水稻乾旱響應蛋白或編碼該蛋白的基因的應用的製作方法
2023-05-29 10:55:11 1
專利名稱：水稻乾旱響應蛋白或編碼該蛋白的基因的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物學領域，具體地說，涉及一種水稻乾旱響應蛋白或編碼該蛋白的基因的應用。
背景技術：
水是生命之源，是自然界所有生物生存和發展的必要條件。然而隨著人口的增長以及人類對環境破壞的加劇，水資源短缺越來越成為制約人類社會生存和發展的重要因素。水稻是全世界是需水最大的作物之一。在水稻的主要種植地亞洲，農業用水佔總用水量的80%，而水稻用水佔農業用水的70%左右(羅利軍和張啟發，2001)。同時，水稻也是世界上最重要的糧食作物。目前，全球每年種植水稻15億公頃，生產水稻約60億噸，養活世界一半以上的人口。在我國，水稻是第一大農作物，在糧食生產和國民經濟中起著極其重要的作用。此外，水稻在禾穀類作物中具有最小的基因組，只有430MB，是玉米的14%和小麥的3%左右，在作物科學研究中被作為重要的模式植物。因此，研究植物特別是水稻的抗旱機理，培育具有節水抗旱特性的新型水稻品種對於提高水資源利用率，促進社會的可持續發展具有十分重要的作用。抗旱性(Drought resistance)是一個總的概念，根據其反應類型的不同，可以細分為逃旱性(Drought escape)、避旱性(Dehydration avoidance)、耐旱性(Drought tolerance)和復原抗旱性(Drought recovery) (Fukai & Cooper, 1995)。植物乾旱響應基因/蛋白根據其功能的不同又可以分為調節性基因/蛋白與功能性基因/蛋白，其中調節性基因/蛋白主要是在植物抗旱分子調控的上遊起作用，比如調節抗旱信號轉導、促進抗旱基因轉錄等；而功能性基因/蛋白主要是直接提高植物的抗旱能力，比如加速滲透調節物質的合成、維持細胞質膜的穩定、清除過多的活性氧離子等(Jangpromma et al. ,2010, Xiong &Zhu，20(^)。發掘和鑑定乾旱響應基因/蛋白作為標記，對於抗旱性材料的篩選以及植物抗旱能力的遺傳改良無疑具有十分重要的作用。蛋白質組(Proteome)是指一種生物基因組編碼的全部蛋白質(Wilkins et al.， 1996)，而蛋白質組學(Proteomics)是基於蛋白質組的對大量蛋白質的一個整體研究，包括在生長發育中和各種外界因素作用下的蛋白質結構、功能和豐度的變化等(Pandey & Mann, 2000)。採用蛋白質組學策略進行植物抗旱標記的開發已有很多的例子，比如水稻的肌動蛋白解聚因子(Salekdeh et al. ,2002)和超氧化物歧化酶(Zang &Komatsu，2007)、 玉米的ABA水分脅迫成熟誘導蛋白(Riccardi et al.，1998)和甘蔗的18kDa未知蛋白 (Jangpromma et al. ,2010)等。此外，採用轉錄組學策略研究植物抗旱基因的表達以及發掘抗旱標記基因也有很多應用，包括水稻中的蛋白磷酸酯酶(Singh et al.，2010)，小麥中的葡聚糖酶(Mohammadi et al.，2008)等。水稻抗旱性的遺傳改良往往採用典型旱稻品種與高產水稻品種之間的雜交配組， 通過對其後代分離群體的多次抗旱性鑑定，選擇同時具備優良綜合農藝性狀和抗旱性的材料，進而培育水稻抗旱品種或者雜交稻組合。水稻全生育期的田間抗旱鑑定主要有兩種解決途徑，其一是在大陸各稻區(當地)建立防雨水的鑑定設施，人工製造土壤乾旱脅迫條件；其二是利用海南島冬季南繁種植時的旱季氣候條件，對水稻材料進行乾旱脅迫處理。前一方法投入成本高、可用面積小，對於產量和生理指標的測定費時費工，穩定性較低；後一方法為水稻的反季節種植，不能對產量等同期進行選擇，也會受到寒潮降雨等幹擾。
發明內容
本發明的第一個目的在於提供OsDRP蛋白或其任意肽段，和/或Osdrp基因或其特異性片段在水稻抗旱育種中的應用。其中，所述的乾旱響應蛋白OsDRP的GenBank登錄號為gi | 115489014,編碼上述蛋白的基因為 Osdrp (0sl2g0555000)。本領域技術人員應當理解，上述的蛋白任意肽段，為所述蛋白的至少10個胺基酸、至少20個胺基酸、至少30個胺基酸、至少50個胺基酸、100個胺基酸、120個胺基酸等的肽段。上述的基因的特異性片段為所述基因的至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸等的基因片段，優選為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物擴增的片段。具體的，雜交配組前，可以通過所述的蛋白或其肽段，所述的基因或其片段鑑定親本的抗旱能力，如雜交育種中，可鑑定父母本的抗旱能力，優化雜交組合。在各分離世代， 可對後代進行抗旱能力的早期鑑定，篩選出符合特定目標，如抗旱性強的後代，加快育種程序。本發明的第二個目的在於提供一種水稻抗旱能力的鑑定方法。本發明提供的水稻抗旱能力鑑定方法，包括將待測水稻進行乾旱處理，再檢測乾旱處理前後水稻中OsDRP蛋白和/或其任意肽段的表達量的變化情況，和/或檢測乾旱處理前後水稻中Osdrp或其特異性片段的表達量變化情況。具體的，乾旱處理後較乾旱處理前，蛋白或基因的表達量下降，則表示該水稻為旱敏感型；乾旱處理後較乾旱處理前，蛋白或基因的表達量提高，則表示該水稻為抗旱型。在本發明的一個實施方案中，通過雙向凝膠電泳和/或質譜檢測所述蛋白和/或肽段的表達量；在本發明的另一個實施方案中，用基因晶片和/或螢光定量PCR檢測所述基因和/或基因片段的表達量。其中，對水稻進行乾旱處理的時期可為水稻的整個生育期，優選為水稻的三葉一心期，從而實現對水稻抗旱能力的早期鑑定和抗旱品種的早期篩選。本發明中，可採用本領域公知的任何乾旱處理方法對待測水稻進行乾旱處理，較為經濟的是，對待測水稻進行小桶盆栽和停止澆水處理，優選停止澆水2 5天，最為優選為停止澆水3天。本發明的另一個目的在於提供一種抗旱水稻的篩選方法，包括將待篩選的水稻進行乾旱處理，再檢測乾旱處理前後水稻中OsDRP或其任意肽段的表達量的變化情況，和/或檢測乾旱處理前後水稻中Osdrp或其特異性片段的表達量變化情況。其中，可採用上述的方法檢測所述蛋白和/或肽段的表達量、檢測所述基因和/或基因片段的表達量。其中，可採用上述的方法對水稻進行乾旱處理。
本方法通過對抗旱水稻品種IRAT109進行乾旱脅迫處理後，通過雙向凝膠電泳和質譜分析了乾旱處理前後蛋白質表達的差異，發現了一個受乾旱誘導的蛋白，這一個蛋白在抗旱水稻品種中，乾旱脅迫後表達提高。此外，編碼這一個蛋白的基因的表達量也在乾旱脅迫後提高。結果表明這一個蛋白及其基因可以應用與水稻的抗旱育種中，與對水稻抗旱性進行鑑定或篩選抗旱水稻。本發明提供的水稻抗旱能力鑑定方法或抗旱水稻的篩選方法與考察水稻籽粒產量等傳統方法相比，實現在較早階段對水稻品種(品系)的抗旱性鑑定或進行抗旱水稻篩選，有利於當代完成雜交配組的育種程序，也可部分避免不同水稻品種間因生育期差異過大而難以同期進行成株期乾旱脅迫鑑定等技術性障礙。
圖1旱稻品種IRAT109苗期植株正常澆水(左)和乾旱脅迫(右)處理形態比較。圖2為正常澆水以及乾旱脅迫的旱稻材料IRAT109葉片總蛋白質的雙向電泳圖譜分析。正常澆水㈧和乾旱脅迫⑶的代表性凝膠圖譜。箭頭指示本項申請的目標蛋白質斑點，在乾旱處理下其表達明顯升高。C-E為正常澆水的三次生物學重複，F-H是乾旱處理的三次生物學重複。圖3為蛋白點OsDRP在正常澆水和乾旱脅迫的抗旱水稻品種IRAT109葉片中的相
對表達量。圖4為蛋白點OsDRP經MALDI-T0F後的一級質譜圖(A)和分子量為973. 517⑶、 1651. 78(C) ,2136. 03(D)的肽段經MALDI-T0F/T0F後得到的二級質譜圖。二級質譜圖右上角列出各肽段的胺基酸序列。圖5為基因Osdrp在正常澆水和乾旱脅迫的抗旱水稻品種IRAT109葉片中的表達量。通過cDNA晶片檢測發現Osdrp在乾旱脅迫葉片中的表達上升，是正常澆水的1. 7倍。圖6為抗旱與旱敏感水稻品種的葉片中Osdrp基因對乾旱脅迫的響應。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1水稻乾旱處理及葉片樣品的收集選用抗旱水稻品種IRAT109。將發芽的種子播種於圓柱形塑料桶(直徑15cm，高 20cm)內，每桶播12粒。每盆每天澆水5次，每次0. 1L，使土壤保持溼潤而土表沒有積水。 在播種四周後，植株處於三葉一心期開始進行斷水處理(乾旱脅迫)。乾旱時間為3天，正常澆水對照每天保持原有澆水量不變(圖1)。從正常澆水組和乾旱處理組分別剪取葉片， 冷凍條件下(_80°C )儲存備用。實施例2標記蛋白篩選1雙向凝膠電泳根據Hajduch等Q001)的方法總結在以下幾個段落中，使用IP(ihor Isoeletric Focusing System與垂直SDS-PAGE系統，對來自於正常澆水組和乾旱處理組的葉片的蛋白質樣品進行雙向凝膠電泳。1.1 等電聚焦(IEF)
採用Mcm長的固相pH梯度(IPG)膠條(GE Healthcare)進行等電聚焦。取1. 2mg 蛋白樣品，加蛋白水化液(7M尿素、2M硫脲、4% CHAPSU%DTT,0. 5% IPG緩衝液和0.002% 溴芬蘭)補足體積至450μ 1。加入聚焦槽中央，去除IPG膠條的保護膜，並覆蓋在蛋白溶液上方，50V電壓吸脹10小時，使蛋白充分進入膠條。按照IOOV(Ih)、200V(lh)、500V(lh)、1000V(lh)、8000V(lh，gradient)、 8000V(15h)的步驟進行等電聚焦電泳，使得蛋白根據其等電點的不同而分離到膠條的不同位置。1. 2SDS-PAGE 分離將等電聚焦後的膠條放入裝有15ml平衡緩衝液1 (0. 05mol/LTris-HCL，6mol/L尿素，30%甘油，2% SDS, 1% 017，0.002%溴酚蘭)的平衡管中搖晃15min，然後轉入15ml平衡緩衝液 2(0. 05mol/LTris-HCL，6mol/L 尿素，30%甘油，2% SDS，4%碘乙醯胺，0. 002%溴酚蘭)的平衡管中搖晃15min。平衡好的膠條放入12% SDS-PAGE凝膠頂部，並採用0. 5%的低熔點瓊脂糖密封， 按照IOOV(Ih) ,200V(7h)的步驟進行SDS-PAGE電泳。1. 3凝膠染色與分析根據(Candiano G et al.，2004)等的方法，對電泳完成後的凝膠進行染色，具體操作包括採用400ml固定液(12% TCA)中固定2h，然後採用400ml染色液(0. 12% G-250， 10% (NH4)2SO4,10% H3PO4, 20%甲醇)中進行染色，時間為12hrs，並用去離子水清洗凝膠數
次至背景清晰。 染色後的凝膠Imag必carmer掃描儀(GE Healthcare)掃描，掃描模式為透射，解析度為300dpi，圖像存儲為tiff格式；隨後採用ImageMaster-Elite軟體(GE Healthcare)進行圖像分析，包括蛋白點檢測、背景扣除、蛋白點體積標準化，凝膠匹配等幾個步驟，獲取每一個蛋白點在不同凝膠上的標準體積值並進行比較分析。結果如圖2所示。結果表明，有一些蛋白質點在乾旱脅迫處理後比對照顯著上調或者下調表達，即差異表達的蛋白質點。2質譜分析2.1蛋白酶解用去離子水對需要鑑定的蛋白斑點進行清洗，然後用50μ 1含50%乙腈 (Acetonitrile, ACN)的碳酸氫銨溶液(25mmol/L NH4HCO3)脫色。脫色完成後用50 μ 1去離子水處理5分鐘，棄去多餘水分，加入50 μ 1含50% ACN的水溶液處理5min，棄去多餘溶液，加入100% ACN處理5min。完全脫色後的凝膠加入5 μ 1含IOng胰蛋白酶(ftOmega， Madison, WI, USA)的碳酸氫銨溶液05mmol/L NH4HCO3)重新吸脹，採用20 μ 1碳酸氫銨溶液進行覆蓋，37°C酶解lOhrs。吸取上清，真空乾燥後重新溶解在50 μ 1 α-氰基-4-羥肉桂酸的飽和溶液中(含0. TFA和50% ACN)，點樣進行質譜測試。2. 2質譜測試與結果檢索採用ΑΒΙ4800 MALDI-T0F/T0F質譜儀進行質譜檢測與數據採集(Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)。合併一級質譜和二級質譜數據，使用 MASCOT V2. 1 搜尋引擎進行數據檢索(Matrix Science，London，U.K.)，檢索資料庫為NCBI nr水稻(Oryza sativa L.)資料庫，酶解過程採用的酶為胰蛋白酶，最大允許錯切位點為1，可變修飾設置為carbamidomethylation (半胱氨酸)和oxidized (甲硫氨酸)，無固定修飾，一級質譜容差為50ppm，二級質譜為0. 25Da，根據以上參數進行資料庫檢索，以實現蛋白斑點的鑑定。通過雙向電泳對正常澆水和乾旱處理的水稻葉片進行的比較分析表明，在葉片中，有多種蛋白差異表達。特別的，在乾旱處理中，發現了 OsDRP蛋白斑點在乾旱脅迫葉片中的表達上升，是正常澆水的2.2倍(圖幻。利用質譜分析的方法對這一個差異表達的蛋白斑點進行檢測，獲得其特徵肽指紋譜(圖4)，與已知蛋白質譜庫中已有數據記錄進行比對查詢，結果表明蛋白點OsDRP在NCBI資料庫上的登錄號為gi|M489014，來自於0sl2g0555000基因，該蛋白為病程相關Bet Vl家族蛋白(Pathogenesis-related Bet ν 1 family protein)，具有聚酮環化酶/脫水酶和脂類轉運功能(Polyketide cyclase/ dehydrase and lipid transport)。實施例3基因標記檢測IRNA提取及純化取植株葉片，液氮研磨後加入總RNA提取液(天根生化科技(北京)有限公司)進行總RNA提取。然後加入DNA酶，37°C水浴30min，以充分去除DNA，並對DNA酶解後的RNA 進行抽提。採用1 %的瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，採用DTO50型紫外分光光度儀(Beckman Coy Iter, Fy llerton, American)檢測 RNA 的濃度，提取的總 RNA 進一步採用 QIAGEN RNeasy Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)進行純化。2cDNA和cRNA合成與純化將純化的總RNA導入cDNA合成體系並進行PCR反應，設定參數為熱蓋65°C，40°C 反應airs，65°C滅活15min，4°C反應5min。然後將合成的cDNA導入cRNA合成體系進行 PCR反應，設定參數為熱蓋65°C，40°C反應2小時。合成的cRNA採用QIAGEN RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)進行純化並採用分光光度計測定合成的cRNA濃度。3cRNA螢光標記和樣品純化取cRNA4ug，加入 10 μ 1DMS0 禾口 3. 4 μ 1 0. 3mol/L 的 NaHCO3 (pH9. 0)溶液，混勻。 將該cRNA混合物加入到螢光染料(Cy3或Cy5)中，混勻，25°C溫浴lh，加入9 μ 1濃度為 4mol/L 的 Hydroxylamine，混勻後 25°C溫浴 15min。採用 QIAGEN RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)進行純化。4晶片雜交掃描和信號處理按如下比例進行片段化混合液的配置(Cy3cRNA :875ng，Cy5cRNA :875ng， 10 Xblocking Agent : 11 μ 1,25XFragmentation Buffer :2.2 μ 1, 用 Nuclease-free water補充總體積至55 μ 1)，60°C溫浴30min。加入55μ1 2 X GEx Hybridization Buffer 後取 100 μ 1 樣品液在 G2545A 型雜交爐(Agilent Technologies, USA)進行雜交，設定參數65°C、Hhrs，IOrpm 滾動。晶片採用水稻Oligo晶片(Agilent Technologies,USA) 0先採用晶片洗滌液清洗晶片，然後採用 G2565BA 型掃描儀(Agilent Technologies, USA)進行掃描，並採用 GenePix Pro3. 0 (Axon Instrument,Foster City,American)圖像處理軟體分析Cy3和Cy5兩種螢光信號的強度。採用cDNA晶片技術對編碼OsDRP蛋白的基因0sl2g0555000的表達水平進行檢測，發現該基因在抗旱品種的乾旱脅迫葉片中的表達量是正常葉片中表達量的1. 7倍(圖
75)，並將該基因命名為水稻抗旱響應蛋白質的編碼基因Osdrp。實施例4不同水稻品種抗旱能力鑑定與Osdrp基因表達量檢測4. 1實驗處理及樣品收集經過抗旱稻品種晚旱稻、早旱稻(傳統陸稻品種)、IRAT109以及普通水稻品種烏尖內田谷、N22、N0rinM (上海市農業生物基因中心種質庫，公眾可以獲得)分別進行斷水3 天處理，處理方法同前。正常澆水對照每天保持原有澆水量不變。從正常澆水組和斷水處理組分別剪取葉片，冷凍條件下(-80°C )儲存備用。4. 2標記基因的螢光定量PCR檢測4. 2. IRNA反轉錄及引物設計取製備的RNA，採用A3500反轉錄體系(ftOmega，USA)合成cDNA，做為螢光定量 PCR分析的模板。採用ft~imer 6進行引物設計，篩選得到其引物序列為正向引物TCGGCATGCTCAAGATGATC(SEQID No. 1)；正反引物TGGATTTGTCGTGGCTCACA(SEQID No. 2)；4. 2. 2螢光定量PCR反應^ Applied Biosystem7000 RealTime PCR System(Applied Biosystems, USA) 進行 PCR 反應，實驗程序為50°C 2min，95°C 10min,95°C 15sec，60°C lmin，45 個循環； 95°C 15sec，60°C 20sec，95°C 15sec 採用2、Act法(Livak and Schmittgen, 2001)計算 RNA 相對表達量，同時採用水稻Actin基因做為內參。4. 3抗旱能力不同的水稻品種葉片在乾旱處理下標記基因的鑑定及特徵通過螢光定量PCR分析了已知抗旱稻品種晚旱稻、早旱稻、IRAT109以及一般水稻品種烏尖內田谷、N22、Norin24葉片中Osdrp基因對乾旱脅迫的響應，發現3份抗旱材料在乾旱脅迫下，其Osdrp基因的mRNA表達水平上升，而3份一般水稻材料在乾旱脅迫下， Osdrp基因的mRNA表達水平下降。據此分析認為通過對水稻品種葉片中Osdrp基因對乾旱脅迫的響應方式，可以評估其抗旱能力的強弱。在乾旱脅迫下，Osdrp基因上升表達的水稻材料其抗旱能力可能較強，而Osdrp基因下降表達的水稻材料，其抗旱能力可能較弱。4. 5乾旱脅迫後不同水稻品種的產量對上述品種的植株進行單株籽粒產量和百粒重的考察，以正常淹水條件下獲得指標為對照，乾旱處理組為乾旱脅迫後復水生長。結果如表1所示，三個旱稻品種的籽粒產量增加，而三個水稻品種(旱敏感品種)全部下降；三個旱稻品種的百粒重略有增加或者僅下降5%以內，而三個水稻品種的百粒重指標，旱處理組比對照下降8% 16%。說明三個旱稻品種能抵禦乾旱脅迫處理，甚至更加適應於土壤通氣條件，在旱處理後能獲得更高籽粒產量，即抗旱性顯著好於參試的三個水稻品種。從結果可以看出，本發明提供方法的鑑定結果與傳統考察水稻籽粒產量的方法結果是一致的。然而，本發明可以在早期對其抗旱性進行鑑定，就可以大大縮短雜交配組育種過程中父母本的選擇時間，從而縮短了育種周期，加快了育種進程。另外也可以避免不同水稻品種間因生育期差異過大而難以同期進行成株期乾旱脅迫鑑定等技術性障礙。表1單株籽粒產量和百粒重
權利要求
1.OsDRP蛋白或其任意肽段，和/或編碼OsDRP蛋白的Osdrp基因或其特異性片段在水稻抗旱育種中的應用。
2.一種水稻抗旱能力的鑑定方法，包括將待測水稻進行乾旱處理，再檢測乾旱處理前後水稻中OsDRP蛋白和/或它們的任意肽段的表達量的變化情況，和/或檢測乾旱處理前後水稻中Osdrp基因和/或其特異性片段的表達量變化情況。
3.根據權利要求2所述的鑑定方法，其特徵在於，用雙向凝膠電泳和/或質譜檢測所述蛋白和/或肽段的表達量。
4.根據權利要求2所述的鑑定方法，其特徵在於，用基因晶片和/或螢光定量PCR檢測所述基因和/或基因片段的表達量。
5.根據權利要求2 4任一項所述的鑑定方法，其特徵在於，對水稻乾旱處理的時期為三葉一心期。
6.根據權利要求5所述的鑑定方法，其特徵在於，所述乾旱處理包括將水稻進行小桶盆栽和停止澆水處理2 5天。
7.一種抗旱水稻的篩選方法，包括將待篩選的水稻進行乾旱處理，再檢測乾旱處理前後水稻中OsDRP蛋白或其任意肽段的表達量的變化情況，和/或檢測乾旱處理前後水稻中 Osdrp基因或其特異性片段的表達量變化情況。
8.根據權利要求7所述的篩選方法，其特徵在於，用雙向凝膠電泳和/和質譜檢測蛋白和/或肽段的表達量；用基因晶片或螢光定量PCR檢測基因和/或基因片段的表達量。
9.根據權利要求7或8所述的篩選方法，其特徵在於，對水稻乾旱處理的時期為三葉一心期。
10.根據權利要求9所述的篩選方法，其特徵在於，所述的乾旱處理包括將水稻進行小桶盆栽和停止澆水處理2 5天。
全文摘要
本發明公開了水稻乾旱響應蛋白或編碼該蛋白的基因的應用。本發明還公開了利用所述的乾旱響應蛋白或編碼該蛋白的基因對水稻進行抗旱能力的鑑定或抗旱水稻的篩選。本發明提供的水稻抗旱能力鑑定或抗旱水稻篩選方法，與考察水稻籽粒產量等方法相比，在較早階段對水稻品種(品系)的抗旱性進行篩選，有利於當代完成雜交配組的育種程序，也可部分避免不同水稻品種間因生育期差異過大而難以同期進行成株期乾旱脅迫鑑定等技術性障礙。
文檔編號C12Q1/68GK102181531SQ20111006688
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月18日 優先權日2011年3月18日
發明者梅捍衛, 羅利軍, 舒烈波 申請人:上海市農業生物基因中心