一種檢測阿司匹林和氯吡咯雷藥物雙重抵抗的試劑盒的製作方法
2023-05-28 23:44:36 3
一種檢測阿司匹林和氯吡咯雷藥物雙重抵抗的試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測阿司匹林和氯吡咯雷藥物雙重抵抗的試劑盒，該試劑盒包括：(1)CK-MB抗體包被的酶聯板；(2)酶標記CK-MB特異性抗體：採用辣根過氧化物酶標記；(3)CK-MB標準溶液：(4)底物顯色液：四甲基聯苯胺；(5)終止液：鹽酸緩衝液；(6)濃縮洗滌液：去離子水；(7)濃縮復溶液：0.1％-5％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液；該試劑盒檢測樣本為血清，可以長期保存，檢測過程簡單、快速，其準確度達到95％以上。
【專利說明】-種檢測阿司匹林和氯n比略雷藥物雙重抵抗的試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種檢測阿司匹林和氯化咯雷藥物雙重抵 抗的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 阿司匹林和氯化咯雷的聯合應用，對冠也病患者，尤其是接受了皮冠脈介入術 (PCI)的冠脈綜合症患者，能顯著防止也血管不良事件的發生，降低死亡率，因此無論是在 歐美，還是國內的冠也病治療指南中，阿司匹林和氯化咯雷都具有舉足輕重的地位。但是， 隨著阿司匹林和氯化咯雷等藥物使用的推廣和深入，阿司匹林抵抗者常伴有氯化咯雷抵 抗，因此該類患者在經PCI術後發生血栓栓賽事件的危險增加。部分接受高危PCI患者在 給予阿司匹林和氯化咯雷雙重抗血小板治療時卻具有雙重抵抗，該類患者是發生血栓栓賽 事件的高危人群，因而該類患者急需預先檢測是否具有阿司匹林和氯化咯雷抵抗，從而為 臨床規劃用藥作為參考，預防不良事件發生。但是目前關於阿司匹林和氯化咯雷雙重抵抗 的研究還非常有限，缺乏PCI術后冠也病患者的阿司匹林和氯化咯雷雙重抵抗檢測手段， 也缺乏大規模隨機臨床研究評估抗血小板藥物抵抗冠也病患者對其抗血小板藥物抵抗檢 測方法和試劑的準確性和特異性，結果導致檢測方法效果誤差大，特異性低從而使得血小 板抵抗功能檢測很難進入臨床廣泛應用。
【發明內容】
[0003] 為解決W上現有技術問題，本發明的目的是提供一種適用於檢測PCI術後患者阿 司匹林和氯化咯雷藥物雙重抵抗的試劑盒。檢測樣本為血清，可W長期保存，檢測過程簡 單、快速；通過大規模樣本收集和多種手段驗證試劑檢測結果，其檢測準確度和特異性都有 很大帖度提局。
[0004] 為達到上述目的，本發明通過W下技術方案實現：
[0005] -種檢測阿司匹林和氯化咯雷藥物雙重抵抗的試劑盒，包括：
[0006] (1) CK-MB抗體包被的酶聯板；
[0007] (2)酶標記CK-MB特異性抗體；採用辣根過氧化物酶標記；
[0008] (3) CK-MB 標準溶液：
[0009] (4)底物顯色液；四甲基聯苯胺；
[0010] 妨終止液；鹽酸緩衝液；
[0011] (6)濃縮洗塗液；去離子水；
[0012] (7)濃縮復溶液；0. 1% -5%牛血清白蛋白的磯酸鹽緩衝液。
[0013] 所述的終止液優選為3%的鹽酸緩衝液；
[0014] 所述的濃縮復溶液優選為1 %牛血清白蛋白的磯酸鹽緩衝液；
[0015] 所述的CK-MB抗體為單克隆抗體，該單克隆抗體的製備方法包括：
[001引 （1)採用6?8周齡Ba化/c小鼠作為免疫動物，CK-MB純化蛋白免疫原免疫劑量 為50?80 y g/只，首次免疫時將免疫原於等量的弗氏佐劑混合乳化，頸背部皮下多點注 射，間隔2?3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次。免疫 完成7天後取脾細胞；
[0017] (2)細胞融合與克隆；將脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞按照5 ; 1混合，採用HAT培養 基篩選雜交瘤細胞，然後將陽性細胞擴大培養，產生分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離 也去除細胞及其碎片；
[0018] (3)抗體在37 C下做凍幹處理，放入-2(TC冷藏；
[0019] 所述的CK-MB抗體包被的酶聯板的製作方法包括：
[0020] (1)用包被緩衝液將CK-MB抗體稀釋為0. Ol?0. 05 y g/ml濃度的抗體稀釋液；
[0021] (2)向酶聯板中加入抗體稀釋液，賠育，傾去包被液，用洗塗液洗塗，拍幹；
[0022] (3)向酶聯板的每孔中加入封閉液，賠育，傾去孔內液體，乾燥後用鉛膜真空密封 保存；
[0023] 所述包被緩衝液為P服.5-10的碳酸鹽緩衝液，優選為pH9碳酸鹽緩衝液；所述洗 塗液為含有2-6%的吐溫-20的去離子水，優選為5%的吐溫-20的去離子水；所述封閉液 為含有5% -15%的脫脂奶和0. 1% -2. 5%的人血清白蛋白溶液，優選為10%的脫脂奶和 1 %的人血清白蛋白溶液。
[0024] 本發明與現有技術相比，其詳細說明如下：
[0025] 本發明針對的檢測對象為PCI術後合用阿司匹林和氯化格雷的患者血清樣品，一 般PCI術後病人在服藥1個禮拜後檢測。
[0026] 目前指南規定使用抗血小板方案是：對於目前廣泛使用的藥物支架（70 %的為 藥物洗脫支架）的患者，放支架後，聯合服用阿司匹林和氯化格雷至少一年。美國休斯敦 Methodist DeBak巧也髒中也研究結果顯示阿司匹林和氯化格雷雙重抵抗為26. 9%，雙重 抵抗的機制是血小板反應性全面增加，提示該類接受高危PCI的患者在聯合服用阿司匹林 和氯化格雷治療是，可能提高發生血栓栓賽事件概率。因此對於該一類人群檢測是否具有 雙重抵抗可W指導藥物使用劑量和用藥方案，預防血栓事件發生。然而目前國內並沒有針 對阿司匹林和氯化格雷雙重抵抗的一次性檢測方法，而本發明填補了該一空白，提供一種 檢測PCI術後患者阿司匹林和氯化咯雷藥物雙重抵抗的試劑盒，血清樣本可長時間保存， 檢測過程簡單、快速，通過大規模樣本收集和多種手段驗證試劑檢測結果，其檢測準確度和 特異性都有很大幅度提高。
[0027] 本發明人通過研究發現利用離子交換柱層析法當CK-MB超過CK總活性的3,或者 通過免疫抑制法當CK-MB超過CK總活性的10時，可W判斷出該患者會出現急性也肌梗塞 的機率會加大，故可將其作為急性也肌梗塞的診斷依據。且各種類型的也髒手術後可引起 血清CK-MB活性增強，在並發術間或術後也肌梗塞時升高更為顯著，發明人也通過多次研 究發現具有阿司匹林和氯化格雷雙重抵抗的患者血清中發現CK-MB較高水平表達，也提示 了 CK-MB的升高與雙重抵抗之間有必然的聯繫。
[0028] 通過上面的研究發現，本發明的試劑盒利用抗原抗體反應測定樣品中CK-MB水 平，用純化的人CK-MB抗體包被酶聯板，製成固相抗體，再往包被單抗的微孔中依次加入含 有CK-MB的血清，HRP標記的CK-MB抗體，形成抗體-抗原-酶標記抗體複合物，經過徹底 洗塗後加底物四甲基聯苯胺顯色，四甲基聯苯胺在HRP酶的催化作用下轉化為藍色，在酸 的作用下呈黃色。顏色的深淺與樣品中CK-MB含量成正比。在酶標儀450nm波長下測定吸 光值，通過標準曲線計算樣品CK-MB含量，若血清CK-MB水平在40?45ng/ml之間，表示阿 司匹林和氯化格雷雙重抵抗；=30ng/ml表示無抵抗；在30?40ng/ml表示可能出現雙重 抵抗。
[0029] 本說明書和權利要求書所使用的縮寫及英文的含義如下所示：
[0030] CK-MB ;肌酸激酶
[0031] HRP ;辣根過氧化物酶
[0032] 本發明試劑盒的具體使用方式如下：
[0033] 1.獲取待檢樣本及樣本處理：
[0034] A.常規方法配製抗凝劑，3. 8%構稼酸軸，全血（V);抗凝劑（V) = 9 ;1 ;
[003引 B.全血混勻，4°C，2000X g離也5min，吸取上層2/3體積血清，放置於-2(TC保存。
[0036] 2.用本發明的試劑盒進行檢測的步驟：
[0037] A.將試劑盒從冷藏箱中取出，室溫平衡15min，每種液體使用前搖勻。標準液做2 個平行試驗。
[0038] B.將酶標記CK-MB特異性抗體與濃縮復溶液混合：體積比為10 ;1混合均勻；
[0039] C.加50 U 1 CK-MB標準溶液或待檢樣品於對應微孔中，再加50 U 1上述混合液，蓋 上酶標板蓋，室溫避光反應Ih ;
[0040] D.打開酶標板蓋，將孔內液體甩幹，並在吸水紙上拍幹酶標板孔底水分；加洗塗 液200 y 1/孔，每次浸泡30s，充分洗塗5次，用吸水紙拍幹；
[0041] E.每孔各加入底物顯色液50 y 1，再各加入酶標記CK -MB特異性抗體50 y 1，搖床 振蕩30s混勻，室溫避光顯色15min ;
[0042] F.每孔加入50 U 1終止液，在酶標儀450nm處檢測OD值，5min內讀取吸光度值數 據；
[0043] G.檢測結果分析：
[0044] 所測得標準溶液或樣本吸光度值的平均值（M)減去空白試驗吸光度值（MO)為實 際吸光度值。
[0045] 吸光度值（OD) = M-MO
[0046] M =標準溶液或樣本吸光度值的平均值（M)
[0047] MO = 0 y g/L空白試驗吸光度值
[0048] W標準品百分吸光率為縱坐標，W標準品濃度（U g/L)的半對數為橫坐標，繪製 標準曲線圖。將樣本的吸光度值（OD)代入標準曲線中，即讀出樣本對應濃度，再乘W稀釋 倍數即為樣本中CK-MB實際濃度。
[0049] 現對現有技術存在的阿司匹林或氯化格雷抵抗是檢測方法進行比較
[0050]
【權利要求】
1. 一種檢測阿司匹林和氯吡咯雷藥物雙重抵抗的試劑盒，其特徵在於：所述的試劑盒 包括： (1) CK-MB抗體包被的酶聯板； (2) 酶標記CK-MB特異性抗體：採用辣根過氧化物酶標記； (3) CK-MB標準溶液： (4) 底物顯色液：四甲基聯苯胺； (5) 終止液：鹽酸緩衝液； (6) 濃縮洗滌液：去離子水； (7) 濃縮復溶液：0. 1%-5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述CK-MB抗體為單克隆抗體。
3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述的單克隆抗體的製備方法包括： (1) 採用6~8周齡Balb/c小鼠作為免疫動物，CK-MB純化蛋白免疫原免疫劑量為 5(Γ80 μ g/只，首次免疫時將免疫原於等量的弗氏佐劑混合乳化，頸背部皮下多點注射，間 隔2~3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，免疫完成7天 後取脾細胞； (2) 細胞融合與克隆：將脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞按照5 :1混合，採用HAT培養基篩 選雜交瘤細胞，然後將陽性細胞擴大培養，產生分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去 除細胞及其碎片； (3) 抗體在37°C下做凍幹處理，放入-20°C冷藏；
4. 根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於，所述的CK-MB抗體包被的酶聯板的 製作方法包括： (1) 用包被緩衝液將CK-MB抗體稀釋為0. 01~0. 05 μ g/ml濃度的抗體稀釋液； (2) 向酶聯板中加入抗體稀釋液，孵育，傾去包被液，用洗滌液洗滌，拍幹； (3) 向酶聯板的每孔中加入封閉液，孵育，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保 存； 所述包被緩衝液為PH8. 5-10的碳酸鹽緩衝液；所述洗滌液為含有2-6%的吐溫-20的 去離子水；所述封閉液為含有5%-15%的脫脂奶和0. 1%-2. 5%的人血清白蛋白溶液。
4. 根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於，所述的終止液為3%鹽酸緩衝液；
6.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於，所述的濃縮復溶液為1%牛血清白 蛋白的磷酸鹽緩衝液。
5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，所述的抗CK-MB抗體包被的酶聯板的 製作方法中所述的包被緩衝液為PH9的碳酸鹽緩衝液；所述的洗滌液為含有5%的吐溫-20 的去離子水；所述的封閉液為含有10%的脫脂奶和1%的人血清白蛋白溶液。
6. -種檢測阿司匹林和氯吡咯雷藥物抵抗的試劑盒，其特徵在於：所述的試劑盒包 括： (1) CK-MB抗體包被的酶聯板； (2) 酶標記CK-MB特異性抗體：採用辣根過氧化物酶標記； (3) CK-MB標準溶液： (4) 底物顯色液：四甲基聯苯胺； (5) 終止液：3%鹽酸緩衝液； (6) 濃縮洗滌液：去離子水； (7) 濃縮復溶液：1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝液； 所述CK-MB抗體為單克隆抗體；所述的單克隆抗體的製備方法包括： (1) 採用6~8周齡Balb/c小鼠作為免疫動物，CK-MB純化蛋白免疫原免疫劑量為 5(Γ80 μ g/只，首次免疫時將免疫原於等量的弗氏佐劑混合乳化，頸背部皮下多點注射，間 隔2~3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，免疫完成7天 後取脾細胞； (2) 細胞融合與克隆：將脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞按照5 :1混合，採用HAT培養基篩 選雜交瘤細胞，然後將陽性細胞擴大培養，產生分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去 除細胞及其碎片； (3) 抗體在37°C下做凍幹處理，放入-20°C冷藏； 所述的CK-MB抗體包被的酶聯板的製作方法包括： (1) 用包被緩衝液將抗CK-MB抗體稀釋為0. 01~0. 05 μ g/ml濃度的抗體稀釋液； (2) 向酶聯板中加入抗體稀釋液，孵育，傾去包被液，用洗滌液洗滌，拍幹； (3) 向酶聯板的每孔中加入封閉液，孵育，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保 存； 所述包被緩衝液為PH9的碳酸鹽緩衝液；所述洗滌液為含有5%的吐溫-20的去離子 水；所述封閉液為含有10%的脫脂奶和1%的人血清白蛋白溶液。
【文檔編號】G01N33/543GK104237505SQ201410473417
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】吳曉星, 宋豔絨, 陳文珍, 楊軍 申請人:杭州特馬賽生物技術有限公司