對蝦的G蛋白pvGαq基因的製作方法

2023-05-29 13:58:21 2

專利名稱：對蝦的G蛋白pvGαq基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從對蝦中克隆的G蛋白pvGαq基因。
背景技術：
細胞與細胞之間的信息和物質之間的交流最主要的一種方式就是G蛋白信號途徑。該途徑普遍存在於各種生物體內，各種胞外信號，包括化學藥物、蛋白激素等都通過細胞膜上具有七重跨膜片斷結構特徵的G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptors，GPCR)將信號傳給細胞內的G蛋白(GTP-binding protein)，再由各種G蛋白亞基(α、β和γ亞基)通過不同的組合激活下遊不同的分子途徑，使細胞以至機體發生不同的生物學效應。
G蛋白是α、β和γ 3個不同的亞基結合而成的異源三聚體，可將七次跨膜受體接受的胞外信號傳給胞內的效應生物功能蛋白。β和γ亞基總是緊密結合在一起作為一個功能單位，而α亞基可以與二磷酸鳥苷GDP或三磷酸鳥苷(GTP)結合。α亞基在結合GDP狀態下比結合GTP更易與β/γ亞基複合體親和。當配體與膜受體結合後，可引起與α亞基結合的GDP被GTP取代，並導致GTP-α亞基與β/γ亞基複合體的分離，進而各自調控相應的效應功能蛋白。α亞基具有內在的GTP酶活性，可將GTP水解成GDP，使GDP-α亞基和功能蛋白分開，並再度與β/γ亞基複合體形成緊密結合，從而恢復到非激活狀態。G蛋白α亞基是最主要的G蛋白成員之一。在哺乳動物中已被克隆的G蛋白α亞基有17個，根據它們的序列相似性，可分為四個家族，即Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。Gαq/11家族成員有Gαq、Gα11、Gα14、Gα15和Gα16。研究已發現，Gαq和Gα11與細胞產生百日咳毒素(PTX)的抗性有關。它們與磷脂酶PLC-形成偶聯，PLC-β被激活後，可促進細胞產生二醯甘油(DAG)和肌醇三磷酸(IP3)，進而導致蛋白激酶C(PKC)的活化和胞內Ca2+的釋放。Gαq/11還能夠激活ERK、p38和JNK/SAPK。目前，對G蛋白信號調控的研究多見於高等生物，對低等生物只限於酵母、真菌、線蟲等，在甲殼類無脊椎動物中只有美國龍蝦(Homarus americanus)中克隆到Gαq，而且它在龍蝦的嗅覺受體神經元中表達豐富。

發明內容
本發明的目的在於利用生物工程技術從對蝦的感覺器官中克隆與Gαq同源的新基因pvGαq，為對蝦生長與發育提供理論基礎，為對蝦養殖、防病害以及新型配合飼料的研製奠定理論基礎。
本發明所說的基因名稱pvGαq(Penaeus vannamei heterotrimeric Gq protein alphasubunit)。
Genbank序列號AY626792序列特徵長度1424個鹼基類型核酸鏈型單鏈幾何特徵線性分子類型cDNA基因來源南美白對蝦Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白編碼序列210-1271表達產物pvGαq翻譯成蛋白的胺基酸序列353aaMACCLSEEAKEQKRINQEIERQLRKDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSDDDKRGFIKLVFQNIFMAMQSMIRAMDLLQISYGDSANSEHADLVRAVDYESVTTFEEPYVTAMKSLWADTGIQHCYDRRREYQLTDSAKYYLDDLERIISSDFLPTEQDILRARVPTTGIIEYPFDLDSIIFRMVDVGGQRSERRKWIHCFENVTSIIFLVALSEYDQILFESDNENRMEESKALFKTIITYPWFQHSSVILFLNKKDLLEEKIMYSHLVDYFPEYDGPQRDAIAAREFILRMFVELNPDPEKIIYSHFTCATDTENIRFVFAAVKDTILQLNLKEYNLVcDNA序列描述1 gagacggccg gaccaaaccc caccccattt ggctttggga ttttgtgtgg aggaaataag cccaaaattg agaaaattcc81 ccgattaaac gccgcttccc cttcgtggcg aaaggcgggc tgaaagagga gaggaaggag gtgaaattag tcccgaagtt161 ggagtgaaag gaagtcaaaa ttggtaataa tattagttga tcagcaaaca tggcgtgctg tttaagcgaa gaagccaagg241 aacagaagag gataaaccaa gaaatagaac gacaattaag gaaagataag agagatgcca gaagagaact caaactactg321 ttattgggca caggagaatc tggcaaatct accttcatca agcagatgcg tattatccac ggtgcaggtt atagcgatga401 tgacaaacga gggttcatca agctggtctt ccagaacatc ttcatggcca tgcagtcaat gatcagggcc atggaccttc481 ttcaaatatc ttatggagac tctgcaaaca gtgaacacgc agatctggtg cgagcggtgg actatgagtc agtcacaacg561 tttgaggagc catatgtaac tgccatgaaa agcttatggg ctgacaccgg catccaacac tgctatgatc gtcgcagaga641 gtaccagctc acagattcag caaaatatta tcttgatgat ttggagcgta tcatatcatc ggacttctta ccgaccgagc721 aggatattct tagggctcga gtaccaacca ctggaatcat tgagtacccc tttgatctgg actcaatcat ctttagaatg801 gtagatgtcg gtggtcagcg atctgagcga cggaagtgga ttcattgctt cgagaatgtc acctctatca ttttcctggt
881 cgcactttct gagtatgatc agatcttgtt tgagtctgac aatgagaacc gaatggaaga atcaaaggcc ctgttcaaga961 ccattatcac atacccctgg ttccagcact cgtctgttat tctcttcctt aacaagaagg atctgttgga ggagaagatc1041 atgtactcac atctggtgga ctattttcca gaatatgatg gcccacagag ggatgccatt gcagcccggg agttcatcct1121 acgtatgttt gtagaattaa atcctgatcc tgagaagatt atatattcac atttcacatg cgcgacagac actgagaaca1201 taaggttcgt cttcgctgcc gtcaaagaca caatcctgca gctaaatcta aaggaataca atctggtgta acgtagagct1281 gtgcccaact ctggccgaaa gtgtacccaa ggtgaagtga cagcataccc ccctactctt gtgaggggct gtcggttgag1361 gcctcacttc atcaccctaa tatggacact aaactatgaa ggcagtaaaa aaaaaaaaa aaaa//pvGαq基因的提取過程如下1)從南美白對蝦(Penaeus vannamei)中取出腦、觸角和眼，用Trizol試劑(Invitrogen)分別提取其中的總RNA，經反轉錄酶SuperScriptTMReverse Transcriptase(Invitrogen)II反轉錄成cDNA。
2)根據已知物種G蛋白α亞基的保守序列設計簡併引物，GαF5』-AGC AGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3』，GαR5』-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3』。進行簡併PCR；3)簡併PCR得到500bp的片斷產物，將這些片段經Klenow和T4 DNA聚合酶處理後克隆到pBluescript經Sma I酶切，CIP去磷酸化後的載體上，測序分析發現，該片斷序列與其他物種Gαq具有非常高的保守性。
4)通過上述序列設計特異的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech，USA)做5』-和3』-RACE，5』-RACE引物為Q5』，5』-CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGA T-3』，3』-RACE引物為Q3』，5』-ATGATCAGGGCCATGGACCTTCTTCAA 3』。5』-和3』-RACE的PCR擴增產物分別克隆到pBluescript載體並測序，得到5』-和3』-兩端序列，從而得到全長序列。
5)利用Genedoc軟體對pvGαq與其它物種Gαq序列進行alignment分析，比較pvGαq與其它物種Gαq的同源性。
6)利用DNAstar軟體對Gαq做進化樹分析，確定對蝦在進化中的地位。
對蝦是我國主要的海水養殖產品之一，對蝦的感覺系統發達，而且感覺系統在其簡單的生命活動中起著非常關鍵的作用，我們發現pvGαq蛋白在對蝦的神經系統(腦)、感覺器官(眼、觸角)、攝食和消化系統(小額、鰓和腸道)中的大量分布也證實了G蛋白在對蝦生命活動中的重要性。而pvGαq蛋白的結構和功能在進化上有極強的保守性，為G蛋白功能分子在進化上的同源性研究提供了分子與結構基礎。所以對對蝦Gαq蛋白的研究可能為對蝦的生命活動規律、對蝦抗病害和養殖的研究打下理論基礎。


圖1為對蝦G蛋白pvGαq與其它物種Gαq的alignment分析。
圖2為對Gαq的進化樹分析。
圖3為Western blot檢測對蝦各器官組織中pvGαq的表達。
圖4為免疫共沉澱實驗電泳圖。
圖5為細胞內IP3濃度測定結果示意圖。
圖6為細胞內游離鈣離子濃度測定結果示意圖。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明做進一步說明。
實施例1.基因pvGαq的克隆1.從市場買來新鮮對蝦，鑑定為從南美白對蝦(Penaeus vannamei)。從新鮮對蝦中取出腦、觸角和眼，用Trizol試劑(Invitrogen)分別提取其中的總RNA，經反轉錄酶SuperScriptTMReverse Transcriptase(Invitrogen)II反轉錄成cDNA。
2.根據已知物種G蛋白α亞基的保守序列設計簡併引物，GαF5』-AGC AGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3』，GαR5』-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3』。進行簡併PCR，PCR在25μl體系中進行，其中單鏈cDNA 1.5μl，兩端引物各20pmol，dNTP 0.24mM，Taq聚合酶(Promega，USA)1.25 U和相應緩衝液2.5μl。運行程序如下94℃退火3分鐘，接著94℃，30秒，42℃ 60秒，72℃60秒40個循環，最後72℃延伸3分鐘。
3.簡併PCR得到500bp的片斷產物，將這些片段經Klenow和T4 DNA聚合酶處理後克隆到pBluescript經Sma I酶切，CIP去磷酸化後的載體上，測序分析發現，該片斷序列與其他物種Gαq具有非常高的保守性。
4.通過這段序列設計特異的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech，USA)做5』-和3』-RACE，5』-RACE引物為Q5』，5』-CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGAT-3』，3』-RACE引物為Q3』，5』-ATGATCAGGGCCATGGACCTTCTTCAA3』。5』-和3』-RACE的PCR擴增產物分別克隆到pBluescript載體並測序，得到5』-和3』-兩端序列，從而得到全長序列。
5.利用Genedoc軟體對pvGαq與其它物種Gαq序列進行alignment分析，比較pvGαq與其它物種Gαq的同源性(見圖1，圖中細線標記為棕櫚醯化修飾後與膜錨定的位點、粗線標記為GTP結合位點、圓點標記R177為霍亂毒素作用位點。)及利用DNAstar軟體對Gαq做進化樹分析，確定對蝦在進化中的地位(見圖2)。發現該基因與其它物種(從無脊椎動物線蟲、甲殼類龍蝦到脊椎動物小鼠和人類)都具有很高的同源性，而且具有其他物種保守的功能位點。與龍蝦具有最近的親緣關係。確定了該基因就是Gαq，我們給它命名pvGαq。
實施例2pvGαq的功能鑑定1.按文獻Sternweis(Sternweis，P.C.，Robishaw，J.D.，1984.J.Biol.Chem.295，13806-13813.)公開的方法提取對蝦各器官中膜蛋白，取10μg膜蛋白進行Western blot分析。發現pvGαq在對蝦的各組織中都有少量分布，尤其在腦、眼、小額、觸角、鰓和腸道上有豐富的表達(圖3)。
2.免疫共沉澱取適當濃度的HEK 293T細胞鋪於60mm細胞培養板，在含10％小牛血清的DMEM(Gibco)培養液中培養，24小時後，用聚醚醯亞胺PEI(Polyethylenimine)將pCMV5-HA-pvGαq分別與pCMV5、pCMV5-Flag-pvGβ1和同樣載體的人類Gβ1各2ug，共轉染到細胞中。36小時後收細胞，按照Sternweis等人(Sternweis，P.C.，Robishaw，J.D.，1984.J.Biol.Chem.295，13806-13813.)的方法提取細胞膜蛋白。將膜蛋白重懸於緩衝液(Hepes 30mM，MgCl2 1mM，EDTA 10mM，DTT 0.1mM，NaCl 150mM，GDP 0.1mM，Lubrol-PX 0.1％)中，取800μl濃度為4mg/ml的膜蛋白，冰上放置30分鐘，然後離心20分鐘後去掉不溶物，在上清溶液中加入抗HA的抗體(Santa Cruz)1μg，Protein-A/G beads 5μl，於4℃混和器上轉過夜，1000rpm 4℃離心收集沉澱產物，同上緩衝液洗三次，然後SDS-PAGE電泳，用抗Flag的一抗進行western blot分析。免疫共沉澱實驗發現在GDP存在的情況下它能結合對蝦G蛋白pvGβ1，也能結合人Gβ1(圖4)。
3.細胞內游離鈣離子濃度的測定同上方法將pCMV5-HA-pvGαq2μg轉染到HEK293細胞，同時轉染空載體做為對照。36小時後分散細胞，取6×104個細胞於Eppendorf管，500g離心3分鐘，用Hanks平衡鹽溶液HBSS洗細胞3次，於10μM的FLUO-3/AM(CalBiochem)中37℃孵育30分鐘，加HBSS(含1％FBS)400μl，繼續孵育30分鐘，再用HEPES緩衝液(HEPES 10mM，Na2HPO41mM，NaCl 137mM，KCl 5mM，CaCl21mM，MgCl20.5mM，glucose 5mM，BSA 0.1％，pH7.4)洗兩次，加180μl HEPES緩衝液，將細胞轉移到黑色96孔板，加入10mM的LiCl 20μl，30uM AlCl3與10mM NaF的混合物30μl，分別孵育5min、10min、20min後加入高氯酸終止反應。最後酶標儀分析，485nm激發，526nm吸收波長檢測。結果顯示在哺乳類細胞HEK293中過量表達pvGαq，能使細胞內Ca2+和IP3濃度上升(圖5)。右圖中灰色為AlF4-激活後檢測結果。
4.細胞內三磷酸肌醇濃度的測定細胞轉染、G蛋白激活過程同鈣離子濃度測定方法，測定IP3具體過程見Amersham公司產品號90-0037-01說明書。
權利要求
1.對蝦G蛋白pvGαq基因，其特徵在於其基因名稱為pvGαq(Penaeus vannameiheterotrimeric Gq protein alpha subunit)，Genbank序列號AY626792序列特徵長度1424個鹼基類型核酸鏈型單鏈幾何特徵線性分子類型cDNA基因來源南美白對蝦Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白編碼序列210-1271表達產物pvGαq翻譯成蛋白的胺基酸序列353aaMACCLSEEAKEQKRINQEIERQLRKDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSDDDKRGFIKLVFQNIFMAMQSMIRAMDLLQISYGDSANSEHADLVRAVDYESVTTFEEPYVTAMKSLWADTGIQHCYDRRREYQLTDSAKYYLDDLERIISSDFLPTEQDILRARVPTTGIIEYPFDLDSIIFRMVDVGGQRSERRKWIHCFENVTSIIFLVALSEYDQILFESDNENRMEESKALFKTIITYPWFQHSSVILFLNKKDLLEEKIMYSHLVDYFPEYDGPQRDAIAAREFILRMFVELNPDPEKIIYSHFTCATDTENIRFVFAAVKDTILQLNLKEYNLVcDNA序列描述1 gagacggccg gaccaaaccc caccccattt ggctttggga ttttgtgtgg aggaaataag cccaaaattg agaaaattcc81 ccgattaaac gccgcttccc cttcgtggcg aaaggcgggc tgaaagagga gaggaaggag gtgaaattag tcccgaagtt161 ggagtgaaag gaagtcaaaa ttggtaataa tattagttga tcagcaaaca tggcgtgctg tttaagcgaa gaagccaagg241 aacagaagag gataaaccaa gaaatagaac gacaattaag gaaagataag agagatgcca gaagagaact caaactactg321 ttattgggca caggagaatc tggcaaatct accttcatca agcagatgcg tattatccac ggtgcaggtt atagcgatga401 tgacaaacga gggttcatca agctggtctt ccagaacatc ttcatggcca tgcagtcaat gatcagggcc atggaccttc481 ttcaaatatc ttatggagac tctgcaaaca gtgaacacgc agatctggtg cgagcggtgg actatgagtc agtcacaacg561 tttgaggagc catatgtaac tgccatgaaa agcttatggg ctgacaccgg catccaacac tgctatgatc gtcgcagaga641 gtaccagctc acagattcag caaaatatta tcttgatgat ttggagcgta tcatatcatc ggacttctta ccgaccgagc721 aggatattct tagggctcga gtaccaacca ctggaatcat tgagtacccc tttgatctgg actcaatcat ctttagaatg801 gtagatgtcg gtggtcagcg atctgagcga cggaagtgga ttcattgctt cgagaatgtc acctctatca ttttcctggt881 cgcactttct gagtatgatc agatcttgtt tgagtctgac aatgagaacc gaatggaaga atcaaaggcc ctgttcaaga961 ccattatcac atacccctgg ttccagcact cgtctgttat tctcttcctt aacaagaagg atctgttgga ggagaagatc1041 atgtactcac atctggtgga ctattttcca gaatatgatg gcccacagag ggatgccatt gcagcccggg agttcatcct1121 acgtatgttt gtagaattaa atcctgatcc tgagaagatt atatattcac atttcacatg cgcgacagac actgagaaca1201 taaggttcgt cttcgctgcc gtcaaagaca caatcctgca gctaaatcta aaggaataca atctggtgta acgtagagct1281 gtgcccaact ctggccgaaa gtgtacccaa ggtgaagtga cagcataccc ccctactctt gtgaggggct gtcggttgag1361 gcctcacttc atcaccctaa tatggacact aaactatgaa ggcagtaaaa aaaaaaaaaa aaaa//
2.對蝦的G蛋白pvGαq基因的提取方法，其特徵在於其步驟為1)從南美白對蝦中取出腦、觸角和眼，用Trizol試劑(Invitrogen)分別提取其中的總RNA，經反轉錄酶SuperScriptTM Reverse Transcriptase(Invitrogen)II反轉錄成cDNA；2)根據已知物種G蛋白α亞基的保守序列設計簡併引物，GαF5』-AGC AGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3』，GαR5』-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3』，進行簡併PCR；3)簡併PCR得到500bp的片斷產物，將這些片段經Klenow和T4 DNA聚合酶處理後克隆到pBluescript經Sma I酶切，CIP去磷酸化後的載體上；4)通過上述序列設計特異的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech，USA)做5』-和3』-RACE，5』-RACE引物為Q5』，5』-CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGAT-3』，3』-RACE引物為Q3』，5』-ATGATCAGGGCCATGGACCTTCTTCAA 3』，5』-和3』-RACE的PCR擴增產物分別克隆到pBluescript載體並測序，得到5』-和3』-兩端序列，從而得到全長序列；5)利用Genedoc軟體對pvGαq與其它物種Gαq序列進行alignment分析，比較pvGαq與其它物種Gαq的同源性；6)利用DNAstar軟體對Gαq做進化樹分析，確定對蝦在進化中的地位。
全文摘要
對蝦的G蛋白pvGα
文檔編號C07K14/435GK1769450SQ20041009029
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月3日 優先權日2004年11月3日
發明者金利華, 林聖彩 申請人:廈門大學