甲殼素多孔止血微球的製備方法與流程
2023-05-29 11:51:11 1
本發明涉及一種甲殼素多孔止血微球的製備方法，屬於天然高分子材料應用技術領域。
背景技術：
甲殼素是地球上含量僅次於纖維素的可再生天然高分子，它存在於各種甲殼綱動物、軟體類動物、昆蟲和某些藻類中。甲殼素作為一種天然高分子，具有生物可再生性、生物相容性、生物可降解性和無毒性等優異特點，比起它的衍生物殼聚糖有著更好的結構穩定性，不需要脫乙醯化加工，節省能源且更加環保。甲殼素在生物工程領域的應用極其廣泛，如三維細胞培養支架、止血膜/海綿、藥物包覆及釋放、無水處理和食品加工等，其中作為止血材料，能夠明顯降低止血時間；作為藥物包覆及釋放材料它具有良好的緩釋作用，且能夠靶向運輸藥物到特定的部位。因此甲殼素具有廣闊的市場前景。
作為止血材料，甲殼素的主要止血機理為：其一，甲殼素具有較強吸水能力，在與傷口接觸時能夠吸收血液中的水分，濃縮血漿中的血細胞、血小板和凝血因子；其二，甲殼素上的氨基正離子與帶負電的紅細胞、血小板和蛋白質相互吸附形成血栓；其三，甲殼素內的物質如鈣離子可以促進凝血串聯反應，激活凝血酶原，產生凝血蛋白酶，使纖維蛋白原分解為纖維蛋白，形成纖維蛋白增強的堅固血栓而止血。根據它的止血機理，可以改變甲殼素材料的形貌結構，從而增強甲殼素材料的止血能力。
甲殼素微球止血劑的優點在於它顆粒小，能與各類外傷傷口(形狀、大小、深淺)密切接觸，從而達到良好的止血效果。目前甲殼素微球的主要製備方法為反相乳液法(一種製備再生甲殼素微球的方法，cn201510075081.6；含有納米銀的磁性甲殼素微球，cn201410059773.7；一種功能性多孔微球的製備方法，cn201610104925.x)。這種製備方法需要消耗大量的有機溶劑和表面活性劑，因此其製備成本高。
技術實現要素：
針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種操作簡單、綠色環保、顆粒均勻的多孔甲殼素微球的製備方法。
本發明是通過以下技術方案實現的：
本發明提供了一種甲殼素多孔止血微球的製備方法，其包括如下步驟：
將甲殼素-氫氧化鈉-尿素水溶液以靜電噴射的方法噴射於凝固液中，進行凝固再生成型，經過洗滌以及超臨界co2乾燥得到所述甲殼素多孔止血微球；其中，所述靜電噴射的電壓為5～20kv。
作為優選方案，所述甲殼素-氫氧化鈉-尿素水溶液中，甲殼素、氫氧化鈉、尿素和水的質量比為(1～3):(10～12):(4～6):(80～85)。
作為優選方案，所述甲殼素-氫氧化鈉-尿素水溶液的製備方法為：將甲殼素、氫氧化鈉和尿素分散於水中，在-30℃下經過至少3次冷凍-解凍循環過程，使甲殼素溶解，再經過300目的紗布過濾，得到澄清透明的甲殼素-氫氧化鈉-尿素水溶液。
作為優選方案，所述甲殼素-氫氧化鈉-尿素水溶液中還含有表面活性劑，所述表面活性劑的質量分數為0.01～0.1％。
作為優選方案，所述表面活性劑選自十二烷基磺酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨和吐溫-80中的至少一種。
作為優選方案，所述凝固液為硫酸-乙醇水溶液，其中，硫酸的體積的分數為5～15％，乙醇與水的體積比(50～80)：(50～20)。
作為優選方案，所述靜電噴射中的供料速率為10～100μl/min。
作為優選方案，所述洗滌的操作為：先經過1n鹽酸水溶液洗滌2h，再依次用水和醇洗，過濾收集。
一種如前述方法製備的甲殼素多孔止血微球在止血材料中的用途。
與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
1、無需有機溶劑，製備速度快、綠色環保、顆粒大小均勻。
2、甲殼素微球具有多孔結構特徵，孔隙率為40％～60％，吸水率高達900％～2300％，比表面積50m2/g～130m2/g，可作為大出血外傷傷口的快速止血劑。
附圖說明
通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特徵、目的和優點將會變得更明顯：
圖1為本發明的實施例1製備的多孔甲殼素微球表面的掃描電鏡圖；
圖2為本發明的實施例1製備的多孔甲殼素微球斷面的掃描電鏡圖；
圖3為本發明的實施例4體外促凝血的數據圖；
圖4為本發明的實施例5全血血栓動力學的數據圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬於本發明的保護範圍。
實施例1
1、配製1.5％甲殼素溶液：將11g氫氧化鈉和4g尿素溶解於83.5g水中，再將1.5g甲殼素加入此溶劑中，室溫下攪拌5min。把混合溶液放置在-30℃冷凍2h，隨後拿出攪拌至均勻，然後在-30℃繼續冷凍。在4h和8h後重複攪拌/冷凍過程直至溶解，過濾得到澄清透明的液體，加入0.1g吐溫，攪拌均勻，在4℃保存備用。
2、配製凝固液：將25ml硫酸溶解於225ml水醇溶液中(v水：v乙醇＝1:1)，作為凝固液。
3、微球製備：將20ml甲殼素溶液注入20ml注射器中，通過靜電噴射得到甲殼素微球。靜電噴射條件為：供料速度：60μl/min，電壓：14kv。
4、洗滌乾燥：過濾收集上述甲殼素微球，放入1m的150ml鹽酸溶液3h，然後分別用150ml水和150ml乙醇各洗滌五次，抽濾收集，最後用二氧化碳超臨界乾燥，得到多孔結構的甲殼素微球。
本實施例製備得到的甲殼素多孔止血微球的表面和斷面的掃描電鏡照片分別如圖1和圖2所示，微球的直徑為：393±32μm，孔隙率58.1％，經過測量，比表面積為137.8m2/g。
實施例2
1、配製1.5％甲殼素溶液：將11g氫氧化鈉和4g尿素溶解於83.5g水中，再將1.5g甲殼素加入此溶劑中，室溫下攪拌5min。把混合溶液放置在-30℃冷凍2h，隨後拿出攪拌至均勻，然後在-30℃繼續冷凍。在4h和8h後重複攪拌/冷凍過程直至溶解，過濾得到澄清透明的液體，在4℃保存備用。
2、配製凝固液：將25ml硫酸溶解於225ml水醇溶液中(v水：v乙醇＝1:1)，作為凝固液。
3、微球製備：將20ml甲殼素溶液注入20ml注射器中，通過靜電噴射得到甲殼素微球。靜電噴射條件為：供料速度：60μl/min，電壓：10kv。
4、洗滌乾燥：過濾收集上述甲殼素微球，放入1m的150ml鹽酸溶液3h，然後分別用150ml水和150ml乙醇各洗滌五次，抽濾收集，最後用二氧化碳超臨界乾燥，得到多孔結構的甲殼素微球。甲殼素微球的直徑為589±45μm，孔隙率為56.4％。
實施例3
1、配製2.0％甲殼素溶液：將11g氫氧化鈉和4g尿素溶解於83g水中，再將2g甲殼素加入此溶劑中，室溫下攪拌5min。把混合溶液放置在-30℃冷凍2h，隨後拿出攪拌至均勻，然後在-30℃繼續冷凍。在4h和8h後重複攪拌/冷凍過程直至溶解，過濾得到澄清透明的液體，加入吐溫-80，使它的濃度達到0.05％，攪拌均勻。在4℃保存備用。
2、配製凝固液：將25ml硫酸溶解於225ml水醇溶液中(v水：v乙醇＝1:1)，作為凝固液。
3、微球製備：將20ml甲殼素溶液注入20ml注射器中，通過靜電噴射得到甲殼素微球。靜電噴射條件為：供料速度：60μl/min，電壓：10kv。
4、洗滌乾燥：過濾收集上述甲殼素微球，放入1m的150ml鹽酸溶液3h，然後分別用150ml水和150ml乙醇各洗滌五次，抽濾收集，最後用二氧化碳超臨界乾燥，得到多孔結構的甲殼素微球。甲殼素微球的直徑為741±57μm，孔隙率為49.5％。
實施例4
1、稱取實施例1所制甲殼素微球和甲殼素粉末樣品各10mg於2ml規格的一次性塑料試管中，並放置在37℃水浴鍋中。
2、用醫用採血針在大鼠心臟取2ml血液於一次性採血管(3.2％檸檬酸鈉:血＝1:9)中，180°顛倒混勻5～8次並放置於37℃水浴鍋恆溫。
3、吸取1ml抗凝血液分別加入上述樣品中，180°旋轉兩次混勻血液和樣品後，立即向血液中中加入100μl0.1mcacl2溶液，同時混勻並開始計時，半分鐘後每鎘5s將試管緩慢傾斜一次，觀察血液是否凝固。
4、血液傾斜90°不再流動時停止計時，所得時間為凝血時間。以空白試管直接加入血液作為陰性對照，每個樣品重複7次實驗。
實驗結果如圖3所示，甲殼素粉末和微球的凝血時間分別為83s和50s。
實施例5
1、實施例1所制甲殼素微球和粉末樣品各5mg置於10ml試管中，每個樣品重複5次。
2、用醫用採血針在大鼠心臟取2ml血液於一次性採血管(3.2％檸檬酸鈉:血＝1:9)中，180°顛倒混勻5～8次並放置於37℃水浴鍋恆溫。
3、取1ml抗凝血液並加入100μl0.1mcacl2溶液，混合均勻後迅速吸取100μl混合血液加入各樣品中以形成血栓，並開始計時。在5分鐘後加入3ml蒸餾水，且在37℃、30rpm搖床中震蕩3min，再靜置2min以溶解未形成血栓的紅細胞，然後取200μl紅細胞蒸餾水溶液加入96孔板中(一式三份)。同理，在23、38、53min時向樣品中加入3ml蒸餾水並放置5min，然後取紅細胞蒸餾水溶液。
4、用biotek.synergyht型酶標儀在540nm處測量去離子水中血紅蛋白含量。
實驗結果如圖4所示：在相同時間內甲殼素多孔微球吸附紅細胞形成的血栓比甲殼素粉末的大，因此甲殼素多孔微球的促凝血能力強於甲殼素粉末。
以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明並不局限於上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的範圍內做出各種變形或修改，這並不影響本發明的實質內容。