一種熱穩定性提高的d-阿洛酮糖3-差向異構酶的突變體酶及其應用的製作方法

2023-05-29 13:20:16 2

一種熱穩定性提高的d-阿洛酮糖 3-差向異構酶的突變體酶及其應用的製作方法
【專利摘要】一種熱穩定性提高的D-阿洛酮糖?3-差向異構酶的突變體酶及其應用，屬於酶的基因工程【技術領域】。本發明公開了由來源於梭狀芽孢桿菌（Clostridium?bolteae）ATCC?BAA-613的D-阿洛酮糖?3-差向異構酶（簡稱DPE酶）作為親本，利用基因突變技術，將其109位的甘氨酸Gly替換為脯氨酸Pro，獲得單突變體酶G109P，其熱穩定性得到提高，具有重要的工業應用價值。
【專利說明】一種熱穩定性提高的D-阿洛酮糖3-差向異構酶的突變體
酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發明公開一種熱穩定性提高的D-阿洛酮糖3-差向異構酶的突變體酶，屬於酶的基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]D-阿洛酮糖3-差向異構酶(DPE酶)屬於D-塔格糖3_差向異構酶(簡稱DTE)家族酶，可以催化多種酮糖C3位的差向異構，是生產稀有糖的良好的生物催化劑，可單獨或與其他酶偶聯合成多種碳水化合物，被廣泛的應用於化學、食品和製藥等領域。DPE酶可分別催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖。目前，DPE酶用於催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉化，利用D-果糖生產D-阿洛酮糖。
[0003]隨著由過量高能量食物攝入引發的一系列慢性病在世界範圍內的爆發，膳食結構越來越受到人們的關注。新型的蔗糖替代品的開發和研究仍是功能性甜味劑領域具有重要經濟價值和實際意義的當務之急。D-阿洛酮糖是一種稀有糖，具有多種營養和生理特性。D-阿洛酮糖可被用作低熱量的甜味劑。D-阿洛酮糖已於2011年被FDA認定為GRAS食品，允許用於食品和膳食補充劑中。另外D-阿洛酮糖具有保護胰腺β-胰島細胞，減少脂肪堆積和清除活性氧等生理作用，在製藥業中有很大的應用前景。
[0004]雖然D-阿洛酮糖的需求量在日益增加，但其在自然界中含量極少且極難獲得。生物法製備D-阿洛酮糖是近 年來的一個研究熱點。良好的生物催化劑的開發對工業應用至關重要。耐熱酶具有多種優點，如轉化率高，反應速度快，汙染少，底物粘度低等。因此，開發具有良好熱穩定性的DPE酶對D-阿洛酮糖的生產有重要的意義。
[0005]由於來源於野生菌株未經改造的DPE酶在熱穩定性等方面存在一定的局限性，限制了其應用範圍。本實驗室開發的梭狀芽孢桿菌如7teae)DPE酶可以有效促進D-果糖與D-阿洛酮糖之間的轉化(Min Jia, et al.2013, Applied Microbiologyand Biotechnology, DOI 10.1007/s00253-013-4924_8)。但為獲得更適合的生物催化劑，通過定點突變的方法，對DPE酶進行分子改造，進一步提高其熱穩定性，以期得到酶學性質更適合工業應用的DPE酶。

【發明內容】

[0006]本發明提供一種熱穩定性提高的D-阿洛酮糖3-差向異構酶的突變體酶及其應用，對D-阿洛酮糖的生產有重要的意義。
[0007]本發明的技術方案:一種熱穩定性提高的D-阿洛酮糖3-差向異構酶DPE的突變體酶G109P，將來源於梭狀芽孢桿菌bolteae)KTCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構酶，進行突變所得的單突變體酶；將原來DPE酶基因中第109位的甘氨酸Gly替換為脯氨酸Pro,命名為G109P。
[0008]與野生型酶DPE相比，所述DPE的突變體酶G109P的熱穩定性獲得提高，以在55°C下的半衰期t5(l來表示熱穩定性，DPE的突變體酶G109P的半衰期為91.5min，是野生型酶DPE 的 2.13 倍。
[0009]一種重組表達質粒，其中含有權利要求1所述DPE的突變體酶G109P基因。
[0010]一種表達宿主，其被含有DPE的突變體酶G109P基因的重組表達質粒轉化。
[0011]所述DPE的突變體酶G109P的應用，在化學、食品和製藥領域中的應用。
[0012]所述梭狀芽抱桿菌(JJlostridiumbo I teae ) ATCC BAA-613 的 DPE 酶基因在GenBank的編號為CL0B0L_00069，基因全長876個核苷酸(見序列表中SEQ ID No:l)，編碼291個胺基酸(見序列表中SEQ ID No:2)0
[0013]所述DPE的突變體酶是將其109位胺基酸甘氨酸Gly突變為脯氨酸Pro，命名為G109P (見序列表中SEQ ID No:4)。G109P的核苷酸序列見(SEQ ID No:3)。
[0014]本發明還提供DPE酶的突變體酶G109P的製備方法，其具體步驟為:
1)在梭狀芽孢桿菌?ο?teae)DPE酶模擬結構的基礎上確定突變位點；
2)設計定點突變的突變引物，以攜帶DPE酶基因的載體為模板進行定點突變構建突變質粒 pet22b(+)-G109P ；
3)將突變質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞，挑選驗證後的陽性單克隆進行發酵培
養;
4)離心菌體，重懸後超聲破碎，Ni2+柱純化得到突變體G109P。
[0015]本發明的有益效果:本發明提供一種具有較高熱穩定性的DPE酶的突變體酶G109P，其半衰期為91.5min,是野生型DPE酶的2.13倍。該突變體酶在化學、食品和製藥領域中具有重要的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1梭狀芽孢桿菌(AoJteae)DPE酶及突變體酶G109P在55°C下的熱穩定性，殘餘酶活與時間的曲線圖
:梭狀芽抱桿菌(t/ia?ieae) DPE 酶；.:DPE 的突變體酶 G109P。
【具體實施方式】
[0017]實施例1:DPE酶熱穩定性定點突變分析及突變體製備方法
通過對DPE酶3D空間結構進行分析，發現G109位於活性位點的β迴轉區域，通過改變109位胺基酸的疏水性，可改變酶分子的穩定性。因此將疏水性較弱的甘氨酸Gly替換為疏水性較強的脯氨酸Pro，以增加其熱穩定性。
[0018]利用快速PCR定點突變的方法構建pet22b (+) -G109P突變質粒；
pet22b (+)-G109P突變質粒的構建:以pet22b (+)-cb-dpe質粒為模板，利用G109P的突變引物通過一次PCR得到大小為6.4kbp左右的產物，將PCR產物經處理後轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，挑選轉化子測序驗證。
[0019]測序驗證結果表明除了所需突變位點外，沒有出現隨機突變，因此突變質粒pet22b (+) -G109P 構建成功。
[0020]突變引物如下所示:(下劃線為突變點)
G109P 1:5』 -CATATCCTGG GAGGGCCATT ATATTCCTAC-3』G109P 2:5』 -CCCTCCCAGGATATGGATAT CCATTAACTG-3』
所用引物由上海生工生物有限公司合成提供。
[0021]PCR擴增體系如下:
組分體積(μυ
5XPrimeSTARTMGC Buffer4
dNTPs (各 2.5 mM)1.6
正向引物(10 μΜ)I
反向引物(10 μΜ)I
模板DNA1.6
PrimeSTARTM HS DNA Ploymerase (2.5U/y L) 0.2 ddH2010.6
上述PCR條件為:
98°C預變性lOmin，然後進行以下循環:98°C變性10s，60°C退火5s，72°C延伸6.5min ；25個循環；72°C延伸10min，4°C保溫。
[0022]實施例2:梭·狀芽孢桿菌(Clostridium bolteae) DPE的突變體酶的表達純化方法。
[0023]將測序驗證後的突變質粒pet22b (+) -G109P轉化大腸桿菌BL21 (DE3)細胞，挑取陽性轉化子在LB培養基中37°C，200rpm搖培過夜，後接入LB培養基37°C培養3_4h至OD值為0.6-0.8，降溫至25°C，加入IPTG終濃度為0.8mM誘導8h。
[0024]發酵液於4°C、1000Orpm 離心 20min,取菌體。加入 15 mL Binding Buffer(50 mMNa2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl，調節pH至7.4)充分重懸浮菌體，然後將離心管置於冰浴中，放入超聲波細胞破碎儀中，超聲破碎的條件為:工作時間I S，停止時間2s，共計20mirio將獲得的破碎液進行低溫高速離心，4°C、10000 r/min離心30 min,所得即粗酶液。用微孔濾膜過濾，備用。
[0025]準備Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和介質填充層析柱,首先,在4°C環境下利用恆流泵，向柱子裡泵入Binding Buffer平衡柱子環境，然後將得到的過膜粗酶液加入到柱子中，利用恆流泵向柱子加入Wash Buffer (50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 500mM NaCl,50 mM咪唑，調節pH至7.4)洗滌雜蛋白，待基線平穩後，泵入Elution Buffer(50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl，500 mM 咪唑，調節 pH 至 7.4)洗脫目的蛋白。收集目的蛋白的洗脫液。將洗脫液放入處理後的透析袋中，採用平衡液透析過夜，得到純化後的DPE的突變體酶。純化後DPE的突變體酶G109P達到電泳純。
[0026]實施例3 =DPE酶在55 °C下的熱穩定性
1.DPE酶活測定方法:I mL的反應體系中，加入700 yL用100 g/LD_果糖，200 μ L稀釋酶液，100 μ L終濃度為I mM的Co2+離子。55°C保溫5 min，然後煮沸10 min以終止酶反應。
[0027]2.將純化後的DPE酶液置於55°C水浴中保溫，定期測定殘餘酶活。繪製殘餘酶活與時間的關係曲線(如圖1)，根據曲線得到該溫度下DPE酶的半衰期。
[0028]表1.DPE酶在55°C熱穩定性
—|t1/a(55°C ) (min) |t1/a(55°C )提高倍數
【權利要求】
1.一種熱穩定性提高的D-阿洛酮糖3-差向異構酶DPE的突變體酶G109P，其特徵在於將來源於梭狀芽孢桿菌bolteae) ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向異構酶進行突變所得的單突變體酶；將原來DPE酶基因中第109位的甘氨酸Gly替換為脯氨酸Pro，命名為G109P。
2.根據權利要求1所述的DPE的突變體酶G109P，其特徵在於與野生型DPE酶相比，所述DPE的突變體酶G109P的熱穩定性獲得提高，以在55°C下的半衰期t5(l來表示熱穩定性，DPE的突變體酶G109P的半衰期為91.5min,是野生型酶DPE的2.13倍。
3.—種重組表達質粒，其特徵在於其中含有權利要求1所述DPE的突變體酶G109P基因。
4.一種表達宿主，其特徵在於其被權利要求3所述的重組表達質粒轉化。
5.權利要求1所述DPE的突變體酶G109P的應用，其特徵在於在化學、食品和製藥領域中的應用。·
【文檔編號】C12N15/61GK103849613SQ201410002096
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2014年1月3日
【發明者】江波, 沐萬孟, 賈敏, 張濤, 黃敏, 周榴明 申請人:江南大學