植物根生長發育相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-05-29 11:59:41 1

專利名稱：植物根生長發育相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物根生長發育相關蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一個 來源於擬南芥的植物根生長發育相關蛋白及其編碼基因與它們在植物生長發育中的 應用。
背景技術：
作為高等生物，植物與動物的最大的區別在於植物必須固著生長，這種生長的固 定以及營養物質的汲取必須強烈地依賴於植物根系的生長。所以根系的生長發育對於 植物整體的良好生長起著至關重要的作用。不論是單子葉植物還是雙子葉植物，雖然 根系的結構和形態有所不同，但是成熟的根都是由根冠區、分生區、伸長區和成熟區 四部分組成，其中每部分都執行著不同的功能。根冠由中央根冠細胞和側面根冠細胞 組成，隨著根尖的不斷生長，根冠最前端的細胞脫落從而對根尖起到了保護的作用； 同時中央根冠細胞內含有大量的澱粉粒，起到感受重力的作用，從而使植物的根產生 向地性的生長。分生區是由處於分裂期的細胞組成，正是這些細胞的不斷分裂，使得 細胞的數目增加，根不斷的生長。伸長區是由介於分裂狀態和分化狀態之間的細胞組 成，是二者之間的過渡階段。成熟區由高度分化的細胞組成，這些分化成熟的細胞大 小形態不再變化，各自執行不同的功能。
擬南芥根分生組織中被稱為原始細胞的幹細胞通過立體的分裂產生了每層細胞 層中各種類型的細胞，這些細胞組成了一個無性繁殖的細胞系。原始細胞經過一次分 裂產生的兩個子細胞中的一個仍保持著原始性，而另外一個細胞成為transit-amplifying cell (TA cell),這個細胞經過很多次的分裂後，分化形成自身的特性。圍繞在原始細胞 中央的靜止中心(QC)的細胞很少分裂，和周圍的幹細胞組成了根分生組織的幹細胞生 境(stem cell niche)， QC是這個niche的組織中心。QC通過和周圍幹細胞的信號交流， 抑制其分化，保持幹細胞的原始性，目前對於這些信號分子本質的了解甚少，但是從 根分生組織與芽分生組織的對比中發現，根的原始細胞類似於芽分生組織的幹細胞， 而QC類似於表達WUS的OC細胞。
在調控擬南芥根生長發育的一些突變體及其基因的研究中，發現CLV類似的信 號傳導途徑也參與了根幹細胞的調控，以及其他一些突變體的分離鑑定，如其中WoW roo^/^)和scwecrow(^r)突變體都表現為根短，並且這兩個位點的突變都導致了根在表皮和內皮層之間少了一層細胞，SHR和SCR同時表達對於維持QC的特性是必須的。 另外，PLT基因對於根幹細胞生境的確立也是必須的。並且PLT和SHR/SCR在參與 調控根分生組織幹細胞的形成中是兩條並行的途徑，共同調控了從胚胎時期胚根到苗 期成熟根的分生組織的形成和發育。

發明內容
本發明的目的是提供一種植物根生長發育相關蛋白及其編碼基因與應用。 本發明所提供的植物根生長發育相關蛋白，名稱為ARD1，來源於擬南芥 (Arabidopsisthaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白質
(a) 由序列表中序列3的胺基酸殘基序列組成的蛋白質；
(b) 將序列表中序列3的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的 取代和/或缺失和/或添加且具有根生長發育調控功能的由(a)衍生的蛋白質。
其中，序列表中的序列3由500個胺基酸殘基組成。
上述植物根生長發育相關蛋白的編碼基因"/ D7 )也屬於本發明的保護範圍。 上述植物根生長發育相關蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一
1) 序列表中序列1的DNA序列；
2) 編碼序列表中序列3所示蛋白質序列的多核苷酸；
3) 在高嚴謹條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。 其中，序列表中序列1是由1925個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列1的5'端第
268-1770位核苷酸序列為編碼序列(ORF)，編碼具有序列表中序列3的胺基酸殘基 序列的蛋白質。
上述植物根生長發育相關蛋白的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一
1) 序列表中序列2的DNA序列；
2) 編碼序列表中序列3所示蛋白質序列的多核苷酸；
3) 在高嚴謹條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。 其中，序列表中序列2是由4881個核苷酸組成，自5'端第262-506位核苷酸為該
基因組基因的第一個外顯子，自5'端第507-748位核苷酸為該基因組基因的第一個內 含子，自5'端第749-820位核苷酸為該基因組基因的第二個外顯子，自5'端第821-916 位核苷酸為該基因組基因的第二個內含子，自5'端第917-1093位核苷酸為該基因組基 因的第三個外顯子，自5'端第1094-1178位核苷酸為該基因組基因的第三個內含子， 自5'端第1179-1248位核苷酸為該基因組基因的第四個外顯子，自5'端第1249-1541 位核苷酸為該基因組基因的第四個內含子，自5'端第1542-1829位核苷酸為該基因組
4基因的第五個外顯子，自5'端第1830-1937位核苷酸為該基因組基因的第五個內含子， 自5'端第1938-2078位核苷酸為該基因組基因的第六個個外顯子，自5端第2079-2157 位核苷酸為該基因組基因的第六個內含子，自5'端第2158-2260位核苷酸為該基因組 基因的第七個外顯子，自5'端第2261-2352位核苷酸為該基因組基因的第七個內含子， 自5'端第2353-2499位核苷酸為該基因組基因的第八個外顯子，自5'端第2500-3085位 核苷酸為該基因組基因的第八個內含子，自5'端第3086-3132位核苷酸為該基因組基 因的第九個外顯子，自5'端第3133-3219位核苷酸為該基因組基因的第九個內含子，自 5'端第3220-3273位核苷酸為該基因組基因的第十個外顯子，自5'端第3274-3345位核 苷酸為該基因組基因的第十個內含子，自5'端第3346-3464位核苷酸為該基因組基因 的第十一個外顯子，自5'端第3465-3552位核苷酸為該基因組基因的第十一個內含子， 自5'端第3553-3688位核苷酸為該基因組基因的第十二個外顯子，自5'端第3689-3766 位核苷酸為該基因組基因的第十二個內含子，自5'端第3767-4092位核苷酸為該基因 組基因的第十三個外顯子。
上述高嚴謹條件可為在0.1xSSPE(或O.lxSSC)， 0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下 雜交並洗膜。
含有上述植物根生長發育相關蛋白的編碼基因的表達載體、轉基因細胞系及 宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
利用植物表達載體，將本發明的植物根生長發育相關蛋白的編碼基因C4/ D/)導 入植物細胞或組織，可得到根發育增強的植物。
使用乂7 D7構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型 啟動子或誘導型啟動子。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所 用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的選擇性標記基因(GUS基因、螢 光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素標記物、卡那黴素標記物等)。 從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
攜帶有本發明^^^的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載 體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞 或組織，並將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是水稻、玉米、 小麥等單子葉植物，也可以是番茄、擬南芥、菸草、棉花等雙子葉植物。
本發明的植物根生長發育相關蛋白及其編碼基因可促進植物根的生長發育，對促 進植物根系生長，提高植物產量，在植物(特別是農作物)品種的改良中發揮巨大作 用。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為正常野生型植物與"M7突變體根的生長情況
圖2為Ji Z)/基因的圖位克隆示意圖
圖3為轉^ Z)/基因的突變體的生長狀況照片
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物合成及測序工作均 由上海生工生物工程有限公司完成。
實施例1、本發明的來源於擬南芥的與根發育相關基因的獲得及其功能驗
證
一、 擬南芥J^/突變體的獲得
通過對一個擬南芥(Col-0) T-DNA突變體庫的篩選，得到一個在根生長發育缺 陷的突變體，命名為J/ D/，該突變體的表型主要為根生長緩慢，根系不發達，主 根變短，主根僅為野生型的1/3左右，如圖1所示。圖1中WT為野生型擬南芥(Col-0 生態型)；^ D7為上述篩選得到的v4/ D7突變體。
二、 用圖位克隆法獲得來自突變體」及D/的與根發育相關基因Ji D7 採用圖位克隆法從上述獲得的JW)/突變體中分離與根發育相關基因J^/，具
體方法包括以下步驟
1) 以v4i D7突變體(Col-0背景)與Ler(擬南芥的另外一個生態型，購自Arabidopsis Biological Resource Center)雜交所獲得的F2代分離群體為材料，從中鑑定到了2100個 具有與上述Ji DJ突變體表型相同的個體進行遺傳學分析，把^i D/基因定位到擬南 芥第1號染色體的一個BAC克隆(T6D22)上，與標記F21M12的物理距離約為550Kb， 如圖2所示。圖2中，箭頭所示是附近相鄰的BAC克隆。
2) 利用圖位克隆的方法進一步縮小目的基因的範圍，最後，根據公布的擬南芥 基因組序列，利用PCR方法擴增目的基因範圍的候選基因，經過序列比對。最終確定 突變位點所在的基因。該基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，將其命名為^ D/。 序列表中序列2是由4881個核苷酸組成，自5'端第262-506位核苷酸為該基因組基因 的第一個外顯子，自5'端第507-748位核苷酸為該基因組基因的第一個內含子，自5' 端第749-820位核苷酸為該基因組基因的第二個外顯子，自5'端第821-916位核苷酸 為該基因組基因的第二個內含子，自5'端第917-1093位核苷酸為該基因組基因的第三 個外顯子，自5'端第1094-1178位核苷酸為該基因組基因的第三個內含子，自5'端第 1179-1248位核苷酸為該基因組基因的第四個外顯子，自5'端第1249-1541位核苷酸為 該基因組基因的第四個內含子，自5'端第1542-1829位核苷酸為該基因組基因的第五個外顯子，自5'端第1830-1937位核苷酸為該基因組基因的第五個內含子，自5'端第 1938-2078位核苷酸為該基因組基因的第六個個外顯子，自5'端第2079-2157位核苷酸 為該基因組基因的第六個內含子，自5'端第2158-2260位核苷酸為該基因組基因的第 七個外顯子，自5'端第2261-2352位核苷酸為該基因組基因的第七個內含子，自5'端第 2353-2499位核苷酸為該基因組基因的第八個外顯子，自5'端第2500-3085位核苷酸為 該基因組基因的第八個內含子，自5'端第3086-3132位核苷酸為該基因組基因的第九 個外顯子，自5'端第3133-3219位核苷酸為該基因組基因的第九個內含子，自5'端第 3220-3273位核苷酸為該基因組基因的第十個外顯子，自5'端第3274-3345位核苷酸為 該基因組基因的第十個內含子，自5'端第3346-3464位核苷酸為該基因組基因的第十 一個外顯子，自5'端第3465-3552位核苷酸為該基因組基因的第十一個內含子，自5' 端第3553-3688位核苷酸為該基因組基因的第十二個外顯子，自5'端第3689-3766位核 苷酸為該基因組基因的第十二個內含子，自5'端第3767-4092位核苷酸為該基因組基 因的第十三個外顯子。其cDNA序列為序列表中序列1的核苷酸序列，自序列表中序 列1的5'端第268-1770位核苷酸序列為編碼序列(ORF)，編碼具有序列表中序列3 的胺基酸殘基序列的蛋白質(ARD1)。
三、本發明的來源於擬南芥的與根發育相關基因^i i)7的轉基因功能驗證 根據步驟一獲得的ARD1的基因組序列及載體pCAMBIA1300，將ARD1基因連 接入載體pCAMBIA1300多克隆位點的Smal禾B Sal I酶切位點之間得到的重組載體， 設計擴增乂肌/序列的引物，引物序列如下所示
弓l物1 (上遊引物)5，-CCCGGGGTGAAGAACAAAATATTACA-3，(劃線部分核苷酸為S脂 I識別位點)；
弓l物2 (下遊引物)5，-GGTACCATGGCAAAATAACCTTGAGG-3，(劃線部分核苷酸為 A:戶I識別位點)。
提取擬南芥品種Col-0的基因組DNA作為模板，在引物1和引物2的引導下進行 PCR擴增，反應結束後對PCR產物進行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收並純化4881bp 的DNA片段，即」^/基因組片段，經測序表明該片段具有序列表中序列2的核苷 酸序列。
將上述獲得的j/^7基因片段用限制性內切酶^"和A^wl進行雙酶切後與經相 同酶酶切的載體pCAMBIA1300連接，將連接產物進行測序，將經測序表明正確的重 組載體命名為pCAMBIA1300- ARD1 。
將卩0八]^81八1300-ARD1在根癌農桿菌的介導下轉化ARD1突變體 SALK_009847 (購自Arabid叩sis Biological Resource Center, ABRC)，然後用選擇性標
7記基因潮黴素(在含50mg/L潮黴素MS培養基)進行抗性篩選，篩選得到在含50mg/L 潮黴素的培養基上能夠生長的轉？0八,仏1300-ARDl植株。用上述引物1和引物2 對抗性篩選得到的轉pCAMBIA1300- ARDl植株進行PCR分子鑑定，得到PCR鑑定 表明正確的轉入^ Z)/基因片段的轉pCAMBIA1300- ARDl植株。
對PCR鑑定表明正確的轉入乂i DJ基因片段的轉？。八^181八1300-ARDl植株， 進表型分析，即將ARDl突變體SALK_009847 (購自Arabidopsis Biological Resource Center)(圖3中的ARD1)和PCR鑑定表明正確的轉入^ D/基因片段的轉 pCAMBIA1300- ARDl植株(圖3中的pCAMBIA1300- ARDl)同時播種在MS培養 基上，4X:黑暗培養3天後，轉移到22攝氏度個光照培養8天，如圖3所示，結果表 明，轉？0八1^1八1300-ARDl植株比未轉基因的ARDl突變體的生長狀況好，表明 v4i D/基因的突變的確影響植物根系的生長發育。序列表
〈160>3
1
<211〉1925
〈212〉DNA
<213〉擬南芥(AraZ 油萍'5" t)Wj.a朋)
<400〉1
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ccctc犯ggttattttgccat4881
〈210〉3
<211〉500
〈212>PRT
〈213>擬南芥(ylraZ^zV。/ 57.51 t/Wi朋s) <400〉3
Met Gin Met Asn Ser 1 5 Ser Ser Val lie Gly 20
Thr Leu Val Lys Lys 35
Val Asn Lys Asp Lys 50
Val Pro Arg Thr Gly 65
Leu Tyr Asp Ser Ser 85
Phe Asn Pro Arg Lys 100
Tyr Ser Leu Met Ala 115
lie Val Arg Asp Pro 130
Val Glu Val Ala Ala 145
Val
Ser
Trp
Arg
Gly
70
Glu
Glu
Lys
lie
150
Trp
Phe
Ala
Ser
55
Arg
Glu
Lys
Leu
Ala 135 Phe
Lys
Ala
Asp
40
Leu
Thr
Cys
Cys
Pro 120 Arg
Leu
Leu
Glu 25 Ser
Lys
Tyr
Pro
Lys 105 Arg
Val
Val
Ser Leu Gly Leu 10
Leu Asp Phe Gly
Ser Ser Ser Arg 45
Asp Leu Leu Phe 60
Phe His Cys Phe 75
Arg Ser Tyr Asp 90
Leu Leu Ala Thr
Glu Arg Thr Ser 125
Leu Ser Thr Tyr 140
His Pro Asn Leu 155
Leu Leu Leu 15
His Cys Glu 30
Glu Glu His
Phe Leu His
Leu Arg Lys 80
Lys Leu His 95
His Asp Asp 110
Val Met Thr
Glu Phe Ser
Thr Ser Ala 160
12Ser Arg
Asp lie
Phe Ala
Asp Asp 210 Tyr Leu 225
Phe Gin
Glu Val
Leu Gin
Thr Glu 290 Ser Gin 305
Lys Ala
Asp Lys
Ala Glu
Tyr Glu 370 Val Asn 385
Arg Thr
Asn Leu
Glu His
lie Val 450 Glu Glu
Met
Trp
Arg 195 Asn
Asp
lie
Arg
Val 275 Glu
Val
Leu
Ser
Ala 355 Gly
Ser
Arg
Asp
Glu 435 Asp
Lys
Ser
Pro 180 Arg
Pro
Ala
Ala
His 260 Ala
His
Leu
Lys
Asn 340 Lys
Cys
Leu
Val
Val 420 Leu
Leu
Leu
Ser 165 Trp
Asp
Tyr
Pro
Gly 245 Cys
Lys
Arg
Ser
Ser 325 lie
Ser
lie
Lys
Pro 405 Glu
Val
Pro
Trp
Arg
Lys
Ala
Asp
Thr 230 Leu
Val
Arg
Glu
Gin 310 Glu
Gin
Gly
Thr
Arg 390 Lys
Leu
Ser
Ser
Lys
lie
Tyr
Arg
Met 215 Ala
Thr
Gin
Arg
Ser 295 Val
Ala
Asn
Asn
His 375 lie
Glu
Tyr
Asn
Glu 455 Phe
Arg
Leu
Lys 200 Glu
His
Asn
Lys
Leu 280 Ala
Val
Ser
Gly
Met 360 Leu
Thr
Val
Lys
Lys 440 Leu
Val
Lys
Val 185 Leu
Glu
Asp
Asn
Phe 265 Asp
Ser
Pro
Val
Thr 345 Thr
Arg
Pro
lie
Tyr 425 Leu
Lys
Pro
Ser 170 Pro
Lys
Met
lie
Ser 250 Lys
Ser
Leu
Ser
Thr 330 Ser
Val
Lys
Ala
Gin 410 Ala
lie
Ser
Val
Asn
Trp
Glu
Leu
lie 235 His
Ser
Met
Phe
Asn 315 lie
Glu
Lys
Ser
Asn 395 Gin
Lys
Ser
Val
Ala
Val
Met
Val
Met 220 His
Leu
Leu
Leu
Ala 300 Ala
Ser
Val
Thr
Gin 380 Phe
lie
Val
Ser
Leu 460 Leu
lie
Arg
Val 205 Pro
Asn
Ser
Gly
Tyr 285 Asn
Thr
Glu
Thr
Leu 365 Gly
Thr
Lys
lie
Ser 445 Gly
Met
Ser
Glu 190 lie
Leu
Gly
Glu
Glu 270 Val
Val
Ala
Thr
Leu 350 Met
Thr
Arg
Ser
Phe 430 Lys
Glu
Leu
Thr Leu 175
Asp Leu
lie Glu
His Lys
Ala Thr 240 Ala His 255
Ser Val
Gly Leu
Val Gly
Lys lie 320 Gly Ser 335
Asn Lys
Glu Val
Arg Arg
Gly Thr 400 Leu Asn 415
Ala Lys Arg Ser Met Gly Leu Leu465 470 475 480
lie Val Leu Phe Phe Leu Phe Val Asn Ala Lys Arg Arg Arg Thr Ser 485 490 495
Lys Val Lys lie 500
權利要求
1、一種植物根生長發育相關蛋白，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №.3的胺基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID №.3胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物根生長發育相關蛋白活性的蛋白質。
2、 權利要求l所述的植物根生長發育相關蛋白的編碼基因，具有自序列表中序 列2的5'端第268-1770位核苷酸序列。
3、 根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述植物根生長發育相關蛋 白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQIDW2: 2的核苷酸序列；2) 編碼序列表中SEQIDW: 3蛋白質序列的多核苷酸；3) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDJV2: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4、 根據權利要求3所述的編碼基因，其特徵在於所述植物根生長發育相關蛋 白的基因組基因具有下述核苷酸序列之一-1) 序列表中SEQID地l的核苷酸序列；2) 編碼序列表中SEQIDW2: 3蛋白質序列的多核苷酸；3) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDW2: 1限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。
5、 含有權利要求2-4中任意一項所述的植物根生長發育相關蛋白編碼基因的重組 表達載體。
6、 含有權利要求2-4中任意一項所述的植物根生長發育相關蛋白編碼基因的轉基 因細胞系。
7、 含有權利要求2-4中任意一項所述的植物根生長發育相關蛋白編碼基因的宿主菌。
8、 權利要求2-4中任意一項所述的植物根生長發育相關蛋白編碼基因在促進植物 根生長發育中的應用。
9、 根據權利要求8所述的應用，其特徵在於所述植物為擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種植物根生長發育相關蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №.3的胺基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID №.3胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物根生長發育相關蛋白活性的蛋白質。本發明的植物根生長發育相關蛋白及其編碼基因可促進植物根的生長發育，對促進植物根系生長，提高植物產量，在植物(特別是農作物)品種的改良中發揮巨大作用。
文檔編號C12N1/19GK101560251SQ20081010408
公開日2009年10月21日 申請日期2008年4月15日 優先權日2008年4月15日
發明者吳曉燕, 孫加強, 李傳友, 李常保, 蔣紅玲, 韋麗榮 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所