多不飽和脂肪酸及含有其的脂質的製造方法

2023-05-28 20:45:41 1

專利名稱：：多不飽和脂肪酸及含有其的脂質的製造方法
技術領域：
：本發明涉及多不飽和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂質的製造方法、含有PUFA的微生物菌體及其利用。本發明特別涉及二高-Y-亞麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的含量高的脂質及含有該脂質的微生物菌體的製造方法、以及其代表性的利用。
背景技術：
：多不飽和脂肪酸(以下稱為PUFA)具有各種有用的生理功能。在此，PUFA是指碳原子數為20以上的具有2個以上雙鍵的脂肪酸。在PUFA中、特別是在二高-Y-亞麻酸(以下稱為DGLA)、花生四烯酸(以下稱為ARA)中，近年來發現了各種有用性(非專利文獻l)。例如在DGLA中發現了特應性皮炎抑制效果、抗變應性作用等，在ARA中發現了以腦功能改善作用、嬰兒營養效果為代表的多種有用性。此外，在成人病患者、其亞健康人群、嬰兒、高齡者、寵物(特別是貓科動物)中DGLA、ARA的不足引人擔心。在這種情況下，對PUFA、特別是DGLA、ARA的供給方法進行了各種探討，作為實用的製造方法，探討了通過培養具有上述脂肪酸的生產能力的微生物而製造的方法。在對培養方法進行各種探討的基礎上，發現了可工業生產的方法(非專利文獻1)。在PUFA中、特別是對於DGLA，發現了通過大規模培養，每lkg乾燥菌體中的DGLA量最高達到167g的培養方法(專利文獻l、非專利文獻2)。但是在這些方法中，在培養初期葡萄糖的消耗量多，另一方面為了避免由高葡萄糖濃度引起的增殖阻礙所導致的生產率降低的障礙，需要從培養初期開始最少在數天內分期頻繁地添加葡萄糖。另一方面，對於特定的物質，也探討了用於使其產量提高的微生物的培養方法。專利文獻2公開了在含有乳清的培養基中培養Khm'eY鼎yceshmis發酵生產腦苷脂時，在培養基中添加各種鈉源的方法、控制培養基pH的方法。此外，對於被孢黴屬絲狀菌的培養方法，非專利文獻3公開了將朋40H兼作氮源並控制pH的方法，專利文獻3公開了在培養的後半期控制pH為77.5的方法。非專利文獻4公開了通過在培養基中添加KH2P04和0.05%CaCl2'2H2O、O.05%MgCl2*6H20、0.l%Na2S04，菌形態變為最適形態，且PUFA生產性提高。專利文獻l日本專利第3354581號專利文獻2日本特開2006-55070專利文獻3US5，658，767非專利文獻l河島洋、FoodsFoodIngredientsJJpn，210,106-114(2005)非專利文獻2HKawashimaetal.，JAmOilChemSoc，77,1135-1138(2000)非專利文獻3Byung-HaeHwangetal.，BiotechnolLett,27，73卜5(2005)非專利文獻4藤川茂昭等、生物科學與工業、57、818-821(1999)
發明內容如上所述，對於通過培養具有脂肪酸生產能力的微生物來製造PUFA、特別是DGLA、ARA的方法進行了各種探討。但是，利用上述以往技術得到的微生物菌體存在微生物菌體中的PUFA含量低的問題。含有PUFA的微生物菌體，雖然可將乾燥後的乾燥菌體直接配合在飲食品、營養組合物、飼料、寵物食品等中，但在微生物菌體中PUFA佔有的含量低時，為了充分發揮PUFA的效果，需要配合大量的微生物菌體，因此其他成分的配合量受到顯著限制。此外，含有PUFA的微生物菌體也可作為用於提取含有PUFA的脂質的原料使用，但是微生物菌體中的PUFA含量低時，必須處理大量的微生物菌體，因此需要大規模的提取裝置、大量的提取溶劑。因為這會引起成本大幅上漲，而且處理時需要的能量也大，所以對地球環境的負荷加大。此外，在以往技術中也嘗試了對微生物菌體進行的各種培養控制，但是因為培養操作變得複雜化時，會引起雜菌汙染、操作失誤的危險及成本上漲，所以包括在培養基中添加添加物的操作，採用儘量少的操作進行高效培養非常重要。本發明是鑑於上述課題而進行的發明，其目的在於提供PUFA或含有其的脂質的低成本、操作簡便、適合大量生產的製造方法、以及PUFA或含有其的脂質的含量高的微生物菌體及其利用方法。到目前為止，對於使被孢黴屬絲狀菌的PUFA生產提高的培養方法，已探討了在基本培養基中添加油脂、鹽類的方法，但是對於有機酸的添加，即使有在其他微生物中添加的例子，但也還未有使PUFA含量增加的見解。此外，對於培養過程中的pH控制，也未有關於最適pH的控制的詳細分析報告。而且，通過添加有機酸當然可以降低pH，但是未著眼於對於有機酸添加和pH控制的組合對PUFA生產所產生的影響。對於培養基中的微量金屬鹽的量，例如非專利文獻4中雖著眼於使用CaCl2和MgCl2、主要是Ca2+和Mg2+的效果，但未考慮與金屬離子成對的陰離子的影響，未著眼於與金屬離子成對的陰離子對微生物的PUFA生產率所產生的影響。關於在基本培養基中添加添加物的操作，對培養前的培養基通常進行加熱滅菌，但因為將葡萄糖和其他化合物混合進行滅菌誘發化學反應的可能性高，所以通常不這樣進行。因此，在培養初期在培養基中添加葡萄糖以外的添加物會使操作變得煩雜、困難。從避免將葡萄糖和其他化合物(容易發生化學反應)同時進行滅菌的方面出發，必須儘量減少上述添加操作。本發明者為了解決上述課題進行精心研究的結果，首次發現在液體培養基中進行通氣攪拌培養高山被孢黴的同時製造PUFA及含有其的脂質的方法中，通過(a)在培養基中添加有機酸及/或有機酸鹽進行培養；(b)在培養開始後，在規定時期提高培養基的pH並控制在一定範圍內；(c)在培養基中添加金屬離子的硫酸鹽；及將所述操作組合，微生物菌體內生產的脂質、以及該脂質中的PUFA、特別是DGLA、ARA的量飛躍提高。並且對於能夠同時進行(a)有機酸等的添加和(b)培養基pH的控制等進行上述(a)(c)的時期進行了進一步的探討，完成了本發明。艮P:本發明提供PUFA、優選ARA及/或DGLA、更優選DGLA或含有其的脂質、優選甘油三酯的製造方法，其為將具有花生四烯酸(ARA)及/或二高-y_亞麻酸(DGLA)生產能力的微生物、優選屬於被孢黴屬的微生物、更優選高山被孢黴進行培養，優選在液體培養基中進行通氣攪拌培養的同時製造多不飽和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂質的方法，包括以下(a)(C)工序中的1種以上(a)在主培養開始後，優選在脂肪酸積累期、更優選在主培養開始後24小時之後、進一步優選在主培養開始後第3天之後、特別優選在主培養開始後第4天之後，在培養基中添加有機酸、優選選自糖酵解途徑和其分支途徑、或TCA循環中含有的有機酸中的1種以上的有機酸、更優選選自琥珀酸、富馬酸、丙酮酸、乳酸及蘋果酸中的1種以上的有機酸、進一步優選琥珀酸0.015w/v。/。、優選0.25w/v%、更優選0.225w/v°/。、進一步優選0.35w/v%、特別優選0.445w/v。/。的工序；(b)在主培養開始後，優選在脂肪酸積累期、更優選在主培養開始後24小時後、進一步優選在主培養開始後第3天之後、特別優選在主培養開始後第4天之後，控制培養基的pH使其在培養有效範圍內、優選在pH68範圍內、更優選在pH6.37.5範圍內、進一步優選在pH6.67.5範圍內、特別優選在pH6.97.2範圍內提高的工序；及(c)在主培養培養基中，添加金屬離子的硫酸鹽、優選選自MgSO,、CaS04、Na2S(X、K2S04、FeS0h及MnS(V等中的1個以上、更優選MgSO,及/或CaS040.01.5w/V/。、優選0.010.25w/w。/。、更優選0.050.2w/wO/。、特別優選0.060.lw/w%的工序，並且最好是代替培養基中的金屬氯化物，添加相應的上述硫酸鹽的工序。本發明還提供上述的製造方法，其包括上述工序(a)及工序(b)，工序(a)及工序(b)優選在同日、更優選在同時、且在與向培養基中添加碳源例如葡萄糖不同的時間、優選在不同的日子進行。本發明還提供上述的製造方法，其包括上述工序(c)，工序(c)在主培養開始前進行。本發明還提供上述的製造方法，其中，在上述PUFA或含有其的脂質中，上述總脂肪酸中的DGLA為35w/wy。以上、優選37w/V/。以上、特別優選40w/w。/。以上。本發明還提供高山被孢黴的乾燥菌體，其中，每lg乾燥菌體中的DGLA為190mg以上、優選195mg以上、更優選200mg以上、特別優選220mg以上。本發明還提供上述乾燥菌體，其為將利用包括以下(a)(c)工序中的1個6以上的方法，在液體培養基中進行通氣攪拌培養後的高山被孢黴菌體，進一步供給千燥工序所得到的乾燥菌體，所述(a)(C)工序為，(a)在主培養開始後第3天之後、優選在主培養開始後第4天之後，在培養基中添加選自琥珀酸、富馬酸、丙酮酸、乳酸及蘋果酸中的l種以上的有機酸、優選琥珀酸0.25w/v%、優選0.225w/v%、更優選0.35w/v%、進一步優選0.445w/v。/。的工序；(b)在主培養開始後第3天之後、優選在主培養開始後第4天之後，控制培養基的pH使其在p朋.67.5範圍內、優選在pH6.97.2範圍內提高的工序；及(c)在主培養培養基中，添加選自MgS04、CaS04、Na2S04、K2S04、FeS04、及MnS04等中的1種以上、優選MgS。4及/或CaS040.050.2w/w%、優選0.060.1w/V/。的工序，並且最好是代替培養基中的金屬氯化物，添加相應的上述硫酸鹽的工序。本發明還提供包含上述乾燥菌體或來自上述乾燥菌體的ARA及/或DGLA的飲食品，優選營養補助品、飲料、動物用飼料，更優選動物用詞料(特別是寵物食品)。進而本發明提供利用上述製造方法獲得的PUFA、優選ARA及/或DGLA或含有其的脂質、優選甘油三酯。進而本發明提供上述製造方法，其中，與不包括工序(a)(c)的製造方法相比，獲得的每lg微生物乾燥菌體中的DGLA增加3%以上、優選5%以上、更優選10%以上。進而本發明提供上述製造方法，其中，與不包括工序(a)(c)的製造方法相比，獲得的每lg微生物乾燥菌體中的ARA增加。進而本發明提供上述製造方法，其中，培養結束後的每lml培養基中的DGLA量為5.5mg以上、優選6.5mg以上、更優選7.0mg以上、進一步優選7.5mg以上。進而本發明提供上述製造方法，其中，與不包括工序(a)(c)的製造方法相比，培養結束後的每lml培養基中的DGLA量增加5%以上、優選10%以上、更優選15%以上。進而本發明提供上述製造方法，其中，與不包括工序(a)(c)的製造方法相比，培養結束後的每lml培養基中的ARA量增加。根據本發明的製造方法，微生物菌體中的PUFA、含有其的脂質的含量飛躍提高，因此，可有效利用含有PUFA的微生物菌體、以及PUFA及含有其的脂質。並且在本發明中，因為在主培養開始前進行(c)金屬離子的硫酸鹽的添加，渡過主培養初期的葡萄糖添加的必要時期之後，進行(a)有機酸的添加、(b)培養基pH的控制即可，所以可以避免在同日進行這些操作和葡萄糖的添加操作這一煩雜問題。其結果，可以提供PUFA或含有其的脂質的低成本、操作簡便的適合大量生產的製造方法、以及PUFA或含有其的脂質的含量高的微生物菌體及其利用方法。圖l表示在實施例4中，從高山被孢黴(Mortierellaalpina)S14株的主培養開始第5天控制pH(pH5.0、5.8、7.2)時對DGLA量的影響。圖2表示在實施例5中，從高山被孢黴nvtortierella由ina)S14株的主培養開始第3天控制pH(pH6.6、6.9、7.2、7.5)時對DGLA量的影響。具體實施例方式作為可在本發明的製造方法中使用的微生物，可例舉具有ARA及/或DGLA生產能力的微生物，優選為被孢黴屬絲狀菌，更優選為被孢黴亞屬絲狀菌，進而優選為高山被孢黴。例如作為具有含有花生四烯酸作為構成脂肪酸而形成的脂質(甘油三酯)的生產能力的微生物，可例舉屬於被孢黴(Mortierella)、耳黴屬(Conidiobolus)、腐黴屬(Pythium)、疫黴屬(Phytophthora)、青黴屬(Penicillium)、枝f包屬(Cl油sporium)、毛黴屬(Mucor)、,廉刀菌屬(Fusarium)、麴黴屬(Aspergillus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、蟲黴屬(Entomophthora)、Echinosporamgium屬、7乂黴屬(Saprolegnia)白勺j敦生物。屬於被孢黴(Mortiere—一la)屬被孢黴(Mort.ierel1a)亞屬的微生物，例如可例舉長孢被包黴(Mortierellaelongatsi)、Mortierellaexigua、Mortierellahygrophila、高山被孢黴(Mortierellaalpina)等。具體可例舉長孢被孢黴(Mortierellaelongata)IF08570、MortierellaexiguaIF08571、MortierellahygrophilaIF05941、高山被孢黴(Mortierellaalpina)IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等菌株。這些菌株均可從大阪市的財團法人發酵研究所(IF0)、及美國菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)以及CentrralBureauvoorSchimmelcultures(CBS)等中無任何限制地獲得。此外也可使用本發明研究組從土壤中分離的菌株高山被孢黴1S-4株、菌株長孢被孢黴SAM0219(微工研菌寄第8703號)(微工研條寄第1239號)、採用常法亞硝基胍誘變法從1S-4株中誘導獲得的高山被孢黴S14株、高山被孢黴Iz3株等。此外，作為可在本發明的製造方法中使用的微生物，還包含上述微生物的突變株。例如可使用對屬於被孢黴亞屬的微生物進行突變操作，使去飽和酶、碳鏈增長酶的活性降低或缺損或提高的突變株。突變操作可採用同領域技術人員公知的方法進行。突變株是否具有所期望的PUFA生產能力，只要是同領域技術人員即可容易地判斷。[基本培養操作]本發明提供在培養上述微生物的同時製造多不飽和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂質的方法。在上述微生物的培養中向培養基內接種菌體的方法，根據培養方法同領域技術人員可適當選擇。具體為將微生物菌株的營養細胞、孢子及/或菌絲、或者經預培養獲得的種子培養液或通過種子培養回收的營養細胞、孢子及/或菌絲接種在液體培養基或固體培養基中並進行培養。本發明的製造方法使用的培養基中，作為碳源，可以單獨或組合使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性澱粉、糖蜜、甘油、甘露醇、蔗糖、山梨糖醇、半乳糖、糖化澱粉等，進而還可以使用含有上述物質的柑橘糖蜜、甜菜糖蜜、甜菜搾汁、甘蔗榨汁等，只要是同領域技術人員通常使用的碳源，可使用任意的碳源。作為氮源，可以使用同領域技術人員通常使用的氮源，例如除蛋白腖、酵9母浸膏、麥芽浸膏、肉浸膏、酪蛋白水解物、玉米漿、大豆蛋白、脫脂大豆、棉籽粕等天然氮源之外，還有尿素等有機氮源、以及硝酸鈉、硝酸銨等硝酸鹽、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等銨鹽等無機氮源。特別是可以使用從大豆中獲得的氮源，具體為大豆、脫脂大豆、大豆片、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆奶、熟黃豆面等。例如可單獨或組合使用對脫脂大豆實施熱改性後的產物，更優選在約709(TC對脫脂大豆進行熱處理，進而除去乙醇可溶性成分後的產物，或者可與上述氮源組合使用。根據其它需要，可將磷酸離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子、鈣離子、鐵、銅、鋅、錳、鎳、鈷等金屬離子、維生素等作為微量營養源使用。根據需要，也可添加ADEKANATE等消泡劑。這些成分在培養基中的濃度，只要不阻礙微生物的生長發育，無特別限制。實際使用中期望碳源的總添加量相對於培養基為0.l40w/w%、優選為l25w/w%，氮源的總添加量相對於培養基為215w/w%、優選為210w/w%。此外，已知在主培養中初始氮源濃度及/或碳源濃度過高時阻礙微生物的成長。作為適當的方式，使初始碳源添加量為l8w/w%、優選l5w/V/。，初始氮源添加量為O.l8w/w%、優選l6w/w。/。，在培養過程中添加微生物消耗的碳源及氮源進行培養。將葡萄糖和其他化合物混合進行滅菌，誘發化學反應的可能性高，並且因為已知碳/氮比高時微生物的脂質生產率高，所以作為特別適當的方式，僅將碳源通過流加等添加在培養基中進行培養。此外，為了提高微生物菌體中的含PUFA脂質的含量，作為不飽和脂肪酸的前體，例如可將十六烷或十八垸等烴；油酸或亞油酸等脂肪酸或其鹽、或脂肪酸酯(例如乙酯、甘油脂肪酸酯、脫水山梨醇脂肪酸酯等)；或橄欖油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油等油脂類單獨或組合添加在培養基中。這些物質的添加量相對於培養基為0.00110w/w%、優選為0.0510w/w%。此外，也可將這些物質作為培養基中的唯一碳源進行培養。培養可使用以往的培養微生物的方法，具體可使用靜置培養、振蕩培養、通氣攪拌培養等。作為培養操作法，可使用所謂的分批發酵法、批式流加發酵法、反覆分批發酵法及連續發酵法等中的任一種。此外，作為攪拌方式，例如可使用葉輪(攪拌葉輪)、氣升發酵槽、發酵液的泵驅動循環、及這些方式的組合等。本發明的製造方法可利用上述培養方法來實施，其中，採用在液體培養基中的通氣攪拌培養來進行主培養在工業上有利。作為用於進行通氣攪拌培養的槽，例如可使用發酵罐及槽等的攪拌槽，但並不限於這些。在通氣攪拌培養中，例如可通入空氣等含氧氣體、氬及氮等不含氧的氣體中的任一種，這種氣體可由同領域技術人員結合培養體系的條件來適當選擇。例如在下述實施例記載的方法(作為本發明的一種方式的高山被孢黴(Mortierellaalpina)時)中，向培養基中通入空氣等含氧氣體。微生物的培養溫度因使用的微生物不同而不同，通常為54CTC、優選203CTC。作為另一方式，在203(TC進行培養使菌體增殖後，在52(TC繼續培養可生產含PUFA的脂質。採用這樣的溫度管理，也可提高含PUFA的脂質中的PUFA含量。在試管、燒瓶中培養上述微生物時(預培養階段)的培養時間通常為110天、優選15天、更優選13天。後續的主培養的培養時間通常為230天、優選520天、更優選515天。可將所期望的PUFA含量、脂肪酸組成作為判斷主培養結束時的基準。主培養大致可分為微生物的對數增殖期、即從微生物的乾燥菌體重量中減去菌體內總脂肪酸重量後的無脂質菌體量增加的時期、和其後續的PUFA等的脂肪酸積累期、即無脂質菌大量變化小的時期。非專利文獻4中記載在10kL培養箱內培養高山被孢黴(Mortierellaalpina)1S-4時，具有從培養開始到第2天的增殖期(無脂質菌體量增加)、和其後續的脂肪酸積累期(無脂質菌體量幾乎無變化)。對數增殖期及脂肪酸積累期的判斷方法，可參照非專利文獻4記載的方法進行。此外，在微生物主培養開始時(添加種子培養液時)，調節培養基的pH為57、優選為5.56.5。本發明提供上述製造方法，其為在培養上述微生物的同時製造PUFA及含有其的脂質的方法，包括(a)在主培養開始後，在培養基中添加有機酸0.015w/v。/。的工序。向培養基中添加有機酸，例如可參照下述實施例進行。在該工序(a)中，所述有機酸包含有機酸及其鹽、以及其水合物，以下有時將這些總稱為"有機酸等"。在本說明書中，有機酸是指在具有-COOH基的有機化合物中，在培養基中添加量為0.015w/v。/。時不阻礙上述微生物增殖的有機酸，其中特別優選糖酵解途徑和其分支途徑、或TCA循環中包含的有機酸。糖酵解途徑及TCA循環是與以葡萄糖為初始物質獲取能量、合成脂肪酸相關的中心途徑，其中大多數由有機酸構成。這些有機酸通過糖酵解途徑、TCA循環、進而通過其分支途徑、旁路途徑進行相互變化。通常情況下，作為PUFA合成的最初階段的脂肪酸合成，需要上述途徑中生成的乙醯CoA、NADPH，與上述途徑密切相關。因此，期待通過改變培養基中有機酸的量、平衡來改變上述微生物的PUFA生產能力。特別優選添加在培養基中培養上述微生物時，每單位重量微生物乾燥菌體中的PUFA量增加的有機酸及/或每單位體積培養基中的PUFA量增加的有機酸。例如可使用琥珀酸、富馬酸、丙酮酸、乳酸、蘋果酸(這些為碳原子數為34的單或二羧酸，具有1個以下-0H基)、所述酸的鹽或其水合物中的至少1種，可優選使用琥珀酸、蘋果酸、乳酸、所述酸的鹽或其水合物中的至少1種。作為有機酸的鹽，可使用鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、銨鹽中的至少1種。是否為添加時的優選有機酸等，例如可根據下述實施例中記載的方法來判斷。在培養基中添加上述有機酸等，換算為游離有機酸，可添加0.015w/v%、優選0.2w/V/o以上、更優選0.22w/V。/。以上、進一步優選0.3w/V/。以上、特別為0.44w/v。/。以上。為0.01w/v。/。以下時，無法獲得提高上述微生物中的PUFA或含有其脂質的含量的所期望效果，為5w/v。/。以上時，有可能阻礙上述微生物的增殖。此外，認為在一定量以上時伴隨有機酸添加量的增加，上述微生物中的PUFA或含有其的脂質的含量並不會增高，所以在該一定量以上的範圍可任意選擇有機酸添加量。作為優選的一種方式，在培養基中可添加琥珀酸二鈉鹽'六水合物lw/v%、即可添加琥珀酸0.44w/v%。上述有機酸等，例如可作為水溶液添加在培養基中。可將有機酸水溶液調節至與有機酸添加前的培養基相同程度的PH後添加，也可調節為不同的pH可使培養基的pH變化。上述有機酸等在微生物的主培養中添加，優選不是在主培養開始前，而是在主培養開始後添加。因為考慮到有機酸等的添加效果表現在脂肪酸積累期，所以在上述微生物的主培養開始後、適合在對數增殖期結束轉移至脂肪酸積累期後、例如在主培養開始後24小時之後、優選在主培養開始後第3天之後、更優選在主培養開始後第4天之後在培養基中添加上述有機酸。特別是可在主培養開始後第35天之間、例如在主培養開始後第4天添加有機酸。此外，有機酸可以1次添加，也可以分為數次添加，從操作簡便性的觀點來看，優選1次添加。[pH]本發明提供上述製造方法，其為在培養上述微生物的同時，製造PUFA及含有其的脂質的方法，包括(b)在主培養開始後，控制培養基的pH使其在培養有效範圍內提高的工序。培養基pH的控制，例如可參照下述實施例進行。認為培養中的培養基pH對微生物代謝產生影響，特別會對參與電子傳遞系統的脂肪酸合成、去飽和反應產生大的影響。培養基的pH的控制，可參照同領域技術人員公知的方法進行控制，使其比控制前的培養基的pH高、且為不阻礙微生物增殖的範圍內(培養有效範圍內)。例如在考慮控制前的培養基pH的情況下，可進行控制使培養基的pH提高到68的範圍內，該範圍優選pH6.37.5、更優選pH6.67.5、進一步優選p朋.97.2。pH的控制，優選用NaOH、K0H、NaHC03、氨等鹼性水溶液進行，特別是可使用廉價、容易獲得且對上述微生物不良影響小的NaOH水溶液進行。已知在上述微生物的主培養開始時被調節至pH57、優選pH5.56.5的培養基的pH，通常在微生物的對數增殖期降低一次後，再逐漸恢復到原來的pH，在脂肪酸積累期變化小。培養基的pH控制，在上述微生物的主培養中進行，優選不在主培養開始前，而是在主培養開始後進行。因為認為PH控制的效果表現在脂肪酸積累期，所以在上述微生物的主培養開始後、適合在對數增殖期結束轉移至脂肪酸積累期後、例如在主培養開始後24小時之後、優選在主培養開始後第3天之後、更優選在主培養開始後第4天之後進行上述pH的控制。特別是可在主培養開始後第35天之間、例如在主培養開始後第4天進行。此外，pH的控制可在控制開始後至培養結束時連續進行，考慮到在脂肪酸積累期的pH變化小及操作簡便性，可優選在脂肪酸積累期進行1次。本發明提供上述製造方法，其為在培養上述微生物的同時，製造PUFA及含有其的脂質的方法，包括(C)在主培養培養基中添加金屬離子的硫酸鹽0.010.5w/wT。的工序。在培養基中添加金屬離子的硫酸鹽，例如可參照下述實施例進行。作為上述金屬離子的硫酸鹽，例如可單獨或組合添加MgS04、CaS04、Na2S04、K2S04、FeS04、MnS04等，優選MgS04及CaS04。更優選代替培養基中的金屬氯化物、例如MgCl2、CaCl2，添加相應的上述硫酸鹽、例如MgS04、CaS04。在添加時可使用這些化合物的水合物。這些金屬離子的硫酸鹽是水合物時，用除去水分子的重量換算，在培養基中可添加合計為0.010.5w/w%、優選0.010.25w/w%、更優選0.050.2w/w°/。、特別優選0.060.lw/w%。添加MgS04及/或CaS04時，可同時添加Na2S04，但優選Na2S04相對於培養基為O.lw/V/c)以下，更優選不添加Na2S04。此外，作為金屬離子的硫酸鹽使用MgS04及CaS04時，例如相對於培養基，可以為0.05w/w%MgS04'7H20+0,05w/w%CaS042H20、0.06w/w%MgS04*7H20+0.06w/w%CaS04'2H20等的添加量。上述金屬離子的硫酸鹽可在主培養開始前添加到培養基中，也可在主培養過程中添加。與有機酸等不同，在對培養基滅菌時可與葡萄糖等碳源進行反應的可能性低，而且從操作簡便性的觀點來考慮，優選在主培養開始前的培養基中1次添加上述金屬離子的硫酸鹽。上述工序(a)(c)可分別進行，也可多數組合進行。例如使工序(a)及(b)組合進行時，通過工序(a)也可引起pH變化，並且從操作簡便性的觀點來看，優選所述工序在同日、更優選在同時進行。從更進一歩的操作簡便性的觀點來看，使所述工序避開碳源、例如葡萄糖的添加時機，優選在與添加碳源不同的日子進行。進而例如可使工序(a)及(c)、工序(b)及(c)、工序(a)、(b)及(c)組合進行，此時從操作簡便性的觀點來看，優選使工序(c)在主培養開始前進行，使工序(a)及/或(b)在主培養開始後、與碳源添加不同的日子進行。從本發明的目的在於提供PUFA或含有其的脂質的含量高的微生物菌體的觀點來看，特別優選使上述工序(a)、(b)及(c)全部組合進行。通過上述培養，在微生物菌體內生產並積累含有PUFA的脂質。在此，作為本發明的製造方法中使用的微生物菌體中含有的脂質，可例舉甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、磷脂質、溶血磷脂質、糖脂質、游離脂肪酸，特別是上述微生物菌體生產甘油三酯作為主要的脂質。作為構成上述脂質的脂肪酸可例舉PUFA。作為PUFA，只要是上述微生物菌體內含有、生產，蓄積的脂肪酸，無特別限制，例如可例舉二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-Y-亞麻酸(DGLA)、Mead酸、二十碳四烯酸、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳三烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳二烯酸、二十四碳三烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、及二十四碳六烯酸等。在本發明的製造方法中，因為使用特別是具有ARA、DGLA生產能力的微生物，所以PUFA中特別優選ARA及DGLA，最優選DGLA。通過對作為上述微生物的一例的被孢黴屬微生物的培養進行研究鑽研，可生產的DGLA、Mead酸、ARA、二十碳五烯酸也是優選的PUFA(參照非專利文獻1)。本發明的課題之一是提供PUFA或含有其的脂質的含量高的微生物菌體，從這一觀點來看，期望構成上述微生物菌體中含有的脂質的PUFA的含量高。該PUFA為DGLA時，在培養基中不添加DGLA的情況下培養上述微生物後，DGLA或DGLA殘基以游離脂肪酸換算，例如用下述實施例記載的方法測定時每lg乾燥菌體中大於164mg，例如為190mg以上、優選195mg以上、更優選200mg以上、進一步優選220mg以上。此外，在一種方式中，與以往的方法(不包括工序(a)(c))相比較，根據本發明的方法得到的每lg乾燥菌體中的DGLA增加，以游離脂肪酸換算，例如增加3%以上、優選5%以上、更優選10%以上。此外，在一種方式中，與以往的方法(不包括工序(a)(c))相比較，根據本發明的方法得到的每lg乾燥菌體中的ARA增加。同樣，期望構成上述微生物菌體中含有的脂質的PUFA在每單位培養基中的收量高。該PUFA為DGLA時，在培養基中不添加DGLA的情況下培養上述微生物後，每lml培養基中的DGLA或DGLA殘基的收量以游離脂肪酸換算，例如用下述實施例記載的方法測定時為5.5mg以上、優選6.5mg以上、更優選7.Omg以上、進一步優選7.5mg以上。此外，在一種方式中，與以往的方法(不包括工序(a)(c))相比較，在本發明的製造方法中培養結束後的每lml培養基中的15DGLA量增加，例如增加5%以上、優選10%以上、更優選15%以上。此外，在一種方式中，與以往的方法(不包括工序(a)(c))相比較，在本發明的製造方法中培養結束後的每lml培養基中的ARA量增加。在一種方式中，優選用本發明的製造方法得到的PUFA或含有其的脂質中的上述總脂肪酸中的DGLA多，以游離脂肪酸換算，例如用下述實施例中記載的方法測定時，例如為35w/V/。以上、優選37w/W/。以上、特別優選40w/w9&以上。培養結束後，採用同領域技術人員所公知的方法例如日本特開2000-69987、或參照下述實施例中記載的方法，可從培養基中獲得PUFA、含有PUFA的脂質、含有所述物質的微生物菌體。對於獲得的PUFA、含有PUFA的脂質，已在上述例舉。根據需要對菌體殺菌後，優選進行乾燥。用於獲得微生物乾燥菌體的乾燥工序，可通過烤箱加熱、冷凍乾燥、熱風乾燥等進行。從培養結束後的培養基中獲得的微生物菌體，期望每單位培養基中的乾燥菌體的重量多，例如優選每lml培養基中的乾燥菌體重量約為34mg以上。使用同領域技術人員所公知的方法，可以從乾燥菌體或溼菌體中獲得含有PUFA的脂質。例如用己烷等有機溶劑對乾燥菌體提取處理後，通過在減壓條件下從提取物中蒸餾除去有機溶劑，獲得以甘油三酯為主的高濃度的含有PUFA的脂質。並且通過對得到的以甘油三酯為主的脂質進行脫膠、脫酸、脫色、脫臭等通常對食用油脂實施的精製處理，可獲得高純度的精製食用油脂(甘油三酯)。脂質中的PUFA可直接分離，但通過形成低級醇酯例如甲酯，可容易地從其它脂質成分中分離出來。此外，可容易地僅將所需的PUFA從其它PUFA中分離出來。這種分離方法是同領域技術人員所公知的。本發明的微生物菌體，可直接或使其乾燥利用。此外，用本發明的製造方法獲得的PUFA及含有其的脂質，也可用各種方法利用。可使用同領域技術人員所公知的方法，例如如下述實施例所記載，將上述物質配合到例如包括營養補助品、營養組合物、動物用飼料(特別是寵物食品)、魚貝類養殖用飼料、奶粉等的飲食品中進行利用。關於PUFA、特別是ARA、DGLA的優選攝取量，例如可參照非專利文獻l的記載。這樣，通過使用本發明涉及的微生物菌體，即使微生物菌體的配合量少，也可簡便地獲得PUFA、特別是DGLA含量高的上述飲食品，例如配合微生物乾燥菌體0.5w/w%，可獲得100g中含有DGLA約lOOmg以上的寵物食品。此外，從上述微生物菌體中提取、精製的甘油三酯，在總脂肪酸中佔有的DGLA非常高，適合作為食用油脂。對於上述微生物(乾燥)菌體、PUFA或含有其的脂質、或配合了這些物質的飲食品，可將其具體用途(例如用於營養補助、成長促進、體質改善、供給特定的脂肪酸(例如DGLA、ARA)、腦功能改善等)及/或其具體使用方法(例如用量、次數、時間等)表示出來。實施例以下根據實施例對本發明進行具體說明，但本發明並不限於這些實施例。此外，在實施例中高山被孢黴(Mortierellaalpina)1S-4株產生含ARA脂質。高山被孢黴(Mortierellaalpina)S14株是本發明者從高山被孢黴(Mortierellaalpina)1S-4株中獲得的突變株，是幾乎完全喪失了使作為ARA的直接前體的DGLA轉化為ARA的△5去飽和酶的活性的菌株。即幾乎不產生ARA，而產生含有顯著量的DGLA的脂質(參照非專利文獻1)。高山被孢黴(Mortierellaal。ina)Iz3株與S14株同樣幾乎不產生ARA，而產生顯著量的含有DGLA的脂質。在已裝入試管內的10ml大豆粉液體培養基(3w/w%葡萄糖、1.5W/w%大豆粉、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2'6H20、0.05w/w%CaCl"2H20、pH6.3)中，接種約1白金耳的高山被孢黴(Mortierellaalpina)S14株，在28。C振蕩培養3天。在培養開始第4天，將滅菌後的50w/V/。葡萄糖溶液添加到.6ml培養基中，同時添加用NaOH調節pH為6.0的5w/v。/。濃度的各種有機酸水溶液0.6ml，進一步繼續培養(振蕩培養)。有機酸相對於全體培養基的濃度相當於0.3w/W。在此，作為有機酸，使用琥珀酸、富馬酸、丙酮酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸及乙酸。此外，作為對照，除不添加有機酸水溶液之外，進行同樣培養。在接種第10天結束培養，用日本特開2000—69987號記載的方法進行乾燥菌體的甲酯化，將獲得的脂肪酸甲酯乙酯用氣相色譜法分析。g卩在培養結束後，通過過濾從培養液中獲得培養菌體，將其充分洗滌後，用烤箱加熱(100°C)進行乾燥，獲得乾燥菌體。將獲得的乾燥菌體加入螺口試管(16.5mmcl))內，加入二氯甲垸lml、無水甲醇一鹽酸(10%)2ml，通過在50。C處理3小時，使菌體內的脂肪酸殘基甲酯化，加入正己烷4ml、水lml，提取2次，提取液的溶劑用離心蒸發器(4CTC、1小時)蒸發除去獲得脂肪酸甲酯。用毛細管氣相色譜法分析獲得的脂肪酸甲酯，求出DGLA的量。結果如表l所示。表ltableseeoriginaldocumentpage18添加琥珀酸、富馬酸、丙酮酸或乳酸時，每單位培養基中的乾燥菌體重量、每單位重量乾燥菌體中的DGLA量、每單位體積培養基中的DGLA量均增加，但添加擰檬酸、酒石酸、乙酸時未觀察到這樣的效果。[實施例2燒瓶培養中有機酸的添加效果]在已裝入燒瓶內的100ml的含有酵母浸膏的液體培養基(8w/w"/。葡萄糖、1.5雙/\￥%酵母浸膏、0.3w/w%K2HP04、0.lw/V/。Na2S04、0.05w/w%MgCl2'6H20、0.05w/w%CaCl2*2H20、pH6.3)中，接種約1白金耳高山被孢黴(Mortierellaalpina)S14株，在2『C振蕩培養5天。在培養開始第6天，添加2ml的用NaOH調節pH為6.0的10w/v%乳酸水溶液，進一歩繼續培養(振蕩培養)。乳酸相對於全體培養基的濃度相當於0.2w/v%。在接種第IO天結束培養，採用與實施例l同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出DGLA量。結果如表2所示。表2tableseeoriginaldocumentpage19通過添加乳酸，每單位培養基中的乾燥菌體重量、每單位重量乾燥菌體中的DGLA量、每單位體積培養基中的DGLA量均增加。並且，獲得的脂質中含有的總脂肪酸中的DGLA比例也增加。將1白金耳高山被孢黴(Mortierellaalpina)S14株接種於種子培養基100ml(2w/w。/。葡萄糖、lw/w%酵母浸膏、pH6.3)中，在往復振蕩100rpm、28。C的條件下進行3天預培養，製備種子培養液。接著在容積10L的通氣攪拌培養槽中加入5L主培養基(2w/w。/。葡萄糖、1.5w,/w%大豆粉、0.lw/w°/。甘油、0.2w/Vo/0大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2*6H20、0.05w/w%CaCl22H20、pH6.3)並進行滅菌，將上述種子培養液全部添加到其中。然後在26。C、通氣量lvvm(空氣、以下實施例中也相同)、攪拌轉速300rpm的條件下，通氣攪拌培養(主培養)7天。根據葡萄糖的消耗適當流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。考慮經過對數增殖期進入脂肪酸積累期的時間，在主培養開始第4天，添加用NaOH調節至pH6.3的有機酸水溶液(琥珀酸、富馬酸、乳酸)，使其終濃度為0.3w/v。/。，然後進行通氣攪拌培養。在主培養開始第7天，採用與實施例l同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出DGLA量。結果如表3所示。表3tableseeoriginaldocumentpage19添加琥珀酸、富馬酸、乳酸時，每單位重量乾燥菌體中的DGLA量、每單位體積培養基中的DGLA量均增加。並且獲得的脂質中含有的總脂肪酸中的DGLA的比例也增加。特別是使用琥珀酸及富馬酸時，增加更加顯著。[實施例4接種後的pH控制的影響1]將約1白金耳高山被孢黴(Mortierellaalpina)S14株接種於種子培養基100ml(2。/。葡萄糖、1%酵母浸膏、p朋.3)中，在往復振蕩100rpm、28。C的條件下進行3天預培養，製備種子培養液。接著，在容積10L的通氣攪拌培養槽中加入5L主培養基(2w/w0/。葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2*6H20、0.05w/w%CaCl22H20、pH6.3)並進行滅菌，將上述種子培養液全部添加到其中。然後，在26。C、通氣量lvvm、攪拌轉速300卬m的條件下，進行通氣攪拌培養13天(主培養)。根據葡萄糖的消耗適當流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。考慮經過對數增殖期進入脂肪酸積累期的時間，在主培養開始第5天到結束培養為止，使用經過滅菌的NaOH溶液或硫酸，調節pH為5.0、5.8、7.2。此外，未調節的對照組在主培養開始第5天的pH約為6.3。在主培養開始第13天，採用與實施例1同樣的方法獲得乾燥菌體，求出DGLA量。結果如圖1A1C所示。圖中橫軸表示培養第5天的pH值。從第5天開始控制pH低(低於對照p朋.3的pH)時的微生物的DGLA生產能力低，但控制pH高(高於對照p朋.3的pH)時的微生物的DGLA生產能力提高。採用與實施例4同樣的方法，培養高山被孢黴(Mortierellaalpina)S14株(預培養:3天、主培養ll天)。根據葡萄糖的消耗適當流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。考慮經過對數增殖期進入脂肪酸積累期的時間，從主培養開始第3天至培養結束，使用經過滅菌的NaOH溶液或硫酸，調節pH為6.6、6.9、7.2、7.5。在主培養開始第11天，採用與實施例1同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出DGLA量。結果如圖2A2C所示。圖中橫軸表示培養第3天的pH值。從第3天開始控制pH，與控制pH為6.6、7.5時相比，控制pH為6.9或7.2時微生物的DGLA生產能力提高。此外，在主培養開始後第5天及第3天控制pH，發現DGLA生產能力均提高，所以認為可在主培養開始後的該前後的時期、在適合培養操作的時期進行PH控制。20採用與實施例4同樣的方法，培養高山被孢黴(MortierellaalDina)1S-4株(預培養:3天、主培養:7天)。根據葡萄糖的消耗適當流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培養開始第4天，在pH為6.6的培養基中加入經過滅菌的NaOH溶液，調節pH為6.8。然後未進行特別的pH調節。在主培養開始第7天，採用與實施例1同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出ARA的量。結果如表4所示。表4pH調節無6.6—6,8千燥菌體重量(mg/ml培養基)40.034.3每單位重量千燥菌體中的ARA量(mg/g千燥菌體)M0206每單位體積培養基中的ARA量(mg/ml培養基)5.307.07總脂肪酸中的ARA的比例(9031.137.9從第4天開始調節pH，但與無調節時相比，微生物的ARA生產能力提高。[實施例7有機酸的添加方法]採用與實施例4同樣的方法，培養高山被孢黴(M。rtierellaalpina)S14株(預培養:3天、主培養10天)。根據葡萄糖的消耗適當流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。僅在主培養開始第4天、或在第4天和第7天添加琥珀酸或乳酸的鈉鹽水溶液，使最終濃度為農1所示量的琥珀酸或乳酸。此外，表4的AE中的任一種均是在第4天使用NaOH水溶液調節培養基的pH為約6.9。在主培養開始第10天，採用與實施例1同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出DGLA量。結果如表5所示。表5有機酸添加量(相對於培養基w/vx)對照A已CD琥珀酸第4天00.220.220.220.44第7天000.2200乳酸第7天0000，220千燥菌體重量(mg/ml培養基)34.636.836.636.939.1每單位重量千燥菌體中的DGLA量220227243228241(ing/g千燥菌體)每單位體積培養基中的DGLA量7.608.338.908.409.41(mg/ml培養基)總脂肪酸中的DGLA的比例(SO40.940.843.041.242.2此外，在第4天或第7天添加琥珀酸或乳酸，使其濃度為0.22w/v呢或0.44w/V/。時，均具有增加每單位重量乾燥菌體中的DGLA量、每單位體積培養基中的DGLA量等的效果。此外，將琥珀酸和乳酸組合添加也有效。將約1白金耳高山被孢黴(Mortierellaal。ina)S14株接種於種子培養基100ml(2w/w%葡萄糖、lw/w%酵母浸膏、pH6.3)中，在往復振蕩100rpm、28°C的條件下進行3天預培養，製備種子培養液。接著在容積10L的通氣攪拌培養槽中加入5L主培養基(2w/wT。葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.lw/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2*6H20、0.05w/w%CaCl22H20、pH6.3)並進行滅菌，將上述種子培養液全部加入其中。然後在26。C、通氣量lvvm、攪拌轉速300rpm的條件下，通氣攪拌培養11天(主培養)。根據葡萄糖的消耗適當流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培養開始第4天，添加琥珀酸鈉鹽水溶液使琥珀酸水溶液的最終濃度為0.44、0.87、1.3w/v%。此外，任一種均是在主培養開始第4天使用NaOH水溶液將培養基的pH調節至約為6.9。在主培養開始第ll天，採用與實施例1同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出DGLA量。結果如表6所示。表6琥珀酸添加量0.44w/v%0.87wM1.3w/v%千燥菌體重量(mg/邁l培養基)37.337.637.2每單位重量千燥菌體中的DGLA量(mg/g千燥菌體)2252282"每單位體積培養基中的DGLA量(mg/ml培養基)8.398.577.87總脂肪酸中的DGLA的比例(％)40.040.439.2以各種濃度添加琥珀酸時，發現添加0.87w/v。/。或1.3w/V/。時可獲得與添加0.44wV石時幾乎同等的生產能力。由此認為，在一定量以上，伴隨有機酸的添加量的增加，DGLA量並不會增加，因此可選擇一定量以上的任意的有機酸添加採用與實施例8同樣的方法，培養高山被孢黴(Mortierellaalpina)S14株(預培養3天、主培養:S天)。根據葡萄糖的消耗適當流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培養開始第4天，添加蘋果酸鈉鹽水溶液使蘋果酸水溶22液的最終濃度為0.71w/v%。此外，任一種均是在主培養開始第4天使用NaOH水溶液將培養基的pH調節至約為6.9。在主培養開始第8天，採用與實施例1同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出DGLA量。結果如表7所示。表7tableseeoriginaldocumentpage23通過添加蘋果酸，可獲得DGLA含量高的菌體。將約l白金耳高山被孢黴(Mortierellaalpina)Iz3株，接種於種子培養基100ml(2w/w%葡萄糖、lw/w%酵母浸膏、pH6.3)中，在往復振蕩100rpm、28°C的條件下進行3天預培養，製備種子培養液。工z3株與S14株相同，是對ARA生產菌高山被孢黴(Mortierellaalpina)IS-4株進行亞硝基胍的常法誘變處理而獲得的DGLA生產菌。接著，在容積10L的通氣攪拌培養槽內加入5L主培養基(2w/w"3/。葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、。.05w/w%MgCl2*6H20、0.05w/w%CaCl2'2H20、pH6.3)並進行滅菌，將上述種子培養液全部加入其中。然後在26"、通氣量lvvm、攪拌轉速300rpm的條件下，通氣攪拌培養9天(主培養)。根據葡萄糖的消耗適當流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培養開始第4天，添加琥珀酸鈉鹽水溶液以使琥珀酸水溶液的最終濃度為0.44w/v%。此外，任一種均是在主培養開始第4天使用NaOH水溶液將培養基的pH調節至約6.9。在主培養開始第9天，採用與實施例1同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出DGLA量。結果如表8所示。表8tableseeoriginaldocumentpage24由此可知，與S14株相同，通過添加琥珀酸，Iz3株的DGLA的生產能力也提高。使用高山被孢黴(Mortierellaalpina)S14株，將約1白金耳的保存菌株接種到酵母浸膏lw/V/。、葡萄糖2w/w%、pH6.3的培養基中，在往復振蕩100rpm、溫度28。C的條件下開始預培養(第一階段)，培養3天。接著，在50L容積的培養槽內製備30L酵母浸膏lw/w%、葡萄糖2w/V%、大豆油0.lw/w%、p服.3的培養基，在其中接種種子培養液(第一階段)，開始預培養(第二階段)，培養2天。接著，在主培養培養基(2w/w。/。葡萄糖、3.lw/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%N&S04、0.05w/w%MgCl2,6H20、0.05w/w%CaCl2*2H20、0.l%w/w%大豆油、0.01w/w%ADEKANATE、p朋.3)中接種種子培養液(第二階段)，配成合計6000L的初始培養液量(培養槽容積10kL)。在溫度26°C、內壓200kPa下開始培養。在培養第15天流加葡萄糖，在不使培養基中的葡萄糖消耗用完的同時培養12天。未進行主培養中的pH控制時，發現pH在6.06.5之間推移，在對數增殖期降低一次後，再逐漸恢復到原來的PH，在脂肪酸積累期變化小的趨勢。培養結束後，在121。C、20分鐘的條件下對培養液7.9kL進行殺菌後，利用附帶空氣壓縮結構的臥式壓濾機回收溼菌體，用iocrc熱風乾燥，獲得乾燥菌體(水分含量2%)。獲得的乾燥菌體量為47.2kg/kL培養基、每單位重量乾燥菌體中的DGLA量為174g/kg乾燥菌體、每單位體積培養基中的DGLA量為8.18kg/kL培養基、總脂肪酸中DGLA的比例為39.1%。此外，在乾燥菌體中加入己烷，在室溫下輕輕振蕩的同時實施提取。將獲得的己烷溶液用濾紙過濾除去含固體成分後，通過在減壓下加熱至約304(TC來除去己烷，獲得以DGLA為構成脂肪酸而形成的甘油三酯。在甘油三酯中的總脂肪酸中DGLA所佔比例為38.5%。採用與比較例1同樣的方法，用合計6000L的初始主培養液量開始高山被孢黴(Mortierellaalpina)S14株的培養。在主培養第13、及第6天流加葡萄糖，在不使培養基中的葡萄糖消耗用完的同時培養12天。在主培養第4天添加lw/v。/。琥珀酸二鈉六水合物水溶液(60kg、相當於琥珀酸0.44w/V/。)和NaOH(1.26kg)，使pH為6.9。然後直至培養結束培養基的pH為6.97。培養結束後，採用與比較例l同樣的方法，獲得乾燥菌體及以DGLA為構成脂肪酸形成的甘油三酯。獲得的乾燥菌體重量為51.8kg/kL培養基、每單位重量乾燥菌體中的DGLA量為240g/kg乾燥菌體、每單位體積培養基中的DGLA量為12.43kg/kL培養基。此外，獲得的甘油三酯中的總脂肪酸中DGLA所佔比例為45.8%。對於比較例1及實施例11中獲得的乾燥菌體及DGLA的量，結果如表9所示。表9tableseeoriginaldocumentpage25[實施例12發酵罐培養中硫酸鹽的效果]將約1白金耳高山被孢黴(Mortierella由ina)S14株接種於種子培養基100ml(2w/w%葡萄糖、l%w/w%酵母浸膏、p朋.3)中，在往復振蕩100rpm、28。C的條件下進行3天預培養。接著，在容積10L的通氣攪拌培養槽中加入5L主培養基並進行滅菌，將上述種子培養液全部接種於其中，在26°C、通氣量lvvm、攪拌轉速300rpm的條件下培養11天。主培養基的組成為以下3種(i)氯鹽+硫酸鈉(對照)2w/w%葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2,4、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2*6H20、0.05w/w%CaCl2*2H20、pH6.3(ii)硫酸鹽+硫酸鈉2w/w%葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgS04'7H20、0.05w/w%CaS04*2H20、pH6.3(iii)硫酸鹽-硫酸鈉2w/w%葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.05w/w%MgS04*7H20、0.05w/w%CaS04*2H20、pH6.3根據葡萄糖的消耗適當流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培養開始第4天，添加琥珀酸鈉鹽水溶液使琥珀酸水溶液的最終濃度為0.44w/v%。此外，任一種均是在主培養開始第4天使用NaOH水溶液調節培養基的pH為約6.9。在主培養開始第11天，採用與實施例1同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出DGLA量。結果如表IO所示。tableseeoriginaldocumentpage26由此可見，使用"硫酸鹽+硫酸鈉"培養基時，每單位重量乾燥菌體中的DGLA量、每單位體積培養基中的DGLA量均比對照增加。並且獲得的脂質中含有的總脂肪酸中的DGLA的比例也增加。使用"硫酸鹽-硫酸鈉"培養基時，每一項均提高。除主培養基的組成為2w/w%葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.01w/w%MgS04'7H20、0.01w/w%CaS04'2H20、pH6.3之外，採用與實施例12同樣的方法，培養高山被孢黴(Mortierellaal由a)S14株(預培養3天、主培養ll天)。在主培養開始第11天，採用與實施例l同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出DGLA量。獲得的乾燥菌體重量為33.7mg/mL培養基、每單位重量乾燥菌體中的DGLA量為209mg/g乾燥菌體、每單位體積培養基中的DGLA量為7.03g/L培養基。[實施例14硫酸鹽對花生四烯酸生產的效果]將約1白金耳高山被孢黴(Mortierellaalpina)1S-4株接種於種子培養基100ml(2w/w%葡萄糖、lw/w%酵母浸膏、pH6.3)中，在往復振蕩100rpm、28°C的條件下進行3天預培養。接著，在容積50L的通氣攪拌培養槽中加入25L主培養基並進行滅菌，將上述種子培養液全部接種於其中，在26°C、通氣量lvvm、攪拌轉速300rpm的條件下培養8天。主培養基的組成為以下2種(i)氯鹽(對照):2w/w%葡萄糖、3.lw/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.lw/w%大豆油、0,3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2'6H20、0.05w/w%CaCl2'2H20、pH6.3。(ii)硫酸鹽2w/w%葡萄糖、3.lw/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.lw/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.06w/w%MgS04'7H20、0.06w/w%CaS04*2H20、p朋.3。根據葡萄糖的消耗適當流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完，在主培養開始第4天，添加琥珀酸鈉鹽水溶液以使琥珀酸水溶液的最終濃度為0.44w/v%。此外，任一種均是在主培養開始第4天使用NaOH水溶液調節培養基pH為約6.9。在主培養開始第8天，採用與實施例1同樣的方法，獲得乾燥菌體，求出ARA量。結果如表ll所示。表11培養基(i)鹽(對照)(ii)硫酸鹽千燥菌體重量(mg/ml培養基)36,539.3每單位重量千燥菌體中的ARA量(邁g/g千燥菌體)159182每單位體積培養基中的ARA量(mg/nil培養基)5.80in總脂肪酸中的ARA的比例(X)47.045.8除了使用2w/w%葡萄糖、4w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl"6H20、0.05w/w%CaCl2'2H20、0.lw/w%大豆油、0.01w/w%ADEKANATE、p朋.3作為主培養培養基之外，採用與比較例1同樣的方法，用合計6000L的初始培養液量開始高山被孢黴(Mortierellaal由a)S14株的培養。在培養第l、2、3、6天流加葡萄糖，在不使培養基中的葡萄糖消耗用完的同時培養10天。在主培養第4天添加lw/v%琥珀酸二鈉六水合物水溶液(6。kg、相當於琥珀酸0.44w/V/。)和NaOH(1.26kg)，使pH為6.9。在培養結束後，採用與比較例l同樣的方法，獲得乾燥菌體及以DGLA為構成脂肪酸而形成的甘油三酯。獲得的乾燥菌體重量為57.3kg/kL培養基、每單位重量乾燥菌體中的DGLA量為168g/kg乾燥菌體、每單位體積培養基中的DGLA量為9.31kg/kL培養基。並且獲得的甘油三酯中的總脂肪酸中DGLA所佔比例為41.8%。除了使用2w/w%葡萄糖、4w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.3wMK風、0.06w/w%MgS04'7H20、0.06w/w%CaS04'2H20、0.lw/w%大豆油、0.01w/w%ADEKANATE、p朋.3作為主培養培養基之外，採用與比較例2同樣的方法，培養高山被孢黴(Mortierellaalpirm)S14株。IO天的主培養結束後，採用與比較例1同樣的方法，獲得乾燥菌體及以DGLA為構成脂肪酸而形成的甘油三酯。獲得的乾燥菌體重量為60.5kg/kL培養基、每單位重量乾燥菌體中的DGLA量為193g/kg乾燥菌體、每單位體積培養基中的DGLA量為11.70kg/kL培養基。並且獲得的甘油三酯中的總脂肪酸中DGLA所佔比例為42.3%。對於比較例2及實施例15中獲得的乾燥菌體及DGLA的量，結果如表12所表12比較例2實施例15千燥菌體重量(kg/kL培養基)57.360.5每單位重量千燥菌體中的DGLA量(g/kg千燥菌體))168193每單位體積培養基中的DGLA量(kg/kL培養基)9,3111.70總脂肪酸中的DGLA的比例(％)41.842.328利用磨粉機將實施例11中獲得的乾燥菌體製成粉末，在由肉末、雞肉浸膏、玉米、大米、大豆、植物油脂、維生素混合物組成的原料中，添加製成粉末的乾燥菌體O.5°/。重量，製作寵物食品。獲得的寵物食品100g中含有DGLA約120mg，適合使用。使用實施例15中獲得的乾燥菌體，採用與實施例16-1同樣的方法，製作寵物食品。獲得的寵物食品100g中含有DGLA約97mg，適合使用。[實施例17幼魚養殖用的微小生物餌料]使用實施例16-1中得到的製成粉末的乾燥菌體，培養用作幼魚養殖時的佴料的輪蟲、及滷蟲。培養方法為在300ml水槽內加入海水200ml，在通氣條件下，在23。C下放養輪蟲每lml100個、滷蟲每lml20個，分別供給乾燥菌體使其生長發育，l天lg/106個輪蟲、l天1g/105個滷蟲。輪蟲、滷蟲均攝取乾燥菌體並生長發育，成為含有DGLA的餌料。均適合作為養殖用餌料。對於實施例11中獲得的乾燥菌體，實施己垸提取、脫膠、脫酸、脫色、脫臭等提取精製處理，製造食用精製甘油三酯。在總脂肪酸中DGLA所佔的比例為45.4%。此外，未檢出己垸、重金屬類，適合作為食用油脂。[實施例18-2食用精製甘油三酯的製造2]使用實施例15中獲得的乾燥菌體，採用與實施例18-1同樣的方法，製造食用精製甘油三酯。在總脂肪酸中DGLA所佔的比例為42.0%。此外，未檢出己烷、重金屬類，適合作為食用油脂。將明膠(新田明膠株式會社制)和食品添加用甘油(花王株式會社制)以重量比100:35混合併加入水，在506(TC的溫度範圍溶解，製備粘度2000cp的明膠被膜。接著將實施例18-1或18-2中獲得的食用精製甘油三酯和維生素E油(衛材(&'ssj')株式會社制)以重量比100:0.05混合，製備內容物。使用上述物質，根據常法進行膠囊成型及乾燥，製造每1粒含有180mg內容物的軟膠囊。該軟膠囊均適合口服攝取。將實施例18-1中獲得的食用精製甘油三酯和大豆卵磷脂(Tsuji制油株式會社)以重量比9:1混合，在水中均勻分散獲得微脂粒分散液。通過在橙汁、汽水、咖啡飲料、牛奶、豆奶、或濃湯飲料中分別添加1/100容量的該微脂粒分散液，製備(製造)作為本發明涉及的食品的上述各飲料。這些飲料均適合口服攝取。權利要求1.多不飽和脂肪酸PUFA或含有其的脂質的製造方法，其為在培養具有花生四烯酸ARA及/或二高-γ-亞麻酸DGLA生產能力的微生物的同時，製造多不飽和脂肪酸PUFA及含有其的脂質的方法，包括以下(a)～(c)工序中的1個以上(a)在主培養開始後，在培養基中添加有機酸0.01～5w/v％的工序；(b)在主培養開始後，控制培養基的pH使其在培養有效範圍內提高的工序；及(c)在主培養培養基中添加金屬離子的硫酸鹽0.01～0.5w/w％的工序。2.如權利要求1所述的製造方法，其中包括工序(a)及工序(b)，工序(a)及工序(b)在與向培養基中添加碳源不同的時間進行。3.如權利要求1或2所述的製造方法，其中包括工序(c)，工序(c)在主培養開始前進行。4.如權利要求13中任一項所述的製造方法，其中，在所述多不飽和脂肪酸PUFA或含有其的脂質中所述總脂肪酸中的二高-Y-亞麻酸DGLA為35%以上。5.高山被孢黴的乾燥菌體，其中，每lg乾燥菌體中的二高-Y-亞麻酸DGLA為190mg以上。6.如權利要求5所述的乾燥菌體，其為將利用包括以下(a)(c)工序中的1個以上工序的方法，在液體培養基中進行通氣攪拌培養後的高山被孢黴菌體進一步供給乾燥工序所得到的千燥菌體，所述(a)(c)工序為(a)在主培養開始後的第3天之後，在培養基中添加選自琥珀酸、富馬酸、丙酮酸、乳酸及蘋果酸中的1種以上的有機酸0.25w/v。/。的工序；(b)在主培養開始後的第3天之後，控制培養基的pH使其在pH6.67.5的範圍內提高的工序；及(c)在主培養的培養基中，添加0.010.25w/w。/。的選自MgS04、CaS04、Na2S0"K2S04、FeS04、及MnS04等中的1個以上的工序。7.飲食品，其含有權利要求5或6中所述的乾燥菌體或來自該乾燥菌體的花生四烯酸ARA及/或二高-Y-亞麻酸DGLA。全文摘要提供多不飽和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂質的製造方法、含有PUFA的微生物菌體及所述微生物菌體的利用方法。提供PUFA或含有其的脂質的製造方法，其為在培養具有花生四烯酸(ARA)及/或二高-γ-亞麻酸(DGLA)生產能力的微生物的同時製造多不飽和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂質的方法，包括以下(a)～(c)工序中的1個以上，(a)在主培養開始後，在培養基中添加有機酸0.01～5w/v％的工序；(b)在主培養開始後，控制培養基的pH使其在培養有效範圍內提高的工序；及(c)在主培養培養基中添加金屬離子的硫酸鹽0.01～0.5w/w％的工序。文檔編號C12P7/64GK101631870SQ200880002270公開日2010年1月20日申請日期2008年1月15日優先權日2007年1月15日發明者河島洋,片野健治申請人:三得利控股株式會社