大白菜eIF4E.a突變位點特異性分子標記及其應用的製作方法

2023-05-29 07:26:06

專利名稱：大白菜eIF4E.a突變位點特異性分子標記及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因的突變體及其相關位點特異性分子標記的開發，尤其涉及一種大白菜真核生物翻譯起始因子eIF4E. a的突變及其位點特異性分子標記開發和應用。突變體能夠為選育含該突變位點的抗病毒大白菜種質提供變異源，位點特異分子標記能夠直接應用於分子標記輔助育種來選擇含有該突變位點的大白菜材料，提高eIF4E突變體的選擇效率，屬於生物技術領域。
背景技術：
大白菜(Brassica rapa L. ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物,原產於中國，目前在世界各地均有種植。尤其在我國蔬菜的常年供應和淡季蔬菜調劑中已經成為蔬菜產品供給的重要組成部分，因而對人們生活具有重要影響。在大白菜生產過程中，常遭 病毒病、霜黴病和軟腐病等病害的威脅。就整體而言病毒病的危害最為嚴重，且沒有普遍適用的抗病毒病藥劑或其它行之有效的控制技術。培育抗病毒大白菜新品種是應對病毒病危害的首選途徑[王雪，劉玉梅，李漢霞，張揚勇，方智遠.蕓薹屬作物抗蕪菁花葉病毒育種研究進展.園藝學報.2005,32(5): 939-946]。苗立強等[苗立強，張耀偉，崔崇士 .我國白菜抗病育種研究進展.東北農業大學學報.2008, 37 (4) : 529-533]研究發現，我國大白菜病毒病的病原分離物中70%是蕪菁花葉病毒(Turnip Mosaic Virus，TuMV)、還有少量黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)和其它病毒。因此我國大白菜抗病毒病育種的主攻目標是抗TuMV。培育抗TuMV大白菜新品種的兩個關鍵要素是擁有豐富的抗TuMV種質資源和高效的育種效率。我國是大白菜原產地，種質資源非常豐富，其中不乏抗TuMV的優良資源，同時也有更多品質優良但不抗病毒的資源。在常規育種實踐中，常通過回交轉育的手段獲得更多遺傳背景豐富的抗性材料。隨著分子標記技術的興起及研究的深入，標記輔助選擇在常規育種操作中已經成為提高選擇效率、縮短育種年限的主要手段。一些跨國的育種集團更是不惜重金把創新資源和開發與重要農藝性狀緊密連鎖的分子標記作為育種攻關的主要內容。
一般而言，要尋找與某農藝性狀緊密連鎖的分子標記，往往需要先選擇在目標性狀方面存在顯著差異的親本，並構建分離群體$2，1 1，8(1，011等)，採用混合分群(BSA)和傳統的分子標記(如RAPD，SRAP, AFLP, SSR等)技術進行分析，用相應的軟體分析所得標記與性狀的連鎖距離，最終得到與目標性狀連鎖的分子標記。目前報導的與大白菜抗蕪菁花葉病毒(TuMV)性狀連鎖的分子標記正是採用上述方法得到的。由於不同研究者所用材料和所選擇的標記類型不同，所得到的與抗病毒特性連鎖的標記距離亦不同，介於
3.8-15. 36cM。由於這些標記與性狀的連鎖程度不夠緊密，因而其用於大白菜抗TuMV輔助育種尚有一定的距離。另一方面，由於擬南芥與大白菜同屬十字花科，其抗病毒相關功能基因已有較深入的研究；同時大白菜的全基因組序列已經公布(Wang et al. , 2011, the genome of themesopolyploid crop species Brassica rapa. Nature Genetics. 43(10):1035-1039)。所以可以將擬南芥功能基因研究的結果和大白菜基因組序列彳目息，直接從抗病毒相關功能基因的角度入手，通過對大白菜自然群體在某一個重要功能基因位點的自然變異入手，尋找抗病毒相關功能基因的突變體；針對突變位點開發位點特異性分子標記(Allele specificmarker, ASM)，則這種標記本身與性狀直接相關，這無疑會使標記輔助選擇更加精準。在抗病毒功能基因研究方面近年來發現，由隱性單基因控制的抗病毒性狀多與真核生物翻譯起始因子4E及其異構體的突變有關。Wittmann等[WittmannS，Chatel H，Fortin MG，Laliberte JF. Interaction of the viral protein genomelinked of Turnip mosaic virus with the translational eukaryotic initiationfactor(iso)4E of Arabidopsis thaliana using the yeast two-hybrid system.Virology. 1997，234:84-92]和 L6onard等[L6onard S，Plante D, Wittmann S，DaigneaultN，Fortin MG, LaliberteJF. Complex formation between potyvirus VPg andtranslation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity.J. Virol. 2000，74:7730-7737]分別證明擬南芥 eIF4E 和 eIF(iso)4E 可以同 TuMV 的病毒基因組結合蛋白(VPg)相互作用。這種相互作用的關鍵胺基酸與真核生物自身mRNA 翻譯所需的關鍵胺基酸位點不同，所以eIF4E及eIF(iso)4E的一些胺基酸突變不影響植物自身的生長發育、卻導致病毒與寄主不能發生互作，從而使寄主表現出抵抗病毒侵染的特性。Ryder 在生菜[Ryder EJ. 1970. Inheritance of resistance to common lettucemosaic. Am Soc Horticult Sci. 95:378 - 379]、Ruffel 在辣椒[Ruffel S，DussaultMHj Palloix A, Moury B，Bendahmane A，Robaglia C, Caranta C. 2002. A natural recessiveresistance gene against potato virus Y in peper corresponds to the eukaryoticinitiation factor 4E (eIF4E) Plant J. 2002 Dec; 32 (6) : 1067-75]、Nieto 在甜瓜[NietoC，Piron F，Dalmais M，Marco CF,Moriones E, Gomez-Guillamon ML, Truniger V,Gomez P，Garcia-Mas J，Aranda MAj Bendahmane A. 2007. EcoTILLING for the identification ofallelic variants of melon eIF4E，a factor that controls virus susceptibility. BMCPlant Biology. 7，34-42]等重要蔬菜作用中已經發現了不少這樣的突變體資源，Yeam等[Yeam I，Kang BCj Lindeman W，Frantz JDj Faber N，and Jahn MM. 2005. Allele-specificCAPS markers based on point mutations in resistance alleles at the pvrl locusencoding eIF4E in Capsicum. Theor. Appl. Genet. NN0，178-186]在辣椒中針對突變位點開發了相應的位點特異性CAPs標記並用於抗病毒材料轉育時的輔助選擇。我國大白菜種質資源十分豐富，從其他作物的eIF4E和eIF(iso)4E突變及其在抗病毒中的作用推測，大白菜自然群體中也可能存在eIF4E和eIF(iso)4E的突變體，且這種突變可能與大白菜的抗病毒特性有關。目前，國內外有關大白菜抗病毒特性與eIF4E和eIF(iso)4E關係的研究很少，涉及的材料極為有限。Rusholme等[Rusholme RL,Higgins EE, Walsh JA, Lydiate DJ. Genetic control of broad-spectrum resistanceto turnip mosaic virus in Brassica rapa (Chinese cabbage). Journal of GeneralVirology. 2007,88:3177 - 3186]以高抗TuMV的大白菜自交系RLR22和病毒敏感材料R-0-18為親本，構建BClFl群體，進行抗TuMV(⑶N I和CZEl株系)遺傳研究。結果發現了一個大白菜抗病毒隱性遺傳位點retrOl和一個顯性位點ConTROl，RFLP標記關聯分析分別發現了與retrOl連鎖的標記pN202el和與ConTROl連鎖的標記p085el。進一步採用southern雜交的手段發現，在A基因組中分別有3個拷貝的eIF4E(分別位於染色體NI、N3和N8)和3個拷貝的eIF(iso)4E(分別位於染色體N4、N5和N8)。作者根據雜交結果，推測位於第8染色體上的eIF4E和eIF(iso)4E可能與ConTROl有關，而位於第4染色體上的eIF(iso)4E可能與retrOl有關。文中沒有關於兩個基因的序列信息報導。Jenner 等[Jenner CE, Nellist CF, Barker GC, Walsh JA. Turnip mosaic virus (TuMV)is able to use alleles of both eIF4E and eIF(iso)4E from multiple loci of thediploid Brassica rapa. Mol Plant Microbe Interact. 2010,3(11):1498-1505]從病毒敏感材料R-0-18中克隆得到了 eIF4E和eIF (iso) 4E各三個拷貝，分別命名為BraA.eIF4E. a、BraA. eIF4E. b>BraA. eIF4E. c 和 BraA. eIF(iso)4E. a、BraA. eIF(iso)4E. b>BraA.eIF(iso)4E. c。除 BraA. eIF4E. b 和 BraA. eIF(iso)4E. b 以外，其餘 4 個基因分別轉化擬南芥 At. eIF (iso) 4E 功能缺失突變體[DupratA, Caranta C，Revers F, Menand B, BrowningKS, Robaglia C. 2002. The Arabidopsis eukaryotic initiation factor(iso)4E isdispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses.The Plant Journal, 32:927 - 934]，然後對所有轉基因株系接種TuMV加拿大株系⑶NI，進行病毒敏感性互補實驗。根據病情指數及ELISA結果，發現所轉的四個基因均能使突變體 完全或部分恢復對TuMV侵染的敏感性。這表明，在TuMV侵染白菜類蔬菜作物時，eIF4E和eIF(is0)4E都可能參與病毒與寄主的相互作用。同時作者指出，要想在大白菜中獲得與eIF4E和eIF (iso) 4E有關的抗病毒材料，則這幾個基因需同時喪失功能。截止目前，大白菜在上述兩個基因位點的突變及相關突變體檢測的標記開發國內外未見報導。鑑於此，有必要對我國豐富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4E和eIF (iso) 4E各個位點的多態性進行廣泛篩查，以發現各位點可能存在的突變類型；同時針對突變位點與野生型的序列差異，開發與突變體檢測有關的位點特異性分子標記。有以下幾個方面的潛在益處①可以將該標記用於篩查大白菜種群，提供高效的大白菜突變體檢測手段；②當其他位點發現突變類型時，可以採用同樣的方法開發標記；③當多個位點的突變位於不同的材料中時，可以通過標記輔助選擇手段將多位點的突變聚合在一起，創造廣譜抗TuMV大白菜新種質在培育廣譜抗TuMV大白菜新品種時，可以實現標記輔助選擇，提高育種效率。由於這種標記直接位於功能基因內部，因此選擇的準確率達100%。

發明內容
針對上述現有技術，針對目前大白菜在eIF4E和eIF (iso) 4E基因位點突變體鑑定方面的空白，本發明首先獲得了兩個eIF4E. a位點的突變體，其次根據突變位點的序列特點，設計引物，開發了鑑定野生型和突變體的ASM顯性標記並用於標記輔助選擇。本發明是通過以下技術方案實現的一種與大白菜eIF4E. a野生型和突變體鑑定直接相關的位點特異性顯性ASM標記與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM-4E. a-s，片段大小384bp，如SEQ ID No. I所示；對應的突變位點檢測相關的標記命名為ASM-4e. a-s，片段大小383bp，SEQ ID No. 3所
/Jn o另外一種大白菜eIF4E. a野生型和突變體鑑定直接相關的位點特異性顯性ASM標記與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM-4E.a-lc，片段大小348bp，如SEQ ID No. 2所示；對應的突變位點檢測相關的標記命名為ASM-4e. a-lc,片段大小347bp，SEQ ID No. 4所
/Jn o一種用於鑑別上述兩種特異性顯性分子標記的引物是正向引物FW : 5』 -GAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCAC-3』 ；正向引物Fm :5』 -GGAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCT-3』 ；反向引物RWm : 5』 -TGGCACAGATAGGATCCTCCCAC-3』 ；如 SEQ ID NO. 5、6、7 所示。本發明採用同源克隆技術從4份大白菜抗/感TuMV自交系材料中分別克隆到了eIF4E. a基因全序列,將4個序列與GenBank中已經報導的B. rapa自交系R-0-18的eIF4E.a比較後發現有多處SNPs的差異，表明所克隆到的BrA. eIF4E. a為新的單倍型。進一步通過編碼區預測和胺基酸序列推導發現，其中兩份材料的eIF4E. a基因ORF雖然與R-0-18的ORF有幾個SNPs的差異，但編碼產物與R-0-18的完全一致；而另外兩份材料的ORF則在第250位缺失了一個鹼基導致ORF移碼突變。據此確定缺失一個鹼基的eIF4E. a是突變基因。為了便於在瓊脂糖凝膠上檢測這一個鹼基的差異，我們根據突變位點設計了兩個正向引物(FW和Fm，其中FW用於鑑別野生型，Fm用於鑑別突變型)，在下遊保守區設計了一個通用反向引物RWm。在確保材料基因組DNA提取完整的前提下，當FW與RWm組合對基因組DNA進行擴增時，凡能夠擴增出條帶的，就是野生型，凡不能擴出條帶的就是突變型；反之，當Fm與RWm組合對基因組DNA進行擴增時，凡能擴出條帶的就是突變型，凡是不能擴出條帶的就是野生型；另外，當兩種組合都能擴出條帶的材料是雜合型。所以兩種引物組合結合使用，互相印證，對野生型、突變體以及雜合型的鑑別效率達100%。所述ASM標記的篩選過程如下(I)以大白菜抗TuMV自交系Hel02、8407和TuMV敏感自交系06-247、Guan291為材料，採用CTAB法，提取兩者的基因組DNA。(2)依據GenBank中已經報導的B. rapa自交系R-0-18的eIF4E. a序列,在編碼區上下遊設計引物。採用同源克隆技術，從四份材料中分別克隆得到了其eIF4E. a並進行測序。(3)將所得eIF4E. a與R_0_18的eIF4E. a序列分別進行比較，發現了多處SNPs和小片段插入及缺失；同時對編碼區進行推導和翻譯產物的預測，發現來自兩份敏感材料06-247和Guan291的eIF4E. a在編碼區缺失一個鹼基導致了移碼突變，只翻譯產生一個103個胺基酸的小肽，而另外兩份抗性材料Hel02和8407的eIF4E. a其編碼區雖與R-0-18有幾處SNPs的差異，但翻譯產物完全一致。所以根據鹼基缺失位點設計兩個正向引物與一個通用的反向引物，兩正向引物分別與反向引物組合，再擴增四份材料，結果在四份中分別得到了條帶有和無的擴增結果，此即為顯性標記。所述標記可以作為分子標記應用於大白菜種質資源鑑定和育種輔助選育，選擇含有06-247或Guan291中eIF4E. a突變類型的種質材料或轉育後代。具體應用方式為利用ASM標記的兩套引物組合對待測個體的基因組DNA進行兩次PCR擴增，檢測擴增片段的有無，如果(FW+RWm)組合擴增出384bp或348bp的條帶，則為野生型，擴不出則為突變型；或者如果(Fm+RWm)組合擴增出383bp或347bp的條帶則為突變型，擴不出則為野生型；如果 兩個組合都能擴出條帶則為雜合型。
本發明的有益效果是由於大白菜eIF4E位點上受多個基因的控制，在同一份材料中多基因同時突變的頻率較低。如果能夠分別在各個位點鑑定出各自的突變體，開發針對各個突變體檢測的位點特異性分子標記，則可以通過聚合雜交並結合分子標記輔助選擇，將多個突變位點聚合在同一份材料中。本發明利用同源克隆技術發現了 eIF4E.a位點的一個突變體並開發了鑑定該位點的分子標記。利用該標記可以對回交轉育後代的基因型進行準確選擇。同時該標記還可用於對大白菜種質資源進行篩查，以尋找遺傳背景更加豐富的突變體材料。其優點具體如下I.本發明獲得的與eIF4E. a位點突變直接相關的標記，結果穩定、準確、操作簡便。適用於不同遺傳背景大白菜材料的篩選，是一個普遍性標記。它能夠準確鑑定大白菜種質資源在該位點的基因型，極大地提高了對大白菜種質資源在eIF4E. a位點突變體的篩 選效率。2.在大白菜eIF4E基因序列及突變型研究方面，僅Jenner等(2010)報導了B. rapa的一個自交系R_0_18的序列，其它突變體未見報導。針對該突變位點的特異標記，可以為種質資源鑑定、通過回交轉育等手段篩選和培育不同遺傳背景的突變體材料提供輔助選擇工具。本發明的應用可大大簡化篩選手段、縮短轉育年限，避免了常規育種方法中選擇的盲目性。


圖I :四份大白菜材料eIF4E.a基因的擴增(瓊脂糖凝膠電泳)，其中1、2、3、4分別代表06-247、Guan291、Hel02和8407四份大白菜自交系材料，M為DNA分子量標準DL2000plus。圖 2 :來自 06-247、Guan291、Hel02、8407 以及 GenBank 檢索到的 R-O-18 的 eIF4E.
a基因組序列比對(圖中示有差異的部分)。圖3 :四份材料及R-0-18的eIF4E. a的開放閱讀框(ORF)序列比對圖(圖中示差異明顯部分，橢圓圈出部分是06-247及Guan291鹼基缺失部分，其餘均為同義突變)。圖4 :四種推導的胺基酸序列與來自R-0-18的eIF4E. a胺基酸序列比較(圖中可以看出06-247與Guan291從第84位胺基酸開始發生移碼突變，並提前終止)。圖5 :兩套ASM引物對四份大白菜材料基因組DNA的擴增結果，1、2、3、4分別指Hel02，8407，06-247 與 Guan291。圖6 :兩套ASM引物在不同大白菜資源中的檢測結果。圖7 :兩套ASM引物在回交後代中對部分單株的檢測結果。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例I、不同大白菜自交系材料中eIF4E. a的克隆I. I大白菜基因組DNA提取(I)將大白菜幼苗葉片放入液氮預冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；(2)待液氮揮發乾，立即轉移到2ml的離心管中，每IOOmg材料約加入0. 6ml預熱至65°C的CTAB提取液，融化後，劇烈振蕩混勻樣品，65°C水浴放置40-60分鐘使細胞裂解；(3)裂解結束後，取出樣品使其完全冷卻至室溫。加入等體積的氯仿(chloroform),輕輕顛倒使混勻，室溫放置10分鐘；(4)室溫，12000rpm 離心 15 分鐘；(5)用移液器小心吸出上層水相，加入新的I. 5ml的離心管中，加入500 ii I的異丙醇(I: I體積)，充分混勻，室溫沉澱IOmin ；(6) 4°C, 12000rpm 離心 IOmin,小心棄去上清液；(7) DNA沉澱用Iml的75%乙醇洗滌。4°C，8000rpm離心IOmin收集沉澱；(8)重複用75%乙醇洗滌一次DNA沉澱；
(9)去上清，DNA沉澱於無菌操作臺上晾乾約10-15分鐘，DNA略顯透明，加入適當體積(30-50 yl)的IOmM的Tris. HCl, pH8. 0使沉澱溶解(可放於4°C冰箱溶解過夜)；(10)紫外分光光度計及1% Agrose凝膠電泳檢測DNA濃度及質量。I. 2eIF4E. a的克隆及序列分析(I)檢索 B. rapa 自交系 R-0-18 的 eIF4E. a 基因全序列(GenBank:HMl31206),在編碼區上遊和下遊分別設計正反向引物，正向引物5』GTTCGGAGAAGAGAAGACGGAG3』反向引物5』AAGATTACAGGCITTTAAGGCC3』，如SEQ ID NO. 17、18 所示。(2) PCR擴增在 20 U I 反應體系中，包含 I X TransStart FastPfu buffer ;20ng 的基因組 DNA ;0. 4 u M 正反向引物；0. 25mM dNTPmix; I 個單位的 TransStart FastPfu DNA 聚合酶(TransGenAP221)。PCR循環條件95°C預變性5分鐘；接著是95°C變性30秒，57. 5°C退火30秒，72 °C延伸40秒，35-38個循環，最後72°C延伸10分鐘。 (3) PCR產物的電泳檢測PCR結束後，取IOiilPCR擴增產物加入IiU IOXloading buffer，在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結束後EB染色，自動凝膠成像系統觀察拍照。結果見圖I。(4) PCR產物的克隆測序電泳確認目的條帶被擴增後，取I PCR擴增產物加I UlpEasy-Blunt (TransGen CB101)載體室溫連接10分鐘，轉化大腸桿菌感受態細胞Transl-Tl (TransGen :CD501)，轉化菌在含Kan 50 u g/ml的LB固體平板上37°C倒置培養16小時左右。菌液PCR檢測後挑取陽性克隆委託北京博尚生物技術有限公司進行DNA序列的測定。(5)所克隆的大白菜eIF4E. a序列分析將來自TuMV抗性材料Hel02和8407的基因命名為fcA. eIF4E. al和fcA. eIF4E.a2，其序列如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示；將來自TuMV敏感材料06-247和Guan的基因命名為 BrA. eIF4e. al 和 BrA. eIF4e. a2，序列如 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 11 所示。它們與GenBank中R-0-18的同源基因序列比較的差異顯著部分如圖2所示。I. 3 ORF預測及胺基酸推導(I)從GenBank 中檢索得到 R-0-18 中同源基因的 0RF。用 NCBI 的 Splign (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/sutils/splign/splign. cgi textpage=online&level=form)工具，分析 BrA. eIF4E. aUBrA. eIF4E. a2 以及 BrA. eIF4e. aUBrA. eIF4e. a2 的 0RF，其序列分別如 SEQ ID NO. 12-15 所示。(2)對其ORF進行序列比對，差異部分如圖3所示。其中Hel02和8407的ORF與R-O-18的ORF差異部分主要是SNPs。胺基酸的推導用DNAMAN軟體進行，結果發現其全部為同意突變。06-247和Guan291的ORF有一處鹼基缺失，如圖3橢圓圈出部分。胺基酸預測結果如圖4所示，結果06-247和Guan291的eIF4E. a只編碼產生103個胺基酸殘基的小肽(正常編碼產物為227個胺基酸殘基)，其序列如SEQ ID NO. 16所示。另外兩個的編碼產物與R-0-18的完全相同。(3)據此判定來自06-247和Guan291的eIF4E. a為突變體。實施例2顯性ASM標記的開發2. I引物設計仔細比較BrA. eIF4E. al、BrA. eIF4E. a2、BrA. eIF4e. al、BrA. eIF4e. a2 的基因組 序列，差異較大的區域即介於150-600bp之間，關鍵是位於外顯子區的單鹼基缺失，所以針對野生型和突變體在該處的差異，用Primer Premier 5. 0軟體設計位點特異性引物。與突變體檢測相關的正向引物序列為Fm :5』 -GGAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCT-3』，與野生型檢測相關的正向引物為FW: 5』 -GGAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCAC-3』，通用的反向引物為RWm :5』-TGGCACAGATAGGATCCTCCCAC-3』。引物委託北京華大基因公司合成。2. 2 ASM標記的獲得(I)分別利用(FW+RWm)與(Fm+RWm)弓丨物組合在抗/感材料中的擴增PCR反應液的配製及擴增條件如I. 2第(2)條所述。(2)擴增結果的檢測如I. 2第(3)條所述。(3)擴增結果如圖5所示，(FW+RWm)引物能夠在野生型Hel02與8407中擴增出384bp和348bp的條帶,在突變體06-247與Guan291中擴不出條帶；反之(Fm+RWm)組合在野生型Hel02與8407中擴不出條帶，在突變體06-247與Guan291中擴出383bp和347bp的條帶。此即顯性ASM標記。四種條帶的序列如SEQ ID NO. 1-4所示。實施例3 ASM標記對大白菜不同資源的鑑定(I)不同大白菜資源的基因組DNA提取隨機選取不同的大白菜材料8份，這些材料基因組DNA提取如I. I所述。(2) PCR擴增PCR反應液的配製及擴增條件如I. 2第⑵條所述。(3) PCR產物的檢測如I. 2第(3)條所述。檢測結果如圖6所示，A :FW+RWm組合擴增結果；B Fm+Rffm組合擴增結果；M分子量標準DL2000，1-8是八份大白菜材料。從圖中可以看出，1-4是野生型，5-8為突變體。兩套引物對純合野生型和突變體的鑑定效率達100%。(4)eIF4E位點的測序驗證如I. 2所述。將不同材料中完整的eIF4E位點進行克隆測序。(5)測序結果表明，利用(FW+RWm)引物組合能夠在野生型Hel02與8407中擴增出條帶的，測序結果表明，該位點的確是野生型，擴不出條帶的是突變型。因此用任何一套引物組合都能實現對該位點純合的大白菜材料的準確鑑定。兩套引物組合使用，使得對於雜合型的鑑定成為可能。因此兩套標記組合使用，對於鑑定eIF4E. a位點的野生/突變以及雜合/純合性的準確率達100%。實施例4. ASM標記對回交後代的檢測
4. I回交後代的製備以Hel02為母本，06-247與Guan291為父本，蕾期人工雜交獲得F1，以Fl為母本，分別以06-247與Guan291為父本，同樣蕾期人工雜交獲得FlBCl。4. 2回交群體各單株DNA提取隨機選取FlBCl單株100株，溫室育苗，苗期取真葉按照I. I的方法提取基因組DNA。4. 3回交後代各單株基因型鑑定以各單株基因 組DNA為模板，用上述引物組合進行PCR擴增及PCR產物的檢測，擴增條件及檢測方法如1.2所述。部分單株檢測結果如圖7所示，A FW+RWm組合擴增結果；B Fm+RWm組合擴增結果；M分子量標準DL2000，1-8是隨機選擇的8個FlBCl單株。M:DNA分子量標準D2000。從A圖可以看出，1，2，4，6，7是野生型，3，5，8是突變體類型。
權利要求
1.一種大白菜eIF4E. a突變位點特異性分子標記，其特徵在於與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM-4E. a-s，片段大小384bp，如SEQ ID No. I所示；對應的突變位點檢測相關的標記命名為ASM-4e. a-s，片段大小383bp，SEQ ID No. 3所示。
2.一種大白菜eIF4E. a突變位點特異性分子標記，其特徵在於與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM-4E.a-lc，片段大小348bp，如SEQ ID No. 2所示；對應的突變位點檢測相關的標記命名為ASM-4e. a-lc，片段大小347bp，SEQ ID No. 4所示。
3.權利要求I或2所述的大白菜eIF4E.a突變位點特異性分子標記的引物，其特徵在於引物序列如下正向引物 FW : 5』 -GAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCAC-3』 ；正向引物 Fm : 5』 -GGAAGCTCCTTACGATCCGTCTTCT-3』 ；反向引物 RWm : 5』 -TGGCACAGATAGGATCCTCCCAC-3』 ；如 SEQ ID NO. 5、6、7 所示。
4.權利要求I或2所述的大白菜eIF4E.a突變位點特異性分子標記在鑑別大白菜eIF4E. a基因位點的基因型中的應用。
5.權利要求3所述的引物在鑑別大白菜eIF4E.a基因位點的基因型中的應用。
6.根據權利要求4或5所述的應用，其特徵在於具體應用方式為利用(FW+RWm)組合和(Fm+RWm)組合這兩套引物組合，對待測個體的基因組DNA進行兩次PCR擴增，檢測擴增片段的有無，如果(FW+RWm)組合擴增出384bp或348bp的條帶，則為野生型，擴不出則為突變型；如果(Fm+RWm)組合擴增出383bp或347bp的條帶則為突變型，擴不出則為野生型；如果兩個組合都能擴出條帶則為雜合型。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於所述PCR擴增具體為在20iU反應體系中，包含I XTransStart FastPfu buffer ;20ng的基因組DNA ;0. 4 u M正反向引物；.0. 25mMdNTPmix; I 個單位的 TransStart FastPfu DNA 聚合酶； PCR循環條件95°C預變性5分鐘；接著是95°C變性30秒，57. 5°C退火30秒，72°C延伸40秒，35-38個循環，最後72°C延伸10分鐘。
全文摘要
本發明公開了兩種與大白菜eIF4E.a野生型和突變體鑑定直接相關的位點特異性顯性ASM標記，其中一種與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM-4E.a-s，如SEQ ID No.1所示；對應的突變位點檢測相關的標記命名為ASM-4e.a-s，SEQ ID No.3所示。另外一種與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM-4E.a-lc，如SEQ ID No.2所示；對應的突變位點檢測相關的標記分別命名為ASM-4e.a-lc，SEQ ID No.4所示。本發明還公開了一種用於鑑別上述兩種特異性顯性分子標記的引物，如SEQ ID NO.5、6、7所示。本發明的標記和引物可以作為分子標記應用於大白菜種質資源鑑定和育種輔助選育，選擇含有06-247或Guan291中eIF4E.a突變類型的種質材料或轉育後代。
文檔編號C12N15/11GK102703445SQ20121017346
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者劉栓桃, 盧金東, 張志剛, 李巧雲, 趙智中 申請人:山東省農業科學院蔬菜研究所