一種實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝置的製作方法

2023-05-29 11:56:51 4

專利名稱：一種實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種醫用器械，特別是涉及一種用於細胞或小組織穿剌，並實現 向胞內注射外源物質或吸弓I胞內或組織內部組分的裝置。
背景技術：
單細胞層次的分子或藥物篩選，在分子生物學和藥物開發等研究領域具有重 要的意義。在該研究領域中，研究者經常需要將外源物質(染色劑，大分子，基 因等)準確的引入目標細胞中或從細胞中提取待測的細胞質，而其中主要面臨的 困難就是來自於細胞壁(僅植物細胞具有)和細胞膜的阻擋。細胞壁和膜的存在， 與細胞的物質交換、細胞識別、分泌、排洩、免疫等功能密切相關。其不僅提供 了對於細胞本體的結構性保護，更重要的是具備選擇透過性，而選擇性恰是生命 活動的體現，因為只有活細胞才具備該種特性。除水以外，單細胞膜只允許被選 擇的離子和小分子通過，這一特性很重要，對於以單細胞為目標的研究者而言， 大分子物質除特殊情況下可通過胞吞和胞吐的作用進出細胞以外，一般情況下均 不能自由通過細胞膜，必須通過其它手段進行人為的幹預。
目前國際上用於外源物質注入細胞的方法包括電穿孔法，脂質體載體法，
病毒載體導入法，基因槍，超聲滲透法，顯微注射法，基於MEMS器件的注射，
基於納米管的注射。其中，前五種方法屬於批量操作，適用於針對一定濃度的細
胞群一次性導入。其缺點是需要外界載體或瞬間大能量的介入，容易對細胞本體
造成汙染或傷害，轉染量不易控制，已轉染和未轉染細胞無法分離，因此不適合
稀有或珍貴的細胞樣本，也不適合針對體積較大的卵細胞進行的轉基因實驗。顯
微注射是當前單細胞注射操作中應用最普遍的方法，實驗者依靠固定於顯微鏡上
的微操作器，在鏡下採用手動或電動的方式控制玻璃中空微針尋找並刺入目標細
胞，然後將微針中灌注的物質注入細胞內。其優點是技術成熟，操作可視化，能 夠針對單細胞進行主動操作。缺點是使用這種靜態力穿刺細胞時引起較大的變形將對細胞造成一定的傷害，穿刺的成功率低，對實驗者的操作技能要求高，需要 對細胞進行預處理，例如提前去除植物細胞的細胞壁。基於MEMS器件的注射 方法和基於納米管的注射法都屬於顯微注射範疇內，是採用新材料、新結構的一 種創新性嘗試，器件製備複雜，作用原理仍然為靜力穿刺，無法減少細胞由於受 擠壓變形而遭受的損傷。
目前用於細胞和小組織內物質提取的方法主要包括高速組織搗碎法，機械
研磨法，反覆凍融法，化學處理法和超聲處理法等。它們的原理是通過機械、物 理、化學等手段破壞細胞壁或細胞膜，繼而將細胞內質或核酸釋放到溶液中以待 進一步檢測。但無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水 解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少。現在尚缺乏一 種可實現細胞胞內或小組織內部物質吸引的技術。
隨著現代科學技術的不斷深入發展和交叉融合，本發明結合微納米技術、微 製造技術、微流體技術、功率超聲技術和細胞生物學等，為實現針對單細胞和小 組織內部的注射和吸引提供了一種新的方法和手段。本發明的特點是改變通常顯 微注射中採用的靜態力穿剌原理，在中空微針穿刺細胞膜的同時，在針尖上施加 瞬間的超聲頻率振動，在局部極大加速度的影響下，產生一個瞬間的衝擊力，以 提高微針的穿刺效率並減少由於擠壓變形對細胞造成的傷害。

發明內容
本發明的目的在於克服通常顯微注射中採用的靜態力穿刺，無法減少細 胞由於受擠壓變形而遭受損傷的缺陷；從而提供一種在中空微針穿刺細胞膜的裝 置。此裝置能將超聲頻率振動傳遞至針尖，引起局部極大的加速度，從而產生一 個瞬間的衝擊力，以提高微針的穿刺效率，並減少由於擠壓變形對細胞造成的傷 害，實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引。
本發明的目的是這樣實現的
本發明提供的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝置，包括穿 刺微針本體l、過渡接頭2和變幅杆3;其特徵在於，還包括超聲換能器4、橡 膠導管5、壓力調節部件6和正弦信號發生器8;所述的穿刺微針本體1為一根 中空管,該穿刺微針本體1的末端通過所述的過渡接頭2與所述的變幅杆3固定； 所述的超聲換能器4由第一金屬圓柱401和第二金屬圓柱402， 2個或4個壓電陶瓷圓環和3片電極13組成，所述的第一金屬圓柱401 —端中心開有螺孔，另 一端面上設置一凸臺14;所述的第二金屬圓柱402 —端加工出螺釘15，另一端 與所述的變幅杆3的另一端固定；所述的壓電陶瓷圓環與所述的3片電極相間排 列，並加裝在金屬圓柱401和402之間的螺釘15上，通過螺釘15連接第一金屬 圓柱與第二金屬圓柱，並對壓電陶瓷圓環施加預應力；所述的橡膠導管5—端套 在所述的凸臺14上，該橡膠導管5的另一端與所述的壓力調節部件6連接；所 述的功率正弦信號發生器8與所述的電極片13電連接；所述的超聲換能器4 一 端相連的變幅杆3，實現能量傳遞和放大，即完成一個微型超聲吸引器，參考圖 1和2。
在上述技術方案中，所述的壓力調節部件6為雙向泵。
在上述技術方案中，所述的壓力調節部件6為一由注射器9和螺旋測微儀 12組成；包括第一支架IO、第二支架10'、聯軸器ll、注射器9和螺旋測微儀 12;其中所述的聯軸器11連接注射器9的推桿和螺旋測微儀12的頂杆；所述的 第一支架10與第二支架10'同軸安裝在一塊平臺上，分別支撐所述的注射器9 和螺旋測微儀12，如圖3所示。
在上述技術方案中，所述的穿刺微針本體l的針尖(刺入端)，考慮其生物 兼容性和強度，可採用微針拉制器拉制的內徑為1 5(^m玻璃針尖，或通過冷拔， 金屬巻饒、雷射焊接、精磨等工藝製成內孔徑為50 500nm的金屬針尖。
在上述技術方案中，所述的壓電陶瓷圓環7和壓電陶瓷圓環7'為PZT-8 (鋯 鈦酸鉛)，該壓電陶瓷圓環7和7'的外徑15mmx內徑8mmx厚度2mm。使用壓 電陶瓷圓環7的特點是發熱小，工作穩定，在實際工作中，壓電陶瓷的兩端被加 載正弦變化的交流電壓，幅值在1 100V之間，壓電陶瓷將產生縱向振動。由於 壓電陶瓷變形率小，在低電壓下為了達到較大的振幅，必須令穿剌針尖工作於超 聲諧振狀態下，並使用變幅杆3完成超聲能量傳遞和振幅放大。
在上述技術方案中，所述的3片電極13為青銅材料的製成的，其厚度 0.05~0.3蘭。
在上述技術方案中，所述的變幅杆3採用階梯形和圓錐形設計，尺寸大小由 四端網絡法或有限元仿真設計法確定。
在上述技術方案中，其穿剌微針本體1與過渡接頭2固定的方式可採用雷射 焊接，氬弧焊，粘接或釺焊，保證機械連接並可完成超聲波的傳遞。
在上述技術方案中，所述的壓電陶瓷7和7'與3片所述的電極13相間粘結在一起，再套在所述的螺釘15上。
在上述技術方案中，本發明的對單細胞或小組織內部實現注射和吸引的超聲
裝置，工作頻率為20kHz 50kHz，尖端振幅設計為l~20pm，總加速度設計超過 50000g，符合軟組織受加速度破壞的閾值。超聲換能器4、變幅杆3、過渡接頭 2和穿刺微針本體1的總長度根據工作頻率和設計差異，可在lcm 50cm以內。
本發明提供的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝置，及其相 應的方法，適合對直徑10^un 10mm的細胞和直徑在5cm以內的小組織進行操 作，可廣泛用於基因工程，藥物篩選，細胞生物學和微創生化檢測等領域。
本發明的優點在於
本發明提供的對單細胞或小組織內部實現注射和吸引的超聲裝置，適合單細 胞胞內物質吸引或注射的中空微針尖，用於細胞或小組織穿刺操作，即在針刺瞬 間於針尖處施加一個超聲振動，克服傳統顯微操作中所用靜力穿刺造成細胞變性 大，對于堅固細胞壁或富有彈性的細胞膜穿刺成功率低等缺點，在微針穿刺單細 胞或小組織質膜的同時，超聲振動產生微米級別的振幅，引起針尖局部的加速度， 從而提供瞬間的(0.1~0.2秒)力，因此相比於通常的人工微操作穿刺，可以避 免細胞膜和細胞骨架的大幅度變形對細胞本體造成的傷害，提高細胞穿剌的成功 率和細胞的成活率。尤其適用於植物細胞或卵細胞這類具有堅固細胞壁或富有彈 性細胞膜的操作對象。
本發明提供的對單細胞或小組織內部實現注射和吸引的超聲裝置，使用壓電 陶瓷圓環7的特點是發熱小，工作穩定，在實際工作中，壓電陶瓷的兩端被加載 正弦變化的交流電壓，幅值在1 100V之間，壓電陶瓷將產生縱向振動。由於壓 電陶瓷變形率小，在低電壓下為了達到較大的振幅，必須令穿刺針尖工作於超聲 諧振狀態下，並使用變幅杆3完成超聲能量傳遞和振幅放大。


圖1本發明的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝置組成示
意圖
圖2本發明的超聲換能器4的剖面圖 圖3本發明的壓力調節部件結構示意圖 圖面說明
1中空穿刺微針； 2過渡接頭； 3變幅杆；4超聲換能器；
7第一壓電陶瓷圓環
9注射器；
11聯軸器；
14凸臺；
402第二金屬圓柱
5橡膠導管；
7'第二壓電陶瓷圓環;
10第一支架；
12螺旋測微儀；
15螺釘；
6壓力調節部件； 8功率正弦信號發生器; 10'第二支架； 13電極；
401第一金屬圓柱；
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖詳細對本發明進行說明 實施例1
參考圖3，首先製作一個用於本發明的壓力調節部件6。該壓力調節部件6 由第一支架IO、第二支架10'、聯軸器ll、注射器9和螺旋測微儀12組成；第 一支架10與第二支架10'採用可以調節高度的金屬支架，例如試管支架、光具 座等，第一支架10與第二支架10'同軸安裝在一塊金屬平臺(或者防震平臺) 上，它們分別支撐所述的注射器9和螺旋測微儀12 (注射器9安裝在第一支架 10上，螺旋測微儀12安裝在第二支架10'上)。 一根橡膠導管5的一埠與注射 器9的前端連接，通過一個聯軸器ll (市場上購買的)連接注射器9的推桿和 螺旋測微儀12的頂杆，使之固定在一起。
本實施例中的調節部件6也可以採用雙向泵，橡膠導管5裝在雙向泵的管路 接頭上。
參考圖1和圖2，採用圖3製作的壓力調節部件6,製作一個本發明的實現 對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝置。
穿刺微針本體1為一根內徑500|am的鈦合金中空管，長度40mm，通過激 光焊接工藝連接至過渡接頭2,由於被焊接對象內外徑存在間隙，因此，雷射焊 接時必須添加焊料。另外變幅杆3與帶有微針的過渡接頭2通過螺紋相連。
過渡接頭2的材料為鈦合金，前端內徑為lmm。
超聲換能器4採用夾心式設計；其中第一壓電陶瓷圓環7和第二壓電陶瓷圓 環7'選用的材料為PZT-8，外徑15mm，內徑8mm，厚度2mm，共2片。電極 13採用青銅材料，厚度0.2mm，共3片。超聲換能器4中的第一金屬圓柱401 和第二金屬圓柱402，由不鏽鋼圓柱製成，在第一金屬圓柱401的一端車出內螺 紋，在第二金屬圓柱402的一端加工出螺釘15，其中螺釘15的螺杆上可以留一段不車出螺紋，也可以全部車出螺紋；第二金屬圓柱402通過螺釘15與第一金 屬圓柱401的內螺紋螺合固定在一起；第一壓電陶瓷圓環7和第二壓電陶瓷圓環 7'，與3片電極13相間粘接在一起，並且套在第一金屬圓柱401和第二金屬圓 柱402之間的螺釘15上，在擰緊第一金屬圓柱401和第二金屬圓柱402時，通 過螺釘15連接成一體，並對第一壓電陶瓷圓環7和第二壓電陶瓷圓環7'施加預 應力，即完成超聲換能器4的製作。第一金屬圓柱402的前端通過過渡接頭2 與變幅杆相連，該變幅杆裝置3可實現能量傳遞和放大。
所述的超聲換能器4另一端設置一凸臺14，通過一根所述的橡膠導管5與 所述的壓力調節部件6連接；所述的電極13分別引線與功率正弦信號發生器8 相連；變幅杆裝置3與帶有微針的過渡接頭2通過螺紋相連後，即完成一個微型 超聲吸引器，參考圖1和圖2。
實施例2
參考圖1和圖2，在實施例1的基礎上，穿剌微針本體1的材料改用不鏽鋼， 其內徑50iam，長度20mm。過渡接頭2的材料為鈦合金，內徑為0.8mm，兩者 通過釺焊工藝連接，使用銀粉和助焊劑的混合物作為焊料。超聲換能器4中第一 壓電陶瓷圓環7和第二壓電陶瓷圓環7'選用材料為PZT-8，外徑10mm，內徑 5mm，厚度2mm，共4片。電極13採用青銅材料，厚度0.2mm，共3片。壓力 調節部件6可選用標準的手動注射器(市場上可購買的)來代替。
實施例3
參考圖1和圖2，在實施例l的基礎上，穿刺微針本體1的材料改用玻璃， 使用拉制器製成尖端內徑2tim，長度40mm。過渡接頭2，其材料為鈦合金，內 徑為0.5mm，兩者通過環氧樹脂膠粘接，高溫4小時凝膠後可使用。超聲換能器 4中第一壓電陶瓷圓環7和第二壓電陶瓷圓環7'的材料為PZT-8，外徑6mm,內 徑3mm，厚度lmm，共2片；電極13採用青銅材料，厚度O.lmm，共3片。 由於本實施例面向的目標是單個小細胞，注射和吸引壓力需要微調，因此壓力調 節部件6選用以注射器為主體的微推進器。本發明中使用的壓力調節裝置結構如 圖3所示， 一個5mL容量的注射器9和一個螺旋測微儀12分別被固定在支架 10和10'上，注射器9的針頭部分與橡膠導管5相連，用於為微型超聲吸引器提 供正負壓力，螺旋測微儀12的前端與注射器9的推進器部分，通過一個市場上 購買的聯軸器11相連，當轉動螺旋測微儀12的手柄時，注射器內的活塞可以按 照微米精度前進或後退，改變導管5中的壓力。
權利要求
1.一種實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝置，包括穿刺微針本體(1)、過渡接頭(2)和變幅杆(3)；其特徵在於，還包括超聲換能器(4)、橡膠導管(5)、壓力調節部件(6)和正弦信號發生器(8)；所述的穿刺微針本體(1)為一根中空管，該穿刺微針本體(1)的末端通過所述的過渡接頭(2)與所述的變幅杆(3)固定；所述的超聲換能器(4)由第一金屬圓柱(401)和第二金屬圓柱(402)，2個或4個壓電陶瓷圓環和3片電極(13)組成；所述的第一金屬圓柱(401)一端中心開有螺孔，另一端面上設置一凸臺(14)；所述的第二金屬圓柱(402)一端加工出螺釘(15)，另一端與所述的變幅杆(3)的另一端固定；所述的壓電陶瓷圓環與所述的3片電極相間排列，並加裝在金屬圓柱(401)和(402)之間的螺釘(15)上，通過螺釘(15)連接第一金屬圓柱與第二金屬圓柱，並對壓電陶瓷圓環施加預應力；所述的橡膠導管(5)一端套在所述的凸臺(14)上，該橡膠導管(5)的另一端與所述的壓力調節部件(6)連接；所述的功率正弦信號發生器(8)與所述的電極片(13)電連接；所述的超聲換能器(4)一端相連的變幅杆(3)，實現能量傳遞和放大。
2. 按權利要求1所述的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝 置，所述的壓力調節部件(6)為雙向泵，橡膠導管(5)裝在雙向泵(6)的管 路接頭上。
3. 按權利要求1所述的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝 置，所述的壓力調節部件(6)為一由注射器(9)和螺旋測微儀(12)組成；包括 第一支架(IO)、第二支架(IO')、聯軸器(ll)、注射器(9)和螺旋測微儀(12); 其中所述的聯軸器(ll)連接注射器(9)的推桿和螺旋測微儀(12)的頂杆；所述的 第一支架(10)與第二支架(IO')同軸安裝在一塊平臺上，分別支撐所述的注射 器(9)和螺旋測微儀(12)。
4. 按權利要求1所述的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝 置，所述的穿刺微針本體(l)的針尖釆用微針拉制器拉制的內徑為l~50^im玻璃針 尖，或製成內孔徑為50 500pm的金屬針尖。
5. 按權利要求1所述的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝 置，所述的壓電陶瓷圓環為PZT-8材料製作，該壓電陶瓷的兩端被加載正弦變化的交流電壓，幅值在1 100V之間，壓電陶瓷將產生縱向振動。
6.按權利要求1所述的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝 置，所述的電極(13)為青銅材料的製成的，其厚度0.05 0.3mrn。
7. 按權利要求1所述的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝 置，所述的變幅杆(3)採用階梯形和圓錐形設計，尺寸大小由四端網絡法或有 限元仿真設計法確定。
8. 按權利要求1所述的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝 置，所述的穿刺微針本體(l)與過渡接頭(2)固定的方式可採用雷射焊接，氬弧 焊，粘接或釺焊。
9. 按權利要求1所述的實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝 置，所述的壓電陶瓷圓環與3片所述的電極相間粘結在一起，再套在所述的螺釘 (15)上。
全文摘要
本發明涉及一種實現對單細胞或小組織內部的注射和吸引的超聲裝置，包括穿刺微針本體的末端通過過渡接頭與變幅杆固定；一超聲換能器由一段中心開有螺孔的金屬圓柱，一段加工出螺釘的金屬圓柱，2壓電陶瓷圓環與3片電極相間排列，加裝在金屬圓柱之間，通過螺釘連接成一體；第一金屬圓柱的另一端面設一凸臺，橡膠導管一端套在凸臺上，該橡膠導管的另一端與壓力調節部件連接；功率正弦信號發生器與所述的電極片電連接；超聲換能器一端相連的變幅杆。本發明的超聲裝置，適於操作植物細胞或卵細胞類具有堅固細胞壁或具有彈性細胞膜，能避免細胞膜和細胞骨架的大幅度變形對細胞本體造成的傷害，提高穿刺成功率，實現向胞內注射外源物質或吸引胞內或組織內部組分。
文檔編號C12M1/00GK101555450SQ200810103558
公開日2009年10月14日 申請日期2008年4月8日 優先權日2008年4月8日
發明者周兆英, 張毓笠, 朱俊華, 興 楊, 羅曉寧, 肖名飛, 婷 鄔 申請人:清華大學