一種赤蘚糖醇的檢測方法
2023-05-29 07:20:11 2
一種赤蘚糖醇的檢測方法
【專利摘要】赤蘚糖醇為白色結晶的四碳多元醇類化合物，是新型發酵型低熱量甜味劑，在醫藥、食品、化妝品及化工等領域均有廣闊的應用前景，對它的研究目前已成為國際上一個備受關注的熱點。本發明提供了一種離子色譜定量檢測赤蘚糖醇的方法，回收率達85％～90％，同現有氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等相比，具有準確性高、不用衍生、操作簡便、靈敏度高、環境友好和重現性好等優點，是一種實用的檢測方法。
【專利說明】一種赤蘚糖醇的檢測方法一、【技術領域】
[0001]本發明屬於化學分析領域，特別涉及用離子色譜法檢測赤蘚糖醇的技術。
二、【背景技術】
[0002]赤蘚糖醇化學名1，2，3，4-丁四醇，英文名Erythritol，分子式為C4HltlO4,分子量為122.12，化學結構式如圖1所示，熔點126°C，沸點329-331°C，是一種四碳多元醇，外觀為白色粉狀結晶，有清涼感，發熱量低，易結晶。
[0003]赤蘚糖醇為白色結晶的四碳多元醇類化合物，是一種採用生物技術生產的新型發酵型低熱量甜味劑，1999年6月國際食品添加劑專家委員會(JECFA)批准赤蘚糖醇作為食用甜味劑，且無需規定ADI值。目前，赤蘚糖醇在美國、日本、紐西蘭、澳大利亞、新加坡、韓國、墨西哥等國已用於食品生產。2007年6月19日我國衛生部公告批准赤蘚糖醇作為甜味劑應用於口香糖、固體飲料、調製乳等食品中。赤蘚糖醇這種新型糖醇類食品甜味劑，具有熱量低、甜味協調、無吸溼性、無齲齒性、穩定性高、不發酵及不會引起腸胃不適等優點。它可通過微生物發酵法生產，得率約50%，並在糖果、飲料、烘焙食品及佐餐食品等食品工業中有著廣泛的應用。赤蘚糖醇是一種新型的多元醇類甜味劑，廣泛存在於真菌類(如海藻、蘑菇等)、水果(甜瓜、葡萄等)以及各類發酵食品中(如葡萄酒、口香糖、清酒、醬油等，在人或動物的組織及體液，如血液、精液、尿液中也存在赤蘚糖醇成分。
[0004]糖醇是一類糖的加氫還原產物，是一種低熱、難以消化、甜度較低的新型功能型甜味劑，隨著其在食品中的應用日益廣泛，關於糖醇類的分析方法也有很多研究。採用HPLC測定糖醇或糖時，糖醇和糖本身在紫外區域或可見光範圍沒有吸收，也無螢光，多採用示差折光檢測器檢測，但示差 折光檢測器靈敏度低，定量水平僅為KT1g/!數量級。蒸發光散射檢測器(Evaporative Light Scaltef ingDetector,英文縮寫詞為ELSD)是近年才見報導的檢測器，ELSD對不吸收紫外光或螢光的化合物，如糖、胺基酸、甘油三酸脂等脂類檢測有很高靈敏度，可以禰補紫外或螢光等檢測器的不足。例如，蔡欣欣等使用高效液相色譜-蒸發光散射檢測法建立了食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖的分析方法；於趁等人研究了高效液相色譜-蒸發光散射法測定了無糖糕餅中糖醇的含量。氣相色譜法測定糖類，具有選擇性好、樣品用量少、快速、靈敏度高等優點，近年來在國內外得到了廣泛應用。採用氣相色譜法測定糖類，遇到的主要問題是糖類本身沒有足夠的揮發性，必須先轉化為揮發性衍生物才可以進行測定。對於多糖，需首先將其降解為結構簡單的單糖或寡糖，然後將其衍生成易揮發、熱穩定的衍生物，通過對降解糖衍生物的定性、定量測定，可得到多糖的基本組成和結構。Adams等使用GC法對植物組織萃取液中的有機酸、蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇等衍生產物進行了分析研究。離子色譜法是近年來最活躍，發展最快的液相色譜領域之一。離子色譜法檢測糖和糖醇的原理是糖類、糖醇類分子具有電化學活潑性及在強鹼溶液中呈離子化狀態，在高PH值的淋洗液中，它們會部分或全部以陰離子形式存在，可以在陰離子交換柱上被保留並得到分離。離子色譜法檢測糖主要使用金電極的脈衝安培檢測器，因為當施加一個電位在金電極上，糖易在金電極表面發生氧化反應。在鹼性條件下，用金電極檢測糖非常靈敏，可檢測pmol/L的糖，而且不需衍生反應和複雜的樣品純化處理。另外，直流安培檢測器不能用於糖的檢測，主要是因為糖氧化產物對電極產生不可逆的汙染。
[0005]對於糖醇的分析，採用氣相色譜法或氣相色譜質譜法測定時，由於糖醇的沸點較高，難以氣化，須將其轉化為揮發性的衍生物才能進行GC測定。採用HPLC測定糖醇時，由於其本身在紫外區域或可見光範圍沒有吸收，也無螢光，所以，糖醇多採用示差折光檢測器檢測，但示差折光檢測器靈敏度低，定量水平僅為KT1g/!數量級。通過衍生化的方法將樣品組分製備成具有紫外吸收或能發出螢光的物質，用紫外、二極體陣列或螢光檢測器，分析靈敏度可大大提高，定量水平達到10_2g/L數量級，但樣品製備操作繁雜，且需要選擇合適的衍生化試劑。離子色譜法和現有的氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等相比，具有不用衍生、操作方便、靈敏度高和環境友好的優點，對糖醇的檢測準確性和重現性也很好。
三、
【發明內容】
[0006]本發明的具體研究內容主要分為以下幾個部分:
[0007]1.確定實際樣品檢測的前處理方法。樣品前處理需要注意以下四個方面:糖醇損失越少越好；前處理步驟越少越好；操作越簡單越好；耗時耗材越少越佳。前處理一般包括提取、除雜、過濾膜三個步驟，然後上儀器分析。糖醇屬於水溶性物質，所以採用二次水對樣品進行稀釋和提取，超聲是最為常用並簡單有效的促溶提取方式，可以加速樣品中的糖醇釋放溶解至水溶液中，本專利採用水溶、超聲提取的方法，通過試驗確定超聲提取時間。經水溶稀釋並超聲後有殘洛的物質，使用8000r/min-9000r/min的轉速下離心10min-60min,以除去固體不溶物(水溶後澄清的物質可省去此步)，取溶有糖醇的上清液部分過經0.2 u m-0.3 u m尼龍濾膜過濾，留取濾液作離子色譜分析備用。
[0008]2.通過篩選色譜柱，探索流動相的濃度、流速、柱溫等因素對糖醇分離效果的影響，綜合各因素，確定離子色譜分析赤蘚糖醇的最佳色譜條件。對已建立的方法進行方法學考察，確定各糖醇的檢出限、測定限以及線性範圍。
[0009]由於糖醇屬於營養型物質，標準品直接用水配製很容易染菌，所以採用的配製方法應能夠保證各待測成分均可得到準確定性的基礎之上，可適當提高標準品的保質時間。通過查閱相關文獻，選擇20mg/L的疊氮化鈉代替水配製標準品，赤蘚糖醇溶液為5.0mg/L。
[0010]糖醇為弱酸類物質，PKa值12~14。在強鹼性溶液中當其PH值大於糖的PKa值時，糖會部分或全部離解，以陰離子形式存在於溶液中，因此可以使用氫氧化鈉作為淋洗液，進行陰離子交換分離。脈衝安培檢測器是近年新發展起來的檢測器，選擇它的主要優勢體現在它的檢測條件與淋洗液分離條件相一致，無需衍生，它同樣要求糖、糖醇以及醇類化合物在強鹼性條件下以羥基陰離子的形式存在。由於羥基的氧化電位較低(0.1V)，所以基體幹擾少，可以獲得較好的重現性和準確性。
[0011]通過比較四種不同填料的可用於糖醇分析的陰離子交換色譜柱，篩選適合赤蘚糖醇分析的色譜柱。對於流動相氫氧化鈉，在其他條件固定的情況下，通過比較四種流動相濃度1000mmol/L、750mmol/L、500mmol/L和250mmol/L對糖醇的分離效果和保留時間的影響，選擇適宜的氫氧化鈉濃度作為等度濃度或者梯度濃度洗脫條件。在其他條件不變的情況下，通過比較0.2ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min和0.5ml/min等不同流速對糖醇和糖的保
留時間和分離效果的影響，選擇適合赤蘚糖醇分析的流動相等度流速或梯度流速。選擇不同的柱溫:20°C、30°C、35°C和40°C進行試驗，考察柱溫赤蘚糖醇保留特性的影響。
[0012]本發明獲得了一種赤蘚糖醇的定量測定方法，回收率達85%?90%，具有準確性高、不用衍生、操作簡便、靈敏度高、環境友好和重現性好等優點，是一種實用的檢測方法。
四、【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1赤蘚糖醇的化學結構式。
五、【具體實施方式】
[0014]實施例1
[0015]本發明選用離子色譜和陰離子交換柱進行糖醇的色譜分析，在強鹼性溶液中當其PH值大於糖醇的PKa值時，糖醇會部分或全部離解，以陰離子形式存在於溶液中，鑑於糖醇的PKa值在12?14，因此使用較大濃度氫氧化鈉作為淋洗液，進行陰離子交換分離，對其濃度進行試驗加以確定。
[0016]色譜條件為:氫氧化鈉作為流動相，柱溫30°C，脈衝安培檢測器，流速為0.4ml/min,色譜柱為 DIONEX Carbopac PAlO 陰離子分析柱(4mmX 250mm)、D10NEX Carbopac ΡΑΙΟ陰離子保護柱(4_X50mm)。流動相濃度a為1000mmol/L,濃度b為750mmol/L,濃度c為500mmol/L,濃度d為250mmol/L,比較a、b、C、d四種濃度下,赤蘚糖醇的分析結果。
[0017]分析比較以上四種不同濃度的流動相的結果，流動相濃度越大，糖醇的保留時間越短，這種效果隨著物質保留特性由弱到強而逐漸明顯，流動相氫氧化鈉500mmol/L時，赤蘚糖醇的分離效果相對來說最好。綜合各因素，確定選用500mmol/L的氫氧化鈉作為流動相，採用等濃度洗脫。
[0018]實施例2
[0019]初步擬定色譜條件為:500mmol/L氫氧化鈉作為流動相等度洗脫，柱溫30°C，脈衝安培檢測器(金電極)，色譜柱為DIONEX Carbopac PAlO陰離子分析柱(4mmX250mm)、DlONEXCarbopac PAlO陰離子保護柱(4mmX50mm)。固定以上的條件，比較不同流動相流速對分析結果的影響，流速a為0.2ml/min,流速b為0.3ml/min,流速c為0.4ml/min,流速d為0.5ml/min。由於Carbopac PAlO色譜柱有流速限制,所以考慮比較a、b、C、d這四種流速下，赤蘚糖醇的離子色譜分析結果。
[0020]當流動相流速為0.2ml/min時,赤蘚糖醇的保留時間在21min左右；當流動相流速為0.3ml/min時,赤蘚糖醇的保留時間在14min左右；當流動相流速為0.4ml/min時，赤蘚糖醇的保留時間在Ilmin左右，而且分離度最好；當流動相流速為0.5ml/min時，赤蘚糖醇的保留時間在8min左右；在做色譜分析工作時，最理想的結果應該是分離度越佳越好，因此選用流動相流速為0.4mL/min。
[0021]實施例3
[0022]研究發現在陰離子交換色譜中，糖醇的保留是一個放熱過程(隨溫度升高，保留減弱)。但是，每種糖醇受溫度的影響程度不同。所以，固定以上色譜條件，比較20°C、30°C、35°C、40°C四種不同柱溫的分析結果。比較20 V、30°C、35°C、40°C四種不同柱溫對應的色譜分析結果，可見，隨著柱溫的降低，保留時間有所提高。然後，還出現一個現象，當柱溫為30°C時，赤蘚糖醇和雜質的色譜峰未達到基線分離，柱溫為35°C時，赤蘚糖醇和雜質的色譜峰是完全分離的，因此，選用柱溫為35°C。
[0023]實施例4
[0024]超聲時間的長短應能夠保證樣品在此時間內均釋放出95%以上的糖醇。通常，液體食品和半固體食品，所需超聲時間應比固體食品短，膠基糖果是耗時最長的一類食品，所以選擇膠基糖果為模型。
[0025]先稱取一定質量的膠基糖果，用IOOOml 二次水定容稀釋，超聲10min、20min、30min、40min、50min、60min時,分別取IOml溶液,經0.22m尼龍濾膜過濾,取濾液供離子色
譜分析，計算膠基糖果在對應超聲時間溶出的糖醇的質量。結果顯示，超聲40min之後，赤蘚糖醇的溶出量不再增加，可以認為，此時膠基糖果中赤蘚糖醇已全部溶出。對於其餘普通食品，所需超聲時間通常小於該時間。所以，選擇超聲40min作為赤蘚糖醇糖醇的超聲提取時間。
【權利要求】
1.一種赤蘚糖醇的檢測方法，其特徵在於採用水溶、超聲處理並用膜過濾後，用陰離子交換色譜-脈衝安培定量檢測赤蘚糖醇。
2.如權利要求1所述的一種赤蘚糖醇的檢測方法，其特徵在於:超聲處理為樣本水溶後用超聲處理10_60min。
3.如權利要求1所述的一種赤蘚糖醇的檢測方法，其特徵在於:膜過濾為取10ml-15ml超聲處理後的溶液，經0.2 y m-0.3 u m尼龍濾膜過濾，取濾液供離子色譜分析。
4.如權利要求1所述的一種赤蘚糖醇的檢測方法，其特徵在於:陰離子交換色譜法的流動相為250mmOl/L-1000mmOl/L的氫氧化鈉作為流動相，流動相流速為0.2mL/min-0.5mL/min。
5.如權利要求1所述的一種赤蘚糖醇的檢測方法，其特徵在於:陰離子交換色譜法的色譜柱為 DIONEX Carbopac PAlO 陰離子分析柱(4mmX250mm)、DIONEX Carbopac PAlO 陰離子保護柱(4mmX 50mm)，柱溫為20°C _40°C。
6.如權利要求1所述的一種赤蘚糖醇的檢測方法，其特徵在於:檢出限為4.62?.100.05 u g/L，線性範圍均跨三個數量級，精密度、穩定性、重現性試驗RSD均小於5%。
【文檔編號】G01N30/02GK103675114SQ201210360900
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月26日 優先權日:2012年9月26日
【發明者】許波, 賀玉榮 申請人:北京貫虹科技集團有限公司