溫和且從流感病毒B株中得到更高產量的rHAO的方法純化rHAO。此方法大致如下用pH值為9.5到10.5的相對粘滯的鹼溶液抽提細胞，從可溶性蛋白、外周膜蛋白和大部分DNA和RNA中分離形成昆蟲細胞膜內在部分的HAO蛋白。當含有濃度約為250mM的蔗糖時，粘度增加。以有效防止混合物中蛋白的二硫鍵形成的濃度。加入二硫鍵還原劑，如β-巰基乙醇將細胞懸浮於提取緩衝液，勻漿，然後離心。在鹼性pH(電導性一般小於1mS，pH10.5)下含二硫鍵還原劑的低離子強度緩衝液中經勻漿洗滌沉澱，然後離心。從含0.3到1.5％去垢劑如Triton，一定量的能有效阻止因電荷相互作用形成複合物的解凝聚劑，如鹼性pH下(優選9.5)0.3到1.0M甜菜鹼或paurine的緩衝液的沉澱中提取HAO。然後用陰離子交換層析隨後用陽離子交換層析純化上清中的HAO。在用含約1/10濃度的去垢劑和二硫鍵還原劑的緩衝液平衡柱後，將HAO過陰離子柱，如DEAE或Q-Sepharose_(一種帶季胺集團的瓊脂糖珠柱)，使用與提取相同的緩衝液，但是要用另外的緩衝液稀釋至少1∶2。然後降低pH值到約為8.5，洗脫HAO。將洗脫的HAO使用基本相同的緩衝液過陽離子交換柱，降低pH到約7.4，洗脫雜質。增加鹽濃度到0.15M NaCl，洗脫HAO。
這一優選的純化方法將在下面詳細敘述。
含重組HA的膜碎片的製備。將表達重組HA的細胞(來自於0.34L培養物的6.2g細胞)以100mg/mL懸浮於冰冷的100mM焦磷酸鈉，100mM氯化鈉，250mM蔗糖，0.1％β-巰基乙醇，pH10.5的緩衝液中。用polytron_勻漿器(Brinkman Instruments Inc.，Westbury，NY)在4檔破碎細胞2分鐘。需用鹼性勻漿介質以增加雜質蛋白的可溶性及膜製品的純度。勻漿液在9.200g下離心30分鐘。棄上清，收集沉澱。隨後用低離子強度緩衝液洗滌膜餾份製品。沉積重懸於初始體積的冰冷的0.1％β-巰基乙醇，10.5中，用Polytron_勻漿器在4檔勻漿2分鐘。勻漿液在9.200g下離心30分鐘。棄上清，收集沉澱。這次低離子強度洗滌去除了外周膜蛋白的多餘部分。所得膜餾份製品明顯富集了重組HA，去除了汙染的核酸。
重組HA的提取。在不使抗原變性的條件下，從膜沉澱中選擇提取重組HA。在41mL冰冷的10mM乙醇胺pH9.5，1％Triton N101，0.1％β-巰基乙醇，25mMNaCl，40mM甜菜鹼中，用Polytron勻漿器在4檔勻漿膜沉澱2分鐘。在23℃培養40分鐘後，在9.200g下離心混合物30分鐘。將含重組HA的上清傾析，然後用相同緩衝液2倍稀釋。
用SDS聚丙烯醯胺凝聚電泳分析蛋白。在2％十二烷基磺酸鈉(SDS)和5％β-巰基乙醇存在的條件下，在沸水浴中破壞樣品10分鐘。然後用含0.1％SDS的11％的聚丙烯醯胺凝膠電泳，用考馬斯藍染色。
層析純化。簡化重組HA的層析純化，使用Lentil凝集素瓊脂糖凝膠的昂貴的親合層析被一種兩步的層析純化過程所代替，此法能製備未變性的、適於作為用於人的流感疫苗組分的高純度重組HA抗原。所使用的層析凝膠基質是Pharmacia Q-Sepharose_Fast Flow和CM-SepharoseFast Flow_。
陰離子交換層析。所有層析都是在室溫下進行。將如上所述製備的含重組HA的提取物以1mL/分過Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow_柱(C10/10 Pharmacia柱中含5mL)，柱先用10mM乙醇胺pH9.5，0.1％Triton_N101，0.01％β-巰基乙醇，25mM NaCl，400mM甜菜鹼平衡。然後用平衡緩衝液洗滌柱至流出液的UV吸收降至基線。在這種條件下，重組HA結合在柱上，而雜質部分流出。然後用30mM二乙醇胺pH8.5，0.1％Triton_N101，0.01％β-巰基乙醇，25mM NaCl，400mM甜菜鹼洗脫部分純化的重組HA。
陽離子交換層析。用30mM二乙醇胺pH8.5，0.1％Triton_N101，0.01％β-巰基乙醇，10mM NaCl，400mM甜菜鹼兩倍稀釋Q-Sepharose洗脫液(23mL)。然後用35mL 10mM磷酸鈉pH7.4，0.1％Triton_N101，0.01％β-巰基乙醇，10mM NaCl，400mM甜菜鹼洗柱。這種處理使雜質從柱中洗脫，而重組HA仍結合在CM瓊脂糖上。然後經過用10mM磷酸鈉pH7.4，10mM NaCl洗柱至流出液的UV吸收降至基線來除去去垢劑。用磷酸鹽緩衝液pH7.5(PBS)洗脫純化的重組HA。
將純化的rHA0重懸於等滲的緩衝溶液中。去除去垢劑後，純化的rHA0能有效地凝集血紅細胞。
重組HA0的結構和生物特性將rHA0純化至至少95％純度，優選為99％。在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上其遷移主要為單一的分子量為68,000的多肽。用電子顯微鏡技術、胰蛋白酶抗性、密度沉積分析和凝集紅細胞能力檢測純化的重組HA0抗原的四級結構。這些數據顯示重組HA0形成三聚體，組裝成花結。
純化的rHA0在去除去垢劑之前不能凝集細胞，這表明為了交聯雞血紅細胞，抗原必須形成複合物(花結結構)。純化的rHA0凝集細胞的定量能力可用來測量抗原的相對應的稠度。1血凝素單位被定義為在用雞血紅細胞做標準血凝素分析時，凝集50％時所需的抗原數量。比較數據表明，純化的rHA0抗原凝集血紅細胞的能力與用完整流感病毒顆粒觀察到的相當。
重組HA0可在二硫鍵處被裂解，引起構象改變，形成兩條鏈HA1和HA2，如Carr，C.M.和Kim，P.S.，「流感血凝素構象改變的跳躍負荷機制」，細胞73823-832(1993)所述，此文已編入本文的參考文獻中。在下文實施例6中對重組HA0的裂解有更詳細的描述。可以確信，天然HA0被裂解為HA1和HA2後，由於獲得與細胞融合的能力，而具有感染性，從而產生增強的免疫應答。抗原如流感血凝素的加工經過抗原肽與主要組織相容性(MHC)分子的結合進行。抗原/MHC複合物被T細胞識別，啟動免疫應答，如Harding和Geuze的綜述所述，CurrentOpinion in Cell Biology 5596-605(1993)，此文已編入本文的參考文獻中。然而，作為完整的分子，在杆狀病毒中生產的rHAO是高度穩定的和有免疫原性的。對在昆蟲細胞中表達的HAO上的糖分子進行比較表明該聚糖與在哺乳動物或鳥類細胞中表達的HAO是不同的。
融合蛋白的製備當第二蛋白的抗原性較低或具有引起對多種抗原的免疫應答的優點時，可製備HAO與此第二抗原蛋白融合的融合蛋白。一種優選的第二抗原的例子是流感病毒產生的神經氨酸酶。此抗原可由細胞、病毒、或細胞蛋白，或包括至少5到8個胺基酸的其抗原性部分組成。其他抗原包括B型肝炎抗原、HIV抗原和癌胚抗原。本文所用的「免疫應答」是指用產生的針對抗原的抗體測量的體液應答，或用介導的針對抗原的應答的T細胞釋放測量的細胞應答。在一些情況下，可在HA和抗原之間插入無抗原性的胺基酸「接頭」，與HA相比進一步增加了抗原的抗原性。這一過程包含構建一種DNA質粒，用於使用寡聚核苷酸探針和聚合酶鏈式反應(PCR)方法，融合目的抗原基因和全長或部分流感病毒HA基因。
經去除天然疏水信號肽序列並代之以新的杆狀病毒信號肽來修飾HA目的抗原融合基因使其在昆蟲細胞能正確表達。將融合基因插入杆狀病毒表達載體，使杆狀病毒多角體啟動子指導融合蛋白在感染的昆蟲細胞中的轉錄。18胺基酸的杆狀病毒信號肽指導HA目的抗原融合多肽的翻譯進入昆蟲細胞糖基化途徑，但其不存在於成熟的融合蛋白。
例如，質粒pA9440包含存在於如下所述的杆狀病毒轉移質粒pMGS12中的A/Beijing/32/92株HA基因，用它作為模板，使用提供者(Gene Amp PCR Cloning Kit，Perkin Elmer Cetus)推薦的方案，用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增HA基因。PCR反應混合物(100μl)含有設計成使部分HA基因退火的20pmol引物。5′和3′引物末端設計有HA基因內部沒有的限制性核酸內切酶位點，HA0和HA1片段的5′PCR引物(O-567)開始於天然HA基因編碼序列5′端下遊52鹼基對。刪除天然信號肽序列，5′端緊接HA編碼序列插入一個SmaI位點。HA2片段的5′PCR引物(O-651)開始於天然HA基因1108核苷酸處，緊接在編碼精氨酸殘基的密碼子後，在HA0裂解為HA1和HA2時，此殘基被去除。HA0和HA2片段的3′PCR引物(O-680)設計成在緊接HA編碼序列後加入一個kpnI位點，去掉天然終止密碼子。HA1的3′PCR引物(O-679)截短了緊靠在HA0裂解時去除的精氨酸殘基之前的基因。HA基因片段的擴增進行30次循環，每次包含94℃下變性1分鐘。55℃下引物退火2分鐘，以及72℃下延長2分鐘。擴增後的HA基因片段進行瓊脂糖凝膠電泳，用GeneClean試劑盒(Bio101，Inc.)從凝膠中純化，連接到設計成接受PCR擴增片段的質粒(pCRII；Invitrogen)上。這樣就得到分別含有HA0、HA1或HA2基因片段的質粒pB142、pB144和pB330。
用SmaI和KpnI限制性酶從質粒pB142、pB144和pB330上切去HA基因片段，然後用標準重組DNA技術(Sambrook等.，1989)亞克隆到AcNPV轉移質粒pMGS12上。pMGS12質粒從5′到3′包含AcNPV多角體啟動子，一個ATG起始密碼子，一個編碼來源於分子量為61,000的杆狀病毒糖蛋白(61K)的可切割信號肽的序列，SmaI和KpnI限制性酶克隆位點，以及一個TAA通用終止密碼子序列。這些調節區域側翼是AcNPV基因組的EcoRII片段的DNA(Summers和Smith，「杆狀病毒載體和昆蟲細胞培養程序的方法手冊」，德克薩斯農業實驗站公告號，1555(1987))。用SmaI和KpnI切除pCRII克隆載體的克隆的HAPCR片段，用瓊脂糖凝膠電泳和Gene Clean試劑盒純化，並連接到同樣用SmaI和KpnI消化的pMGS12上。所得AcNPV轉移質粒pB879、pB1201和pB1205分別含有編碼HA0、HA1或HA2的區域。這些區域與來自於61K基因的可裂解的杆狀病毒信號肽和多角體啟動子在閱讀框內相連。AcNPV轉移質粒pB879、pB1201和pB1205可用來將HA0、HA1或HA2與任何感興趣的基因融合。
構建HA-CEA融合基因轉移質粒的第二步是將CEA編碼序列插入到HA編碼結構中。在質粒pA9080PCR擴增時，在CEA基因兩端加入SmaI和KpmI的限制性內切酶識別/切除位點。5′PCR引物，O-649，起始於離基因5′端82鹼基對處，刪除了原始CEA信號肽序列。3′PCR引物、O-650，設計成刪除了編碼C-末端區域疏水序列的該基因3′端最後72個鹼基對。CEA基因片段的擴增進行30次循環，每次包含94℃下變性1分鐘，55℃下退火2分鐘，以及72℃下延長2分鐘。所得的擴增的CEA基因片段進行瓊脂糖凝膠電泳，用GeneClean方法純化，按照生產廠家的使用說明，連接到pCRII(Invitrogen)上。所得質粒，pB806，包含CEA基因，此基因不含原始信號肽、C-末端疏水域或終止密碼子，但在該基因兩端都含有SmaI和KpnI位點。
大量製備質粒pB806，用SmaI或KpnI消化DNA。用瓊脂糖凝膠電泳和GeneClean試劑盒純化CEA編碼片段，然後將純化片段連接到每個用相同限制性酶切過的編碼HA構建體(pB879、pB1201或pB1205)中。例如，將具有SmaI酶切末端的CEA編碼片段分別與用SmaI酶切的HA0-、HA1-和HA2-編碼構建體(pB879、pB1201和pB1205)連接，分別得到質粒pB1250、pB1555和pB1584。將具有KpmI酶切末端的CEA編碼片段與用KpnI酶切的HA0-、HA1和HA2編碼構建體連接，得到質粒pB1264、pB1564和pB1593。在SmaI位點插入CEA基因，使CEA編碼序列位於HA編碼序列的下遊。對所有的構建體，設計PCR引物時使CEA基因與HA插入閱讀框內，融合基因的翻譯將終止在KpnI位點下遊pMGS12載體序列的通用翻譯終止信號處(TAATTAATTAA)(序列號No.4)。
這種構建體可以通過刪除在如下所述的信號肽和HAO之間或HAO和融合基因之間的間插胺基酸得到改善以提高摺疊和免疫原性。
疫苗的製備和包裝利用流感疫苗領域技術人員所知的方法和材料，可將rHA單獨或與其他流感抗原一起進行製備和包裝。在優選的實施方案中，將來自兩種A株和一種B株的HA蛋白結合組成一種多價疫苗。
在特別優選的實施方案中，以有效提高對HA蛋白的免疫應答的量，將這些HA與一種佐劑結合。目前，廣泛用於人的唯一佐劑是釩(磷酸鋁或氫氧化鋁)。用於研究及獸醫應用的皂苷及它的純化組分OuilA.Freund′s完全左劑和其他左劑因為其毒性限制了它們在人類疫苗中的有效應用。但是，一些在化學上新限定的製品也應該是有用的，例如胞壁醯二肽、單磷醯脂A、如本文參考文獻包括的Goodman-Snitkoff等，免疫學雜誌147410-415(1991)所述的磷脂偶聯物、如本文參考文獻包括的Miller等，實驗方法雜誌1761739-1744(1992)所述的包含於蛋白脂質體內的蛋白膠囊、包含在脂微囊如NovasomeTM脂微囊(MicroVescular Systems，Inc.，Nashua，NH)的蛋白膠囊。
在優選的實施方案中，疫苗以單劑量包裝用於非腸道(即肌肉內、皮內或皮下)用藥或鼻咽(即，鼻內)用藥免疫。如在隨後的實施例中所述確定了有效的劑量。載體一般為水或緩衝鹽水，含或不含防腐劑。可將抗原凍幹，服用時重懸，或製成溶液。
載體還可使用高分子緩釋系統。在製備可有效控制抗原釋放的疫苗時，合成高分子特別有用。一個較早的例子是據Kreuter，J.報導(Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology，M.Donbrow(Ed).CRC Press.p.125-148)的將甲基異丁烯酸聚合成直徑小於1微米的小球，稱為納球。對流感病毒感染的抗體反應及保護明顯比服用結合有氫氧化鋁的抗原要好。用其他微粒所做的實驗證明，這些高分子的輔助作用效果與微粒的大小和疏水性有關。
微膠囊已被用於微囊包含的藥物的注射，使藥物受控釋放。許多因素影響微膠囊高分子的選擇。合成高分子的再生性和微膠囊化過程，微膠囊原料和生產過程的費用，毒性分布，各種釋放的動力學要求，以及高分子與抗原的物理化學相容性都是需要考慮的因素。有用的高分子的例子有聚碳酸酯、聚脂、聚氨基甲酸乙酯、polyorthoesters和聚醯胺，特別是那些可被生物降解的。
藥物經常使用的、最近被用於抗原的載體是聚(d，1-Iactide-co-glycolide)(PLGA)。這是一種可生物降解的聚脂，長期以來被醫學上用來進行可降解性縫合、骨託架和其他臨時性修復、未表現出任何毒性。許多藥物包括肽和抗原配製進PLGA微膠囊中。有關PLGA用於抗原的可控釋放改變的數據已有所積累，如Eldridge，J.H.，等的綜述CurrentTopics in Microbiology and Immunology，1989，14659-66。口服時，將抗原包於直徑為1到10微米的PLGA的微球內，具有明顯的輔助作用。PLGA微膠囊化經過一個油包水乳化分離階段。將目的複合物製成水溶液。PLGA則溶於合適的有機溶劑如亞甲基氯和乙酸乙酯。這兩種不互溶的溶液在高速旋轉下共乳化。然後加入此高分子的非溶劑，使包裹在水滴周圍的高分子沉澱，形成胚肽形微膠囊。收集微膠囊，用一類試劑(聚乙烯醇(PVA)，明膠，藻酸鹽，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，甲基纖維素)之一使其穩定，經真空乾燥或抽提去除溶劑。
參考以下非限制性的實施例可對本發明有進一步的了解。
實施例1流感病毒的繁殖和純化從雞蛋尿囊液的FDA中獲得以下流感疫苗株A/Beijing/353/89-like(H3N2)A/Beijing/32/92-like(H3N2)A/Texas/36/91-like(H1N1)B/Panama/45/90為繁殖從FDA得到的流感病毒原種，在TPCK處理的胰蛋白酶(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)和能獲得最大滴度第一代病毒的最適濃度的胎牛血清的存在下，感染MDCK細胞。依據標準HA分析實驗(Rosen，「用動物病毒的血細胞凝集作用」，在《病毒學基礎技術》，編者K.Habel和N.P.Salzman，pp.276-28(學術出版社，紐約1969))，用流感病毒株以低感染複數(0.1到0.5)感染MDCK細胞。被感染的細胞在33℃下培養48小時，用血細胞凝集反應活性分析法測量培養基中的病毒產量。產生最高HA活性的條件被用來製備大量流感病毒。對以上流感病毒的最適TPCK胰蛋白酶和胎牛血清濃度列於表1。
表1.最適TPCK胰蛋白酶和胎牛血清濃度
流感病毒的純化感染24-48小時後，經澄清流感感染的MDCK細胞的培養基(1,000×g，10分鐘)從10T175組織培養瓶中收穫病毒。100,000×g離心1小時，從培養基中沉澱病毒。所得病毒沉澱重懸於1ml pH7.4的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中，在20ml 20-60％(w/v)PBS蔗糖梯度中離心。在40-45％蔗糖梯度區收穫流感病毒帶，用PBS稀釋，100,000×g沉澱。純化的病毒沉澱重懸於0.5ml PBS，-70℃下保存。
實施例2流感病毒A/Texas/36/91 HA基因的克隆圖2顯示了一個流感病毒HA基因的克隆步驟的具體實施例。如上所述提取從CDC得到的流感A/Texas/36/91病毒RNA。使用與流感RNA片段3′端5′-AGCAAAAGCAGG-3′(SEQ ID NO.1)互補的通用引物，用Moloney鼠白血病病毒(M-MuLV)逆轉錄酶合成流感cDNAs。用Pharmacia Inc.提供的首鏈cDNA合成試劑盒中的M-MuLV逆轉錄酶，以純化的病毒RNA或mRNA(5μg)為模板，合成cDNA。用於來自流感病毒A株病毒RNA的cDNA的引物是合成的寡聚核苷酸引物(5′-AGCAAAAGCAGG-3′)(SEQ ID NO.1)，它同所有病毒顆粒HA基因片段3′末端同源。
用聚合酶鏈式反應(PCR)在標準反應條件下(Gene Amp kits；Cetus/Perkin Elmer，Norwalk，CT)，從cDNA擴增HA基因。PCR反應混合物(100μl)含有20pmol引物，根據表2所示從GeneBank DNA數據資料查到的共有序列確定該引物對流感病毒A(H3)或A(H1)或流感B株HA基因5′和3′末端具有特異性。擴增進行30次循環，每次包含94℃下變性1分鐘，55℃下引物退火2分鐘，以及72℃下延長2分鐘。PCR產物在克隆前進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，以確定其正確大小。
在PCR中使用HA基因5′端PCR引物5′-GGG GGT ACC CCCGGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA AAA-3′(SEQ ID NO.2)及HA基因3′端引物5′-GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/TACT CCA TGG CCC-3′(SEQ ID NO.3)，產生全長的HA基因。
從基因5′端設計一種新的5′PCR引物無信號序列5′端5′-GGGGGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GGC TAC CAT-3′(SEQ ID NO.4)及基因的3′端5′-GA AAC GTC ACG TCT TATACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3′(SEQ ID NO.5)。在PCR中使用這些引物產生無信號肽序列的HA基因。然後將其插入用KpnI酶切的TA載體中。然後將用於杆狀病毒表達的61K信號肽和多角體蛋白啟動子插入含無流感病毒信號肽序列的HA基因的TA載體中。所得杆狀病毒重組載體含有多角體蛋白啟動子，61K杆狀病毒信號肽和流感病毒A/Texas/36/91的HA基因。
從被流感病毒B株B/Panama/45/90感染的MDCK細胞中提取總信使RNA(mRNA)，從中克隆來自流感病毒B株的HA基因。從5瓶T175培養瓶被感染的細胞中製備總RNA。在硫氰酸胍的存在下，裂解收穫的細胞，如上所述純化總細胞RNA。如上所述，用寡聚(dT)纖維素旋轉柱從細胞RNA中提取總mRNA。
用於來自流感病毒B株的mRNA的引物是隨機寡聚核苷酸DNA引物(Pharmacia，Inc.)。
表2. PCR擴增使用的引物
有一例cNDA合成產物使用流感病毒A/Texas/36/91病毒RNA為模板。編碼流感病毒蛋白的cDNA片段的位置可用以下步驟確定。將純化的病毒RNA與通用單鏈DNA引物5′-AGCAAAAGCAGG-3′(SEQ IDNO.1)在反應混合液中結合。如上所述，這一引物與流感病毒顆粒片段的3′端互補。反應還包括加入[α-32P]dCTP，以觀察在1.5％鹼水解凝膠(Maniatis，et al.，1982)上分離的cDNA產物，並曝光到X-OMAT-A膜上。
實施例3克隆HA基因到細菌質粒上用TA克隆系統(Invitrogen，Inc.)將PCR擴增的rHA基因克隆到pUC-類質粒載體上。經過用限制性酶切分析經標準方法(Maniatis，等.，1982)純化的質粒DNA，證實HA基因的存在。然後對rHA基因的5′端進行DNA序列分析，設計出去除了編碼HA蛋白N末端疏水信號肽序列的新引物。然後用表2中所列的特異性5′和3′寡聚核苷酸引物對cDNA產物進行PCR擴增，並用標準克隆方法克隆到E.coli TA質粒載體(Invitrogen，Inc.)上。所得DNA克隆包含編碼成熟HA的序列。
用標準方法(Maniatis等.，1982)將來自A/Texas/36/91，A/Beijing/353/89，A/Beijing/32/92和B/Panama/45/90的rHA基因亞克隆到杆狀病毒表達載體中。用適當的限制性酶將HA基因從TA克隆質粒切除，純化的HA DNA片段被插入杆狀病毒重組質粒中。所得細菌克隆用氨苄青黴素抗性篩選，然後用限制性酶切，釋放插入的HA基因，以確定其存在。用氯化銫-溴化乙錠梯度法(Maniatts，等.，1982)純化含有HA基因的重組質粒。對質粒5′端進行測序，以確定存在正確的杆狀病毒信號(AcNPV多角體蛋白啟動子，ATG翻譯起始信號和杆狀病毒信號肽序列)以及HA編碼序列位於正確的讀碼框內。HA基因5′端DNA序列和側翼AcNPV多角體蛋白啟動子及杆狀病毒信號肽(每個胺基酸序列的前18個胺基酸殘基)列於序列表中。
SEQ ID NO.6編碼A/Bei.jing/32/92的HA基因5′端序列(序列範圍1-481)。SEQ ID NO.7是相應胺基酸序列(從SEQ ID NO.6的起始密碼子「ATG」[核苷酸21]開始)。61K信號肽的胺基酸序列見SEQ ID NO.7的1-18個胺基酸。
SEQ ID NO.8編碼A/Texas/36/91的HA基因5′端序列(序列範圍1-481)。SEQ ID NO.9是相應胺基酸序列(從SEQ ID NO.8的起始密碼子「ATG」[核苷酸21]開始)61K信號肽的胺基酸序列見SEQ ID NO.9的1-18個胺基酸。
SEQ ID NO.10編碼B/Panama/45/90的HA基因5′端序列(序列範圍1-434)。SEQ ID NO.11是相應胺基酸序列(從SEQ ID NO.10的起始密碼子「ATG」[核苷酸21]開始)。61K信號肽的胺基酸序列見SEQID NO.11的1-18個胺基酸。
在SEQ ID Nos6，8和10中，核苷酸1-20是多角體蛋白啟動子3′端，核苷酸21-74編碼61K信號肽，核苷酸75以後編碼HA基因的5′端。
實施例4重組HA在昆蟲細胞中的表達純化含有克隆HA基因的嵌合重組質粒，取2μg與1μgAcNPV野生型DNA混合。將NDA與鈣共沉澱，用標準方法(Smith，Summers和Fraser，分子和細胞生物學32156-2165(1983))轉染進S.frugiperda細胞。通過噬菌斑形態鑑別重組杆狀病毒，然後再用幾次噬菌斑純化法進一步純化。篩選表達rHA的經噬菌斑純化的重組杆狀病毒，選出一個杆狀病毒表達載體，進行進一步的實驗。
用含有來自流感病毒株B/Panama/45/90的HA基因的杆狀病毒載體感染S.frugiperda細胞。感染24、48和72小時後，用25μCi[32S]甲硫氨酸脈衝1×106細胞，標記合成的蛋白。收集細胞，在有0.1％SDS的11％聚丙烯醯膠凝膠上分離蛋白。在X-OMAT-AR膜上曝光，檢測被放射性標記的蛋白。蛋白標準位置及其大小(千道爾頓kd)顯示，在感染48和72小時後，85kd重組HA蛋白是細胞合成的主要蛋白之一。
實施例5重組HA的製備和純化杆狀病毒表達載體A8611含有流感病毒A/Beijing/353/89的基因，其製備基本類似於如上所述在多角體蛋白啟動子控制下A/Beijing/32/92血凝素的製備。用它感染S.frugiperda細胞。在加有10％胎牛血清的TNMFH培養基中(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)，於27℃培養細胞至濃度為1×106細胞/mL，用A8611重組杆狀病毒感染，感染複數(MOI)為1。感染期間，在杆狀病毒多角體蛋白啟動子的轉錄控制下，產生流感病毒A/Beijing/353/89血凝素。感染72小時後，3,400xg離心15分鐘，收穫細胞，在無血清的TNMFH培養基中重懸清洗，然後在10,400xg下離心30分鐘。棄上清，於-70℃保存感染的細胞沉澱。
已形成了一種在不使抗原變性的條件下，從感染細胞中選擇提取重組HA的方法。除非註明，所有提取過程都在4℃進行。將從0.5L培養液中得到的細胞沉澱(約5×108細胞)在40mL冰冷的30mM Tris-HCl，pH8.4，25mM LiCl，1％(V/V)Tween-20，1mg/mL亮抑蛋白酶肽中，使用PolytronTM勻漿器(Brinkmann Instruments Inc.Wesbury，NY)破裂2分鐘。勻漿液在9,200xg下離心30分鐘。棄上清，收集沉澱。進一步從昆蟲細胞中去除了可溶性和膜周邊蛋白，而保留了如rHA的膜內在蛋白。為提取rHA，將沉澱在40mL冰冷的30mMTris，10mM乙醇胺，pH11，25mM LiCl，2％Tween-20中以4檔勻漿2分鐘。冰浴60分鐘後，用1N HCl調勻漿液pH至8.4，9,200xg離心30分鐘，去除不溶性物質。傾析含有可溶性rHA的上清液，測pH，如果需要，在室溫下調pH至8.4。重懸不溶物於40mL水中，進行分析。HA膜內在蛋白在高pH、含Tween-20去垢劑的條件下溶解，在pH降低時保持溶解狀態。
蛋白經SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分析。在2％十二烷基磺酸鈉(SDS)及5％β-巰基乙醇的存在下，用沸水浴破裂樣品10分鐘，然後在含0.1％SDS的11％聚丙烯醯胺凝膠上電泳，再用考馬斯藍染色。
已形成了一種層析純化方法，用來純化重組HA，可得到高純的、未變性的、適於作為人使用的流感疫苗組份的重組HA抗原。用以下方法從被重組病毒A8611感染的S.frugiperda細胞中純化A/Beijin/353/89的HA。用於從0.5L被感染的S.frugiperda細胞中純化HA的層析凝膠介質是30mL Pharmacia DEAE Sepharose Fast Flow(於Pharmacia C16/20柱)和4mL Pharmacia Lentil凝集素瓊脂糖4B(於Pharmacia C10/10柱)。把DEAE柱的流出口與Lentil凝集素柱的流入口相連，將如上所述製備的S/N2細胞提取液過柱，流速為1mL/分鐘。用30mM Tris-HCl，pH8.4，25mM LiCl，0.5％Tween-20洗脫，至Lentil凝集素柱流出液的280nm處UV吸收降到基線。在此條件下，大部分雜質蛋白與DEAE結合，而重組HA流過柱子。殘留的雜質經過凝集素柱，糖基化的rHA結合於Lentil凝集素親合介質上。拆掉DEAE柱，用另40mL 30mM Tris-HCl，pH8.4，25mM LiCl，0.5％ Tween-20洗凝集素柱。然後用40mL 30mM Tris-HCl，pH8.4，25mM LiCl，0.4％(V/V)脫氧膽酸鈉(DOC)洗柱。這一步用另一種去垢劑如DOC替代Tween20去垢劑，DOC可通過透析從蛋白上去除。然後用約20mL到40mL含0.3M a-D-甲基甘露糖苷的30mM Tris-HCl，pH8.4，25mMLiCl，0.4％(V/V)脫氧膽酸鈉洗脫重組HA。洗脫液用11％PAGE分析。
由於流感病毒HA蛋白的遺傳多樣性，對每一種特殊的重組HA蛋白，以上的純化方法的細節可進行變化。例如，rHA可能結合在DEAE離子交換柱上，而並不流出。如果發生這種情況，應該用含更高濃度的LiCl、NaCl或其他鹽的緩衝液洗柱，從DEAE柱上分離rHA。
為了除去DOC去垢劑和其他緩衝液組分，含有純化的rHA的凝集素柱的洗脫液在磷酸緩衝鹽水pH7.5(PBS)中透析。在SDS聚丙烯醯胺凝膠上分析，純化的重組HA的純度至少為95％。
實施例6rHA蛋白酶抗性分析成熟HA組裝成三聚體結構，抗多種能降解HA單體的蛋白酶，包括胰蛋白酶(Murphy和Webster，1990)。因此對胰蛋白酶的抗性可用來進行活性三聚體形成分析。以下方法被用來研究rHA對蛋白酶處理的抗性。
將兩份在30mM Tris-HCl，pH8.4，150mM NaCl中的純化的60μg/mL rHA(A/Beijing/353/89)，在含有和不含50μg/mL TPCK處理的胰蛋白酶的條件下置於冰上培養30分鐘。加入57.4mM苯甲基磺醯氟的異丙醇溶液至終濃度為1mM來終止反應。在3％SDS還原條件下，沸騰滅活每一份樣品，在11.5％聚丙烯醯胺凝膠上電泳，並用標準Western印跡法轉移至硝酸纖維素濾膜上。用針對純化的rHA製備的豚鼠抗HA血清及羊抗豚鼠IgG鹼性磷酸酶偶聯物檢測HA多肽。
未處理的rHA以HA前體(HA0)的大小遷移。蛋白酶處理出現兩條主要的帶，以預測的流感病毒凝集素HA1和HA2的大小遷移。結果顯示，胰蛋白酶裂解rHA蛋白一次，產生兩條預測為HA1和HA2大小的多肽。沒有進一步的蛋白裂解加工發生。這些結果證明用以上方法純化的HA抗蛋白酶降解。這一特性與純化的rHA以三聚體形式存在相符。
實施例7用標準小鼠效價分析rHA免疫原性一種測量抗原免疫原性的方法是測量引起小鼠可檢測的抗體反應所需的量(小鼠效價分析)。用標準小鼠效價分析測量rHA0疫苗的免疫原性。用含系列稀釋的rHA，即0.500μg，0.1μg，0.02μg和0.004μg純化的rHA的疫苗對幾組小鼠免疫一次，每組含5-10隻小鼠。免疫28天後收集血清，在96孔微量盤中用標準酶聯免疫固相測定(ELISA)測量抗rHA抗原的抗體。如果28天抗血清1∶100稀釋液的OD450大於小鼠免疫前血清OD450平均值三倍標準偏差，則小鼠有血清轉變。導致50％小鼠血清轉變所需的疫苗有效劑量(ED50)是抗原免疫原性的一項測量指標。
例如，四組小鼠，每組含10隻小鼠，用0.1μg，0.02μg，0.004μg或0.0008μg(5倍稀釋)rHA0疫苗免疫一次。免疫28天後收集血清，對疫苗中的每一種rHA0抗原，用ELISA測量血清轉變。計算50％小鼠血清轉變所需的劑量(ED50)，建立了每一種rHA0抗原的最小ED50。
最初的數據表明，單劑量0.004μg rHA0能使至少50％小鼠血清轉變。
實施例8與佐劑結合的rHA的服用及其與已有流感疫苗的比較用鋁或不用鋁(純淨的)測量從流感病毒A/Beijing/353/89純化的rHA的小鼠效價，並與含有流感病毒A/Beijign/353/89株的商業流感疫苗，FLUZONE_(Connaught Laboratories，Inc.Swiftwater，PA)比較。疫苗以0.5μg，0.1μg，0.02μg和0.004μg的劑量服用。在28天時用如上所述純化的rHA劑量加強免疫小鼠。42天時收集血清，用ELISA測定IgG抗HA抗體的滴度。
結果列於圖3。無佐劑時，只有0.5μg的劑量產生明顯的抗體滴度(200,000)。有佐劑時，0.004μg rHA0的小劑量就可產生明顯的抗體。用rHA(純淨的)免疫的動物產生與商業疫苗大致相同水平的抗HA抗體。鋁增加了rHA的免疫原性，所產生的抗HA抗體滴度是不用佐劑的10倍或更高。
總之，將純化的rHA0的免疫原性與一種流感完整病毒顆粒疫苗(FLUZONE_，Connaught Laboratories，Inc.，Swiftwater，PA)進行比較，證明rHA0在42天期間使小鼠產生類似的免疫應答。用實施例7中所述方法檢測，鋁輔助的rHA0吸收能明顯增加純化的rHA0對小鼠的免疫原性。與鋁的結合使得IgG血凝素抗體高於Fluzone_流感疫苗。
實施例9血凝抑制研究血凝抑制(HAI)抗體結合於血凝素的四個已知表位中的三個，阻止流感病毒凝集血紅細胞的能力(Wilson等.，「在3A解析度下流感病毒血凝素膜糖蛋白的結構」自然，289366-378(1981))。這些抗原決定簇聚集於血凝素三體的唾液酸受體結合位點周圍。針對這些位點的抗體會中和病毒的感染性(Weis等，「與其受體唾液酸複合的流感病毒血凝素的結構」，自然，333426-431(1988))。HAI抗體的滴度和特異性是流感病毒疫苗針對類似和相關流感病毒株感染的保護性的重要測量指標。
在小鼠中進行的研究比較了純化的來自A/Beijing/353/89的rHA0與FLUZONE_(Connaught Laboratories，Inc，Swiftwater，PA)的引起HAI抗體產生的能力。在0和28天對幾組小鼠，每組5隻，注射0.5μg，0.1μg，0.02μg或0.004μg rHA0或三倍量的FLUZONE_血凝素，以便施用相同水平的重組或病毒A/Beijing/353/89血凝素。例如，用1.5μgFLUZONE_血凝素(來自每一株的0.5μg血凝素)和0.5μg rHA0對高劑量組的小鼠免疫。FLUZONE_中來自另兩種流感病毒株的其它血凝素抗原的存在導致產生交叉反應抗體。
用標準稀釋ELISA測量針對純化的rHA0的抗血凝素抗體(血凝素IgG)。對4血凝素單位的以下抗原測量HAI抗體完整流感A/Beijing/353/89病毒(A/Bei)，純化的rHA0 A/Beijing/353/89抗原，和FLUZONE_。HAI滴度是指能抑制雞血紅細胞50％凝集的抗血清的最高稀釋度的倒數。
表3總結了42天時小鼠血清血凝素IgG和HAI滴度。用重組rHA0疫苗生產了高水平的抗血凝素抗體。對比FLUZONE_的滴度約高10倍。最有意義的是rHA0疫苗可產生能較好抑制A/Beijing/353/89病毒和rHA0抗原引起的血紅細胞凝集的抗體滴度。因此，rHA0疫苗產生的HAI抗體，能同樣較好地識別免疫原以及流感A/Beijing病毒。對FLUZONE_的低HAI滴度可能是因為抗血清不能抑制FLUZONE_疫苗中其他兩株血凝素的凝集作用。作為對照，當只針對其自身進行測量時，FLUZONE_免疫的小鼠產生高HAI抗體。對流感A/Beijing/353/89病毒和rHA0抗原的HAI滴度明顯減少。在低劑量組的小鼠中，發現了同樣的結果。
表3.對rHA0和FLUZONE_的HAI滴度
這些數據還表明FLUZONE_中的流感A/Beijing/353/89病毒株與從FDA得到的HAI分析前在雞蛋中傳過一代的相同流感病毒株之間存在著遺傳差異。與從流感A/Beijing/353/89克隆的重組HA0反應所產生的抗體抑制此株流感病毒及其自身對血紅細胞的凝集作用，這一事實證明了在克隆過程中，沒有發生遺傳改變影響純化的rHA0抗原的唾液酸受體結合位點。
實施例10；一種1993/1994流感疫苗的配方及其臨床效果進行了一系列人體臨床試驗來鑑定一種含重組HA的實驗性流感疫苗在人體中的安全性和免疫原性，並收集有關此種疫苗在流感季節對自然感染的保護效果的原始數據。結果證明，按照本文描述的方法生產的含有重組流感血凝素(rHA0)的疫苗與從商業獲得的標準在雞蛋中生產的減毒流感疫苗相比，令人驚奇地導致更少的局部不良反應，而產生相當的或更好的免疫保護反應。
材料和方法疫苗。本研究中使用的重組HA疫苗含有來自流感A/Beijing/32/92(H3N2)病毒的全長的未被切割的HA(HA0)糖蛋白。重組HA0(rHA0)在Lepidopteran(昆蟲)細胞培養物中生產，隨後與含編碼HA基因的cDNA插入片段的杆狀病毒載體接觸。經過用定量掃描光密度測量法對十二烷基磺酸鈉聚丙烯醯胺凝膠上電泳的大量抗原進行測定在非變性條件下純化表達蛋白至＞95％。用胺基酸分析、N-末端測序和利用抗流感A/Beijing/32/92血清進行的Western印跡分析證實肽的鑑定。rHA0疫苗包含特定量的合成HA抗原，溶於磷酸鹽緩衝液中或以凝膠懸液形式吸附於磷酸鋁(釩)佐劑上。在本研究中使用的獲準的三價亞病毒顆粒疫苗含有15μg/劑的分別來自流感A/Texas/36/91(H1N1)、A/Beijing/32/92(H3N2)和B/Panama/45/90病毒(生產於雞蛋的FLUZONETM減毒流感疫苗，Connaught Laboratories，Swiftwater，PA)的一種HA。
臨床研究。鑑別研究方法已獲得Institutional Review Boards of SaintLouis University和University of Rochester的認同。18到45歲的健康成年人在兩研究所招收。受試驗者被隨機分配，以雙盲法接受以下五種疫苗製劑之一(1)15μg rHA0；(2)μg rHA0加鋁；(3)90μg rHA0；(4)獲準的三價滅活流感疫苗；或(5)鹽水安慰劑。肌肉內注射0.5ml疫苗。為了初步確定含rHA0的三種疫苗製劑的安全性，前25個接種疫苗的受試者被獨立於其他受試者隨機分組(即每研究組5人)，並在接種後48小時通過電話聯繫密切監視。然後進行其餘的接種。在接種後前6天，所有受試者都被建議填寫不良反應的每日報告卡，包括局部和系統症狀。症狀被自己按情況分為輕微、適中和嚴重幾級。對感到發熱的受試者，測量並記錄其口腔溫度。如果發現注射部位有局部腫大或紅斑，分別按其直徑大於或小於四分之一英寸分級。所有接種都在1993年十一月最後一星期和十二月第一星期進行。在接種時、接種3星期後和1994能三月末或四月流感病毒不再在當地人群中流行後至少2到3星期時，取血清樣品。每個研究所的志願者都被建議當在冬季流感流行季節中有流感類似病症時與研究中心聯繫。流感類似病症是指兩天或兩天以上持續有呼吸道症狀，並伴隨有發熱和/或肌痛或寒冷等系統症狀。報告有流感類似病症的受試者被取鼻咽棉拭樣品，進行病毒培養和鑑定。臨床樣品被編號，並打亂處理。
血清學。對每一種類型的血清學試驗，來自兩個研究所的樣品合成一批在同一單獨的實驗室中進行。用受體破壞酶去除非特異性抑制劑，並在4℃用血細胞吸附去除冷凝集素後通過標準微滴度試驗，測量血清中針對流感A/Beijing/32/93(H3N2)病毒抗原的血凝抑制(HAI)抗體。滴度被定義為完全阻止4病毒抗原單位引起的血細胞凝集所需的最高血清稀釋液，其中起始稀釋為1∶4。用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測量血清HA特異性免疫球蛋白G(IgG)抗體，用來自流感A/Beijing 32/92(H3N2)的純化rHA0作為包被抗原。從固相外周到內的試劑依次包括(I)純化的rHA0抗原；(2)血清樣品；(3)鹼性磷酸酶偶聯的羊抗人IgG；和(4)對-硝基苯基磷酸二鈉底物。ELISA滴度以當含抗原槽的光密度至少是不含抗原的相應的對照槽的二倍時的最高稀釋度來表示。用以前Treanor，J.J.和Betts，R.F.(傳染病雜誌168455-459(1993))描述的微量中和檢測法測量中和抗體。簡單地說，將熱滅活的血清的系列稀釋液與大約100TCID50流感A/Beijing/32/92(H3N2)病毒混合，在37℃培養1小時。室溫下，病毒-血清混合物吸附於96孔平板上匯合的單層Madin-Darby狗腎(MDCK)細胞上1小時。洗滌平板，以除去殘留的接種物，重新加入含2μg/ml胰蛋白酶的無血清Dulbecco′s MEM，在5％CO2中33℃下培養72小時。然後用甲醇固定細胞，用一組特異於流感A病毒基質和核蛋白(疾病控制中心，Atlanta，GA)的鼠單克隆抗體及隨後的鹼性磷酸酶偶聯的抗小鼠IgG評價病毒複製。血清的終滴度定義為與非中和對照槽相比，導致高於50％的信號減少的最高稀釋度。
病毒學。在每個研究所用標準技術進行鼻咽棉拭樣品的病毒培養。將樣品接種到MDCK或恆河猴腎細胞中並於33℃培養14天。用0.4％豚鼠紅細胞對單層細胞進行血細胞吸附試驗。用H3-特異性抗血清(病毒控制中心)通過HAI在血細胞吸附陽性培養物中鑑定流感病毒。
統計學分析。對HAI、ELISA、IgG和中和抗體的滴度的倒數取對數。進行統計學分析。對接種的明顯反應定義為接種前到接種後3星期血清樣品的抗體滴度升高了4倍或更高。流感A(H3N2)病毒感染的實驗證據定義為從鼻咽腔分泌物中分離出病毒，和/或在接種3星期後(流感季節前)12月收集的樣品與來年春季收集的相應流感季節後的樣品中，血清HAI抗體滴度有4倍或更高的增加。用Fisher′s精確試驗分析疫苗組間的差異，比較產生不良反應、顯著的抗體反應或實驗室證實的流感疾病或感染的受試者比例，並進行方差(ANOVA)分析，對接種後Iog2抗體滴度的倒數的平均值進行比較。在適於進行多重可能的比較時進行改進的Bonferroni′s不等性和Tukev-Kramer測試。
結果反應原性。本研究中使用的HA0疫苗是安全的和可耐受的。產生不良反應的頻率不隨rHA0抗原劑量從15μg增加到90μg而改變，但隨鋁的加入而略有增加。據報告，在服用獲準的亞病毒疫苗的受試者中，注射部位出現局部紅斑、疼痛和敏感的頻率明顯比服用15μg或90μg rHA0鹽溶液的受試者高。除了一人在用獲準的疫苗免疫後胳膊出現中等嚴重的疼痛、敏感和硬化外，其他症狀都是溫和的，一般持續1-2天。出現的局部紅斑和/或硬化其範圍都不超過四分之一英寸。
免疫原性。在127名招收的受試者中，64名(50％)針對流感A/Beijing/32/92(H3N2)病毒的血清HAI抗體滴度的基線滴度低於或等於1∶8。在四個疫苗組的每一組中，大部分受試者經HAI和ELISA測量具有HA特異性血清學反應(表4)。所有疫苗受試者中血清HAI抗體的接種後滴度都大於或等於1∶32，除了接種了15μg rHA0的兩個和接種了獲準的疫苗的一人例外。在大部分志願者中接種同樣與中和抗體的產生相關。用15μg rHA0免疫比用獲準的疫苗免疫後抗體滴度平均值高，而血清轉變率有輕微的降低，雖然這些差異在統計學上並不顯著。對rHA0的抗體反應不隨鋁的加入而增強。用90μg rHA0免疫的受試者免疫後產生的平均HAI和ELISA IgG抗體滴度比其他三個疫苗組的任意一個中高2到5倍(比較血清HAI滴度時其差異在統計學上是顯著的)。
保護效果。在監視期間，共有26人報告了總共28次流感類似疾病。其中4人(其中三個服用了安慰劑，另一個用15μg rHA0免疫)從鼻咽腔樣品培養物中分離出流感A(H3N2)病毒。在四例培養物證明的病例中，有三例在季節前和季節後血清樣品中的針對流感A/Beijing/32/92的HAI抗體滴度有明顯增加，但其他報導過疾病的個體並不是這樣。隨後出現實驗確證有流感病症的僅接受rHA0的受試者在免疫31天後得到的培養物為陽性，並有血清轉變，從接種前HAI滴度小於1∶4變為接種後(流感季節前)的1∶32。另兩名服用安慰劑和一名用獲準的疫苗免疫的志願者在流感流行季節時具有感染了流感A(H3N2)病毒的血清學證據，但沒有臨床病狀。與所有免疫接種的受試者(或所有接受任何rHA0疫苗的受試者)作為一組相比，服用安慰劑的受試者中具有實驗確證的流感A(H3N2)疾病(p＜.05)或被感染(p＜.005)的比例明顯更大。
上述發現表明，按以上限定的專利申請所述的方法製備的含有純化的rHA0抗原的流感疫苗的耐受性較好，並能引起人類受試者的保護性免疫反應。甚至在90μg劑量時，本研究中評價的rHA0的反應原性不比鹽水安慰劑高，並且由其引起的局部不良反應明顯少於獲準的含有一半(即45μg)總HA抗原的三價亞病毒疫苗。
與15μg rHA0製劑的中和、HA特異性抗體的反應與由亞病毒疫苗引起的相當，並在rHA0劑量增加到90μg時有明顯提高。
由於自然接觸流感A(H3N2)病毒循環流行株而產生的總的感染和致病率在接種的受試者中比服用安慰劑的受試者要明顯降低。這些數據顯示，rHA0特別是以高劑量的用藥時引起的保護性免疫與目前使用的疫苗相當或更好。
表4年青成年受試者用含有來自流感A/Beijing/32/92(H3N2)的純化的重組血凝素(rHA0)的疫苗、獲準的含有來自A/Beijing/32/92(H3N2)的15μg HA三價亞病毒，或鹽水安慰劑免疫後產生的血清抗體反應。
HAI，血凝抑制HA，血凝素，ELISA，酶聯免疫吸附測定。接種後血清樣品採自免疫後3個星期。抗體滴度用log2±SEM倒數平均值表示。將指定組接種後HAI滴度的平均值與90μg rHA0疫苗組進行統計學比較，用多重比較的Dunnett′s檢驗分析方差。*，P＜0.01；*，P＜0.05；#P＜0.01
實施例11製備改善的HAO克隆載體的方法設計一個改善的表達成熟HA的克隆載體，其中編碼HA的基因緊接於編碼幾丁質酶信號肽的序列的下遊。
製成具單鏈尾部的線性pMGS27在質粒pMGS27中，HA克隆進緊接幾丁質酶信號肽下遊的Smal或Kpnl位點。核酸和胺基酸序列分別列於SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.235′-幾丁質酶信號肽SmalKpnlTGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG ATT CCC GGG GGT ACCTRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA ILE PRO GLY GLY THR在此區域發生寡聚核苷酸指導的誘變，生成pMGS27(突變的鹼基下劃線表示)(SEQ ID NO.24)5′TGG TTA GTC GCC GTG TCCTGCAGGCCAGAGAGGCCTT GGTACC Pst1用PstI酶切將質粒pMGS27線性化(列出SEQ ID NO.24的6-35鹼基)A GTC GCC GTG TCC TGCA 5′GGCCAGAGAGGCC TT CAG CGG CAC AGG5′ ACGTCCGGTCTCTCCGG A然後用T4 DNA聚合酶與dATP處理線性pMGS27，產生如下所示的單鏈尾部(SEQ ID NO.24的23-36鹼基和6-18鹼基的互補序列)A 5′GGCCAGAGAGGCC TT CAG CGG CAC AGG 5′ A將目的HA基因克隆到pMGS27中。
步驟1.合成PCR引物。
上遊寡聚核苷酸(SEQ ID NO.25)5′GTC GCC GTG TCC AAC GCG(成熟HA的5′端20個鹼基)反向寡聚核苷酸(SEQ ID NO.26的互補序列)(成熟HA的3′端20個鹼基)ATT AAC CGG TCT CTC CGG 5′HA基因的PCR目的HA基因與兩寡聚核苷酸進行PCR，得到(SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26)
5′GTC GCC GTG TCC AAC GCG(成熟HA)CAG CGG CAC AGG TTG CGC (成熟HA)TAA TTGGCCAGAGAGGCC 3′ATT AACCGGTCTCTCCGG將目的HA基因與pMGS27退火，轉化E.coli混合線性pMGS27和用T4 DNA聚合酶處理的HA基因PCR片段。兩分子退火，形成一環形質粒，可用於轉化E.coli。圖中包括SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26，SEQ ID NO.24的23-36和6-18鹼基。
GTCGCCGTGTCCAACGCG(成熟HA)TAATTTTGCGC(成熟HA)ATTAACCGGTCTCTCCGG+AGGCCAGAGAGGCCTTCAGCGGCACAGG A到幾丁質酶信號肽 終止GTCGCCGTGTCCAACGCG(成熟HA) TAATTGGCCAGAGAGGCCT如上所述，在信號肽和成熟HA之間沒有多餘的胺基酸。
實施例12三價型A和B1995-1996流感病毒疫苗的製備及其效果。
流感病毒疫苗，純化的重組血凝素，三價體，類型A和B(A/Texas/36/92\1(H1N1)，A/Johanesburg/33/94(H3N2)，和B/Harbin/7/94)是從純化的重組流感血凝素抗原(HA)得到的非感染性亞單位。HA基因從如上所述的疾病控制中心/食品和藥物局推薦的流感A和B病毒株克隆，並用DNA測序分析確定每一克隆的基因。使用包含從流感病毒株A/Texas/36/91(H1N1)，A/Johanesburg/33/94(H3N2)，B/Harbin/4/94克隆的HA基因的杆狀病毒表達載體在培養的昆蟲細胞中產生重組HA抗原。重組的HA蛋白是全長的未被切割的血凝素(rHA0)，分子量約為69,000。在無血清培養基中維持的Spodopterafrugiperda(Lepidopteran)細胞系中生產rHAO。三價疫苗含有來自兩種流感A株和一種B株的純化的(純度大於95％，很可能大於99％)rHAO，按相同比例混合。此疫苗作為溶於磷酸鹽緩衝溶液的、不加防腐劑的純化的A和B型rHAO蛋白用於臨床。
使用單價、二價和三價rHAO疫苗的動物實驗表明它們沒有明顯的毒性。在疫苗中沒有可檢測到的有毒或有害物質。在小鼠和豚鼠中對A/Beijing/32/92和A/Texas/36/91 rHAO的一般安全性和免疫原性進行了研究。沒有發現不良反應。在小鼠中，用不加佐劑的15微克rHAO抗原的單次免疫在2到3星期誘導高水平的抗HA IgG抗體、血凝素抑制(HAI)抗體和中和抗體。
在一項研究中，用15微克純化的產於適應含10％胎牛血清的培養基的細胞中的rHAO A/Beijing/32/92(H3N2)或產於在含10％胎牛血清的培養基中適應的昆蟲細胞的rHAO或產於適應無血清培養基的昆蟲細胞的rHAO(rHAO-SF)免疫每組10隻的小鼠組。注射2到3星期後，對小鼠取血製備血清樣品。測量每一血清樣品的抗HA IgG和HAI抗體。rHAO和rHAO-SF抗原產生相同的抗HA和HAI抗體滴度。單次免疫2星期後，大部分小鼠產生明顯的HAI抗體滴度，到第三星期每組中8/10的小鼠的HAI滴度為32或更高。這些及其他的生化和免疫學研究證明產於無血清昆蟲細胞培養物的rHAO與在含血清的發酵條件下生產的rHAO沒有區別。
進行了一項研究，對三價rHAO流感疫苗的1994-1995配方和一種獲準的純化病毒表面抗原疫苗，Fluvirin_(一種在雞蛋中培養生產的減毒流感病毒疫苗)進行了對比。每種疫苗每0.5微升含有來自A/Texas/36/91(H1N1)，A/Shangdong/9/93(H3N2)和B/Panama/45/90流感病毒株的15微克rHAO或病毒HA。所有重組rHAO和Fluvirin_疫苗都配製於磷酸鹽緩衝鹽水。在接種後0，2和3周，以十隻小鼠為一組的數組被採血且製備血清。就抑制抗蛋-生長的流感病毒抗體的抗-HA IgG抗體，以及就抗來自於每一病毒株的蛋-生長流感病毒的中和抗體測試血清樣品。
如圖4a，4b和4c所示，重組rHAO和批准的流感疫苗誘導高水平的、抗來自於疫苗的三種流感毒株的每一種的血凝素的血清IgG抗體。與批准的疫苗相比，rHAO疫苗誘導了4至10倍高的IgG抗體滴度。如圖5所示，亦用流感病毒A和B株病毒製備了抑制雞紅細胞血凝素的抗體。與批准的疫苗相比，在接受了三價rHAO疫苗的小鼠中，針對三種流感病毒毒株的每一種，HAI滴度是等同的或更高。在一標準微量滴定病毒試驗中，測得該疫苗亦誘導高水平的抗特異的流感A和B病毒毒株的中和抗體。用rHAO免疫接種的小鼠與用批准的純化病毒表面抗原疫苗，Fluvirin_免疫接種的小鼠相比，其幾何中和抗體滴度大約2倍高。這些結果表明，基於1994-1995型A和B流感毒株的rHAO疫苗的三價製劑在誘導功能性HAI和中和抗疫苗中所有三種毒株的血清抗體方面，與批准的亞單位流感疫苗是等同的或更優越。
表5三價rHAO疫苗與Fluvirin_的比較三價rHAO流感疫苗Fluvirin_GMT(n＝10隻小鼠) GMT(n＝10小鼠)作為抗原的病毒株 抗HA IgG 抗HA IgG0星期 3星期 0星期 3星期A/Texas/36/92(H1N1) ＜1000 103,000 ＜1000 11,200A/Shangdong/32/92(H ＜1000 162,400 ＜1000 41,0003N2)B/Panama/45/90 ＜1000 164,800 ＜1000 26,000作為抗原的病毒株HAI HAIA/Texas/36/92(H1N1) ＜8 1,522 ＜81,088A/Shangdong/32/92(H ＜8 494 ＜84353N2)B/Panama/45/90 ＜8 174 ＜842作為抗原的病毒株 中和Ab中和AbA/Texas/36/92(H1N1) ＜100 5,800 ＜100 2,720A/Shangdong/32/92(H ＜100 840 ＜100 3603N2)B/Panama/45/90 ＜100 1,300 ＜100 700用於製備和使用重組流感疫苗的本文所述的方法及組合物的改進和變動對本領域的技術人員而言將是顯而易見的。這些改進和變動將包含於隨後的權利要求的範圍中。序列表(1)一般信息(i)申請人MicroGeneSys，Inc.
(ii)發明名稱一種生產流感血凝素多價疫苗的方法(iii)序列數32(iv)聯繫地址(A)聯繫人Patrea L.Pabst(B)街道2800 One Atlantic Center1201 West Peachetree Street(C)城市Atlanta(D)州GA(E)國別USA(F)郵政編碼30309-3450(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOC(D)軟體PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)目前申請數據(A)申請號PCT/US95/06750(B)申請日1995年5月26日(C)分類(ix)電訊信息(A)電話(404)-873-8794(B)電傳(404)-873-8795(2)SEQ ID NO.1信息(i)序列特徵(A)長度12鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)有機體流感病毒(x)出版信息(A)作者Davis等(B)題目含有流感病毒WSN株(NON1)血凝素基因的細菌克隆的構建和鑑定(C)期刊基因(D)卷10(F)頁205-218(G)日期1980(xi)序列描述SEQ ID NO.1AGCAAAAGCA GG12(2)SEQ ID NO.2信息(i)序列特徵(A)長度39鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO.2GGGGGTACCC CCGGGAGCAA AAGCAGGGGA AAATAAAAA 39(2)SEQ ID NO.3信息(i)序列特徵(A)長度35鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO.3CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG 35(2)SEQ ID NO.4信息
(i)序列特徵(A)長度39鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO.4GGGGGTACCC CCGGGGACAC AATATGTATA GGCTACCAT39(2)SEQ ID NO.5信息(i)序列特徵(A)長度35鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO.5CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAG 35(2)SEQ ID NO.6信息(i)序列特徵(A)長度1793鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離A/Beijing/32/92 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18
(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號序列編碼區(B)位置19到72(ix)特徵(A)名稱/符號SmaI限制性酶切位點(B)位置76到81(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置73到1728(ix)特徵(A)名稱/符號KpnI限制性酶切位點(B)位置1771到1777(ix)特徵(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1776到1782(ix)特徵(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1783到1793(xi)序列描述SEQ ID NO.6TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGACTTTCCA GGAAATGACA ACAGCACAGC AACGCTGTGC 120CTGGGACATC ATGCAGTGCC AAACGGAACG CTAGTGAAAA CAATCACGAA TGATCAAATT 180GAAGTGACTA ATGCTACTGA GCTGGTTCAG AGTTCCTCAA CAGGTAGAAT ATGCGACAGT 240CCTCACCGAA TCCTTGATGG AAAAAACTGC ACACTGATAG ATGCTCTATT GGGAGACCCT 300CATTGTGATG GCTTCCAAAA TAAGGAATGG GACCTTTTTG TTGAACGCAG CAAAGCTTAC 360AGCAACTGTT ACCCTTATGA TGTACCGGAT TATGCCTCCC TTAGGTCACT AGTTGCCTCA 420TCAGGCACCC TGGAGTTTAT CAATGAAGAC TTCAATTGGA CTGGAGTCGC TCAGGATGGG 480GGAAGCTATG CTTGCAAAAG GGGATCTGTT AACAGTTTCT TTAGTAGATT GAATTGGTTG 540CACAAATCAG AATACAAATA TCCAGCGCTG AACGTGACTA TGCCAAACAA TGGCAAATTT 600GACAAATTGT ACATTTGGGG GGTTCACCAC CCGAGCACGG ACAGAGACCA AACCAGCCTA 660TATGTTCGAG CATCAGGGAG AGTCACAGTC TCTACCAAAA GAAGCCAACA AACTGTAACC 720CCGAATATCG GGTCTAGACC CTGGGTAAGG GGTCAGTCCA GTAGAATAAG CATCTATTGG 780ACAATAGTAA AACCGGGAGA CATACTTTTG ATTAATAGCA CAGGGAATCT AATTGCTCCT 840CGGGGTTACT TCAAAATACG AAATGGGAAA AGCTCAATAA TGAGGTCAGA TGCACCCATT 900GGCACCTGCA GTTCTGAATG CATCACTCCA AATGGAAGCA TTCCCAATGA CAAACCTTTT 960CAAAATGTAA ACAGGATCAC ATATGGGGCC TGCCCCAGAT ATGTTAAGCA AAACACTCTG1020AAATTGGCAA CAGGGATGCG GAATGTACCA GAGAAACAAA CTAGAGGCAT ATTCGGCGCA1080ATCGCAGGTT TCATAGAAAA TGGTTGGGAG GGAATGGTAG ACGGTTGGTA CGGTTTCAGG1140CATCAAAATT CTGAGGGCAC AGGACAAGCA GCAGATCTTA AAAGCACTCA AGCAGCAATC1200GACCAAATCA ACGGGAAACT GAATAGGTTA ATCGAGAAAA CGAACGAGAA ATTCCATCAA1260ATCGAAAAAG AATTCTCAGA AGTAGAAGGG AGAATTCAGG ACCTCGAGAA ATATGTTGAA1320GACACTAAAA TAGATCTCTG GTCTTACAAC GCGGAGCTTC TTGTTGCCCT GGAGAACCAA1380CATACAATTG ATCTAACTGA CTCAGAAATG AACAAACTGT TTGAAAAAAC AAGGAAGCAA1440CTGAGGGAAA ATGCTGAGGA CATGGGCAAT GGTTGCTTCA AAATATACCA CAAATGTGAC1500AATGCCTGCA TAGGGTCAAT CAGAAATGGA ACTTATGACC ATGATGTATA CAGAGACGAA1560GCATTAAACA ACCGGTTCCA GATCAAAGGT GTTGAGCTGA AGTCAGGATA CAAAGATTGG1620ATCCTATGGA TTTCCTTTGC CATATCATGC TTTTTGCTTT GTGTTGTTTT GCTGGGGTTC1680ATCATGTGGG CCTGCCAAAA AGGCAACATT AGGTGCAACA TTTGCATTTG AGTGTATTAA1740TTAAAAACAC CCTTGTTTCT AGGATGATTC GGTACCAGAT CTTAATTAAT TAA 1793(2)SEQ ID NO.7信息(i)序列特徵(A)長度570胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株A/Beijing/32/92 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號序列
(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到552(xi)序列描述SEQ ID NO.7Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser1 5 10 15Asn Ala Ile Pro Gly Asp Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr20 25 30Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr35 40 45Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln50 55 60Ser Ser Ser Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Arg Ile Leu Asp65 70 75 80Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys85 90 95Asp Gly Phe Gln Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys100 105 110Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu115 120 125Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu Asp130 135 140Phe Asn Trp Thr Gly Val Ala Gln Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Cys Lys145 150 155 160Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His Lys165 170 175Ser Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Gly180 185 190Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp195 200 205Arg Asp Gln Thr Ser Leu Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr Val210 215 220Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Thr Pro Asn Ile Gly Ser Arg225 230 235 240Pro Trp Val Arg Gly Gln Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile245 250 255Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile260 265 270Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile Met275 280 285Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Thr Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr Pro290 295 300Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile305 310 315 320Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu325 330 335Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe340 345 350Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp355 360 365Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala370 375 380Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys385 390 395 400Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu405 410 415Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr420 425 430Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu435 440 445Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met450 455 460Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu465 470 475 480Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala485 490 495Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg500 505 510Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys515 520 525ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys530 535 540Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln545 550 555 560Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile565 570(2)SEQ ID NO.8信息(i)序列特徵(A)長度1776鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株A/Texas/36/91 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號肽編碼區(B)位置19到72(ix)特徵(A)名稱/符號SmaI限制性酶切位點(B)位置76到81
(ix)特徵(A)名稱/符號KpnI限制性酶切位點(B)位置82到87(ix)特徵(A)名稱/符號SmaI限制性酶切位點(B)位置88到93(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置73到1734(ix)特徵(A)名稱/符號KpnI限制性酶切位點(B)位置1744到1749(ix)特徵(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1750到1755(ix)特徵(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1756到1766(xi)序列描述SEQ ID NO.8TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGGTACCCCC GGGGACACAA TATGTATAGG CTACCATGCG 120AACAACTCAA CCGACACTGT TGACACAGTA CTTGAGAAGA ACGTGACAGT GACACACTCT 180GTCAACCTAC TTGAGGACAG TCACAACGGA AAACTATGTC GACTAAAGGG AATAGCCCCA 240CTACAATTGG GTAATTGCAG CGTTGCCGGA TGGATCTTAG GAAACCCAAA ATGCGAATCA 300CTGTTTTCTA AGGAATCATG GTCCTACATT GCAGAAACAC CAAACCCTGA GAATGGAACA 360TGTTACCCAG GGTATTTCGC CGACTATGAG GAACTGAGGG AGCAATTGAG TTCAGTATCA 420TCATTCGAGA GATTCGAAAT ATTCCCCAAA GAAAGCTCAT GGCCCAACCA CACCGTAACC 480AAAGGAGTAA CGAGATCATG CTCCCATAAT GGGAAAAGCA GTTTTTACAG AAATTTGCTA 540TGGCTGACGG AGAAGAATGG CTTGTACCCA AATCTGAGCA AGTCCTATGT AAACAACAAA 600GAGAAAGAAG TCCTTGTACT ATGGGGTGTT CATCACCCGT CTAACATAAG GGACCAAAGG 660GCCATCTATC ATACAGAAAA TGCTTATGTC TCTGTAGTGT CTTCACATTA TAGCAGAAGA 720TTCACCCCAG AAATAGCAAA AAGACCCAAA GTAAGAGATC AAGAAGGAAG AATTAACTAC 780TACTGGACTC TGCTGGAACC CGGGGACACA ATAATATTTG AGGCAAATGG AAATCTAATA 840GCGCCATGGT ATGCTTTCGC ACTGAGTAGA GGCTTTGGGT CAGGAATCAT CACCTCAAAC 900GCATCAATGG ATGAATGTGA CGCGAAGTGT CAAACACCCC AGGGAGCTAT AAACAGTAGT 960CTTCCTTTCC AGAATGTACA CCCAGTCACA ATAGGAGAGT GTCCAAAGTA TGTCAGGAGT1020ACAAAATTAA GGATGGTTAC AGGACTAAGG AACATCCCAT CCATTCAATC CAGAGGTTTG1080TTTGGAGCCA TTGCCGGTTT CATTGAAGGG GGGTGGACTG GAATGATAGA TGGATGGTAT1140GGTTATCATC ATCAGAATGA ACAAGGATCT GGCTATGCTG CGGACCAAAA AAGCACACAA1200AATGCCATTA ACGGGATTAC AAACAAGGTG AATTCTGTAA TCGAGAAAAT GAACACTCAA1260TTCACAGCTG TGGGCAAAGA ATTCAACAAA TTAGAAAGAA GGATGGAAAA CTTAAATAAA1320AAAGTTGATG ATGGATTTCT GGACATTTGG ACATATAATG CAGAATTGTT GGTTCTACTG1380GAAAATGGAA GGACTTTGGA TTTTCATGAC TCAAATGTGA AGAATCTGTA TGAGAAAGTA1440AAAAGCCAAT TGAAGAATAA TGCCAAAGAA ATAGGGAACG GGTGTTTTGA ATTCTATCAC1500AAGTGTAACA ATGAATGCAT GGAAAGTGTG AAAAATGGAA CTTATGACTA TCCAAAATAT1560TCCGAAGAAT CAAAGTTAAA CAGGGGAAAA ATTGATGGAG TGAAATTGGA ATCAATGGGA1620GTCTATCAGA TTCTGGCGAT CTACTCAACT GTCGCCAGTT CACTGGTGCT TTTGGTCTCC1680CTGGGGGCAA TCAGCTTCTG GATGTGTTCT AATGGGTCTT TGCAGTGCAG AATATGAATC1740TGAGGTACCA GATCTTAATT AATTAA 1766(2)SEQ ID NO.9信息(i)序列特徵(A)長度572胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株A/Texas/36/91 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號序列
(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到554(xi)序列描述SEQ ID NO.9Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser1 5 10 15Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr Pro Gly Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr20 25 30His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn35 40 45Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly50 55 60Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys65 70 75 80Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn Pro Lys Cys Glu Ser Leu Phe85 90 95Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile Ala Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn100 105 110Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu115 120 125Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys130 135 140Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr Val Thr Lys Gly Val Thr Arg Ser145 150 155 160Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu165 170 175Thr Glu Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn180 185 190Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His Pro Ser195 200 205Asn Ile Arg Asp Gln Arg Ala Ile Tyr His Thr Glu Asn Ala Tyr Val210 215 220Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala225 230 235 240Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp245 250 255Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn260 265 270Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser275 280 285Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser Met Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys290 295 300Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val305 310 315 320His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys325 330 335Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg340 345 350Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly355 360 365Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser370 375 380Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile385 390 395 400Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr405 410 415Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu420 425 430Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala435 440 445Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gly Arg Thr Leu Asp Phe His Asp450 455 460Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn465 470 475 480Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys485 490 495Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro500 505 510Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Gly Lys Ile Asp Gly Val515 520 525Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr530 535 540Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe545 550 555 560Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile565 570(2)SEQ ID NO.10信息(i)序列特徵(A)長度1799鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型RNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株B/Panama/45/90 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號HA信號肽序列編碼區(B)位置19到69(ix)特徵(A)名稱/符號SmaI限制性酶切位點(B)位置22到27(ix)特徵
(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置70到1773(ix)特徵(A)名稱/符號KpnI限制性酶切位點(B)位置1777到1782(ix)特徵(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1783到1788(ix)特徵(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1789到1799(xi)序列描述SEQ ID NO.10TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCGGGAAG GCAATAATTG TACTACTCAT GGTAGTAACA 60TCCAACGCAG ATCGAATCTG CACTGGGATA ACATCTTCAA ACTCACCTCA TGTGGTCAAA 120ACAGCTACTC AAGGGGAAGT CAATGTGACT GGTGTGATAC CACTGACAAC AACACCAACA 180AAATCTCATT TTGCAAATCT AAAAGGAACA AAGACCAGAG GGAAACTATG CCCAAACTGT 240CTCAACTGCA CAGATCTGGA TGTGGCCTTG GGCAGACCAA TGTGTGTGGG GACCACACCT 300TCGGCAAAAG CTTCAATACT CCACGAAGTC AGACCTGTTA CATCCGGGTG CTTTCCTATA 360ATGCACGACA GAACAAAAAT CAGACAGCTA CCCAATCTTC TCAGAGGATA TGAAAATATC 420AGATTATCAA CCCAAAACGT TATCAACGCA GAAAGAGCAC CAGGAGGACC CTACAGACTT 480GGAACCTCAG GATCTTGCCC TAACGTTACC AGTAGAGACG GATTCTTCGC AACAATGGCT 540TGGGCTGTCC CAAGGGACAA CAAAACAGCA ACGAATCCAC TAACAGTAGA AGTACCATAC 600ATTTGTACCA AAGGAGAAGA CCAAATTACT GTTTGGGGGT TCCATTCTGA TAACAAAATC 660CAAATGAAAA ACCTCTATGG AGACTCAAAT CCTCAAAAGT TCACCTCATC TGCCAATGGA 720GTAACCACAC ATTATGTTTC TCAGATTGGT GGCTTCCCAA ATCAAACAGA AGACGGAGGG 780CTACCACAAA GCGGCAGAAT TGTTGTTGAT TACATGGTGC AAAAACCTGG GAAAACAGGA 840ACAATTGTCT ATCAAAGAGG TGTTTTGTTG CCTCAAAAGG TGTGGTGCGC AAGTGGCAGG 900AGCAAGGTAA TAAAAGGGTC CTTGCCTTTA ATTGGTGAAG CAGATTGCCT TCACGAAAAA 960TACGGTGGAT TAAACAAAAG CAAGCCTTAC TACACAGGAG AACATGCAAA AGCCATAGGA1020AATTGCCCAA TATGGGTGAA AACACCTTTG AAGCTTGCCA ATGGAACCAA ATATAGACCT1080CCTGCAAAAC TATTAAAGGA AAGGGGTTTC TTCGGAGCTA TTGCTGGTTT CTTAGAAGGA1140GGATGGGAAG GAATGATTGC AGGTTGGCAC GGATACACAT CTCATGGAGC ACATGGAGTG1200GCAGTGGCAG CAGACCTTAA GAGTACGCAA GAAGCCATAA ACAAGATAAC AAAAAATCTC1260AATTCTTTGA GTGAGCTAGA AGTAAAGAAT CTTCAAAGAC TAAGTGGTGC CATGGATGAA1320CTCCACAACG AAATACTCGA GCTGGATGAG AAAGTGGATG ATCTCAGAGC TGACACAATA1380AGCTCGCAAA TAGAGCTTGC AGTCTTGCTT TCCAACGAAG GAATAATAAA CAGTGAAGAT1440GAGCATCTAT TGGCACTTGA GAGAAAACTA AAGAAAATGC TGGGTCCCTC TGCTGTAGAC1500ATAGGGAATG GATGCTTCGA AACCAAACAC AAGTGCAACC AGACCTGCTT AGACAGGATA1560GCTGCTGGCA CCTTTAATGC AGGAGAATTT TCTCTTCCCA CTTTTGATTC ACTGAATATT1620ACTGCTGCAT CTTTAAATGA TGATGGATTG GATAATCATA CTATACTGCT CTACTACTCA1680ACTGCTGCTT CTAGTTTGGC TGTAACATTG ATGATAGCTA TTTTTATTGT TTATATGGTC1740TCCAGAGACA ATGTTTCTTG TTCCATCTGT CTGTGAGGTA CCAGATCTTA ATTAATTAA 1799(2)SEQ ID NO.11信息(i)序列特徵(A)長度585胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株B/Panama/45/90 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號HA信號肽(B)位置1到17(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置18到568(xi)序列描述SEQ ID NO.11Met Pro Gly Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn1 5 10 15Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val20 25 30Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro35 40 45Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr50 55 60Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu65 70 75 80Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala85 90 95Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe100 105 110Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu115 120 125Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val Ile Asn Ala130 135 140Glu Arg Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys145 150 155 160Pro Asn Val Thr Ser Arg Asp Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala165 170 175Val Pro Arg Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val180 185 190Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe195 200 205His Ser Asp Asn Lys Ile Gln Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn210 215 220Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val225 230 235 240Ser Gln Ile Gly Gly Phe Pro Asn Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro245 250 255Gln Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gln Lys Pro Gly Lys260 265 270Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly Val Leu Leu Pro Gln Lys Val275 280 285Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu290 295 300Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys305 310 315 320Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys325 330 335Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr340 345 350Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile355 360 365Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His370 375 380Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu385 390 395 400Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser405 410 415Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met420 425 430Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp435 440 445Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu450 455 460Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu465 470 475 480Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly485 490 495Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp500 505 510Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr515 520 525Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu530 535 540Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu545 550 555 560Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser Arg565 570 575Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu580 585(2)SEQ ID NO.12信息(i)序列特徵(A)長度1811鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)有機體流感病毒(C)個體分離株B/Netherlands/13/94 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號序列編碼區(B)位置19到72(ix)特徵(A)名稱/符號SmaI限制性酶切位點(B)位置76到81(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置73到1785(ix)特徵
(A)名稱/符號KpnI限制性酶切位點(B)位置1789到1794(ix)特徵(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1795到1800(ix)特徵(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1801到1811(xi)序列描述SEQ ID NO.12TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGATCGAATC TGCACTGGGA TAACATCTTC AAAATCACCT 120CATGTAGTCA AAACAGCTAC TCAAGGGGAG GTCAATGTGA CTGGTGTGAT ACCACTGACG 180ACAACACCAA CAAAATCTCA TTTTGCAAAT CTCAAAGGAA CAAAGACCAG AGGGAAACTA 240TGCCCAAACT GTCTCAACTG CACAGATCTG GATGTGGCCT TGGGCAGACC AATGTGTGTG 300GGGATCACAC CTTCGGCAAA AGCTTCAATA CTCCACGAAG TCAGACCTGT TACATCCGGG 360TGCTTTCCTA TAATGCATGA CAGAACAAAA ATCAGACAGC TACCCAATCT TCTCAGAGGA 420TATGAAAACA TCAGACTATC AACCCAAAAC GTTATCAACG CAGAAAAGGC ACCAGGAGGA 480CCCTACAGAC TTGGAACCTC AGGATCTTGC CCTAACGTTA CCAGTAGAAC CGGATTCTTC 540GCAACAATGG CTTGGGCTGT CCCAAGGGAC AACAAA CAG CAACGAATCC ACTAACAGTA 600GAAGTACCAT ACATTTGTAC GAAAGGAGAA GACCAAATTA CTGTTTGGGG GTTCCATTCT 660GATAACAAAA CCCAAATGAA AAACCTCTAT GGAGACTCAA ATCCTCAAAA GTTCACCTCA 720TCTGCCAATG GAGTAACCAC ACATTATGTT TCTCAGATTG GTGGCTTCCC AGATCAAACA 780GAAGACGGAG GACTACCACA AAGCGGCAGA ATTGTTGTTG ATTACATGGT GCAAAAACCT 840GGGAAAACAG GAACAATTGT CTATCAAAGA GGTATTTTGT TGCCTCAAAA GGTGTGGTGC 900GCAAGTGGCA GGAGCAAGGT AATAAAAGGG TCCTTGCCTT TAATTGGTGA AGCAGATTGC 960CTTCACGAAA AATACGGTGG ATTAAACAAA AGCAAGCCTT ACTACACAGG AGAACATGCA1020AAAGCCATAG GAAATTGCCC AATATGGGTG AAAACACCTT TGAAGCTTGC CAATGGAACC1080AGATATAGAC CTCCTGCAAA ACTATTAAAG GAAAGGGGTT TCTTCGGAGC TATTGCTGGT1140TTCTTAGAAG GAGGATGGGA AGGAATGATT GCAGGTTGGC ACGGATACAC ATCTCACGGG1200GCACATGGAG TGGCAGTGGC AGCAGACCTT AAGAGTACGC AAGAAGCCAT AAACAAGATA1260ACAAAAAATC TCAATTCTTT GAGTGAGCTA GAAGTAAAGA ACCTTCAAAG ACTAAGTGGT1320GCCATGGATG AACTCCACAA CGAAATACTC GAGCTGGATG AGAAAGTGGA TGATCTCAGA1380GCTGACACAA TAAGCTCGCA AATAGAGCTT GCAGTCTTAC TTTCCAACGA AGGAATAATA1440AACAGTGAAG ATGAGCATCT ATTGGCACTT GAGAGAAAAC TAAAGAAAAT GCTGGGTCCC1500TCTGCTGTAG ACATAGGGAA TGGATGCTTC GAAACAAAAC ACAAGTGCAA CCAGACCTGC1560TTAGACAGGA TAGCTGCTGG CACCTTTAAT GCAGGAGAAT TTTCTCTTCC CACTTTTGAT1620TCACTGAATA TTACTGCTGC ATCTTTAAAT GATGATGGAT TGGATAATCA TACTATACTG1680CTCTACTACT CAACTGCTGC TTCTAGTTTG GCTGTAACAT TGATGATAGC TATTTTTATT1740GTTTATATGG TCTCCAGAGA CAATGTTTCT TGTTCCATCT GTCTGTGAGG TACCAGATCT1800TAATTAATTA A 1811(2)SEQ ID NO.13信息(i)序列特徵(A)長度589胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株B/Netherlands/13/94 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號序列(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到571(xi)序列描述SEQ ID NO.13Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser1 5 10 15Asn Ala Ile Pro Gly Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Lys20 25 30Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr35 40 45Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn50 55 60Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn65 70 75 80Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Ile85 90 95Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr100 105 110Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu115 120 125Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn130 135 140Val Ile Asn Ala Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr145 150 155 160Ser Gly Ser Cys Pro Asn Val Thr Ser Arg Thr Gly Phe Phe Ala Thr165 170 175Met Ala Trp Ala Val Pro Arg Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu180 185 190Thr Val Glu Val Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly Glu Asp Gln Ile Thr195 200 205Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Lys Thr Gln Met Lys Asn Leu Tyr210 215 220Gly Asp Ser Asn Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr225 230 235 240Thr His Tyr Val Ser Gln Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gln Thr Glu Asp245 250 255Gly Gly Leu Pro Gln Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gln260 265 270Lys Pro Gly Lys Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly Ile Leu Leu275 280 285Pro Gln Lys Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly290 295 300Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly305 310 315 320Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala325 330 335Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn340 345 350Gly Thr Arg Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe355 360 365Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile370 375 380Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val385 390 395 400Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys405 410 415Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu420 425 430Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu435 440 445Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu450 455 460Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His465 470 475 480Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala485 490 495Val Asp Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln500 505 510Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe515 520 525Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn530 535 540Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala545 550 555 560Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr565 570 575Met Val Ser Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu580 585(2)SEQ ID NO.14信息(i)序列特徵(A)長度1757鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株A/Shandong/9/93 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號序列編碼區(B)位置19到72(ix)特徵(A)名稱/符號SmaI限制性酶切位點(B)位置76到81(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置73到1728(ix)特徵(A)名稱/符號KpnI限制性酶切位點(B)位置1735到1740(ix)特徵(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1741到1746(ix)特徵(A)名稱/符號通用翻譯終止信號
(B)位置1747到1757(xi)序列描述SEQ ID NO.14TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60GTTTCTAACG CGATTCCCGG GCAAGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTG 120TGCCTGGGAC ATCATGCAGT GCCAAACGGA ACGCTAGTGA AAACAATCAC GAATGATCAA 180ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGTTGGTT CAGAGTTCCT CAACAGGTAG AATATGCGGC 240AGTCCTCACC GAATCCTTGA TGGAAAAAAC TGCACACTGA TAGATGCTCT ATTGGGAGAC 300CCTCATTGTG ATGGCTTCCA AAATAAGGAA TGGGACCTTT TTGTTGAACG CAGCAAAGCT 360TACAGCAACT GTTACCCTTA TGATGTGCCG GATTATGCCT CCCTTAGGTC ACTAGTTGCC 420TCATCAGGCA CCCTGGAGTT TATCAATGAA GACTTCAATT GGACTGGAGT CGCTCAGGAT 480GGGGGAAGCT ATGCTTGCAA AAGAGGATCT GTTAACAGTT TCTTTAGTAG ATTGAATTGG 540TTGCACAAAT TAGAATACAA ATATCCAGCG CTGAACGTGA CTATGCCAAA CAATGGCAAA 600TTTGACAAAT TGTACATTTG GGGGGTTCAC CACCCGAGCA CGGACAGTGA CCAAACCAGC 660CTATATGTTC GAGCATCAGG GAGAGTCACA GTCTCTACCA AAAGAAGCCA ACAAACTGTA 720ACCCCGAATA TCGGGTCTAG ACCCTGGGTA AGGGGTCAGT CCAGTAGAAT AAGCATCTAT 780TGGACAATAG TAAAACCGGG AGACATACTT TTGATTGATA GCACAGGGAA TCTAATTGCT 840CCTCGGGGTT ACTTCAAAAT ACGAAATGGG AAAAGCTCAA TAATGAGGTC AGATGCACCC 900ATTGGCAACT GCAGTTCTGA ATGCATCACT CCAAATGGAA GCATTCCCAA TGACAAACCT 960TTTCAAAATG TAAACAGAAT CACATATGGG GCCTGCCCCA GATATGTTAA GCAAAACACT1020CTGAAATTGG CAACAGGGAT GCGGAATGTA CCAGAGAAAC AAACTAGAGG CATATTCGGC1080GCAATCGCAG GTTTCATAGA AAATGGTTGG GAGGGAATGG TAGACGGTTG GTACGGTTTC1140AGGCATCAAA ATTCTGAGGG CACAGGACAA GCAGCAGATC TTAAAAGCAC TCAAGCAGCA1200ATCGACCAAA TCAACGGGAA ACTGAATAGG TTAATCGAGA AAACGAACGA GAAATTCCAT1260CAAATCGAAA AAGAATTCTC AGAAGTAGAA GGGAGAATTC AGGACCTCGA GAAATATGTT1320GAAGACACTA AAATAGATCT CTGGTCTTAC AACGCGGAGC TTCTTGTTGC CCTGGAGAAC1380CAACATACAA TTGATCTAAC TGACTCAGAA ATGAACAAAC TGTTTGAAAA AACAAGGAAG1440CAACTGAGGG AAAATGCTGA GGACATGGGC AATGGTTGCT TCAAAATATA CCACAAATGT1500GACAATGCCT GCATAGGGTC AATCAGAAAT GGAACTTATG ACCATGATGT ATACAGAGAC1560GAAGCATTAA ACAACCGGTT CCAGATCAAA GGTGTTGAGC TGAAGTCAGG ATACAAAGAT1620TGGATCCTAT GGATTTCCTT TGCCATATCA TGCTTTTTGC TTTGTGTTGT TTTGCTGGGG1680TTCATCATGT GGGCCTGCCA AAAAGGCAAC ATTAGGTGCA ACATTTGCAT TTGAGGTACC1740AGATCTTAAT TAATTAA 1757(2)SEQ ID NO.15信息(i)序列特徵(A)長度571胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株A/Shandonng/9/93 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號序列(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到553(xi)序列描述SEQ ID NO.15Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser1 5 10 15Asn Ala Ile Pro Gly Gln Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala20 25 30Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys35 40 45Thr Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val50 55 60Gln Ser Ser Ser Thr Gly Arg Ile Cys Gly Ser Pro His Arg Ile Leu65 70 75 80Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His85 90 95Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser100 105 110Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser115 120 125Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu130 135 140Asp Phe Asn Trp Thr Gly Val Ala Gln Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Cys145 150 155 160Lys Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His165 170 175Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn180 185 190Gly Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr195 200 205Asp Ser Asp Gln Thr Ser Leu Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr210 215 220Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Thr Pro Asn Ile Gly Ser225 230 235 240Arg Pro Trp Val Arg Gly Gln Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr245 250 255Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asp Ser Thr Gly Asn Leu260 265 270Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile275 280 285Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Asn Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr290 295 300Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg305 310 315 320Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys325 330 335Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile340 345 350Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val355 360 365Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln370 375 380Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly385 390 395 400Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile405 410 415Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys420 425 430Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu435 440 445Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu450 455 460Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala465 470 475 480Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn485 490 495Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr500 505 510Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu515 520 525Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser530 535 540Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys545 550 555 560Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile565 570(2)SEQ ID NO.16信息(i)序列特徵(A)長度1814鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無
(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株B/Shanhai/4/94 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號序列編碼區(B)位置19到72(ix)特徵(A)名稱/符號SmaI限制性酶切位點(B)位置76到81(ix)特徵(A)名稱/符號KpnI限制性酶切位點(B)位置82到87(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置73到1794(ix)特徵(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1804到1814(xi)序列描述SEQ ID NO.16TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGGTACCGAT CGAATCTGCA CTGGGATAAC ATCTTCAAAC120TCACCTCATG TGGTCAAAAC AGCTACTCAA GGGGAGGTCA ATGTGACTGG TGTGATACCA180CTGACAACAA CACCAACAAA ATCTCATTTT GCAAATCTCA AAGGAACAAA GACCAGAGGG240AAACTATGCC CAAACTGTCT CAACTGCACA GATCTGGATG TGGCCTTGGG CAGACCAATG300TGTGTGGGGA CCACACCTTC GGCAAAAGCT TCAATACTCC ACGAAGTCAG ACCTGTTACA360TCCGGGTGCT TTCCTATAAT GCACGACAGA ACAAAAATCA GACAGCTACC CAATCTTCTC420AGAGGATATG AAAATATCAG ATTATCAACC CAAAACGTTA TCAACGCAGA AAAGGCACCA480GGAGGACCCT ACAGACTTGG AACCTCAGGA TCTTGCCCTA ACGCTACCAG TAGAAGCGGA540TTTTTCGCAA CAATGGCTTG GGCTGTCCCA AGGGACAACA ACAAAACAGC AACGAATCCA600CTAACAGTAG AAGTACCATA CATTTGCACA AAAGGAGAAG ACCAAATTAC TGTTTGGGGG 660TTCCATTCTG ATAACAAACC CCAAATGAAA AACCTCTATG GAGACTCAAA TCCTCAAAAG 720TTCACCTCAT CTGCTAATGG AGTAACCACA CATTATGTTT CTCAGATTGG CGGCTTCCCA 780GATCAAACAG AAGACGGAGG GCTACCACAA AGCGGCAGAA TTGTTGTTGA TTACATGGTG 840CAAAAACCTG GGAAGACAGG AACAATTGTC TATCAGAGAG GTGTTTTGTT GCCTCAAAAG 900GTGTGGTGCG CTAGTGGCAG GAGCAAAGTA ATAAAAGGGT CCTTGCCTTT AATTGGTGAA 960GCAGATTGCC TTCACGAAAA ATACGGTGGA TTAAACAAAA GCAAGCCTTA CTACACAGGA 1020GAACATGCAA AAGCCATAGG AAATTGCCCA ATATGGGTGA AAACACCTTT GAAGCTTGCC 1080AATGGAACCA AATATAGACC TCCTGCAAAA CTATTAAAGG AAAGGGGTTT CTTCGGAGCT 1140ATTGCTGGTT TCTTAGAAGG AGGATGGGAA GGAATGATTG CAGGTTGGCA CGGATACACA 1200TCTCACGGAG CACATGGAGT GGCAGTGGCA GCAGACCTTA AGAGTACGCA AGAAGCCATA 1260AACAAGATAA CAAAAAATCT CAATTCTTTG AGTGAGCTAG AAGTAAAGAA TCTTCAAAGG 1320CTAAGTGGTG CCATGGATGA ACTCCACAAC GAAATACTCG AGCTGGATGA GAAAGTGGAT 1380GATCTCAGAG CTGACACAAT AAGCTCGCAA ATAGAACTTG CAGTCTTGCT TTCCAACGAA 1440GGAATAATAA ACAGTGAAGA TGAGCATCTA TTGGCACTTG AGAGAAAACT AAAGAAAATG 1500CTGGGTCCCT CTGCTGTAGA CATAGGAAAT GGATGCTTCG AAAC AAACA CAAGTGCAAC 1560CAGACCTGCT TAGACAGGAT AGCTGCTGGC ACCTTTAATG CGGGAGAATT TTCTCTTCCC 1620ACTTTTGATT CACTGAATAT TACTGCTGCA TCTTTAAATG ATGATGGATT GGATAACCAT 1680ACTATACTGC TCTACTACTC AACTGCTGCT TCTAGTTTGG CGGTAACATT GATGATAGCT 1740ATTTTTATTG TTTATATGGT CTCCAGAGAC AATGTTTCTT GCTCCATCTG TCTGTGAGGA 1800TCTTAATTAA TTAA 1814(2)SEQ ID NO.17信息(i)序列特徵(A)長度592胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端
(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株B/Shanhai/4/94 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號肽(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到574(xi)序列描述SEQ ID NO.17Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser1 5 10 15Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser20 25 30Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn35 40 45Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe50 55 60Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys65 70 75 80Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val85 90 95Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro100 105 110Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg115 120 125Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr130 135 140Gln Asn Val Ile Asn Ala Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu145 150 155 160Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn Ala Thr Ser Arg Ser Gly Phe Phe165 170 175Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro Arg Asp Asn Asn Lys Thr Ala Thr180 185 190Asn Pro Leu Thr Val Glu Val Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly Glu Asp195 200 205Gln Ile Thr Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Lys Pro Gln Met Lys210 215 220Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn225 230 235 240Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser Gln Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gln245 250 255Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr260 265 270Met Val Gln Lys Pro Gly Lys Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly275 280 285Val Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val290 295 300Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu305 310 315 320Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His325 330 335Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys340 345 350Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu355 360 365Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu370 375 380Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly385 390 395 400Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys405 410 415Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu420 425 430Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu435 440 445Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln450 455 460Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu465 470 475 480Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly485 490 495Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys500 505 510Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala515 520 525Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala530 535 540Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr545 550 555 560Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe565 570 575Ile Val Tyr Met Val Ser Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu580 585 590(2)SEQ ID NO.18信息(i)序列特徵(A)長度1802鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株B/Harbin/7/94 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號HA信號肽序列編碼區
(B)位置19到69(ix)特徵(A)名稱/符號SmaI限制性酶切位點(B)位置22到27(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置70到1776(ix)特徵(A)名稱/符號KpnI限制性酶切位點(B)位置1780到1785(ix)特徵(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1786到1791(ix)特徵(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1792到1802(xi)序列描述SEQ ID NO.18TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCGGGAAG GCAATAATTG TACTACTCAT GGTAGTAACA 60TCCAACGCAG ATCGAATCTG CACTGGGATA ACATCTTCAA ACTCACCTCA TGTGGTCAAA 120ACAGCTACTC AAGGGGAAGT CAATGTGACT GGTGTGATAC CACTGACAAC AACACCAACA 180AAATCTCATT TTGCAAATCT AAAAGGAACA AAGACCAGAG GGAAACTATG CCCAAACTGT 240CTCAACTGCA CAGATCTGGA TGTGGCCTTG GGCAGACCAA TGTGTGTGGG GACCACACCT 300TCGGCAAAAG CTTCAATACT CCACGAAGTC AGACCTGTTA CATCCGGGTG CTTTCCTATA 360ATGCACGACA GAACAAAAAT CAGACAGCTA CCCAATCTTC TCAGAGGATA TGAAAATATC 420AGATTATCAA CCCAAAACGT TATCAATGCA GAAAAAGCAC CAGGAGGACC CTACAGACTT 480GGAACCTCAG GATCTTGCCC TAACGCTACC AGTAGAAGCG GATTTTTTGC AACAATGGCT 540TGGGCTGTCC CAAGGGACGA CAACAAAACA GCAACGAATC CACTAACAGT AGAAGTACCA 600TACGTTTGTA CAGAAGGAGA AGACCAAATT ACTGTTTGGG GGTTCCATTC TGATAACAAA 660GCCCAAATGA AAAACCTCTA TGGAGACTCA AATCCTCAAA AGTTCACCTC ATCTGCTAAT 720GGAGTAACCA CACATTATGT TTCTCAGATT GGCGGCTTCC CAGATCAAAC AGAAGACGGA 780GGGCTACCAC AAAGCGGCAG AATTGTTGTT GATTACATGG TGCAAAAACC TGGGAAAACA 840GGAACAATTG TCTATCAAAG AGGTGTTTTG TTGCCTCAAA AGGTGTGGTG CGCGAGTGGC 900AGGAGCAAAG TAATAAAAGG GTCCTTGCCT TTAATTGGTG AAGCAGATTG CCTTCACGAA 960AAATACGGTG GATTAAACAA AAGCAAGCCT TACTACACAG GAGAACATGC AAAAGCCATA1020GGAAATTGCC CAATATGGGT GAAAACACCT TTGAAGCTTG CCAATGGAAC CAAATATAGA1080CCTCCTGCAA AACTATTAAA GGAAAGGGGT TTCTTCGGAG CTATTGCTGG TTTCTTAGAA1140GGAGGATGGG AAGGAATGAT TGCAGGTTGG CACGGATACA CATCTCACGG AGCACATGGA1200GTGGCAGTGG CAGCAGACCT TAAGAGTACG CAAGAAGCCA TAAACAAGAT AACAAAAAAT1260CTCAATTCTT TGAGTGAGCT AGAAGTAAAG AATCTTCAAA GACTAAGTGG TGCCATGGAT1320GAACTCCATA ACGAAATACT CGAGCTGGAT GAGAAAGTGG ATGATCTCAG AGCTGACACT1380ATAAGCTCGC AAATAGAACT TGCAGTCTTG CTTTCCAACG AAGGAATAAT AAACAGTGAA1440GATGAGCATC TATTGGCACT TGAGAGAAAA CTAAAGAAAA TGCTGGGTCC CTCTGCTGTA1500GACATAGGGA ATGGATGCTT CGAAACCAAA CACAAGTGCA ACCAGACCTG CTTAGACAGG1560ATAGCTGCTG GCACCTTTAA TGCAGGAGAA TTTTCTCTCC CCACTTTTGA TTCACTGAAT1620ATTACTGCTG CATCTTTAAA TGATGATGGA TTGGATAATC ATACTATACT GCTCTACTAC1680TCAACTGCTG CTTCTAGTTT GGCTGTAACA TTGATGATAG CTATTTTTAT TGTTTATATG1740GTCTCCAGAG ACAATGTTTC ATGCTCCATC TGTCTGTGAG GTACCAGATC TTAATTAATT1800AA1802(2)SEQ ID NO.19信息(i)序列特徵(A)長度586胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株B/Harbin/7/94 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號HA信號肽(B)位置1到17(ix)特徵
(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置18到569(xi)序列描述SEQ ID NO.19Met Pro Gly Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn1 5 10 15Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val20 25 30Val Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro35 40 45Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr50 55 60Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu65 70 75 80Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala85 90 95Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe100 105 110Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu115 120 125Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Val Ile Asn Ala130 135 140Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys145 150 155 160Pro Asn Ala Thr Ser Arg Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala165 170 175Val Pro Arg Asp Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu180 185 190Val Pro Tyr Val Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Val Trp Gly195 200 205Phe His Ser Asp Asn Lys Ala Gln Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser210 215 220Asn Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr225 230 235 240Val Ser Gln Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu245 250 255Pro Gln Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gln Lys Pro Gly260 265 270Lys Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gln Arg Gly Val Leu Leu Pro Gln Lys275 280 285Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro290 295 300Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn305 310 315 320Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn325 330 335Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys340 345 350Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala355 360 365Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp370 375 380His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp385 390 395 400Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn405 410 415Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala420 425 430Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp435 440 445Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Val Leu450 455 460Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala465 470 475 480Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile485 490 495Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu500 505 510Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro515 520 525Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly530 535 540Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser545 550 555 560Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser565 570 575Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu580 585(2)SEQ ID NO.20信息(i)序列特徵(A)長度1757鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株A/Johannesburg/33/94 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號肽編碼區(B)位置19到72(ix)特徵(A)名稱/符號SmaI限制性酶切位點(B)位置76到81(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA編碼區
(B)位置73到1731(ix)特徵(A)名稱/符號KpnI限制性酶切位點(B)位置1735到1740(ix)特徵(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1741到1747(ix)特徵(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1747到1757(xi)序列描述SEQ ID NO.20TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60GTTTCTAACG CGATTCCCGG GCAGGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTG120TGCCTGGGAC ACCATGCAGT GCCAA CGGA ACGCTAGTGA AAACAATCAC GAATGATCAA180ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGCTGGTT CAGAGTTCCC CAACAGGTAG AATATGCGAC240AGTCCTCACC GAATCCTTGA TGGAAAGAAC TGCACACTGA TAGATGCTCT ATTGGGAGAC300CCTCATTGTG ATGGCTTCCA AAATAAGGAA TGGGACCTTT TTGTTGAACG CAGCAAAGCT360TACAGCAACT GTTACCCTTA TGATGTGCCG GATTATGCCT CCCTTAGGTC ACTAGTTGCC420TCATCAGGCA CCCTGGAGTT TATCAACGAA AACTTCAATT GGACTGGAGT CGCTCAGGAT480GGGAAAAGCT ATGCTTGCAA AAGGGGATCT GTTAACAGTT TCTTTAGTAG ATTGAATTGG540TTGCACAAAT TAGAATACAA ATATCCAGCG CTGAACGTGA CTATGCCAAA CAATGGCAAA600TTTGACAAAT TGTACATTTG GGGGGTTCAC CACCCGAGCA CGGACAGTGA CCAAACCAGC660CTATATGTCC GAGCATCAGG GAGAGTCACA GTCTCTACCA AAAGAAGCCA ACAAACTGTA720ATCCCGGATA TCGGGTATAG ACCATGGGTA AGGGGTCAGT CCAGTAGAAT AGGCATCTAT780TGGACAATAG TAAAACCGGG AGACATACTT TTGATTAATA GCACAGGGAA TCTAATTGCT840CCTCGGGGTT ACTTCAAAAT ACGAAATGGG AAAAGCTCAA TAATGAGGTC AGATGCACCC900ATTGGCAACT GCAGTTCTGA ATGCATCACT CCAAATGGAA GCATTCCCAA TGACAAACCT960TTTCAAAATG TAAACAGGAT CACATATGGG GCCTGCCCCA GATATGTTAA GCAAAACACT 1020CTGAAATTGG CAACAGGGAT GCGGAATGTA CCAGAGAAAC AAACTAGAGG CATATTCGGC 1080GCAATCGCAG GTTTCATAGA AAATGGTTGG GAGGGAATGG TAGACGGTTG GTACGGTTTC 1140AGGCATCAAA ATTCTGAGGG CACAGGACAA GCTGCAGATC TTAAA GCAC TCAAGCAGCA 1200ATCGACCAAA TCAACGGGAA ACTGAATAGG TTAGTCGAGA AAACGAACGA GAAATTCCAT 1260CAAATCGAAA AAGAATTCTC AGAAGTAGAA GGGAGAATTC AGGACCTCGA GAAATATGTT1320GAAGACACTA AAATAGATCT CTGGTCTTAC AATGCGGAGC TTCTTGTTGC TCTGGAGAAC1380CAACATACAA TTGATCTAAC TGACTCAGAA ATGAACAAAC TGTTTGAAAG AACAAGGAAG1440CAACTGAGGG AAAATGCTGA GGACATGGGC AATGGTTGTT TCAAAATATA CCACAAATGT1500GACAATGCCT GCATAGGGTC AATCAGAAAT GGAACTTATG ACCATGATGT ATACAGAGAC1560GAAGCATTAA ACAACCGGTT CCAGATCAAA GGTGTTGAGC TGAAGTCAGG ATACAAAGAT1620TGGATTCTAT GGATTTCCTT TGCCATATCA TGCTTTTTGC TTTGTGTTGT TTTGCTTGGG1680TTCATCATGT GGGCCTGCCA AAAAGGCAAC ATTAGGTGCA ACATTTGCAT TTGAGGTACC1740AGATCTTAAT TAATTAA 1757(2)SEQ ID NO.21信息(i)序列特徵(A)長度571胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株A/Johannesburg/33/94 rHA(ix)特徵(A)名稱/符號AcNPV 61K蛋白信號序列(B)位置1到18(ix)特徵(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到569(xi)序列描述SEQ ID NO.21Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser1 5 10 15Asn Ala Ile Pro Gly Gln Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala20 25 30Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys35 40 45Thr Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val50 55 60Gln Ser Ser Pro Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Arg Ile Leu65 70 75 80Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His85 90 95Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser100 105 110Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser115 120 125Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu130 135 140Asn Phe Asn Trp Thr Gly Val Ala Gln Asp Gly Lys Ser Tyr Ala Cys145 150 155 160Lys Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His165 170 175Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn180 185 190Gly Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr195 200 205Asp Ser Asp Gln Thr Ser Leu Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr210 215 220Val Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asp Ile Gly Tyr225 230 235 240Arg Pro Trp Val Arg Gly Gln Ser Ser Arg Ile Gly Ile Tyr Trp Thr245 250 255Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu260 265 270Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile275 280 285Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Asn Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr290 295 300Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg305 310 315 320Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys325 330 335Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile340 345 350Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val355 360 365Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln370 375 380Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly385 390 395 400Lys Leu Asn Arg Leu Val Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile405 410 415Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys420 425 430Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu435 440 445Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu450 455 460Met Asn Lys Leu Phe Glu Arg Thr Arg Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala465 470 475 480Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn485 490 495Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr500 505 510Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu515 520 525Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser530 535 540Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys545 550 555 560Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile565 570(2)SEQ ID NO.22信息(i)序列特徵(A)長度39鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO.22TGGTTGGTCG CCGTTTCTAA CGCGATTCCC GGGGGTACC 39(2)SEQ ID NO.23信息(i)序列特徵(A)長度13胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.23Trp Leu Val Ala Val Ser Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr1 5 10(2)SEQ ID NO.24信息(i)序列特徵(A)長度43鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO.24TGGTTAGTCG CCTGTGCCTG CAGGCCAGAG AGGCCTTGGT ACC 43(2)SEQ ID NO.25信息(i)序列特徵
(A)長度18鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO.25GTCGCCGTGT CCAACGCG 18(2)SEQ ID NO.26信息(i)序列特徵(A)長度18鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO.26TAATTGGCCA GAGAGGCC 18(2)SEQ ID NO.27信息(i)序列特徵(A)長度39鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO.27GGGGGATCCG GTACCAGCAA AAGCAGGGGA TAATTCTAT39(2)SEQ ID NO.28信息(i)序列特徵(A)長度38鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO.28GGGGGTACCC CCGGGGACTT TCCAGGAAAT GACAACAG 38(2)SEQ ID NO.29信息(i)序列特徵
(A)長度44鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO.29CCCGGTACCG AATCATCCTA GAAACAAGGG TGTTTTTAAT TAAT 44(2)SEQ ID NO.30信息(i)序列特徵(A)長度47鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO.30GGGGAATTCG GTACCCCCGG GAAGGCAATA ATTGTACTACTCATGGT 47(2)SEQ ID NO.31信息(i)序列特徵(A)長度36鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO.31GGTACCCCCG GGGATCGAAT CTGCACTGGG ATAACA 36(2)SEQ ID NO.32信息(i)序列特徵(A)長度50鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO.32GGGGAATTCG GATCCGGTAC CTCACAGACA GATGGARCAAGAAACATTGT 50
權利要求
1.一種在培養的昆蟲細胞中的杆狀病毒表達系統中表達的重組流感HAO血凝素蛋白。
2.權利要求1的蛋白，進一步包括直接偶聯到HAO蛋白上，不含間插胺基酸的杆狀病毒信號肽。
3.權利要求1的蛋白，進一步包括藥用上可接受的載體以作為疫苗用藥。
4.權利要求1的蛋白，進一步包括佐劑和藥用上可接受的載體，作為疫苗用藥。
5.權利要求3的蛋白，其中藥用上可接受的載體是高分子傳遞系統。
6.權利要求1的蛋白，其中流感病毒選自流感病毒A株和流感病毒B株。
7.權利要求6的蛋白，其中流感病毒感染人類。
8.權利要求1的蛋白，進一步包括另一種與血凝素融合的蛋白。
9.權利要求8的蛋白，選自B肝病毒蛋白、HIV蛋白、癌胚抗原和神經氨酸酶。
10.一種用於製造重組流感HAO血凝素蛋白的載體，包含以下5′-＞3′序列來自杆狀病毒的多角體蛋白啟動子，ATG翻譯起始密碼子，信號肽，編碼來自一株流感病毒的成熟血凝素的序列，翻譯終止密碼子，以及多角體蛋白RNA聚腺苷酸化信號。
11.權利要求10的載體，其中信號肽是分子量約為61K的杆狀病毒蛋白，胺基酸序列列於序列表ID NO.7的前18個胺基酸。
12權利要求10的載體，其中信號肽是流感血凝素蛋白啟動子。
13.權利要求10的載體，其中編碼信號肽和血凝素的序列不編碼任何間插胺基酸。
14.權利要求10的載體，進一步包括編碼第二種蛋白的序列，該蛋白與血凝素以融合蛋白的形式表達。
15.權利要求10的載體，轉染進培養的昆蟲細胞中。
16.一種製造重組流感血凝素蛋白的方法，包括用載體感染培養的昆蟲細胞，該載體包含以下5′-＞3′序列來自杆狀病毒的多角體蛋白啟動子，ATG翻譯起始密碼子，信號肽，編碼來自選自流感病毒A株和流感病毒B株的流感病毒的血凝素的序列，翻譯終止密碼子和多角體蛋白RNA聚腺苷酸信號，以及在營養培養基中培養細胞。
17.權利要求16的方法，進一步包括從細胞中分離HAO流感血凝素蛋白，使其純度至少為95％。
18.權利要求17的方法，其中經過在鹼性pH下，從非膜蛋白中分離血凝素，洗膜結合蛋白以洗脫血凝素，從其他結合於陰離子交換樹脂的其它蛋白中通過改變pH值分離血凝素，以及從其他結合於陽離子交換樹脂的蛋白中通過改變鹽濃度分離血凝素來分離該蛋白。
19.一種製造載體的方法，該載體包含以下5′-＞3′序列來自杆狀病毒的多角體蛋白啟動子，ATG翻譯起始密碼子，信號肽，編碼來自一株選自流感病毒A株和流感病毒B株的流感病毒的血凝素的序列，翻譯終止密碼子和多角體蛋白RNA聚腺苷酸信號，該方法包括從細胞培養基中收穫病毒，就流感病毒A株分離病毒RNA，或就流感病毒B株分離mRNA；合成cDNA，對來自流感病毒A株的病毒RNA，用通用引物(5′-AGCAAAAGCAGG-3′(SEQ ID NO.1))，對來自流感病毒B株的mRNA，用隨機引物，其中5′和3′引物末端含血凝素基因中沒有的限制性酶切位點；擴增混合有血凝素基因片段的流感病毒A或B引物和流感病毒cDNA，產生含有完整成熟血凝素編碼序列的雙鏈DNA片段；鑑定血凝素基因的信號肽，然後擴增無信號肽的血凝素基因；和將無信號肽的血凝素基因克隆到含AcNPV多角體蛋白啟動子的載體中。
20.權利要求19的方法，其中用PCR將血凝素基因克隆到載體上，從而使此載體編碼的信號肽直接連於血凝素上，不含任何間插胺基酸。
21.權利要求19的方法，進一步包括將載體轉染進昆蟲細胞，選擇表達血凝素的細胞。
22.一種針對流感病毒接種動物的方法，包括給動物施用有效量的在培養的昆蟲細胞中的杆狀病毒表達系統中表達的重組流感血凝素蛋白HAO。
23.權利要求22的方法，進一步包括施用存在於高分子傳遞系統中的蛋白。
24.權利要求22的方法，其中流感病毒選自流感病毒A株和流感病毒B株。
25.權利要求22的方法，其中動物選自哺乳動物和鳥類。
26.權利要求22的方法，其中動物是人。
全文摘要
本發明提供了使用DNA技術製備重組流感疫苗的方法。所產生的疫苗是多價的,優選三價的,基於從具有流行潛能的流感病毒克隆的重組血凝素抗原混合物的流感疫苗。重組的血凝素抗原為全長的,未被切割的(HAO),從培養昆蟲細胞內的杆狀病毒表達載體產生,並在非變性的條件下純化的糖蛋白。在優選的實施方案中,通過切除天然的疏水信號肽序列並代之以一個新的杆狀病毒幾丁質酶信號肽來對克隆的HA基因進行修飾。還公開了用於從A亞型和B型流感病毒中純化rHA蛋白的有效提取和純化從昆蟲細胞中產生的重組HA蛋白的一般方法。
文檔編號C12N15/44GK1194005SQ95197928
公開日1998年9月23日 申請日期1995年5月26日 優先權日1993年9月13日
發明者G·E·史密斯, F·沃爾沃維茨, B·E·維爾金森, A·I·沃茲內森斯基, C·S·哈克特 申請人:Mg-Pmc有限公司