利用抗體庫陣列(ara)發現靶標特異性抗體的方法和組合物的製作方法

2023-05-29 13:14:56 1

專利名稱：利用抗體庫陣列(ara)發現靶標特異性抗體的方法和組合物的製作方法
技術領域：
本發明通常涉及對靶標抗原有特異性的抗體序列。確切的說，本發明涉及到包括自然人類抗體，含有該抗體的抗體陣列和表達該抗體的人類B細胞在內的發現方法及其化合物。本發明亦涉及到潛在治療性抗體的高通量和平行篩選方法。本發明還涉及到指向功能性抗原決定簇的抗體，這些抗原決定簇對應於靶標，疫苗和源於所述的抗體的治療方法。
背景技術：
可以識別細胞表面受體胞外域的單克隆抗體可以作為該受體的激動劑或者拮抗劑。單克隆抗體(MAb) 263是一種廣泛使用的單克隆抗體，它可以識別生長激素(GH)受體的胞外域(ECD)，它也可以在生物體內或者體外作為生長激素(GH)的激動劑。(Wan Y.，等人，Molecular Endocrinology 17(11) :2240-2250(2003))。然而，並不是所有的結合有受體的抗體都會顯示出與激動劑或者拮抗劑配對的活性。有些需要額外的構象變化引發信號。甚至並不是所有指向激素結合位點和作為激素結合競爭者得Mab都能夠充當激動劑並引發信號。(Rowlinson SW，等人，1998JBiol Chem 273 :5307-5314).有報導，將激動作用限制在一個很小的Mab範圍內作用於促紅細胞生成素受體，大量研究顯示該受體的96種Mab，僅有4種有激動劑活性(Elliott S，等人， 1996JBiol Chem 271 :24691-24697)。在需要延長半衰期的情形下或者可以期望減少頻繁治療的情形下，抗體刺激細胞表面受體的激動劑活性，使它成為非常有吸引力的治療選擇。為了觀察了解單克隆抗體怎樣激活受體，利用已知的抑制激動劑Mab定位抗原決定基的工作已經開始實行。進一步來講，在定位激動劑的細胞表面受體結合位點時，單克隆抗體可以加深我們對於受體的結構功能關係的理解。一種用人類巨核細胞培養的鼠類單克隆抗體，術語為BAH-I，可以專一性識別細胞表面促血小板生成素(TPO)的受體(C-Mpl)，顯示出激動劑活性。(Deng B.，等人， Blood,92(6) :1981-1988(1998)).目前特異性蛋白質檢測和定量測量的方法有基於抗原/抗體結合的免疫測定法， 包括經典的直接免疫測定，比如免疫擴散，免疫電泳，血液凝集和免疫沉澱反應實驗，還包括最近發展的一些方法，比如螢光免疫檢驗法，放射性免疫測定法(RIA)，酶免疫測定法(EIA)和蛋白質印跡法。這些方法利用的是抗原抗體間的專一性反應。但是這些方法每次只能分析一個試劑，限制了單次實驗中可以被分析的分子數量。為了優化人類抗體工程，研究者開發出了一系列的顯示方法。噬菌體顯示法具有能夠與分子庫內分子專一性結合的特點，是一種廣泛用於多肽和蛋白質分離的方法。抗體庫的噬菌體顯示法可以作為尋找靶標抗體片段的一種替代方法。在功能性基因和蛋白質方面，在篩選新型高親和力基和其受體時，噬菌體顯示法的使用在基因組學和蛋白質組學方面有至關重要的作用。顯示法使得許多疾病下確定主要化合物和路徑成為可能，這些疾病主要包括癌症，愛滋病(AIDQ，心血管疾病和自身免疫混亂。噬菌體顯示法具有能夠與分子庫內分子專一性結合的特點，是一種廣泛用於多肽和蛋白質分離的方法。抗體庫的噬菌體顯示法可以作為尋找靶標抗體片段的一種替代方法。在篩選新型高親和力基和其受體時，噬菌體顯示法的使用在基因組學和蛋白質組學方面有至關重要的作用。顯示法使得許多疾病下確定主要化合物和路徑成為可能，這些疾病主要包括癌症，愛滋病(AIDQ，心血管疾病和自身免疫混亂。一般的噬菌粒/輔助噬菌體體系的缺點是噬菌體的高傳染性背景，其不顯示目的蛋白質，但是與選擇靶標的非特異性結合會促使噬菌體繁殖。所述的問題和已提高的細菌的生長速率為不表達重組蛋白的異常噬菌體提供了有利條件，以上的兩個特點使得選擇效率大大降低。施用於抗體時，這一方法的主要缺點是會丟失輕鏈和重鏈的自然組合，並會產生很多假陽性組合。因此尋找輕鏈和重鏈(從自然免疫系統中發展起來的)的最優組合的可能性非常小。由人類後胚胎中心(POSt-GC)B細胞表達出的親和成熟的抗體預示著對傳染病和生化暴露治療的極大希望(Casadeval 1，A.，Pirofski，L. A. ,2005. Expert Opin. Biol. Ther. 5，1359)。這些抗體的最好來源可能是特定的傳染病恢復者或者疫苗接種者，並產生特定保護性抗體響應的人。人類抗體是由健全的人類免疫系統由於自身功能自然產生的抗體。自然抗體對人類病毒類疾病治療的效用已經被人超免疫球蛋白的治療實踐證實。三階段療法能夠利用人類外周血液B細胞產生穩定的雜合細胞群，這些雜合細胞可以很大程度上提高對抗肉毒桿菌神經毒素的親和成熟的人類IgG抗體的作用。在這個方法中，外周單核血液細胞(PBMC) (a)被選中來表達CD27，後胚中心B細胞的標記物，(b)通過體外培養來改進B細胞的增殖能力和等級轉換能力，(c)與已經基因改造的骨髓瘤細胞系融合。(Adekar等人，J Immunol Methods. 2008 Apr 20 ；333 (1-2) :156-66.)。自然抗體，作為一類，在一些方面與通過重組庫內細胞(噬菌體和基因改造的小鼠細胞)得到的抗體不同，它所特有的性質使其成為治療人類疾病的理想治療手段。 (參見 Dessain 等人，Exploring the Native Human Antibody Repertoire to Create Antiviral Therapeutics in Current Topics in Microbiology and Immunology 317 155-183 (2008)， Springer-Verlag New York)。更明確的表述是，通過人類B細胞表達得到的抗體相對於通過噬菌體得到的抗體有一個獨特的優點由於噬菌體法在產生所有原始或者自然輕鏈重鏈的配對物方面的限制，會阻止重要的抗體結構嵌入基於噬菌體的抗體庫中。因此，人們期望能夠得到高質量的由人類B細胞表達出的人類抗體，並利用高通量法進行病原體的檢測，診斷，治療。
進一步來說，並不是每一個源於病原體染色體組的潛在抗原決定基的免疫識別都是必須的。抗原集合和傳染性病原體的抗原決定簇的響應對於保護作用已經足夠。所以 「免疫性抗病毒藥物」基於這樣一個概念，即對抗原集合和與宿主免疫系統相互作用的抗原決定基的響應就可以滿足保護的需要，並不需要對整個有機體響應。對癌症的有效免疫響應也經常限制到被腫瘤影響的免疫系統範圍。因此，人們希望能夠獲得與任何傳染或者腫瘤相關的人類免疫系統的抗體庫。目前此篩選抗體庫方法的另一個缺點是我們得到的信息本質上是基於抗體結合目標的能力，在結合到目標物時，只能提供很少或者不能提供基於抗體功能性影響篩選作用。九十年代見證了基因技術和蛋白質技術的快速發展，使開發一整套新目標物變得非常有希望。對正常組織和腫瘤組織的核苷鏈和蛋白質鏈的高通量篩選和計算機輔助分析揭示了在蛋白質水平下的細微差別，在理論上可以瞄準癌症治療。然而，沒有獲得任何一種臨床上可以應用的或者被證實的靶標。在表達模式上的細微差別可能並不是那麼重要，而腫瘤選擇性功能可能更加相關。新的抗原決定基水平上的靶標物的調查是為了確定哪些可以給腫瘤細胞帶來功能性區別，因為與一個抗原決定基的結合可以帶來信號傳播的變化，而與另一個抗原決定基的結合可能會產生不同的性質。這樣在單一治療失去效力的情況下，允許使用聯合治療法或者利用阻礙不同功能和互相影響的抗體的二階治療法。舉例來說，TRASTUZUMAB (HERCEPTIN ⑧；Genentech，San Francisco, CA)是一種重組人類單克隆抗體，目標為HER-2(人類表皮生長因子受體2;erb-B2 ；neu)酪氨酸激酶受體的胞外域。臨床研究證實TRASTUZUMAB 有抗轉HER-2過量表達移性乳腺癌的活性，美國食品藥品監督局於1998年批准其上市(Carter P，Presta L，Gorman CM, ^A Humanization of an anti-pl85her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA(1992)89 :4285-4289.) 另外一種以HER-2為靶標物的單克隆抗體， PERTUZUMAB (0ΜΝΙΤ ARG ，2C4 ;Genentech)最近正在患有不同類型實體瘤的癌症病人中進行第一階段的臨床試驗。為了和TRASTUZUMAB 對照，PERTUZUMAB 通過空間上阻礙HER-2和其他的HER受體的二聚作用來發揮效力，它阻礙了 HER-2/EGFR和HER-2/HER-3 異二聚體(Agus DB，等人Cancer Cell (2002) 2 :127-137.)發出的配基活性信號。由於大部分初始就對TRASTUZUMAB 有反應的乳腺癌患者一年內就會復發(Cobleigh MA,等人J ClinOncol 1999 ；17 :26394648)，研究發現用 TRASTUZUMAB 和PERTUZUMAB 聯合治療可以協同阻礙HER-2過量表達BT474乳腺癌細胞的存活。(Nahta R.，等人Cancer Res. 64， 2343-2346(2004))。因此，人們希望能夠得到下述抗體庫，其中的抗體可以用快速檢測或者高通量檢測的方式按照功能或者抗原決定基特異性分類。erbB2致癌基因編碼增長因子受體。經證實erbB2基因的過量表達與越來越多的侵略性腫瘤和低水平預後相關。針對這個分子的抗體在體內有抗癌作用，但是有些沒有此作用。(Wang等人MoI Immunol. 2004 Feb ；40 (13) :963-969)。顯然，有些抗原決定基與 erbB2腫瘤生長功能相關，有些則不相關。因此，需要在給定目標下，對抗原決定基進行全面的空間性能研究。

發明內容
以下針對不同實施方案方法、組合物和試劑盒的實施方案的描述將不在任何方面作為對附上的權利要求的限制的解釋。本發明涉及一種人類抗體發現方法，該方法有利於促進基於人類抗體的新型、有效的治療方法，診斷方法和預測方法的開發。本項發明提供了一種建立包含有與人體內構象相同的抗體庫的方法。本發明將進一步提供一個新型的包含人類抗體庫中抗體的抗體庫陣列(ARA)，來發現瞄準特定抗原的人類自然抗體。通過應用本發明的ARA，本發明可提供包含有瞄準特定抗原的人類自然抗體的新型組合物和試劑盒。本發明涉及一種快速鑑別有特異性功能的單克隆抗體的方法，該單克隆抗體來自於一系列指向特異性靶細胞表面分子單克隆抗體，比如受體。本發明可以提供新型組合物和試劑盒，所述的組合物和試劑盒包括瞄準特定抗原的人類自然抗體，並具有通過利用本發明中的靶標特異性抗體庫陣列(ARA)發現的特異性功能。本發明涉及一種篩選有生物學功能的單克隆抗體的方法，該方法包括提供一個含有眾多指向細胞表面特異性靶標分子的單克隆抗體的抗體庫陣列(ARA)，還包括將此ARA 與細胞表面存在特異性靶標分子的細胞聯繫起來，並確定哪些單克隆抗體對細胞表面的特異性靶標分子有抑制作用或者促進作用。此方法進一步包括使ARA與通信細胞接觸，其中的通信細胞被改造為當其與通信細胞表面靶標分子的激動劑或拮抗劑接觸時會表達可檢測性信號；在生成可檢測性信號必須底物存在的情況下，用單克隆抗體培養通信細胞，其中可檢測性信號水平上的變化就可以顯示出單克隆抗體細胞表面靶標分子激動劑或者拮抗劑的功能的存在。在一些情況下，存在於細胞表面的特異性靶標分子就是受體分子。在一些情況下，受體從以下這組物質中選擇，這些物質包括外周膜蛋白受體，跨膜受體，代謝性受體，G蛋白偶聯受體(GPCR)，酪氨酸激酶受體，鳥苷酸環化酶受體，對胞外配基響應的離子型受體，酪氨酸激酶受體，細胞因子受體，鳥苷酸環化酶受體，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體，胰島素受體，胰島素樣生長因子受體，人類生長激素受體，葡萄糖輸運， 鐵轉蛋白受體，表皮生長因子受體，低密度脂蛋白受體，瘦素受體，白細胞介素受體，IL-I受體，IL-2受體，GPCRs，毒蕈鹼乙醯膽鹼受體，腺苷受體，腎上腺素受體，伽馬氨基丁酸受體， 血管緊張素受體，大麻酯受體，膽囊收縮素受體，多巴胺受體，胰高血糖素受體，代謝型穀氨酸受體，組胺受體，嗅覺受體，阿片受體，視紫紅質，分泌素受體，血清素受體，生長激素抑制素受體，鈣感受受體，生長因子受體，共刺激因子受體，蛋白激酶受體，T細胞受體，B細胞受體，ITIM含受體，ITAM含受體，TNFR總科組分，TNF受體總科，離子通道，和趨化因子受體。在一些方面，抗體起著受體蛋白全激動劑，部分激動劑，拮抗劑或者反拮抗劑的作用。一些實施方案中，可檢測信號有螢光劑，化學染料，放射性結合試劑，化學發光結合試劑，電化學發光試劑，磁性結合試劑，順磁性結合試劑，可生成有色物質的酶，可生成化學發光物質的酶，可生成磁性物質的酶或者釕。本發明與篩選方法相關，其中細胞表面分子的激活作用與作用於底物的酶的活力相關的胞內信號途徑相耦合。在一些實施方案中，酶從以下這些酶組成的本組物質中進行選擇，這些酶包括 β-內醯胺酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，α-甘露糖苷酶，β -甘露糖苷酶，酸性磷酸酶，鹼性磷酸酶，磷酸二酯酶II。
在一些實施方案中，底物從以下底物中進行選擇，這些底物包括對氨基苯-β -D-吡喃半乳糖苷，對氨基苯-α -D-吡喃半乳糖苷，對氨基苯-α -D-吡喃葡萄糖苷， 對氨基苯-β -D-吡喃葡萄糖苷，對氨基苯-α -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯-β -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯磷酸鹽和對氨基苯磷酸膽鹼或其衍生物。在一些實施方案中，酶對底物的作用可以與化學反應，發光反應，顯色反應或者螢光反應相耦合。本發明涉及一種篩選方法，進一步包括在抗體功能檢測前利用流體剪切力從 ARA表面除去未結合的通信細胞。在一些方面，ARA試驗在96或者384孔板中進行。每個孔中都有從單個B細胞克隆中得到的單克隆抗體，其中單克隆抗體的濃度足夠從細胞表面靶標分子中得到反應信號。每個孔中都可以與IO3以上通信細胞進行接觸。在一些實施方案中，每孔都可以與少於 IO3通信細胞接觸，允許細胞在適宜的條件下生長直至每個孔中都達到或超過IO3個信號細胞，能夠產生可檢測信號。一些情況下，可檢測性物質可能是或者不是通信細胞分泌的，信號檢測在各個孔中，也即物質生成的地方進行。一些情況下，每個孔中都可以與通信細胞接觸，通信細胞在適合細胞生長的條件下增殖，直至達到103，IO4, IO5或者更多。細胞生長條件同樣適合於可檢測物質的表達。一些情況下，本篩選法為高通量篩選。一些情況下，本篩選法為高含量篩選。一些情況下，可檢測性物質是細胞表面靶標分子激活過程中間接產生的。—些情況下，細胞表面靶標分子信號路徑的激活可以和β -內醯胺酶表達關聯起來，內醯胺酶的表達可以用螢光能量共振轉移(FRET)反應的底物來量化。本發明提供了一種可以生產抗體庫的方法，該方法包括從每一個有效數目的人類供體內得到至少10 細胞，形成一個B細胞群，所述的細胞群包含至少105，優選至少106， 更加優選至少IO7不同種類自然生成的抗體。其中的每一個抗體都有自然配對的重鏈和輕鏈，以充分表現整體人類免疫系統；將所述的B細胞群劃分成不同B細胞亞群，每個亞細胞群平均都可以產生1，5，10，20，50或者100種不同種類抗體；將每個B細胞亞群擴增為B細胞系；在擴增前或者擴增後，將所述的任一個B細胞永生化以產生永生化的B細胞；在B細胞可以將抗體分泌到培養基的合適條件下培養所述的B細胞培養；將所述的抗體附著或者分配到固體表面的特定位置，從而產生抗體陣列。進一步，本方法包括確定對所述的靶標有特異性的抗體。本方法可以進一步包括確定哪個永生化或者非永生化B細胞系能夠生產所述的靶標抗體和從B細胞培養中分離產生所述的靶標抗體的B細胞的步驟。本發明提供從一個或者多個單個供體中生產抗體的方法，該方法包括從所述的一個或者多個單一供體中利用自然表達出的抗體獲得至少IO4個B細胞；將所述的B細胞分成可生產至少一個抗體以上的亞細胞群，優選的亞細胞群可以產生約1-100個抗體；將每個B細胞的亞細胞群增殖以得到一個擴增的B細胞系；任選地在擴增前或擴增後固定每一個所述的B細胞系的每個細胞以生產固定化B細胞系；在所述的B細胞可以分泌抗體到所述的培養基的條件下培養所述的B細胞系中的每一個細胞；將所述的抗體固定到固體表面的特定位置。本方法可以進一步包括以下步驟篩選針對一靶標的所述的抗體。
本發明提供的方法中所述人類供體數至少10，50，100或者500。本發明提供的方法中所述B細胞群被分成至少10，20，50，100，1000，104，直至IO7 個亞細胞群。本發明包含一個含有至少105，優選至少106，更加優選至少IO7個自然產生、有自然配對的Vh區和\區的抗體庫，所述的抗體由人類B細胞，優選由永生化的人類B細胞表達得到，其中B細胞從一個足夠多樣的人類群體中獲得，以至於所述的抗體庫中的這些抗體具有與全部人類免疫實質上類似的結合活性的多樣性。本發明提供了一個陣列和一個抗體庫，它們包括至少105，優選至少106，更加優選至少IO7或者更多自然表達的人類抗體，所述的抗體有自然配對的與Vh和\區，是由人類 B細胞表達的。在一些實施方案中，該抗體庫或者ARA可以識別至少IO5不同的特異性抗原或者靶標，優選至少可以識別106，更加優選至少IO7或者更多不同的特異性抗原或者靶標。 參見US 6319690，通過在此引證全部全部併入本申請。本發明提供了一個由人類B細胞群組成的庫，B細胞可以產生至少105，優選至少 106，更加優選至少IO7或者更多的不同種類的自然生成的抗體，所述的抗體有自然配對的與Vh和\區。所述的人類B細胞群被分為多個B細胞亞群，每個亞群平均可以產生1-100 不同種類的抗體，所述的人類B細胞可以從足夠多樣的病人獲得，以至於由所述的庫內B細胞所產生的抗體具有與完整的人類免疫實質上相似的結合活性的多樣性。本發明提供了一種建立非永生化B細胞庫的方法，該方法包括從每個有效數量的人類供體中獲得至少IO4記憶B細胞；製備人類B細胞群，所述的B細胞群包含至少IO5 個不同種類的自然產生的抗體，優選至少106，更加優選至少IO7或者更多個不同種類的自然產生的抗體，其中所述的每個抗體都有自然配對的與重區和輕區；將所述的B細胞群分為多個B細胞亞群，每個亞細胞群平均可以產生1-100個不同種類的抗體；任選地，擴增B 細胞亞群生產擴大的B細胞系；在適合保存亞細胞群RNA的條件下存儲每一個細胞亞群，這樣能夠產生平均每個B細胞群可以表達1-100個不同種類的抗體的非永生化B細胞群庫。 該方法進一步包含下述步驟製備與所存儲的B細胞亞群相應的RNA樣本；在RNA樣本上， 實現逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)；分離對應於可以自然配對的Vh區和Vl區的DNA ；在適合表達所述的Vh區和\區的宿主上克隆所述的DNA ；並在免疫球蛋白重鏈和輕鏈存在的情況下表達所述的Vh區和\區，這樣就可以形成自然配對的免疫球蛋白(Ig)。本發明提供了一種分離靶標特異性抗體的方法，該方法包括從曾被靶標影響的人類供體中獲得B細胞，其中所述的B細胞群包含至少IO5不同種類的自然產生的與重鏈和輕鏈自然配對的抗體；將所述的B細胞群分為多個B細胞亞群，每個亞群平均可以產生 1-100種不同種類的抗體；在所述的B細胞分泌抗體到培養基的情況下，擴增B細胞亞群以得到擴增的B細胞培養；將所述的分泌到培養基中的抗體分配到固體表面特定位置，建立抗體庫陣列(ARA)；用天然靶標分子探測該抗體庫陣列來確定一個或者更多對所述的靶標有特異性的抗體群；利用對應於對所述的靶標有特異性的抗體群的B細胞培養製備RNA樣品；在眾多RNA樣品上實現逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)；分離Vh區和Vl區對應的可以自然配對的DNA ；在適合表達所述的Vh區和\區的宿主內，克隆所述的對應於Vh區和\區的DNA ；在免疫球蛋白重鏈和輕鏈存在的情況下表達所述的Vh區和\區，這樣就可以形成自然配對的免疫球蛋白。一些實施方案中，靶標為病毒，細菌，酵母，寄生蟲，真菌或者其他病菌。一些實施方案中，靶標分子為病毒粒子，病毒樣粒子，被病毒感染的細胞或者病毒蛋白質。在一個實施方案中，靶標為人類免疫缺陷病毒(HIV)。在一方面，本方法進一步包括，提供了一系列靶標物，這些化合物包括多種類型靶標物和相同靶標的不同血清類型；並且可以確定可交叉反應的抗體。本發明包括用以下任一方法製備的抗體庫陣列(ARA)。本發明提夠了一種基於成簇的抗原決定基篩選抗體的方法，本方法包括從對應某靶標蛋白的基因片段中得到基因片段抗菌素顯示法(GFPD)庫，其中GFPD庫中的成員依照與一個或者多個抗原決定基團的關係歸類成組；提供完整的靶標蛋白；提供從預先暴露在足量靶標下能引起免疫反應的實驗者血樣中取得的抗體庫陣列(ARA)。用完整靶標分子和來自於靶標的有抗原決定基特異性的成簇的GFPD庫成員探測該ARA ；確定一個或者多個對所述的靶標有特異性的抗體群和至少一個抗原決定簇；利用對應於對所述的抗原決定簇有特異性的抗體群的B細胞培養製備RNA樣品；在眾多RNA樣品上實現逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)；分離對應與可以自然配對得Vh區和\區的DNA ；在適合表達所述的Vh區和 Vl區的宿主內，克隆所述的對應於Vh區和\區的DNA ；在免疫球蛋白重鏈和輕鏈存在的情況下表達所述的Vh區和\區，這樣就可以形成自然配對的免疫球蛋白。在一方面，本方法進一步包括利用完整的靶標和GFPD庫成員基於ARA的識別模式確定新的抗原決定基。該方法包括下述附加步驟利用對應於對所述的抗原決定簇有特異性的抗體群的B細胞培養製備RNA樣品；在眾多RNA樣品上實現逆轉錄聚合酶鏈式反應 (RT-PCR)；分離對應與可以自然配對得Vh區和Vl區的DNA ；在適合表達所述的Vh區和\區的宿主內，克隆所述的對應於Vh區和\區的DNA ；在免疫球蛋白重鏈和輕鏈存在的情況下表達所述的Vh區和\區，這樣就可以形成自然配對的免疫球蛋白。依據所述的方法，本發明涉及一種通過表達特定和克隆區和\區鏈製備的治療性抗體。本發明涉及一種製備基因片段噬菌體顯示(GFPD)庫的方法，其中該GFPD成員依照與一個或者多個抗原決定基關係是成簇存在的，通過以下方法實現提供可以編碼靶標蛋白的基因；將所述的基因分為基因片段；製備由GFPD庫成員組成的噬菌體顯示庫；根據有靶標特異性的人類抗體淘選GFPD庫；依據其與一個或者多個抗原決定簇的關係對GFPD 進行分組。本方法進一步包括對GFPD庫成員分組；將GFPD庫成員覆蓋到靶標物已知的三維結構表面，其中靶標物的功能是與部分已知的靶標物三維結構相關的。本發明涉及一種檢測兩個或多個其中本申請描述的方法所確定的抗原決定簇之間協同作用的方法，該方法包括製備表達Vh區和\區第一自然配對的免疫球蛋白，其中Vh 區和\區序列得自於對不同抗原決定簇有特異性的抗體群；製備表達Vh區和\區第二自然配對的免疫球蛋白，Vh區和\區序列得自於對不同抗原決定簇有特異性的抗體群；在檢測系統中分別和組合執行第一自然配對和第二自然配對的免疫球蛋白來測量完整靶標的活性；檢測新的與已知功能相關的抗原決定基的活性或者協同作用活性。本發明提供小分子和治療性抗體製備，該抗體可以有效調整已結合有一個或多個以上所述的抗原決定簇的靶標的功能。本發明提供一種疫苗製備方法，包括對本申請所述方法決定的功能性抗原決定簇有效的抗體。
本發明提供一種由可轉變細胞表面受體功能的治療性抗體組成的試劑盒。本發明提供一種可篩選具有特定功能的單克隆抗體的試劑盒，該試劑盒包括由指向細胞表面特定靶標分子的抗體組成的抗體庫陣列(ARA)；和任選地，通信細胞，其中通信細胞被改造成當與通信細胞表面激動劑或者拮抗劑接觸時能夠表達可檢測性信號。本發明和本發明的其他研究對象，特點和優點在以下具體實施方式
、附附圖和實施例中進一步說明。


附圖1是利用抗體庫陣列來發現抗體過程的示意附圖。附圖2是利用ARA平臺技術發現抗HIV單克隆抗體過程的示意附圖。附圖3是開發對應於人類基因的抗原決定基庫的噬菌體顯示法過程的示意附圖。附圖4是利用全蛋白質或者病原體作為靶標和利用單個抗原決定級作為靶標篩選ARA過程的示意附圖。附圖5是指向靶標上單個功能性抗原決定基的特異抗體群分離過程的示意附圖。
具體實施例方式沒有進一步細節描述的情況下，根據以下描述，本領域的技術人員能夠將本發明進行充分擴展。以下描述僅為說明性描述，任何條件下不作為對本發明公開的其餘部分的限制。將被動抗體治療應用於傳染病治療的功效和必要性已經被公眾認胃。(Keller and Stiehm. Clin. Microbiol. Rev. 13 :602-614(2000) ；Oral HB.等人 MoI. Biotechnol. 21 :225-239 (2002) ；Casadevall 等人 Nat. Rev. Microbiol. 2 695-703(2004).)從病毒性傳染病中康復的人和接種含有抗體群的治療性疫苗的人可以獲得對病毒的終身免疫。這些「天然抗體」有與人類免疫系統活動時產生的構想完全一致的成對的重鏈和輕鏈。它們與用重組細胞系統或者基因改造的小鼠系統產生的人類或者人類化抗體不同，它們不會複製由人類系統自然產生的抗體全長的「野生型」結構。天然人類抗體庫擁有發展新型單克隆治療法的未開發潛力。天然人類抗體庫有對人類疾病明確的免疫學解決辦法，而且它很可能是臨床應用上最安全的方法。儘管以前人們採用靜脈內免疫球蛋白(IVIG;利用血漿中的自然IgG)的多克隆抗體療法，本發明涉及一種更有效的新方法的開拓，涉及到克隆天然人類抗體的治療潛力。目前已經構建出抗體庫或者抗體陣列(參見US4^9010和4591570，均通過在此引證全部併入本申請)；然而正如本申請所描述和聲明的，目前沒有任何人類自然抗體庫或者ARA能夠實質上包括所有人類天然免疫。本發明提供一個用來發現抗體的抗體庫陣列(ARA)。一方面，高通量、多元和可升級的平臺可用於對給定供體或者供體庫的抗體庫做全面的探測。另一方面本發明提供了一個大型候選庫，以提高檢定有獨特功能特點的高質量抗體的機率。本發明涉及一種從抗體庫陣列(ARA)的眾多單克隆抗體中快速識別有特定功能抗體的方法。。一方面，高通量、多元和可升級的平臺可用於對給定供體或者供體庫的抗體庫做全面的探測。另一方面本發明提供了一個大型候選庫，以提高檢定有獨特功能特點的高質量抗體的機率。受體是嵌入在細胞膜或者細胞質中，移動信號分子可能接觸的蛋白分子。與受體結合的分子叫做配基，有可能是肽(比如神經傳遞素)、激素、藥物分子、毒素或者抗體，當其與激動劑成鍵是，受體會發生能夠引起細胞響應的構象變化。有些配基(比如拮抗劑) 很少在不引起任何反應的情況下阻礙受體。配基誘導的受體變化會導致生理學上的變化， 即配基的生理活性。依據本發明受體包括外周膜蛋白受體，跨膜受體，代謝性受體，G蛋白偶聯受體 (GPCR)，酪氨酸激酶受體，鳥苷酸環化酶受體，對胞外配基響應的離子型受體等等。跨膜蛋白可能包括一個或多個跨膜域。例如酪氨酸激酶受體，一些細胞因子受體，鳥苷酸環化酶受體和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體包含一個單個的跨膜域。然而，包括離子通道和腺嘌呤環化酶的各種其他的蛋白質包含多個跨膜域。由於它們包含7個跨膜區，所以很多重要的細胞表面受體被歸類為「七跨膜域(7TM)」蛋白，重要的跨膜蛋白受體包括但不限於胰島素受體，胰島素樣生長因子受體，人類生長激素受體，葡萄糖輸運，鐵轉蛋白受體，表皮生長因子受體，低密度脂蛋白受體，瘦素受體，白細胞介素受體，比如IL-I受體，IL-2受體等等。GPCR包括毒蕈鹼乙醯膽鹼受體，腺苷受體，腎上腺素受體，GABA受體，血管緊張素受體， 大麻酯受體，膽囊收縮素受體，多巴胺受體，胰高血糖素受體，代謝型穀氨酸受體，組胺受體，嗅覺受體，阿片受體，視紫紅質，分泌素受體，血清素受體，生長激素抑制素受體，鈣感受受體，趨化因子受體，細胞因子受體，諸如此類。信號轉換中會涉及到某些受體。跨膜域的特徵包括大約20個連續的被帶電胺基酸跟隨的疏水胺基酸。因此，基於特定蛋白質的胺基酸序列的分析，可以預測蛋白質內的跨膜域的位置和數量。跨膜蛋白的胞外域是多種多樣的，然而在各種胞外域多次重複發現保守序列。保守結構和/或功能已被歸於不同的胞外主題。舉例來說，細胞因子受體的特點是半胱氨酸簇和WSXWS(W=色氨酸，S=絲氨酸，X=任意胺基酸)。免疫球蛋白樣域是高度保守的。粘液素樣域可能與細胞粘附有關，富亮氨酸重複參與到了蛋白-蛋白相互作用中。與其他分子結合時會涉及到很多胞外域。一方面，胞外域就是受體。與受體域結合的因子包括循環配基，可能是多肽，蛋白質或者小分子，比如腺苷等等。舉例來說，生長因子，比如EGF，FGF和PDGF是循環生長因子，會與它們的同源受體結合來引發各種細胞反應。 其他影響因子包括細胞因子、有絲分裂因子，神經因子等等。依照本發明，功能性單克隆抗體可以和細胞表面蛋白胞外特定域互相作用，並直接或者間接性的引發生物學反應。激動劑可以激活受體並導致強烈的生物學反應。大多數自然配基都是全功能激動劑。相對於全功能激動劑來說，部分激動劑不會徹底激活受體，它們只能引發部分反應。拮抗劑可以與受體結合但是不會激活受體。這樣就會導致受體阻礙，抑制其他激動劑的結合。 反激動劑通過抑制受體基本活性，會降低受體活力。與受體結合的單克隆抗體有任一種或者多種所述的作用。本發明使單個樣品或者群體中痕量(IO5-IO6分之一，)抗體的靈敏檢測成為可能。 本方法中還提供了在短時間內(三個月或者更短時間)識別和確定靶標特異性天然人類抗體群的方法。此外，本發明的方法允許在自然構象下，利用天然人類抗體，在自然配對的重鏈和輕鏈下對靶標分子進行探測，從而實現有靶標特異性的高質量抗體的篩選。從人類供體得到的人類IgG+記憶B細胞單個個體中，人類免疫系統包含101 細胞純系型和IO9以上的組合抗體(Jerne NK, Scand J Immunol. 38(1) :1-9(1993))。然而，其中所用的B細胞群包含至少IO5不同種類的IgG抗體，優選至少106，更加優選至少IO7不同種類的IgG抗體，IgG抗體可以視為人類對疾病、機能失調和傳染病抗原自然免疫響應的代表。每個供體中至少收集10 細胞。 其中預期得到的人類天然抗體庫和陣列充分包含完整的人類免疫系統對疾病、機能失調或者傳染病響應時所可能產生的抗體，通常從10不同供體中收集至少105，優選至少106，更加優選至少IO7不同種類的自然產生的抗體。靜脈內免疫球蛋白(IVIG)含有從血漿中獲得的純化的自然人類抗體群，可以反映出其生成體的集體抗體免疫的情況。人們注意到，不同地域的供體庫特定抗體的濃度不同。因此，本發明中供體庫是由不同地域的供體中採集到的，從而提高靶標特異性抗體的多樣性。本發明中一方面，供體群包括未治療過的患者，未被一般病原體感染的正常人，或者已經接受常規疫苗治療的病人。另一方面，本發明中所述瞄準特異性傳染病病原體或人類疾病的抗體是人們期望的供體庫，選擇出來用於患有常見病的患者，或已被感染的或針對接種常見傳染病疫苗的人。實施方案中，供體被目標疾病感染，例如傳染病，比如流行性感冒病毒，肝炎病毒C (HCV)，單純皰疹病毒(HSV)，人類免疫缺陷病毒(HIV)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)，埃-巴二氏病毒(EBV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，假單胞菌，假絲酵母；呼吸障礙如哮喘，過敏症，慢性障礙性肺病(COPD)，先天性肺纖維化(IPF)，成人呼吸窘迫症候群(ARDS)， 代謝障礙比如虛弱，惡病體質，肌消失症，肥胖，血脂異常，代謝綜合症，心肌梗塞(MI)，慢性腎衰竭(CRF)，骨質疏鬆症的腸易激症候群的消化系統紊亂(IBS)，炎性腸病(IBD)，克羅恩氏病(節段性迴腸炎)，脂肪肝，纖維症，藥物性肝病；神經障礙包括阿耳茨海默氏病(早老性痴呆病)，多發性硬化(MQ，帕金森氏症，牛海綿狀腦病(BSE，狂牛症)；腫瘤包括乳腺癌， 腎癌，胃癌惡性黑色素瘤，肺癌，結腸癌，神經膠質瘤，淋巴瘤和前列腺腫瘤。在一個實施方案中，為確定治療相關靶標的抗體的存在進行B淋巴細胞篩選，所述的靶標物包括與神經狀況相關的多肽，細胞因子，趨化細胞因子，生長因子，粘附分子，共刺激分子，瘤細胞抗原，惡性腫瘤細胞抗原及其受體。多肽與多種神經變性疾病相關，比如亨丁頓舞蹈症(HD)，帕金森氏症(PD)，阿爾茨海默病(AD)，和肌萎縮性側索硬化(ALQ包括亨廷頓蛋白，重組人蛋白-1，雄激素受體， 共濟失調蛋白1，共濟失調蛋白2，共濟失調蛋白3，CACNA1A(鈣離子通道，電壓增益，P/Q類型，αΙΑ亞單位)，共濟失調蛋白-7，α-突觸核蛋白(synuclein)，澱粉樣前體蛋白(APP)， τ，β-澱粉樣蛋白，低分子量神經纖維(LNF)，α-絲連蛋白，外周蛋白，N-Cor，mSin3a， CBP(c-AMP_應答元件結合蛋白)，α-銜接蛋白，α-l-抗胰凝乳蛋白酶，synphilin-Ι，泊蛋白，UCH-Ll(泛素羧基端酯酶Li)，hip-Ι，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶-1，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶-2，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶_3，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶-6，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶_8，需鈣蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，組蛋白乙醯轉移酶2 (HD AC2)，穀氨醯胺轉移酶，多聚穀氨醯胺結合蛋 S -1 (PQBPl), β-突觸核蛋白，Y-突觸核蛋白，SODl，載脂蛋白E (APOE)，hip-Ι，早老素 PS-I，和早老素PS-2。細胞因子是各種多肽媒介物的一個統稱，它與很多生理功能包括免疫系統和炎症反應的激活有關。細胞因子包含且不限於下述物質白細胞介素(IL-Ia，IL-I β，ILIra 和IL-2到IL-18)，腫瘤壞死因子(TNF- α和TNF-β)，幹擾素(INF-α，β和γ)，克隆朿Ij 激因子(G-CSF，M-CSF，GM-CSF，IL-3和其他白細胞介素)和生長因子(EGF，FGF，PDGF， TGFa，TGF β，BMP, GDF，CTGF和ECGF)。細胞因子包含且不僅限於心營養素_1 (CT-I)； CD27 ；CD27L ；CD30Ki_I ；CD30L ；CD40L (TRAP)；幹擾素 a (IFN-a )；幹擾素 β (IFN-β )； 幹擾素Y (IFN-y)；幹擾素ω (IFN-ω)；幹擾素敏感基因15(ISG_15)；肥胖基因OB ；白血病抑制因子LIF;淋巴毒素LT/TNFi3 ；巨噬細胞克隆刺激因子(M-CSF)；巨噬細胞刺激蛋白- a (MSP-α)；巨噬細胞刺激蛋白- β (MSP-β)；移動抑制因子(MIF)；抑瘤素M(OSM)； RANKL ；可溶性 IL6 R 複合物 sIL6RC (gpl30+sIL6R)；可溶性 Fas 配體 sCD95L ；TNF I 型受體 TNF-RI ；TNFII 型受體 TNF-RII ；TNFSF-18 ；腫瘤壞死因子 α TNF-α 和 TNFSF-12。趨化細胞因子是對白細胞有激活或者趨化作用的細胞因子。趨化細胞因子受體屬於G蛋白偶聯受體組。舉例來說，HIV進入宿主細胞需要趨化細胞因子受體，那麼它們的拮抗劑就可以用於AIDS的治療。趨化細胞因子包含且不限於B-淋巴細胞趨化物 (BLC)；趨化細胞因子受體(CCK-I)；皮膚T細胞虜獲趨化因子CTACK ；嗜酸細胞活化趨化因子-1 ；嗜酸細胞活化趨化因子-2MPIF-2 ；嗜酸細胞活化趨化因子-3 CCL26 ；神經趨化因子；粒細胞趨化蛋白2(GCP-2) ；MGSA ；ΜΙΡ-2 α ；ΜΙΡ-2 β ；血液透析CCl (HCC-I)；血液透析 CC4(HCC-4) ； IFN γ誘導蛋白IO(IP-IO) ； IFN誘導T細胞α趨化細胞因子(I-TAC)；白細胞間介素-8(IL-8)；白細胞衍生趨化因子-2 ;Limgkine ；淋巴細胞趨化因子(LPTN)；巨噬細胞炎症蛋白Ia ；巨噬細胞炎症蛋白1β ；巨噬細胞炎症蛋白IS ；巨噬細胞炎症蛋白IY ； 巨噬細胞炎症蛋白3α ；巨噬細胞炎症蛋白3β ；巨噬細胞衍生趨化因子(MDC)；單核細胞趨化蛋白-KMCP-I ；單核細胞趨化蛋白-2(MCP-2)；單核細胞趨化蛋白-3(MCP-3)；單核細胞趨化蛋白-4(MCP-4)；單核細胞趨化蛋白-5(MCP-5) ；IFN γ誘導的單核因子(MIG)；骨髓抑制因子(MPIF)；血小板鹼性蛋白(PBP)；血小板因子4;肺部活化調節趨化因子(PARC)； RANTES(依賴激活T細胞分泌調節蛋白)；二級淋巴組織趨化因子(SLC)；間質細胞衍化因子I(SDF-I)；胸腺活化調節趨化因子(TARC)和胸腺表達趨化因子(TECK)。生長因子包含且不限於酸性纖維原細胞生長因子(aFGF)；活化素βΑ;刺豚鼠相關蛋白(AGRP)；雙調蛋白AR;血管生成素樣因子(ALF)；鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)；乙胞素因子；骨形態發生蛋白2(BMP》；骨形態發生蛋白4(BMP4)；骨形態發生蛋白5(BMPQ ；骨形態發生蛋白6(ΒΜΡ6)；骨形態發生蛋白7 (BMP 7)；畸胎瘤衍生生長因子-I(CRGF)；表皮生長因子(EGF)；促紅細胞生成素(EPO)；纖維原細胞生長因子 17(FGF-17)；纖維原細胞生長因子18(FGF-18)；纖維原細胞生長因子19 (FGF-19)；纖維原細胞生長因子2(FGF-2)；纖維原細胞生長因子4(FGF-4)；纖維原細胞生長因子6 (FGF-6)； 纖維原細胞生長因子7(FGF-7)；纖維原細胞生長因子8(FGF-8)；纖維原細胞生長因子 9 (FGF-9) ；Flt3配體(Flt3L)；卵泡抑素(FSP)；粒細胞集落刺激因子(G-CSF)；粒細胞/ 巨噬細胞CSF(GM-CSF)；增殖分化因子11 (OTF-Il)；增殖分化因子15 (⑶F-15)；生長抑制特異性基因6(feS-6)；肝素結合性表皮生長因子(HB-EGF)；肝細胞生長因子(HGF)；肝細胞生成素A(HPTA)；神經調節蛋白；調蛋白α ；調蛋白β ；IGF結合蛋白I(IGFBP-I) ；IGF 結合蛋白-2(IGFBP-2) ；IGF結合蛋白-3(IGFBP-3) ；IGF結合蛋白-4(IGFBP-4)；抑制素 A ；抑制素B;胰島素樣生長因子IA(IGF-IA)；胰島素樣生長因子IB (IGF-IB)；胰島素樣生長因子II(IGF-II)；巨噬細胞半乳糖特異性血凝素I(MAC-I)；神經突蛋白；神經秩蛋白； 食慾素A ；骨粘連蛋白；血清護骨素；血小板源性生長因子α (PDGF-A)；血小板源性生長因子β (PDGF-B)；催乳激素(PRL)；感覺和運動神經元衍生因子(SMDF)；可溶性GM-CSF 受體(sGM-CSFR)；幹細胞因子(SCF)；促血小板生成素(TPO)；胸腺介質淋巴細胞生成素 (TSLP)；促胸腺生成素(Tpo)；轉化生長因子α (TGF-α)；轉化生長因子β l(TGF_i3 1)；轉化生長因子i3 2(TGF-i3 2)；轉化生長因子i3 3(TGF-i3 3)和血管內皮生長因子(VEGF)。靶向細胞粘附分子和趨化因子/趨化因子受體作為白細胞溢出和遷移作用的調節物可以作為諸如類風溼關節炎和骨關節炎等慢性炎症性疾病的治療方法。(Vergimst CE 等人，Scandinavian Journal of Rheumatology 34 :6，415-425.)細胞粘附分子(CAM)是在與其他細胞或者細胞外基質(ECM)結合，即細胞粘附過程中所涉及的一種位於細胞表面的蛋白質。大多數CAM屬於以下四種蛋白家族Ig(免疫球蛋白)總科(IgSFCAMs)，整合素，鈣粘著蛋白和選擇素。免疫球蛋白總科CAMs (IgSF CAMs)是親同種抗原或異染性的，並與整合素或者不同的IgSF CAM結合。IgSF CAM包含且不僅限於NCAM(神經元細胞粘附分子)；ICAM-I (細胞間粘附分子)；VCAM-I (血管內皮細胞粘附分子)；PECAM-I (血小板內皮細胞粘附分子)；Ll ；CHLl ；MAG ；結合素和結合素樣分子。鈣粘著蛋白家族的成員包括E-鈣粘著蛋白(位於上皮)，P-鈣粘著蛋白(位於胎盤1)和N-鈣粘著蛋白(位於神經元)。 選擇素家族成員的例子有E-選擇素(位於內皮)，L-選擇素(位於白細胞)和P-選擇素 (位於血小板)。整合素是可以和細胞外基質相互作用的細胞表面受體，是很多胞外信號傳遞的媒介物。細胞粘附在傳染病和神經障礙疾病中都有涉及。共刺激性信號是一種在T細胞激活過程中使用的抗原非特異性信號，是細胞表面表達共刺激分子的抗原所在細胞和T細胞相互作用時產生的。(Tacke等人，Eur. J. Immunol.，1997，27 =239-247.)由T細胞表達的共刺激分子⑶28即是一個實例，它可以與APC細胞膜上的⑶80和⑶86相互作用。其他由T細胞表達的共刺激受體包括ICOS (可誘導共刺激分子)，CTLA-4和PD1。共刺激信號的抑制物可用於風溼性關節炎和腎移植期間的治療，以及T細胞共刺激缺乏症的治療，尤其是B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)，血中丙球蛋白貧乏症，選擇性免疫球蛋白不足，比如選擇性IgA不足和普通可變性免疫缺陷 (CVID)。含有淋巴細胞的樣本可以在不同時間點從病人供體採集。在一個實施方案中， 從已經從靶標疾病恢復的病人體內採集淋巴細胞樣本，恢復時間至少為1，5，10，15，20，25 天，至少為 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11 個月，或至少為 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 年。另一實施方案中，從目前患有靶標疾病的病人體內採集淋巴細胞，該病人在採集之前已經被診斷出患有靶標疾病至少1，5，10，15，20，25天，或者至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10月，或者1,2, 3，4，或者5年。為了製備供體特異性人類抗體庫，需要從人體(病人供體)中收集含有B淋巴細胞的樣品。舉例來說，這個樣品可能取自骨髓，血液，脾臟，淋巴結，扁桃體等等。外周血液單核細胞是最常見的樣本來源，人們注意到，骨髓是單個個體成熟抗體庫的完整「化石檔案」，在脾臟內的單核細胞中IgG抗體存在的比例更高。初級人類B細胞的最好來源是脾單核細胞，扁桃體和外周血液單核細胞。(Olsson等人J. Immunol. Methods 61:17-32(1983)； Karpas A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1799-1804(2001))。正如本領域技術人員所熟知的，本程序開始於從人類血液中分離外周血液單核細胞(PBMC)，通常是使用Ficoll梯度離心法。用B細胞選擇性標記物比如anti-⑶19將 PBMC染色。將染色的B細胞用流式細胞(計量)術進行分類。在本發明中，每5mL血液樣本中可以獲得約5-10x104B細胞。克隆抗體生成B細胞抗體生成B細胞可以在多孔板中進行培養。在一個實施方案中，96，384或者 1536孔板的每個孔內為寡克隆，每個孔內含有一個以上B細胞克隆。一個孔容納至少1， 2，5，10，15或20不同的B細胞克隆，優選是1-100B細胞克隆。優選地，一個孔容納10個左右不同的B細胞克隆。可以依據Love等人(Love et al.，Nature Biotechnology, 24, pp. 703-707(2006) (" Love "))的方法構建高密度庫。優選地在微孔板內處理B細胞；更加具體的說是96孔，384孔或1536孔微孔板。使用微孔板(例如與使用Love的 nano-format相比)的優點是便於B細胞的回收。人們預期，微孔板單個孔可以容納多個B 細胞，每個孔的多個B細胞可以生成不同的人類自然抗體。另一實施方案中，在一個96，384 或者1536孔孔板的每個孔進行克隆，孔內平均包含有不超過一個B細胞克隆，這個實施方案在人類B細胞非永生化時為優選的。在限制每孔稀釋約10個細胞的情況下，將細胞分類到微孔板中可選的兩個辦法包括從半固體培養基中挑選克隆(Davis，J. Μ.，等人J. Immunol. Methods 50， 161-171(1982) ;Rueda，A. Z.&Coll，J.M.J· Immunol. Methods 1 14,213-217(1988))和螢光激活細胞分類術(FACS ;Herzenberg，L. Α.等人· Clin. Chem. 48，1819-1827 (2002)； Carroll, S.& Al-Rubeai, Μ. Expert Opin.Biol. Ther. 4，1821-1829(2004)) 任選地，B細胞克隆可以在孔板內任意擴增。在體外刺激B細胞會導致細胞內生成更多免疫球蛋白mRNA，克隆擴增的細胞分離，從而提高釋放到培養基中的可溶性免疫球蛋白生成量。本文已經描述了多種體外有效刺激原始B細胞的方法。^ibler和他的同事們 (Wen等人，Eur J. Immunol. 198717 :887)描述了在B細胞培養中利用EL4亞克隆突變株 EL4-B5作為刺激物/飼養細胞的方法。Banchereau和他的同事們(Valle等人，Eur J Immunol. 1989 19 :1463)描述了拮抗劑anti_CD40單克隆抗體的使用，用於呈現Fc-γ受體表達用作飼養細胞的成纖維細胞。最近，CD40L轉染細胞系已經用於刺激物/飼養細胞 (Armitage 等人，Nature. 1992 357 :80 和 Spriggs 等人，J Exp Med. 1992 176 :154；3)，此外應用的還有⑶40L可溶性片段的重組細胞(HollerAaugh等人，EMBO J. 1992 11 :4313和 Mazzei等人，JBiol. Chem. 1995 270 :7025)。美國專利5540擬6描述了一種有助於B細胞增殖的方法將激活的B細胞暴露在體外直至達到可溶性gp39蛋白的有效濃度。在用美國商陸有絲分裂原或者EBV使雜種細胞融合前用增殖的刺激物處理初始B細胞。(Olsson等人 J. Immunol. Methods 61:17-32(1983) ；Butler JL 等人 J. Immunol. 130 165-168 (1983))。 美國專利5851531描述了一種用含有美國商陸(Phytolacca americana)血凝素的美國商陸有絲分裂原刺激B細胞的方法。已知含有未甲基化的CpG 二核苷酸的寡核苷酸具有免疫刺激作用，尤其是在基礎環境(CpG motifs)下，對人類白細胞有高度的刺激作用，會引起 B 細胞的增殖。(Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321 1-10 ；Krieg, A.M. , Applied Antisense Oligonucleotide Technology, 24 :431-448(1998)).通過刺激B細胞，能夠使可溶性免疫球蛋白釋放到培養基中，從而使工作人員可以方便的篩選B細胞培養以確定抗原特異性重鏈抗體的存在。例如，人們可以通過從細胞中去除條件培養基來檢測條件上清液，用免疫配置中的部分或者全部樣品對培養基中的免疫球蛋白的濃度進行定量，顯示其中已被刺激B細胞的細胞培養。這樣使人們在後續的免疫球蛋白基因克隆步驟中，能夠排除未成功刺激的B細胞群。B細胞克隆的永生化能產生人類天然抗體的初始人類B細胞能夠通過EBV轉換，形成雜和細胞或者重組的方式在原位實現永生化和堆積。克隆這些抗體的雜和細胞法有很多潛在的優勢，包括操作方便，抗體表達產量高和自然構象下捕獲抗體的能力強。B細胞克隆可以通過本領域內熟知的技術方法進行擴增，如雜交瘤細胞技術的使用，舉例來說，Harlow 等(Harlow 等人，Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988))禾口 Hammerling 等(Hammerling,等人』在 Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas 563-681(Elsevier, N. Y. ,1981))者M故過相關描述。在改進的雜交瘤細胞生成法中，Dessain等(J. Immunol. Methods 291, 109(2004))證明通過使用可以表達人類端粒酶(hTERT)和鼠白細胞介素_6 (mIL_6)的鼠融合夥伴細胞系(MPT)能夠產生穩定的人類B細胞雜交細胞。另一個熟知的擴增人類B細胞系的方法是用EB病毒(EBV)轉化。生成EBV轉化B細胞系的實驗方案在本領域內很知名，比如《Current Protocols in Immunology)) (Coligan 等人，Eds.，1994，John Wiley & Sons, N. Y.)第 7 章 22 節中概述的方案，也全部納入了參考資料。在進行EBV轉化前一般需將組織製作成單細胞懸浮液。此外，會在含有B 細胞的樣本溶液中執行物理去除T細胞或者滅活T細胞(例如用環孢黴素處理)的步驟， 因為從抗EBV抗體血清反應呈陽性的個體中取得的T細胞會用EBV抑制B細胞永生化。通常，將EBV接種到人類B細胞樣本中培養3-4周。典型的EB病毒來源是B95-8 細胞系(ATCC#VR-149》培養上清。通常EBV轉化的物理特徵在3-4周的培養周期結束後可以看到。利用相差顯微鏡觀察，轉化細胞呈現個大，清晰，多毛的特徵，並傾向於聚集成緊密的細胞簇。初始條件下，EB病毒系一般是多克隆的。然而，細胞培養時間過度延長的話， 由於特定B細胞克隆的選擇性生長，EB病毒系可能變成單克隆或者多克隆。或者多克隆EB 病毒轉化系可能是亞克隆的(例如通過控制稀釋培養)，或者用合適的融合夥伴融合併至於限制稀釋的平板上以獲得單克隆B細胞系。用於EB病毒轉化細胞系的適宜的融合夥伴包括小鼠骨髓瘤細胞系(例如SP2/0，X63-Ag8.653)，異源骨髓瘤細胞系(人鼠雜交，例如 SPAM-8, SBC-H20 和 CB-F7)和人細胞系(例如 GM1500，SK0-007, RPMI 8226 和 KR-4)。在一個最近改進的EB病毒永生化方法中，在EB病毒暴露之前，先用CpG寡核苷酸刺激人類初始 CD 19+IgG+B 細胞。(Hartmann and Krieg. J. Immunol. 164 :944-953 (2000)) 以上過程可得到一個克隆擴增的IgG+記憶B細胞培養庫，每個細胞培養都能產生1，2，3，4，5和/或10種不同的IgG。每個孔板內的雜合細胞或者EB病毒永生化細胞可以被存儲作為特異性抗體種類的來源。作為抗體源的非永生化B細胞庫在分析上清液之前需從相應的B細胞分離出條件上清，上清液分析期間，所有B細胞培養都要保存好。這樣孔板內原始B細胞培養中的對應於重要抗體的B細胞可以重新獲得，並用本領域內技術人員熟知的方法來拯救人類自然IgG編碼的mRNA。本發明建立了這樣一個B細胞庫，每個對應於特定抗原特異性和/或每個代表1，2，5，10或者20能產生B 細胞的人類自然IgG能夠克隆，堆積和存儲(例如作為冷凍顆粒)。已除去用於分析的條件上清的B細胞顆粒在條件上清分析期間可以用多種方法存儲用適合於存儲活哺乳動物細胞的介質(即含有10% DMSO細胞培養基)以完整的冷凍細胞的形式存儲，用RNA保護性細胞裂解液裂解細胞顆粒，以冷凍細胞溶解產物的形式(也就是TRIzol ，Invitrogen(Carlsbad, California))來存儲，或者不降解細胞的情況下，在室溫或者更低溫度下在防RNA降解的緩衝液中存儲(也就是RNAlater Ambion(Austin，Texas))。從原始定義的單個人類B細胞克隆和表達抗體的策略是本領域所已知的 (Wardemann等人，Science 301 1374-1377 (2003))。依據本發明的後續發展，RNA是從存儲的B淋巴細胞中分離得到的。所得的RNA是從免疫庫中挑選出來的核酸的集合，其中含有編碼人類自然免疫球蛋白的mRNA。在本發明中，事先挑選免疫球蛋以便結合重要的抗原。 分離RNA的方法在本領域內也是已知的(Liedtke等人PCR Methods Appl. 1994 Dec ；4 (3) 185-187)，如TRIzol 試劑(Invitrogen)。從非永生化抗原特異性B淋巴細胞中能夠獲得足量的RNA以用於RT-PCR中抗體的拯救。利用可以與編碼抗體基因的核酸序列側鏈雜交的種群特異性寡核苷酸，像單細胞逆轉錄PCR這樣的方法可以用於擴增重鏈和輕鏈變異核酸序列或其碎片(Coronella， 等人^)00) Nucleic Acids Res. 28(20) :E85)。舉例來說，利用人類特異性寡核苷酸，人類變異的重鏈和輕鏈抗體域可以利用PCR擴增(參見Sblattero and Bradbury Immunotechnology 3:271-278(1998))。擴增的序列可以用DNA序列表徵，作為單個序列在表達系統中直接克隆。從單個B細胞擴增常規的4鏈抗體的免疫球蛋白的其他技術在 Takahashi 等(Takahashi 等人，Journal of Biotechnology 49 (1996)，201-210)和 Embleton 等(Embleton 等人，Nucleic Acids Research, Vol. 20，No. 15,3831—3837)的文章中均有描述。Tiller 等(J Immunol Methods. 329(1-2) :1 12-124(2008))描述了用嵌套RT-PCR擴增單個人類B細胞克隆轉錄得到的重鏈和對應輕鏈的方法，該人類B細胞可以用螢光活性細胞分類法獲得。接下來，被擴增的核酸序列可以引入到合適的表達體系中存儲和進一步的使用。 在表達體系中生成重組蛋白，如抗體，的方法是本領域所熟知的。通常，在宿主細胞中編碼抗體的核酸序列能夠以一種適宜表達抗體或其片段的形式被插入到重組表達載體中。適宜的表達形式要求重組表達載體含有一個或者多個與編碼抗體或其片段的核酸相關的調控序列，在某種程度上此序列會允許從核酸到mRNA的轉錄過程和mRNA到蛋白質的翻譯過程的進行。調控序列可能包括啟動子，增強子和其他表達的調控元件(例如Poly A信號)，這是本領域技術人員都熟知的(Goeddel D. D. ，ed. ，Gene Expression Technology, AcademicPress, San Diego, Calif. (1991))。應該理解解表達載體的設計可能會受轉染宿主細胞的選擇和/或所要求的表達水平不同這些因素的影響。在一個實施方案中，為進行免疫球蛋白的逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)拯救， 將為RT和PCR實驗準備的新制的引物與酶/核苷的主混合物加入到所有孔內，孔內有新解凍的PCR擴增條，擴增條內有在-80°C下存貯的B細胞。利用相同或者不同的合適的3』端引物，使cDNA的逆轉錄反應和PCR擴增相繼在同一個管內進行。如領域內技術人員所知，反應在溫度循環器下進行。一旦RT和PCR實驗開始，立即開始反應混合物的分析(例如，用 STOR Mfe的螢光染色瓊脂糖凝膠)。PCR是一種有純化作用的擴增。例如，利用Qiagen PCR淨化離心柱，在合適的限制酶作用下擴增元可以被純化和消化，消化物通過瓊脂糖凝膠純化，如Qiaquick 的凝膠萃取試劑盒Oliagen)。這樣，與人類自然免疫球蛋白輕鏈和重鏈對應的DNA就被捆綁到預先消化的含有誘導性啟動子的表達載體中，周質空間領導人信號採用標準方式。用電穿孔的方式將捆綁混合物引入到感受態細胞中，在選擇培養基上培養。採用兩個引物分別退火克隆位點的5'和3'的克隆PCR法，篩選單個克隆以確定插入質粒的克隆，用STOR Mfe瓊脂糖凝膠染色法檢測PCR擴增長度。輕鏈和重鏈基因的克隆可以通過測序進行證實。我們計劃建立一個從每個人類有效供體採集至少IO4記憶B細胞從而建庫的方法，製備人類B細胞群，其中B細胞群含有至少IO5不同種類的自然生成的抗體，每個抗體都有成對的重鏈和輕鏈；將所述的B細胞群隨機分入不同B細胞亞群，每個亞群平均可以產生1-100不同種類的抗體；擴增每個B細胞亞群從而產生一個擴增的B細胞培養；在適宜保存其RNA的條件下，儲存每個B細胞亞群，這樣可以生成一個每個群平均可以表達1-100不同種類的抗體的非永生化B細胞群庫。接下來，我們計劃製備與所存儲的 B細胞亞群相應的RNA樣本，對RNA樣本進行逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)；分離對應於可以自然配對的Vh區和\區的DNA。再下一步，我們計劃在可以表達所述的Vh區和\區的宿主內，克隆所述的與Vh區和\區對應的DNA，在免疫球蛋白重鏈和輕鏈存在的情況下表達所述的Vh區和\區，就可以形成一個自然配對的免疫球蛋白。對複製人類自然IgG基因的抗原反應活性篩選可以在用於測序的相同細胞培養複製上進行。在抗原覆蓋的ELISA平板上，細胞培養的萃取物可以平行地被篩選結合。篩選抗原特異性抗體的B細胞庫利用免疫測定的B細胞條件上清來檢測連結免疫球蛋白的抗原，允許人們檢測哪個孔內含有被刺激的可以編碼與抗原連結的免疫球蛋白的B細胞。本領域中的技術人員均能夠獲得選擇性免疫球蛋白免疫測定所需要的試劑。例如，這樣的試劑包括但不限於針對抗體輕鏈和/或重鏈的多克隆或者單克隆抗體。製備和表徵這種多克隆或者單克隆抗血清的方法是本領域內的技術人員所熟知的。Daley等(Clin Diag Lab Immunol. 2005 12 :380) 在其文章中對適用於檢測標記物的非限制性試劑進行了描述。被刺激的B細胞將可溶性免疫球蛋白釋放到培養基中，使得人們可以方便地對B 細胞培養進行篩選來確定抗原特異性重鏈抗體的存在情況。例如，人們除去細胞的條件培養基，可以檢測條件上清，用免疫測定中用來定量培養基中免疫球蛋白濃度的全部或者部分樣本研究哪個被刺激的細胞培養內含有成功刺激的B細胞。這使人們在後續的免疫球蛋白基因克隆步驟中能夠排除未成功刺激的B細胞培養。這樣的篩選方法的應用，允許人們關注唯一相關B細胞克隆的免疫球蛋白基因的下遊克隆(抗原特異性人類自然免疫球蛋白生成細胞)。有機會獲得被刺激的B細胞條件上清使人們能夠篩選能夠生成具有理想功能特點的免疫球蛋白的B細胞克隆，例如在可疑抗原處，能夠中和受體/配基相互作用，對受體激活有激動或者拮抗作用，有高抗原連結親和力，或者能夠抑制酶的活性。對這些特性的篩選可以在從B細胞培養條件上清中分離得到的抗體上進行，但是在條件上清本身中進行更加方便。篩選包含有B細胞條件上清的抗體，以確定以上提到的活性類型的方法是本領域技術人員所知悉的。多相實驗法(比如平板，珠，微陣列和生物測定免疫測定中的顯色，螢光和放射性信號)和均相實驗法(比如LANCE，Alphascreen 或者用共焦成像系統例如 ABI' s FMAT 或者Evotech' s Opera ) 二者都適用於結合及活性測定。關於親和測定方法，舉例如生物測定方法，表面質膜回聲方法或者懸臂式MEMS方法和速率(rate-off) 選擇性免疫測定方法(Friguet等人，J Immunol Methods. 198577 305)作為非排他性例子曾被提到。在一個實施方案中，在克隆擴增前篩選可以產生抗體的B細胞。Love等[Nature Biotech. 24(6) :703-707(2006)]描述了一種用於微型雕刻的軟性印刷技術，它採用密集的含有單個細胞的微孔(每個0. I-Inl)排列來列印相應細胞分泌的分子排列。這些細胞在列印之後繼續培養，這個微陣列以類似商業化的蛋白質或者抗體微陣列相似的方式被探測。該方法使人們實現了顯示出期望特徵的細胞快速確定，這些特徵包括抗原特異性抗體的分泌和其隨後恢復為克隆擴增。由B細胞培養上清所產生的抗體可能被檢驗用於免疫特異性連接，其方法是本領域技術人員熟知的。可以應用的免疫測定包括且不限於競爭性或者非競爭性試驗體系，僅舉幾例western印記，放射性免疫測定，ELISA (酶聯免疫吸附測定)，「三明治」免疫測定， 免疫沉澱反應檢測，沉澱素試驗，凝膠擴散沉澱反應，免疫擴散試驗，凝集試驗，補體結合試驗，免疫放射性試驗，螢光免疫測定，和蛋白A免疫試驗等。以上試驗方法為常規手段並且是本領域知悉的。(參見 Ausubel 等人，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1，John Wiley & Sons, Inc.，New York，在此通過引證全部併入本申請)。生成抗體庫陣列(ARAs)ARA的原材料通過培養永生化克隆產生分泌IgG抗體來生成。人類免疫球蛋白分 ^nTl^ffl ELISA !的t示}(Ε. Harlow, D. Lane, Antibodies :A laboratory manual. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，1988))來分析。在一個實施方案中，標準96孔板或者384孔板的孔內附著有原始重鏈和輕鏈特異性抗體兔抗人類IgG。該抗體，與辣根過氧化物酶結合後，只能在1 3000磷酸緩衝鹽/0.1%牛血清白蛋白溶液中次要應用。這些試驗方法是由使用顯色底物的標準技術發展而來的。每個孔內擴增的B細胞培養表達的B細胞培養上清可用來建立抗體庫陣列(ARA)。 典型地，IO4到IO5個特點，優選的切104個特點一式兩份被印記到每個ARA上。幾個這樣的印記技術是本領域中知悉的。在不丟失ELISA微陣列活性的情況下，人類免疫的典型ARA的形成要求將抗體固定化在固體基質上。在結構上蛋白質是比DNA更複雜的分子，由於其疏水性和與表面的離子相互作用，當其被固定到固體基質上時它可能解開摺疊，失去活性。在烘乾過程中，也有可能使蛋白質變性。微陣列ELISA的抗體捕捉是在低體積(0. 3到InL)下印記的。由於印記體積下，抗體捕獲點幹得非常快，長時間的存儲通常需要晶片被預先乾燥。當抗體比大多數蛋白質都穩定時，由於乾燥和存儲仍然有可能會喪失活性。目前有三種將抗體連結到載玻片上的固定化化學範疇(i)物理吸附，(ii)活性基團通過共價鍵結合，(iii)載玻片上功能基團與抗體之間的親和相互作用。(Reviewed in Seurynck-Servoss SL 等人，Frontiers in Bioscience 12:3956-3964(2007).(i)蛋白質的物理吸附能夠通過在蛋白質和載玻片表面覆蓋的物質之間的疏水作用或者離子相互作用進行，這些物質包括瓊脂糖，聚丙烯醯胺，硝化纖維，聚-L-賴氨酸，或氨基矽烷。雖然這是一種簡易的固定化技術，但其不容易控制，而且可能導致高可變性和表面抗體分子取向任意的不理想情況。抗體被隨便的固定化到表面可能會導致結合到抗體區的抗原直接吸附到玻璃表面，因此很難接近。(ii)共價連接是通過功能基團連接的，功能基團包括賴氨酸或者精氨酸的伯胺基團，半胱氨酸鉸鏈區的活性硫醇基團或者與恆定區(Fc)H2域連接的碳水化合物，其中恆定區可以用於將抗體永久固定在表面上。儘管通過硫醇或者碳水化合物的附著允許抗體直接定位，但附著的流程卻更加複雜。在附著到表面之前，必須減少二硫鍵或者必須氧化碳水化合物組。這些氧化還原反應會破壞抗體結構，降低活性，還可能需要額外的純化步驟。最常用的用於抗體共價固定化的表面化學是環氧化物，醛類和N-羥基琥珀醯亞胺酯，它們都可以與蛋白質表面的伯胺反應。附著在表面的胼通過碳水化合物殘餘粘附，附著在表面的順丁烯二醯亞胺通過硫醇基殘餘粘附。(iii)通基於親和相互作用的抗體永生化典型實例是利用抗體獨特的官能團或者蛋白質序列為抗原結合位點定位。目前用於親和抗體永生化的技術有(i)蛋白質A或G塗片，其對抗體的 Fc 區域有高親禾口力(Kusnezow, W. &J. D. Hoheisel Journal of Molecular Recognition, 16,165-176 (2003) ；Anderson, G. P.,等人Biosensors and Bioelectronics, 12,329-336(1997))或者(ii)對抗體獨特標記有特異性的親和載玻片(Cha, T.，等人 Proteomics, 5 :416-419(2005) ；Wingren，C，等人 Proteomics，5 :1281-1291 (2005)) 通過 Fc特異性抗體實現固定化是很有吸引力的，因為商業化的單克隆抗體不需經過任何進一步處理就可以使用。蛋白質A和G在抗體種類和緩衝條件上是變化的。因此，在所有條件下用蛋白質A和G固定化所有抗體可能是不可能的，可能需要換用抗人類Fc抗體。鏈黴生物素-親和素相互作用有很高的親和力，研究顯示通過鏈黴生物素或者生物素-親和素相互作用的抗體固定化可能導致高度敏感試驗(Delehanty，J. B. &F. S. Ligler. Analytical Chemistry, 74, 5681-5687 (2002)) 然而，有必要用生物素化抗體在鏈黴生物素或者抗生素圖層的載玻片上進行捕獲。生物素可以以化學法加入。含有聚L-賴氨酸斑的抗體陣列利用交聯層附著在玻璃表面(Haab，B.B.等人Genome Biol. 2,research 0004. 1-0004. 12(2001)),含有聚 L-賴氨酸斑 IgG 陣列(CEL Associates, Pearland, Tex.)利用光反應交聯層(Molecular Biosciences, Boulder, Colo.)或者聚丙烯醯胺凝膠(Packard Bioscience, Meriden, Conn.)或者已經描述過的載玻片(Miller，JC 等人 Proteomics 3，56-63 (2003))。然而典型的ARA含有每個孔板內擴增B細胞培養表達的B細胞培養上清，可以同樣包括待檢測的靶標抗原的陽性對照，條形碼和關於ARA組成的相似識別信息。在一個實施方案中，我們計劃在ARA的每個斑點或者位點用一個以上獨特抗體對ARA進行印記或者定位，優選至少每個點一個抗體克隆，更加優選每個點1-50個抗體克隆， 再更加優選是每個點10-20個抗體克隆。篩選用於靶標連結的ARA可以採用天然蛋白質，多肽或者其他包括各種試劑和疾病條件在內的抗原性分子探測方法來篩選ARA。Haab BB(Molecular & Cellular Proteomics 4 :377-383(2005))撰文評論了各種篩選方法。利用抗體庫進行高通量篩選和蛋白質定量分析的方法是本領域知悉的。(Chaga GS 441:129—151 in Tissue Proteomics, B. C-S. Liu and J. R. Ehrlich eds. , Methods in Molecular Biology (2008)Springer-Verlag(NY) ；Cahill D., Journal of Immunological Methods,250(1~2) :81-91 (2001) ；Sanchez-Carbayo Μ. ,Clin Chem. 52(9) : 1651-1659(2006))。Sanchez-Carbayo(Sanchez-Carbayo Μ. , Methods MoI Biol. 428 :263-87(2008))和 Kopf 等(Kopf 等人，Int J Biochem Cell Biol. 39(7-8) 1305-1317(2007))撰文討論了抗體陣列在腫瘤蛋白質組學方面的應用。ARA可能包括附著在微陣列表面的抗體。用結合到可檢測化合物上的目的抗原對 ARA進行探測(interrogate)，化合物舉例如下螢光標記化合物，化學發光標記或生物發光標記，或者是將酶的底物(例如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶)添加到ARA內，並作用一段時間，然後檢測適宜抗體的存在。在將目的抗原添加到以塗層的孔內後，可能還會添加連接有可檢測化合物的第二個抗體。任何可用於檢測的合適的標記物或者篩選工具都可以用於此項探測(interrogation)。本領域的技術人員能夠知道那些能夠被改進以提高可檢測信號的參數和其他本領域內已知的ELISA參量。關於ELISA的進一步討論，參見Ausubel 等撰寫的《Current Protocols in Molecular Biology》。(Ausubel 等人，eds，(1994)， Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc. , New York, section 1 1. 2. 1.)。在一些實施方案中，可以直接用全病毒或表面表達抗原的細胞對ARA進行篩選。 本實施方案中病毒或者細胞被固定化在ARA內，可以被任何已知的，包括以上所討論的，檢測技術檢測。抗原對抗體的親和力和抗原-抗體相互作用解除率可以通過競爭性結合試驗測量。一個競爭性結合試驗的實施例是放射性免疫測定，它包括在未標記抗原數量上升的情況下，用目的抗體培養標記抗原(例如3H或125I)，檢測結合到標記抗原上的抗體。目的抗體對特定抗原的親和力和結合解除率可以用katchard點分析的數據來確定。和第二抗體的競爭也可以用放射性免疫測定法來檢測。在本實施方案中，在未標記的第二抗原數量上升的情況下，用結合有標記化合物(例如咕或1251)的目的抗體培養抗原。對應ARA 「hits」孔板內對抗體生成克隆的拯救永生化的抗體生成克隆可能會通過限制稀釋培養被解纏繞，然後用反拯救ELISA 進行陽性抗體檢測。生產針對特定抗原的人類自然抗體的B細胞克隆被連續稀釋直至達到每孔內一個B細胞的濃度，然後用反IgG捕獲ELISA法篩選所期望抗體的生成。這樣單個抗體生成B細胞雜合細胞對特定抗原的特異性就可以被確定和分離出來。在一個實施方案中，所期望的人類自然抗體的「拯救」涉及到在合適的宿主細胞內自然配對的克隆重鏈和輕鏈的表達。Coronella (Nucleic Acids Res. 28(20) :E85 (2000)) 發現了用FACS從單個B淋巴細胞中分離人類免疫球蛋白重鏈和輕鏈並進行擴增的方法。用嵌套RT-PCR方法，Coronell乂2000)記述了一種在體內重新產生成對的來自大量細胞的Vh 區和 Vl 區的方法。TillerQ. Immunol Methods. 329(1-2) :112-124(2008))也描述了擴增重鏈和相應輕鏈基因轉錄產物的方法，其中輕鏈基因轉錄產物是從單個人類B細胞克隆中利用嵌套RT-PCR用螢光激活細胞分選法得到的。TilleH2008)進一步描述了體細胞變異 Ig基因到原細菌系基因的回覆突變，將免疫球蛋白基因從單個人類B細胞克隆到真核表達載體，在人類腎細胞系產生重組抗體。其中將Coronella(2000)和TilleH2008)的方法全部納入了參考範圍。可以用如ELISA法和螢光免疫檢測法對自然配對的人類抗體重組體進行篩選。通過此法，能夠獲得表達人類自然配對免疫球蛋白的細胞系。本發明涉及到人類 Ig重組體和表達重組體Ig的細胞系，其中重組體Ig包括輕鏈和重鏈的自然配對。抗體表徵和鉛的選擇/驗證一旦B細胞雜合細胞或者EBV永生化克隆被確定為能夠生產預期種類的IgG， 永生化的B細胞系就可以採用領域內的標準方法進行產生毫克級的所謂的"hit"抗 # W λ IS Il ^ Zfe ( # JaL Monoclonal Antibody Production, The National Academies Press (1999))ο這樣的永生化B細胞系可以利用單個抗體生成克隆的Vh區和\區基因的拯救進行表徵。額外的步驟，比如用本領域已知的方法進行Vh區和\基因的克隆和測序，可以被用於此新型永生化B細胞系的增殖。利用ARA平臺發現新的功能性抗原決定基本發明的抗體庫陣列(ARA)提供了一個高通量平臺，促進新的功能性抗原決定基的確定和被保護實驗者的B細胞中相應人類單克隆抗體(mAbs)的確定。這個平臺為發現能在自然構象下結合靶標的人類Abs提供了可能。抗體庫可以在被不同mAb結合的抗原或者自然靶標的不同抗原決定基下生成。由於給定蛋白質或者抗原的不同抗原決定基與靶標蛋白質的不同功能特點有關，此ARA平臺可以實現被人類免疫系統瞄準的多功能抗原決定簇的鑑定。典型的，ARA平臺可以用於篩選幾百個被特定疾病的特異性抗體影響的人類對象。由於每一個對象可以提供大約IO5IgG種類，此ARA平臺在生產高通量mAb庫方面非常有用，mAb能夠瞄準幾乎所有被人類免疫系統瞄準的功能性抗原決定基。由於ARA平臺允許基於成百上千的供體樣本的快速篩選，該高通量方法實現了在低試劑使用量下的微陣列蹄選。在本發明的一方面，ARA平臺用於恢復 IO7種對抗濾過性毒菌靶標，比如附圖2 所示的人類免疫缺陷性病毒(HIV)，的重組IgG種類。在該實施例中，涉及到的從暴露在HIV 下的實驗對象中採集的血液樣本和含有IgG+記憶B細胞。在多孔平板上培養單個的B細胞，實現克隆擴增和抗體分泌細胞分化。ARA是通過人體B細胞培養中IgG的永生化形成的。用HIV感染相關的自然濾過性毒菌靶標篩選該ARA。這些靶標可能是從所有病毒粒子或者病毒樣蛋白質，單個蛋白質(例如表面蛋白或者包膜蛋白)或者被HIV感染的細胞中篩選出來的。確定ARA靶標連結點對應的B細胞培養，從細胞培養分離得到的B細胞裂解物中拯救IgG重組體。採用ARA平臺技術，抗HIV單克隆抗體發現的方法提供了符合潛在保護性抗濾過性病原體反應的人類IgG+記憶B細胞生成的存檔，該篩選是在靶標的自然構象下進行的， 因此能產生更多的相關結果。
在本發明的一方面，實現了假設得自不同種類HIV變形或者相同靶標蛋白質內的多靶標的平行篩選。這使得其可以利用廣泛交叉反應鑑定抗體。對應給定靶標上單個抗原決定簇的抗體的發現erbB2致癌基因可以編碼生長因子受體，生長因子受體的過度表達與侵襲性腫瘤和不良預後有關。有些指向該分子的抗體在體內有抗癌作用，但是有些卻沒有。利用計算機指導的蛋白質工程和定點突變，對erbB2基因上抗原決定基結合作用的抑制(HERCEPTIN )和非抑制作用(HF)分析揭示了兩種不同的結合相互作用。(Wang等人MoI Immunol. (2004)40(13) :963-969)。非抑制作用抗體HF只能識別erbB2胞外域(ECD)的N末端，然而抑制作用抗體HERCEPTIN 結合到其專有的C末端。ARA篩選平臺可用於指向給定靶標不同抗原決定基的抗體鑑別和表徵。這使得具有與抗原決定簇結合的特異性功能有潛在活性的抗體的發現成為可能。在本發明的這一方面，噬菌體顯示庫的成員可以表達由給定靶標基因片段表達的部分蛋白質，該庫可以用於確定對給定靶標產生假定免疫反應的抗原決定基庫。在一個實施方案中，靶標的功能性測試和其他標準技術，比如如定點突變，可以結合起來用於具有特異性功能的單個或者組基因片段關係的分析。由噬菌體顯示提供的基因片段決定了抗原決定基特異性，此ARA篩選平臺可用於使抗靶標Abs成簇。從功能性抗原決定簇得到的Abs代表樣本的詳細表徵(如測序 sequencing)可用於進一步揭示相互作用的特點，該特點可能可以積極或者消極用於與每個抗原決定簇相關的功能。在本發明的一方面，兩個或者更多抗原決定簇的成對分析可用於確定潛在的或者隱藏的功能性抗原決定基。這些隱藏的抗原決定基可能可以促進與不同抗原決定基得結合，或與已知功能相關的功能。該方法允許對抗原決定基間隔的擴展，基於之前的方法在文獻中抗原決定基間隔被比喻成唯一可用的東西。在一個實施方案中，如附圖3所示，可以生成噬菌體基因片段顯示(GFPD)庫。利用本領域已知的方法可以生成一個噬菌體基因片段顯示表達庫。(參見Silverman G. J.， 第 20章Construction and Selection from Gene Fragment Phage-Display Expression Libraries, in Phage Display :A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas III, Dennis R. Burton, Jamie K. Scott, Gregg J. Silverman, CSHL Press, 2004)基因片段是通過核酸內切酶降解可以編碼給定靶標基因得到的。通過將基因片段插入到噬菌體的基因組DNA 中，在噬菌體表面表達部分靶標蛋白質的方法，就可以產生一個GFPD庫。通過在指向靶標的人類抗體上篩選GFPD庫，獲得了一個包含有被恢復的基因片段的人類抗原決定簇庫。對應不同抗原決定簇A、B、C等的基因片段(GFPD庫的成員)被分別定義。在一個實施方案中，將基因片段覆蓋在已知三維結構的靶標蛋白質上，以確定基因片段對應的特定抗原決定基。在ARA平臺上，利用完整的蛋白質或者病原體靶標進行的篩選通常能夠形成眾多 hit,如附圖4所示。用與抗原決定基A、B、C等對應的GPDL成員完成同來源ARA的進一步篩選。通常，每個抗原決定基篩選2-3個GPDL成員，儘管可被篩選的抗原決定基對GPDL成員數沒有任何上限。Hit形式的比較對用被抗原決定基特異性基因片段簇產生的完整蛋白質也可以揭示以前未發現的新型抗原決定基。優選地，抗原決定基特異性基因片段和完整靶標都可以被抗體識別出來。因此，成千上萬個特定靶標抗原的hit可以被分解為10，20， 30，40或者更多的對應抗原決定簇的抗體「族」(「families」)。抗體可以通過與可以識別新型抗原決定基的抗體Vh區對應的基因測序來進一步表徵。附圖5為用ARA平臺來確定功能性抗原決定基抗體的步驟的示意圖。功能相關的篩選得到已知的和新確定的抗原決定基的典型的抗體在Vh區被排序並拯救，以用於進一步的開發。用這個方法可以確定適合於治療方法發展和對靶標特異性功能有效地主動和被動疫苗開發的獨特抗體。本發明同樣涉及特異性抗體庫，抗體和對本發明方法中抗體對應的特異靶標有效地治療方法和疫苗。利用ARA對進行抗體功能篩選哮喘是一種複雜的肺部傳染病，其可以用氣道高反應性(AHR)，嗜酸性粒細胞炎症，粘液分泌過多，皮下纖維化，IgE水平升高來表徵。白細胞介素13 (IL-U)是哮喘過敏性反應效應階段的關鍵媒介物。(Huang SK，等人J Immunol. (1995) ；155(5) =2688-2694) 抗IL-13抗體在治療阻礙其相關信號途徑的哮喘方面非常有用。(W0/2005/062967)。IL-13 同樣與霍奇金病(HD)相關，研究發現其在HD細胞系中過量表達。(Kapp，U.，等人J. Exp. Med.，Volume 189，Number 12,1999 ；1939-1946)。對霍奇金病(HD)有效的抗 IL-13 抗體因IL-13的作用會影響受體結合。單克隆抗體(MAb)263是廣泛使用的單克隆抗體，它可以識別生長激素(GH) 受體的胞外域(EOT)，在體外和體內都可作為GH激動劑。(Wan Y.，等人，Molecular Endocrinology 17(11) :2240-2250 (2003))。小鼠單克隆抗體，術語為BAH-I，在人類巨核細胞內培養，其可以特異性識別血小板生成素(TPO)的細胞表面受體(C-Mpl)，顯示了其激動劑活性。(Deng B.，等人，Blood，92 (6) :1981-1988(1998)).並不是所有指向激素結合點的MAb和在激素結合時充當全競爭物的MAb都可以作為激動劑並引發信號。(Rowlinson SW，等人，1998 J Biol Chem 273:5307-5314).有文獻報導過將激動劑限制在MAb的狹小範圍內作用於促紅細胞生成素受體，大量研究顯示，96 個作用於受體的MAb，只有4個顯示出激動劑活性。(Elliott S，等人，1996 J Biol Chem 271 :24691-24697).erbB2致癌基因能編碼生長因子受體。erbB2的過量表達經證明與很多侵略性腫瘤和預後較差有關。一些指向該分子的抗體在體內具有抗腫瘤效果，但是有些抗體卻沒有此效果。(Wang 等人 MoI Immunol. 2004 Feb ；40 (13) :963-969).幾個用於抑制腫瘤壞死因子(TNF)功能的抗體通過與TNF結合以影響其不同功能的方式來發揮作用。INFLIXIMAB 通過與可溶性(在血液內能自由移動)和跨膜形式 (位於T細胞和其他相似細胞的細胞膜膜外側)的TNF α的高親和性結合來抑制TNF α的生物活性，抑制或者防止TNF α和其受體的有效結合。REMICADE and HUMIRA (另一種TNF拮抗劑)屬於抗TNF抗體的亞類(它們是自然生成形式的抗體)，能夠抑制各種形式 (胞外，跨膜，和與受體結合)的 TNF α。(Choy EH 等人 N EnglJ Med. 2001 ；344 :907-916)。 ENBREL ,第三種TNF拮抗劑，屬於不同的亞類，由於其修飾過的形式，不能抑制與受體結合的 TNF α。⑶觀存在於T細胞表面，在其激活過程中起著重要作用。⑶觀通過與其配基結合從而被觸發，信號轉導可通過CD^進行。CD^的激活依賴於其細胞質域的磷酸化過程。CD28並沒有內在的磷酸化活性，反之它依賴於外在的激酶作用，例如p561ck。然而，有些抗體可以通過預先排斥受體附近的磷酸酶(與激酶作用相反)，從而充當CM8受體的超級激動劑。通過本發明的ARA平臺技術，針對不同抗原決定基的自然抗體的高通量鑑定和分類得以實現，並能夠對大量調節不同抗原決定簇各種功能的抗體同樣進行鑑定。本方法同樣可以鑑定隱藏的抗原決定簇。對有些確定的隱藏抗原決定基功能的調節同樣也是對已知的功能性抗原決定基或者整個靶標功能調節的協同作用。在一個實例中，單克隆抗體可以排列在固體表面上並通過ARA內離散的靶標特異性元素克隆來分類。在一些實施方案中，MAb被固定在器皿的內表面，這些器皿主要從微滴度孔，微滴度板，試管，培養皿，微通道和微陣列中選擇。這樣，就可以在原位對抗體從通信細胞引發信號的能力進行檢測。通常情況下，在一個優選的實施方案中，抗體是不擴散的， 它結合到一種從樣品接受地(例如微滴度板，微陣列等)中分離出來的不溶性支撐物上。該不溶性支撐物可以是由任何抗體能夠結合上去的物質組成的，它很容易從可溶性材料中分離出來，或者和整個篩選方法互不排斥。這種支撐物的表面可能是固體的，可能是多孔的或者任何可用的形狀。合適的不溶性支撐物舉例如下，如微滴度板，微陣列，膜和水珠。這些通常是由玻璃、塑料(如聚苯乙烯)、多糖，尼龍或者消化纖維，聚四氟乙烯等製成的。微滴度板和微陣列尤其方便，因為利用他們，用少量的試劑和樣本就可以同樣進行大量的檢測。 由於化合物的結合方法與試劑和整個方法是一致的，所以化合物的特殊結合方式不是至關重要的，這種結合方式可以維持化合物的活力並且是不可擴散的。被改造為能夠直接或者間接表達對細胞表面受體活性調節做出響應的可測量「信號」(「importer」)物質(可檢測性標籤)的細胞系可以被用於篩選能夠激活或者抑制受體的單克隆抗體。在一些實施方案中，細胞表面分子(例如受體)的激活與影響底物共價鍵斷裂的酶的活力是相耦合的。酶可以從本組物質中選擇，包括內醯胺酶，α-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，α-甘露糖苷酶，甘露糖苷酶，酸性磷酸酶，鹼性磷酸酶，和磷酸二酯酶II。底物可以從本組物質中選擇，包括對氨基苯-β -D-半乳糖苷，對氨基-α -D-半乳糖苷，對氨基-α -D-葡萄糖苷，對氨基_ β _D_葡萄糖苷，對氨基苯-α -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯-β -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯磷酸鹽和對氨基苯磷酸膽鹼或其衍生物。底物的斷裂通常與可檢測的變色或者螢光反應相關連。在一些實施方案中，可檢測性標籤是螢光基團，化學染料，放射性結合試劑，化學發光結合試劑，電化學發光試劑，磁結合試劑，順磁結合試劑，熱磁結合試劑，能產生有色物質的酶，能產生化學發光物質的酶，能產生磁性物質的酶。在一些特定實施方案中，可檢測性標籤是釕或者多釕標記物。篩選用染料或者螢光試劑處理的細胞的方式是本領域熟知的。相當可觀的與細胞基因工程相關的文獻均利用能產生螢光的蛋白質，例如將改性的綠色螢光蛋白(GFP)作為通信分子。Morise 等(Biochemistry 13(1974)，p. 2656-2662)和 Ward 等(Photochem. Photobiol. 31(1980)，p. 611-615)發現了野生型 GFP 的一些特點。Aequorea victoria 水母的GFP最大激發在395nm，最大發射波長在510nm，而且它不需要外部因子來激發起螢光活性。發出螢光的(luminogenic)可檢測性底物，例如螢光素酶，也可以利用。美國專利^016 和討361觀描述了檢測和評估胞外信號的細胞內轉導的試驗方法和化合物，該方法利用了可以表達細胞表面受體的重組細胞，且該專利包含有轉錄調控元件的通信基因結構，該轉錄調控元件能夠對細胞表面受體活動做出響應。標準高通量篩選(「HTS")用化合物和生物學試劑的混合物連同能夠注入到96 或者384標準微滴度板內的指示劑化合物。每個孔內測量的信號，螢光釋放，光密度或者放射能，與孔內所有試劑發出的信號結合到一起顯示出孔內所有分子的總平均數。Science Applications International Corporation (Science Applications International Corporation(SAIC) 130 Fifth Avenue, Seattle, Wash. 98109)描述了一種成像板式指示器。這個系統利用CCD相機對96孔板整個區域成像。所得圖像用於分析計算每個孔內所有試劑的總螢光強度。Molecular Devices, Inc. (Sunnyvale, Calif.)描述了一種系統 (FLIPR)，其利用低角度照射雷射掃描和在96孔板的孔底200微米範圍內選擇性激發螢光的方法來降低細胞單層膜成像時的背景影響。該系統利用CCD相機來對96孔板底部整個區域成像。儘管這個系統能夠測量孔底部細胞單層膜產生的信號，但是所測得的信號是孔內整個區域的平均值，因此仍然認為該信號是一種細胞群體的平均響應值的測量。該圖像用於分析計算細胞試驗中每個孔內的總螢光信號。細胞基篩選系統中，為了激活響應也應用了流體傳輸設備，例如FLira系統，來激發響應，這樣利用宏觀成像系統就能夠觀察到整個孔內群體平均響應情況。與高通量篩選形成對照的是，各種高含量篩選(HCQ被開發出來以滿足細胞成分和作用過程中時空動力學詳細信息的需要。高含量篩選能夠自動提取與細胞結合的特異性螢光試劑的各色螢光信息(Giuliano and Taylor (1995), Curr. Op. Cell Biol. 7 4 ；Giuliano 等人(1995)Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24 :405)，並用可測量空間和時間動力學的光學系統對細胞進行分析。(Farkas等人(1993)Ann. Rev. Wiysiol. 55 785 ；Giuliano 等人(1990)In Optical Microscopy for Biology. B. Herman and K. Jacobson(eds.), pp.543-557. ffiley-Liss, New York ;Hahn 等人(1992)Nature 359 736 ；Waggoner 等人(1996) Hum. Pathol. 27 :494)。高含量篩選可以利用螢光標記抗體，生物配基，和/或核酸雜交探針在固定化細胞上實現；或利用多色螢光指示劑和「生物傳感器」(biosensor)在活細胞上實現。固定化細胞和活細胞的選擇取決於所需的特定細胞試驗方法。固定的細胞實驗是最簡單的，因為微滴度板內的初始活細胞庫可以用各種化合物以檢測劑量處理，然後細胞就可以被固定用特異性試劑標記和檢測。固定化之後不能對細胞進行任何環境控制。僅可以在一個時間點獲得空間信息。數千種可用於細胞的抗體，配基和核酸雜交探針的可用性使得這個方法對於多種細胞篩選非常有吸引力。固定化和標記步驟的自動實現，使得該方法效率很高。活細胞試驗更加成熟有效，這是因為含有理想試劑的活細胞庫的能夠隨時間，空間被篩選。必須保持細胞的生理健康以適應多種螢光測量的需要，所以測量中需要控制細胞的環境(溫度，溼度和二氧化碳)。目前可以顯示細胞內的生物化學變化和分子活動情況的螢光生理指標和生物傳感器越來越多。(Giuliano等人，(19%)Arm. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24 :405 ；Hahn等人，(1993) In Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. W. T. Mason, (ed. ), pp. 349-359, Academic Press, San Diego).螢光試劑的使用和其可用性促進了活細胞和固定化細胞的高含量篩選的發展。由
31於多色自動提取儀器製造的進步，高含量信息使得發展HCS自動化儀器成為可能。Taylor 等(American Scientist 80 (1992)，p. 322-335)描述了很多相關的方法和應用。典型試驗方法中，夠表達靶標受體的細胞和被改造包含有對受體激活和抑制敏感的可檢測信號基因系統的細胞可用於接觸含有指向受體分子的單克隆抗體的ARA。在一些實施方案中，ARA包含一個多孔板(96或者384孔)，每個孔內含一種已知單克隆抗體。可能有必要準備多個含有單個單克隆抗體的「點」，這樣的話MAb濃度才能足夠大以引發可檢測性信號。同樣地，每個孔內必須含有103，104，或者IO5以上的細胞以激發可檢測性信號。 在實例中，例如U. S. Pub. Pat App. No. 20070275435所描述的，可以採用微孔內細胞培養實時監測的細胞培養晶片。在通訊細胞接觸ARA儀器表面後，未被檢測性單克隆抗體捕獲的細胞會通過流體剪切力去除。被捕獲的細胞在儀器上以允許細胞生長和通信物質表達的方式被培養。保留在被捕獲的細胞內部的通信物質可以利用ARA設備直接測量(例如利用可檢測性底物)。 採用這種方法，擁有受體激動活性或者拮抗活性的單克隆抗體可以利用通信信號的有無來進行確定，通信信號由代表成組的單克隆抗體的ARA設備上離散元素捕獲的細胞引發的。例如，NF-K B(核因子被激活的B細胞的κ輕鏈增強子)是一個蛋白質複合物，它可以充當轉錄因子。幾乎所有動物細胞中都發現有NF-kB的存在，它與外界刺激的細胞應答有關。很多細胞表面受體的刺激，比如RANK，TNFR，會直接導致NF-κ B被激活，在基因表達中快速變化。人類胚胎腎臟細胞系在NF-K B響應元件(NF-κ B-bla HEK 293T CellSensor Cell Line, Invitrogen Corp.，Calif.)的調控下能夠穩定表達 β -內醯胺酶基因，對腫瘤壞死因子α (TNFa)的刺激作出響應，使得NF-κ B信號途徑被激活，隨之開始表達β內醯胺酶。β內醯胺酶的表達通過螢光共振能量轉移(FRET)底物 (LiveBLAzer-FRET B/G Substrate, Invitrogen Inc.，Calif)來定量。底物為親脂性的酯化物，它可以很容易地進入通信細胞系。經內源性細胞質酯酶斷裂，底物被轉換成能夠在細胞質內保留的帶負電荷的底物。內醯胺酶的斷裂空間上分成兩個底物生色團，分裂FRET並產生藍色螢光信號，波長為450nm(用409nm激發)。β內醯胺酶未裂解時，在 560nm(用409nm激發)處底物產生綠色螢光信號。藍色螢光信號比例提高即顯示出β內醯胺酶活性的提高。對Toll樣受體(TLR)的刺激會導致NF- κ B的激活(Hayden MS, West AP, Ghosh S(October 2006). " NF- κ B and the immune response " . Oncogene 25(51) 6758-6780)。單克隆抗體激動TLR的受體激動活力可能導致由於受體細胞系內TNF α和隨後的β內醯胺酶表達提高而引起的內生NF-κΒ的高水平激活。反之，拮抗劑活性可能導致 β內醯胺酶表達水平的降低。在執行TLR的單克隆抗體存在時，TLR的調節水平可由監控得到的由FRET底物產生的藍綠螢光信號比例變化得到，例如藍色螢光信號比例上升是TLR 催化劑的指示信號，藍色螢光信號比例下降是TLR抑制劑的指示信號。存在給定的Mab情況下TLR活性(activity)水平可以和對照(例如，存在已知活性的化合物情況下)的TLR 活性水平進行比較。本發明的方法同樣涉及到可以由恢復的V基因序列產生的治療性抗體，該抗體可以指向靶標病原體或者抗原的不同功能抗原決定基，或者對靶標受體有功能性影響。本發明中的方法可以應用到小分子篩選。通過鑑定與特異性功能相關的抗原決定基或者抗原決定簇，可以檢測人造小分子或者天然小分子與功能性抗原決定基結合的效力和活性，其中功能性抗原決定基由本發明方法確定。本發明中的方法同樣涉及到疫苗設計方法，通過確定不同的抗原決定簇，從而能夠製備指向靶標病原體或者抗原的不同部位的疫苗。本發明中的方法同樣涉及到由回復的V基因序列和。生成的治療性抗體和。試劑盒本發明提供了所述的方法可以應用的試劑盒。一實施方案中，試劑盒包含有本發明中抗體組成的陣列(ARA)，優選地還包括一個或者多個內有已純化了的抗體的容器。優選地，本發明的試劑盒進一步包括不會與目的多肽反應的對照抗體。另一特定實施方案中，本發明的試劑盒含有檢測抗體和目的多肽結合的方法(例如，抗體可能與可檢測底物，比如螢光化合物、酶底物、放射性化合物或者發光化合物，成對結合；或者能識別第一抗體的第二抗體可能與可檢測底物結合)。試劑盒還包括獨立的通信標記抗人類抗體。在本實施方案中，抗體和多肽抗原的結合可以利用所述的信號標記抗體的結合來檢測。一些試劑盒中包括與胞外域蛋白質(例如受體)功能相耦合的信號系統的細胞系。一些試劑盒中包括比色試劑，螢光檢測試劑或者光度檢測試劑。本發明的另一實施方案中，試劑盒為可篩選對增殖的和/或癌變的核苷酸和多肽有特異性的抗體血清的診斷性試劑盒。這樣的試劑盒內包括不會和目的多肽反應的控制抗體。這樣的試劑盒可能包括已充分分離的帶有抗原決定基的多肽抗原，該抗原決定基對至少一種抗多肽抗原抗體有免疫活性。此外，該試劑盒包括檢測所述的抗體和抗原結合的方法(例如，抗體可能與螢光化合物，如螢光素或若丹明，成對結合，即可被流式細胞術檢測)。在具體實施方案中，試劑盒可能含有重組生成的或者化學合成的多肽抗原。試劑盒中的多肽抗原被固定到固體支撐物上面。在一個實施方案中，本發明包括一種可以篩選含有本發明的多肽抗原血清的診斷性試劑盒。該診斷性試劑盒包括充分分離的對多肽或者多核苷酸抗原有特異性免疫活性的抗體庫，和檢測所述的多肽或者多核苷酸抗原與抗體結合的方法。因此，本發明提供了一種測定系統(assay system)或者試劑盒來實現該診斷方法。試劑盒包括帶有表面結合重組抗原的支撐物和用來檢測表面結合抗抗原抗體的信號標記抗人類抗體。本專利說明書中引用的所有出版物和專利申請在此通過引證併入本申請，就如同單個出版物或者專利申請是在具體情況下和分別被引用併入本申請。儘管為了清楚起見，已經用說明和舉例的方式對前述發明進行了一些詳細描述， 依照本發明的教導、在沒有脫離附上的權利要求書的精神或者範圍的情況下，對本申請進行一些改變和修飾，，對於本領域技術人員是容易的。
權利要求
1.用於製備抗體庫陣列(ARA)的方法，該方法包括(a)從每個有效數量的人類供體中獲得至少IO4記憶B細胞；(b)製備人類B細胞群，所述的其中所述的細胞群含有至少IO5不同種類的自然生成抗體，其中每個抗體有自然配對的重鏈和輕鏈；(c)將所述的B細胞群分成B細胞亞群，每個細胞亞群產生至少1種不同種類的抗體；(d)擴增每個B細胞亞群以產生擴增的B細胞培養；(e)在所述的B細胞能夠分泌抗體到培養基的條件下，在所述的培養基中培養所述的每個B細胞培養；和(f)將所述的分泌到培養基中的抗體置於固體表面，從而產生含有抗體庫的抗體庫陣列(ARA)。
2.根據權利要求1所述的方法，進一步包括(g)用靶標物探測抗體庫陣列來確定對所述的靶標有特異性的抗體或者抗體可變區或者其部分。
3.根據權利要求1所述的方法，其中B細胞被永生化以產生永生化的B細胞培養。
4.根據權利要求1所述的方法，進一步包括以下步驟(h)決定哪個B細胞培養能夠產生所述的靶標抗體；和(i)從所述的B細胞培養中分離能夠產生所述的靶標抗體的B細胞。
5.根據權利要求1所述的方法，其中抗體被放置於陣列表面，所述的表面包括依次捕獲抗體的Fc區的蛋白質A或者蛋白質G。
6.根據權利要求1所述的方法，其中b步驟中的B細胞被置於微梯度板的孔內。
7.根據權利要求1所述的方法，其中b步驟中的B細胞群含有至少IO7種不同種類的自然生成的抗體。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述的有效的人類供體數至少為10。
9.根據權利要求1所述的方法，其中抗體庫包含至少IO5自然生成的有自然配對的Vh 區和\區的人類抗體，其中所述的抗體為從足夠多樣的病人群體採集得到的永生化人類B 細胞分泌得到的，以至於所述的庫內的抗體有與人類整體免疫實質上相似的結合活性的多樣性。
10.根據權利要求9所述的方法，其中自然生成的人類抗體是由可以識別至少IO2不同靶標的人類B細胞表達的。
11.根據權利要求9所述的方法，其中的B細胞進一步是永生化的。
12.根據權利要求11所述的方法，其中永生化的B細胞能夠表達埃-巴二氏病毒抗原。
13.根據權利要求11所述的方法，其中永生化的B細胞分泌抗病原體的抗體，所述的病原體從下述組成的組中選擇RNA病毒，DNA病毒，細菌，酵母，寄生蟲和真菌。
14.根據權利要求11所述的方法，其中永生化B細胞分泌針對由惡性或者良性腫瘤細胞所表達抗原的抗體
15.根據權利要求11所述的方法，其中永生化的B細胞分泌抗體，其中抗原從下述物質組成的組中選擇與神經退行性疾病結合的多肽；細胞因子，趨化因子，生長因子，黏附分子和共刺激分子及其受體。
16.製備自然配對的免疫球蛋白的方法，該方法包括下述步驟(a)從非永生化B細胞群中分離RNA樣本，其中每個B細胞群平均可以表達1-100不同種類的抗體；(b)利用眾多RNA樣本實施逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)；和(c)分離可以自然配對的Vh區和\區對應的DNA；(d)在合適的可以可以表達所述的Vh區和\區的宿主內克隆所述的Vh區和\區對應的DNA ；和(e)在免疫球蛋白重鏈和輕鏈環境下表達所述的Vh區和\區，從而形成自然配對的免疫球蛋白。
17.根據權利要求16所述的方法，其中平均可以表達1-100不同種類的抗體非永生化 B細胞群採用下述方法製備(a)從每個有效數量的人類供體中獲得至少IO4記憶B細胞；(b)製備人類B細胞群，其中所述的細胞群含有至少IO5不同種類的自然生成抗體，每個抗體有自然配對的重鏈和輕鏈；(c)將所述的B細胞群分成B細胞亞群，每個細胞亞群平均產生1-100種不同種類的抗體；(d)任選地，擴增每個B細胞亞群以產生擴增的B細胞培養；和(e)在適合保存其RNA內容物的條件下，存儲每個細胞亞群，其中產生平均表達1-100種不同種類的抗體的非永生化B細胞群的庫。
18.製備靶標特異性抗體的方法，該方法包括(a)從受靶標影響的人類供體中獲得B細胞，其中所述的B細胞群含有至少IO5不同種類的自然生成抗體，每個抗體有自然配對的重鏈和輕鏈；(b)將所述的B細胞群分成B細胞亞群，每個細胞亞群平均產生1-100種不同種類的抗體；(c)在所述的B細胞能夠將抗體分泌到所述的培養基的條件下，擴增每個B細胞亞群以產生擴增的B細胞培養；(d)將所述的B細胞培養分泌到培養基中抗體置於固體表面的特定位置以生成抗體庫陣列(ARA)；和(e)用天然靶標分子探測抗體庫陣列來確定對所述的靶標有特異性的一個或者多個抗體群。
19.根據權利要求18所述的方法，進一步包括下述步驟(f)對所述的靶標有特異性的抗體庫對應的B細胞培養中製備RNA樣本；(g)利用眾多RNA樣本實施逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)；(h)分離可以自然配對的Vh區和\區對應的DNA；(i)在合適的可以表達所述的Vh區和\區的宿主內克隆所述的Vh區和\區區對應的 DNA ；和(j)在免疫球蛋白重鏈和輕鏈環境下表達所述的Vh區和\區，從而形成自然配對的免疫球蛋白。
20.根據權利要求19所述的方法，其中的靶標是病毒，細菌，酵母，寄生蟲和真菌或者其他病原體。
21.根據權利要求20所述的方法，其中靶標是人類免疫缺陷病毒(HIV)。
22.根據權利要求20所述的方法，其中天然靶標分子是病毒粒，病毒樣粒子，病毒感染的細胞，病毒蛋白質及其片段。
23.根據權利要求18所述的方法，進一步包括下述步驟確定交叉反應抗體，其中靶標包括多種類的靶標或者這些靶標的多種血清型。
24.基於抗原決定基成簇篩選抗體的方法，所述的方法包括(a)提供從代表部分靶標蛋白的基因片段中生成的基因片度噬菌體顯示(GFPD)庫，其中依據一個或多個抗原決定基相互作用，GFPD庫成員是成簇的；(b)提供完整的靶標蛋白質；(c)提供依據權利要求1從研究對象血樣中生成的抗體庫陣列(ARA)，其中研究對象事先暴露在足夠引起其免疫反應的靶標物劑量下；(d)用完整的靶標和/或從靶標得到的GFPD庫成員中的抗原決定基特異性簇對ARA進行探測；和(e)確定對一個或者多個對所述的完整靶標和至少一個抗原決定簇有特異性抗體群。
25.根據權利要求M所述的方法，進一步包含下述步驟(f)由對應於對所述的抗原決定簇有特定性的抗體群的B細胞培養製備RNA樣本；(g)利用眾多RNA樣本實施逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)；(h)分離可以自然配對的Vh區和\區對應的DNA。(i)在合適的可以表達所述的Vh區和\區的宿主內克隆所述的Vh區和\區對應的 DNA ；和(j)在免疫球蛋白重鏈和輕鏈環境下表達所述的Vh區和\區，從而形成自然配對的免疫球蛋白。
26.根據權利要求M所述的方法，進一步包括利用完整靶標和GFPD庫成員，基於ARA 的識別模式確定新的抗原決定簇。
27.根據權利要求M所述的方法，依據一個或多個抗原決定基的關係，其中GFPD庫成員是成簇的，該方法包括提供能夠編碼靶標蛋白質的基因；將所述的基因分成基因片段；製備含有GFPD庫成員的噬菌體顯示庫；根據靶標特異性抗體淘選GFPD庫；和依據與一個或者多個抗原決定簇的關係將每個GFPD庫成員分組。
28.根據權利要求27所述的方法，進一步包括將GFPD庫成員分組，將GFPD庫成員覆蓋在靶標的已知三維結構上。
29.根據權利要求M所述的方法，進一步包括檢測兩個或者多個抗原決定基功能的協同作用，所述的方法為製備通過表達VH區和VL區形成的第一自然配對免疫球蛋白，其中VH區和VL區的序列得自於對抗原決定簇有特異性的抗體群；製備通過表達VH區和VL區形成的第二自然配對免疫球蛋白，其中VH區和VL區的序列得自於對抗原決定簇有特異性的抗體群；分別或者聯合對檢測系統施用第一和第二自然配對的免疫球蛋白來檢測完整靶標的活性；和確定與已知功能相關的新抗原決定基的活性和協同活性。
30.一種疫苗製備方法，包括對根據權利要求M所述方法決定的功能性抗原決定基有效的抗體。
31.一種治療性抗體製備方法，包括在調節根據權利要求M所述方法決定的與一個或多個抗原決定簇結合靶標的功能方面有效的抗體。
32.—種篩選單克隆抗體以確定於細胞表面靶標分子生理功能的方法，該方法包括提供根據權利要求1所述方法生成的抗體庫陣列(ARA)，該ARA包括一系列位於表面離散點的單克隆抗體，其中抗體指向存在於細胞表面特異性靶標分子；用包括存在於細胞表面的特異性靶標分子的細胞接觸所述的ARA ；和確定這些單克隆抗體中哪些對細胞表面的靶標分子有抑制作用或者激活作用。
33.根據權利要求32所述的方法，進一步包括用通信細胞接觸所述的ARA，其中通信細胞經過改造當與通信細胞表面的細胞表面靶標分子激動劑或者拮抗劑接觸時能夠表達可檢測性信號；在能生成可檢測信號底物存在的條件下用單克隆抗體培養此通信細胞，其中可檢測信號水平的變化能夠顯示單克隆抗體的細胞表面靶標分子激動劑或者拮抗劑的存在。
34.根據權利要求32所述的方法，其中細胞表面的特異性靶標分子是受體分子。
35.根據權利要求34所述的方法，其中所述的受體可以從本組中選擇，本組包括外周膜蛋白受體，跨膜受體，代謝性受體，G蛋白偶聯受體(GPCR)，受體酪氨酸激酶，鳥苷酸環化酶受體，對胞外配體響應的離子型受體，受體酪氨酸激酶，細胞因子受體，受體鳥苷酸環化酶，受體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，胰島素受體，胰島素樣生長因子受體，人生長激素受體， 葡萄糖轉運，轉鐵蛋白受體，表皮生長因子受體，低密度脂蛋白受體，瘦素受體，白細胞介素受體，IL-I受體，IL-2受體，毒蕈鹼乙醯膽鹼受體，腺苷受體，腎上腺素受體，GABA受體，血管緊張素受體，大麻受體，膽囊收縮素受體，多巴胺受體，胰高血糖素受體，代謝型穀氨酸受體，組胺受體，嗅覺受體，阿片受體，視紫紅質，分泌素受體，血清素受體，生長激素抑制素受體，鈣敏感受體，生長因子受體，共刺激因子受體，蛋白酶活化受體，T細胞受體，B細胞受體，含ITIM受體，含ITAM受體，TNFR總科成員，TNF總科成員，離子通道和趨化因子受體。
36.根據權利要求35所述的方法，其中抗體功能為全激動劑，部分激動劑，拮抗劑或受體蛋白的反激動劑。
37.根據權利要求32所述的方法，其中可檢測性信號為螢光基團，化學染料，放射形結合試劑，化學發光結合試劑，電化學發光試劑，磁性結合試劑，順磁性結合，熱磁性結合試劑，能產生有色物質的酶，能產生化學發光物質的酶，能產生磁性物質的酶或者釕。
38.根據權利要求32所述的方法，其中細胞表面分子的激活和與作用於底物的酶的活性相聯繫胞外離子通道是耦合的。
39.根據權利要求38所述的方法，其中酶是選自下述組中β-內醯胺酶，α-半乳糖苷酶，β -半乳糖苷酶，α -葡萄糖苷酶，β -葡萄糖苷酶，α -甘露糖苷酶，β -甘露糖苷酶， 酸性磷酸酶，鹼性磷酸酶和磷酸二酯酶II。
40.根據權利要求38所述的方法，其中所述的底物從下列物質中選擇對氨基苯-β-D-半乳糖苷，對氨基苯-a-D-半乳糖苷，對氨基苯-a-D-葡萄糖苷，對氨基苯-β -D-葡萄糖苷，對氨基苯α -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯-β -D-吡喃甘露糖苷，對氨基苯磷酸鹽，和對氨基苯磷酸膽鹼及其衍生物。
41.根據權利要求38所述的方法，其中酶對底物的作用是與化學反應，發光反應，比色反應或者螢光反應相耦合的。
42.根據權利要求32所述的方法，其中ARA置於96或者384孔板內，每個孔內含有從單個B細胞克隆中得到的單克隆抗體，進一步，其中單克隆抗體的濃度足以誘發細胞表面靶標分子發出信號。
43.根據權利要求42所述的方法，其中每個孔都會與至少IO3通信細胞接觸。
44.根據權利要求42所述的方法，其中可檢測性標籤不是通信細胞分泌的。
45.根據權利要求42所述的方法，其中可檢測性標籤是通信細胞分泌的。
46.根據權利要求42所述的方法，其中每個孔都與通信細胞接觸，其中通信細胞在適合細胞生長的條件下培養，直至達到大於IO3通信細胞的濃度。
47.根據權利要求32所述的方法，其中的篩選是高通量篩選。
48.根據權利要求32所述的方法，其中的篩選是高含量篩選。
49.根據權利要求32所述的方法，其中細胞表面靶標分子的激活包含與β-內醯胺酶表達耦合的信號途徑的激活。
50.根據權利要求49所述的方法，其中內醯胺酶的表達是螢光共振能量轉移 (FRET)底物來定量的。
51.根據權利要求32所述的方法，其中ARA包括表面每個離散點的抗體濃度足以引發細胞表面的特異性靶標分子接觸的信號。
52.用權利要求1所述方法製備的抗體庫陣列(ARA)。
53.根據權利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包括至少IO4由人類B細胞表達的，可識別至少IO2不同靶標的人類自然抗體，每個抗體是由不同B細胞分泌的，含有自然配對的Vh區和\區鏈。
54.根據權利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA中的抗體可識別至少IO3不同靶標。
55.根據權利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA中的抗體包含至少IO3被表達的人類自然抗體。
56.根據權利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中的ARA包含至少IO5自然生成的有自然配對的Vh區和\區的人類抗體，其中所述的抗體是由永生化的人類B細胞分泌得到的，B 細胞是從足夠不同的病人中採集的，從而所述的庫內的抗體有與整體人類免疫實質上相似的結合活性的多樣性。
57.根據權利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包括針對病原體的自然生成的人類抗體，病原體從下面組內選擇RNA病毒，DNA病毒，細菌，酵母，寄生蟲和真菌。
58.根據權利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包括針對由惡性腫瘤或者良性腫瘤細胞表達抗原的自然生成的人類抗體。
59.根據權利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包括針對抗原的自然生成的人類抗體，病原體從下面組內選擇與神經變性疾病結合的多肽；細胞因子，趨化因子，生長因子，黏附分子和共刺激分子及其受體。
60.根據權利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包含自然生成的針對從代表靶標的基因片段噬菌體顯示庫(GFPD)得到的抗原決定基特異性簇的抗體。
61.根據權利要求52中的抗體庫陣列(ARA)，其中ARA包含自然生成的針對細胞表面靶標分子的人類抗體。
62.根據權利要求61中的抗體庫陣列(ARA)，其中細胞表面分子指的是受體分子。
全文摘要
本發明涉及對靶標抗原有特異性的抗體序列。發現方法和組合物包含人類抗體，包含此抗體的序列，表達此抗體的永生化B細胞和能夠包含這些抗體的非永生化B細胞庫。本發明提供了一種篩選對細胞表面分子，比如利用抗體庫陣列對靶細胞表面分子，有特異性的受體有功能性作用的單克隆抗體的方法，同時提供了得自於這些抗體的指向靶標的功能性抗體和治療方法，並提供了對潛在性治療性抗體的高通量和平行篩選。本發明還涉及到指向靶標和疫苗的功能抗原決定簇的抗體和源自於這些抗體的治療方法。
文檔編號G01N33/50GK102164957SQ200980137918
公開日2011年8月24日 申請日期2009年7月24日 優先權日2008年7月25日
發明者M·摩勒 申請人:特羅科隆科學有限公司