應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的方法
2023-05-28 20:11:21 1
專利名稱：應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的方法
技術領域：
本發明涉及辣根過氧化物酶提取純化的方法，尤其涉及一種應用單克隆抗 體親和吸附技術從辣根中提取純化辣根過氧化物酶的方法。
背景技術：
過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP， EC 1.11. 1.7)，通常來 源於辣根C4r膨racia rustica朋)(生長於歐洲和亞洲部分地區的多年生草本植 物)，因此稱辣根過氧化物酶，該酶是臨床檢驗試劑中的常用酶，不但用於 多個生化檢測項目，也廣泛運用於免疫類實驗檢測等，過氧化物酶作為免疫 類顯色體系的關鍵成分，對實驗結果和相關產品質量的影響至關重要。
辣根過氧化物酶服P比活性高，性質穩定，分子量小，所以被廣泛地應 用於生命科學的各個領域。HRP廣泛分布於植物界，辣根中含量高，它是由 無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。 HRP由至少 15同功酶(A1-A3， B1-B3， Cl， C2， D， El-E6)組成，其中以辣根過氧化物酶 C (HRPC)含量最高；HRP分子量為40，000，等電點為PH3 9 (酸性(A型)， 中性(B和C型)，鹼性(D和E型))，酶催化的最適PH因供氫體不同而稍 有差異，但多在PH5左右。酶溶於水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP 的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm， 一般以0D403nm / 0D275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值 應在3.0左右(最高可達3.4)。 RZ值越小，非酶蛋白就越多。
早在80年前，HRP已經被純化，並且被廣泛應用在生物學各個領域；傳統 的生產HRP的方法多是用硫酸銨和乙醇沉澱，這種方法不但產生大量廢料汙染 環境，酶的回收率低，純度低，而且酶的活性在純化過程也大大降低；在很多情況下，HRP需要通過親和吸附或者色譜分離技術進一步純化，曾經有學者分別
用刀豆蛋白A (Con A)和苯氧肟酸(BHA )色譜技術純化服P，但是不能有效 避免蛋白質的非特異性結合問題(HRP是一種糖蛋白)，生產的HRP純度不高。
發明內容
為了解決現有的HRP生產方法存在的回收率、純度和酶活性低的技術缺陷， 本發明的目的是提供應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的方 法，該方法通過單克隆抗體親和吸附技術提取純化辣根過氧化物酶，具有節約 時間，節約成本，不汙染環境，而且純化的辣根過氧化物酶純度高的特點。
為了實現上述的目的，本發明採用了以下的技術方案
應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的方法，該方法採用針 對辣根過氧化物酶具有高特異性和高親和力的單克隆抗體與載體填料的藕聯 物，通過親和層析的方法從辣根中提取、純化辣根過氧化物酶。
作為優選，上述的方法的步驟如下
① 採用上樣緩衝液勻漿辣根，離心去除沉澱；
② 將上清夜加入到單克隆抗體與載體填料的藕聯物親和填料，室溫孵育10 60分鐘；
③ 採用上樣緩衝液洗掉非結合雜蛋白；
採用酸性洗脫緩衝液解離被捕獲的辣根過氧化物酶HRP，並迅速用中和緩 衝液中和，得到所述的辣根過氧化物酶服P。 作為再優選，上述的上樣緩衝液採用PBS7.2;洗脫緩衝液採用0. 05M甘氨 酸-鹽酸緩衝液，PH2.7;中和緩衝液採用lMTris-Cl， PH8. 0。作為最優選，上 述的步驟④採用酸性洗脫緩衝液解離被捕獲的辣根過氧化物酶HRP的溫度為20 。C。作為優選，上述的載體填料採用瓊脂糖凝膠4B、瓊脂糖或免疫磁珠。作為
最優選，上述的載體填料採用瓊脂糖凝膠4B。
本發明由於採用單克隆抗體親和吸附純化HRP，不但節約時間，節約成本，
而且不會產生很多廢棄物，而且，與傳統方法相比，酶的活性將大大提高，符
合環境友好型和社會節約型社會建設需求。經此技術提取純化的HRP產品質優 價廉，將具有更強的市場競爭力，也符合技術發展對HRP越來越高的品質要求， 因此，本發明將取代傳統的沉澱純化方法。
具體實施方式
實施例1 高特異性高親和力單抗的篩選
從市場上購買針對HRP的特異性單抗，分別編號01-13，按照以下步
驟篩選
Q髙親和力單抗篩選
單抗捕獲HRP的能力測試在96孔酶標板中進行首先，用包被緩衝液 (50mM碳酸鹽，PH 9.6 )將特異性單抗按照不同濃度，100yL/孔，包被 於96孔酶標板中，4 。C過夜。用PBS/Tween-20 (0.05%)洗板後，將HRP 溶液分別加入包被特異性單抗孔和空白孔，100yL/孔，37。C孵育30分鐘； 再次洗滌後，加入即用型3， 3' ，5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)顯色液II (Biopanda)，室溫反應10分鐘，每孔加100uL終止液(2M H2S04)終止反 應，通過酶標儀讀取450 nm吸光值(0D4s。)，比較不同的特異性單抗的0D45。， 選取相同實驗條件下，OD，較高的單抗進行抗體對酶封閉活性測試。 ②單抗對酶封閉活性測試
首先，用包被緩衝液(50mM碳酸鹽，PH9.6 )將特異性單抗按照不同 濃度，10(^L/孔，包被於96孔酶標板中，4。C過夜。抗體對酶封閉活性測試也在96孔酶標板中進行，分別在包被特異性單抗和空白酶標孔中滴加
服P溶液，然後滴加100 Hl即用型TMB顯色液II (Biopanda)，室溫反應
10分鐘，終止液(2M H2S04)終止反應，通過酶標儀讀取450 nm吸光值(0045。)。
選取相同實驗條件下OD，較高的的單克隆抗體，與不同載體填料藕聯，進
行載體填料的篩選實驗。
實施例2 單抗藕聯用載體填料的篩選
本發明篩選範圍主要包括瓊脂糖凝膠4B，瓊脂糖和免疫磁珠，篩選主要考
慮如下因素載體的藕聯效率，穩定性，可循環利用次數和載體填料成本，篩 選程序如下
① 單克隆抗體與載體藕聯按照各個產品說明書進行操作，單抗與載體藕聯後 簡稱單抗藕聯物。
② 藕聯物吸附效力測試此項測試所選取的樣品為市售HRP，主要測試單抗藕聯 物吸附服P的能力。
用3倍藕聯物體積的緩衝液平衡藕聯物填料，取足量的HRP(溶於PBS溶液， 10mg/ml)與藕聯物室溫孵育1小時(或者4° C過夜)或者上藕聯物層析柱； 本實驗按照層析柱實驗流程(柱床體積為2ml)進行上柱流速為1.0ml/min， 上樣完畢，然後以同樣的流速用PBS緩衝液衝洗層析柱直到PBS衝洗液不再含 有蛋白質成分，洗脫緩衝液(0. 05M甘氨酸-鹽酸緩衝液，PH2. 7)洗脫HRP蛋白， 分管收集，每管lml，立即用1/10體積的中和緩衝液(lMTris-Cl， PH8. 0)中 和。分別測每管0D280吸收值，計算總蛋白量。蛋白量總量最高的為採用組
③ 穩定性測試將藕聯物分別放在4 。C和37 。C四個星期，每周檢測其吸附 服P能力，按照②藕聯物吸附效力測試方法進行；④可循環利用次數測試本藕聯物可被反覆多次重複使用，用標準HRP測試其
可以有效使用次數，測試按照②藕聯物吸附效力測試方法進行。
經過以上各項測試，綜合成本考慮，本發明優選瓊脂糖凝膠4B和單抗5 (Biopanda)藕聯為最佳組合。 實施例3純化條件的優化
通過改變洗脫液的不同離子濃度(NaCl濃度分別為0， 50mM， 100mM， 200mM， 500 mM) ， pH值(2.7， 3.0， 4.0， 5.0)和實驗溫度(4 。C， 20 。C， 37 。C)， 以上各項條件做正交實驗，實驗方案按照②藕聯物吸附效力測試方法進行。並
測試比較純化前後酶活性變化情況，酶活力測試按照以下實驗方案進行
用包被緩衝液(50mM碳酸鹽，PH 9.6 )將特異性單抗按照不同濃度， 100pL/ L，包被於96孔酶標板中，4 。C過夜。將上述各項條件純化的HRP， 稀釋到相同濃度，分別在包被特異性單抗和空白酶標孔中滴加5^1 HRP溶 液，然後滴加100 W即用型TMB顯色液II (Biopanda)，室溫反應10分 鍾，終止液(2M H2S04)終止反應，通過酶標儀讀取450 nm吸光值(0D45。)。 相同實驗條件下，0D45。最高的實驗組為條件最優實驗組。
選取對酶活性影響最小的作為純化的標準條件，標準條件為洗脫液的離 子濃度(NaCl濃度分別為50mM) ， pH值(2.7)，實驗溫度20 。C。 實施例4從辣根中純化HRP的操作流程
應用是以上篩選的實驗材料和優化的實驗條件小規模地從辣根中純化HRP
的基本操作流程如下
① 用上樣緩衝液(PBS 7.2)勻漿樣品；
② 1000rpm ， 10min離心去除沉澱；
③ 將上清夜加入到親和填料室溫孵育30分鐘；④ 用上樣緩衝液(PBS 7.2)洗掉非結合雜蛋白；
⑤ 洗脫緩衝液(0. 05M甘氨酸-鹽酸緩衝液，PH2. 7)解離被捕獲的HRP，並迅 速用中和緩衝液(1M Tris-Cl， PH8. 0)中和;
⑥ 純化得到的HRP的質量分析 HRP酶的活性檢測分析；
用包被緩衝液(50mM碳酸鹽，PH9.6 )將特異性單抗按照1 u g/ml濃 度，100uL/孔，包被於96孔酶標板中，4。C過夜。將HRP (SHINGENE)與 以上步驟純化的HRP，稀釋到不同濃度，分別在包被特異性單抗和空白酶標 孔中滴加5WHRP溶液，然後滴加100 W即用型TMB顯色液II (Biopanda)， 室溫反應10分鐘，終止液(2M H2S04)終止反應，通過酶標儀讀取450 nm吸 光值(0D45。)。相同實驗條件下，以上純化的HRP的0D45。高於HRP(SHINGENE)。
HRP產物的RZ值(OD403/OD275)測定；
RZ值(0D403/0D275) 二3. 15。
權利要求
1. 應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的方法，其特徵在於該方法採用針對辣根過氧化物酶具有高特異性和高親和力的單克隆抗體與載體填料的藕聯物，通過親和層析的方法從辣根中提取純化辣根過氧化物酶。
2. 根據權利要求1所述的應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的 方法，其特徵在於該方法的步驟如下① 採用上樣緩衝液勻漿辣根，離心去除沉澱；② 將上清夜加入到單克隆抗體與載體填料的藕聯物親和填料，室溫孵育10 60分鐘；③ 採用上樣緩衝液洗掉非結合雜蛋白；④ 採用酸性洗脫緩衝液解離被捕獲的辣根過氧化物酶HRP，並迅速用中和緩 衝液中和，得到所述的辣根過氧化物酶服P。
3. 根據權利要求2所述的應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的 方法，其特徵在於上樣緩衝液採用PBS 7.2;洗脫緩衝液採用0. 05M甘氨 酸-鹽酸緩衝液，PH2.7;中和緩衝液採用1M Tris-Cl， PH8.0。
4. 根據權利要求3所述的應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的 方法，其特徵在於步驟④採用酸性洗脫緩衝液解離被捕獲的辣根過氧化物 酶HRP的溫度為20°C。
5. 根據權利要求1或2所述的應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物 酶的方法，其特徵在於載體填料採用瓊脂糖凝膠4B、瓊脂糖或免疫磁珠。
6. 根據權利要求5所述的應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的 方法，其特徵在於載體填料採用瓊脂糖凝膠4B。
7. 根據權利要求1或2所述的應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物 酶的方法，其特徵在於針對辣根過氧化物酶具有高特異性和高親和力單克隆抗體的選取方法由高親和力單抗篩選和單抗對酶封閉活性測試組成。
8. 根據權利要求7所述的應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的 方法，其特徵在於高親和力單抗篩選方法如下① 市場採購針對HRP的特異性單抗；② 用包被緩衝液50mM碳酸鹽，PH 9.6，將特異性單抗按照不同濃度， 100uL/孔，包被於96孔酶標板中，4"過夜；③ 用PBS/Tween-20，洗板後，將HRP溶液分別加入包被特異性單抗孔和 空白孔，100uL/孔，37 。C孵育30分鐘；④ 再次洗滌後，加入即用型3， 3， ，5， 5，-四甲基聯苯胺TMB，顯色液 II，室溫反應10分鐘，每孔加100uL終止液2M H2S04終止反應，通 過酶標儀讀取450 nm吸光值0D45。；⑤ 比較不同的特異性單抗的0D4s。，選取相同實驗條件下，0D45。較高的單 抗進行抗體對酶封閉活性測試。
9. 根據權利要求7所述的應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的 方法，其特徵在於單抗對酶封閉活性測試方法如下① 用包被緩衝液50mM碳酸鹽，PH 9.6，將特異性單抗按照不同濃度， 100uL/孔，包被於96孔酶標板中，4。C過夜；② 抗體對酶封閉活性測試也在96孔酶標板中進行，分別在包被特異性 單抗和空白酶標孔中滴加HRP溶液；(D然後滴加IOO W即用型TMB顯色液II，室溫反應10分鐘，終止液2M H2S04終止反應，通過酶標儀讀取450 nm吸光值0D45。； ④選取相同實驗條件下0D45。較高的單克隆抗體。
全文摘要
本發明涉及辣根過氧化物酶提取純化的方法，尤其涉及一種應用單克隆抗體親和吸附技術從辣根中提取純化辣根過氧化物酶的方法。應用單克隆抗體親和吸附技術提取辣根過氧化物酶的方法，該方法採用針對辣根過氧化物酶具有高特異性和高親和力的單克隆抗體與載體填料的藕聯物，通過親和層析的方法從辣根中提取、純化辣根過氧化物酶。本發明採用單克隆抗體親和吸附純化HRP，不但節約時間，節約成本，而且不會產生很多廢棄物，而且，與傳統方法相比，酶的活性將大大提高，符合環境友好型和社會節約型社會建設需求。經此技術提取純化的HRP產品質優價廉，將具有更強的市場競爭力，也符合技術發展對HRP越來越高的品質要求，因此，本發明將取代傳統的沉澱純化方法。
文檔編號C12N9/08GK101531998SQ20091009790
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月23日 優先權日2009年4月23日
發明者關義海, 費小戰, 閻可廷 申請人:湖州英創生物科技有限公司