細胞片疊層化物的製造方法、由該方法得到的具有血管網的細胞片疊層化物及其利用方法
2023-05-29 05:42:41
專利名稱：細胞片疊層化物的製造方法、由該方法得到的具有血管網的細胞片疊層化物及其利用方法
技術領域：
本發明涉及在醫學、生物、藥物發現、藥學等領域有用的細胞片疊層化物的製造方法、由該方法得到的具有血管網的細胞片疊層化物及其利用方法。本申請是主張2010年9月14日提出的日本申請(日本特願2010-225201)為基礎的優先權的申請。
背景技術：
今天，動物細胞培養技術顯著進步，以動物細胞為對象的研究開發也廣泛在各種領域被實施。成為對象的動物細胞的使用方法也不僅是開發當初的將細胞本身製品化、將其產生物製品化，現在通過分析細胞和/或其細胞表層蛋白質來設計有效的藥物、將患者本人的細胞在活體外再生、或者提高其功能然後送回活體內進行治療等方式也在逐漸被實施。現在，動物細胞的培養技術、以及評價、分析、利用的技術是研究者關注的一個領域。但是，包含人細胞在內，動物細胞大多是附著依賴性的。即，要在活體外培養動物細胞時，需要使它們一次性附著於基材表面。並且，不能將培養的細胞剝離成一個一個，還需要保持在該基材表面上培養的形態使其剝離。特別對於使患者本人的細胞在活體外再生的技術而言，近年來，將治療困難的臟器替換成他人的臟器的臟器移植已經一般化。成為對象的臟器也實際上多樣化為皮膚、角膜、腎臟、肝臟、心臟等，另外，術後恢復也特別良好，作為一種醫療技術已經逐漸被確立。作為一例列舉角膜移植，約50年前日本也設立眼庫開始了移植活動。然而，據說供體數尚且少，僅國內每年需要角膜移植的患者約由2萬人，與此相對，實際進行移植治療的患者僅為約1/10的2000人左右。雖然有角膜移植這樣基本確立的技術，但由於供體不足這樣的問題，現狀是要求其他的醫療技術。基於這樣的背景，開發了要將患者本人的正常細胞培養至所需大小將其移植的技術。基於這樣的背景，日本特開平02-211865號公報(專利文獻I)顯示了在用對水的上限或者下限臨界溶解溫度為O 80°C的聚合物包覆了基材表面而得的細胞培養支撐體上，將細胞在上限臨界溶解溫度以下或下限臨界溶解溫度以上培養，然後調整到上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，從而無酶處理而剝離培養細胞的新的細胞培養法。另外，日本特開平05-192138號公報(專利文獻2)記載了，通過利用該溫度應答性細胞培養基材將皮膚細胞在上限臨界溶解溫度以下或者下限臨界溶解溫度以上培養，然後調整至上限臨界溶解溫度以上或者下限臨界溶解溫度以下，從而以低損傷剝離培養皮膚細胞。通過利用溫度應答性細胞培養基材，可以對現有的培養技術謀求各種新的展開。進而，日本再表02-008387號公報(專利文獻3)中發現，在用溫度應答性聚合物包覆了基材表面的細胞培養支撐體上培養心肌組織的細胞，得到心肌樣細胞片，然後，使培養基溫度為上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，使培養的多層化細胞片粘附於聚合物膜，直接與聚合物膜一起剝離，並且用規定的方法使其3維結構化，從而可以構建結構缺陷少、作為體外(in vitro)的心肌樣組織具有數種功能的細胞片、 和3維結構。然而,在上述的現有技術中，心肌樣細胞片的疊層化不能無限進行，3層左右為極限，強烈要求能夠簡便地多次疊層化的技術。為了解決如上問題，FASEB.J.，20 (6)，708-710 (2006)(非專利文獻I)中嘗試了在活體內將細胞片疊層化，顯示得到了厚的心肌片疊層化物。其中，已知為了獲得有厚度的細胞片疊層化物，必須向被疊層化的各細胞或者各細胞片供給營養和/或氧，但在FASEB.J.，20 (6)，708-710 (2006)(非專利文獻I)的方法中，需要反覆向活體內移植細胞片，其必須相應於其次數地將移植部位開口，是被移植側的負擔大的方法，強烈要求解決該課題的、能夠簡便地多次疊層化的技術。現有技術文獻專利文獻專利文獻1:日本特開平02-211865號公報專利文獻2:日本特開平05-192138號公報專利文獻3:日本再表02-008387號公報非專利文獻非專利文獻1:FASEB.J.，20 (6)，708-710 (2006)
發明內容
發明要解決的課題本發明的目的是解決如上所述的關於細胞片的疊層化的問題。即，本發明提供基於與現有技術完全不同想法創造的新的細胞片疊層化物的製造方法、由該方法得到的具有血管網的細胞片疊層化物及其利用方法。用於解決課題的方法本發明者們為了解決上述課題而從各種角度實施研究而進行了研究開發。其結果發現，通過在凝膠內部設置用於灌注培養基的流路，誘導血管內皮細胞，製作在凝膠內構建了血管網的血管床，向該血管床上疊層細胞片，可以在細胞片內構建血管網，從而簡便地將細胞片較厚地疊層化。本發明基於該見解而完成了本發明。S卩，本發明提供一種細胞片疊層化物的製造方法灌注，其特徵在於，通過製作從設置在凝膠內部的用於灌注培養基的流路向表面構建了血管網的血管床，向該血管床上疊層細胞片，從而在細胞片內構建血管網。進而，本發明提供由該方法得到的細胞片疊層化物。進而，本發明提供利用該細胞片疊層化物的方法。認為本發明是使用由利用血管床而能夠在活體外製作有厚度的細胞片疊層化物這樣的在世界上沒有類似的新的想法而獲得的細胞結構物而首次實現的極為重要的發明。發明的效果根據本發明所示的製造方法，只要在細胞片內構建血管網，將該細胞片疊層化，就可以簡便地製作有厚度的細胞片疊層化物。這樣的有厚度的細胞片疊層化物可期待作為活體內組織樣的物質，在各種組織的再生醫療有用。
圖1是顯示實施例1的血管床製作時的步驟的概要的圖。
圖2是顯示實施例1的血管床製作時的概要的圖。圖3是顯示實施例1的血管床製作時的概要的圖。圖4是顯示向實施例1的血管床灌注培養基的裝置的概要的圖。圖5是顯示血管內皮細胞向實施例1的血管床的流路遊走的狀態的圖。㈧顯示細胞片疊層化物的剖面圖。用虛線表示的區域顯示膠原凝膠中的流路，箭頭顯示血管內皮細胞從細胞片遊走而形成的毛細血管網。(B)顯示從流路注入丙烯酸系樹脂，固化後除去凝膠和細胞片。圖6是顯示使實施例1的細胞片疊層化時的厚度的圖。(A)是顯示I次操作而疊層化的細胞片的片數(橫軸)、和灌注培養後的細胞片的厚度(縱軸)的圖。(B)是顯示將3片細胞片在血管床上疊層化，灌注培養一定時間後，再次將3片細胞片疊層化，重複該操作時的細胞片的厚度的圖。橫軸顯示疊層化的細胞片的片數、次數與厚度的關係。圖7是顯示實施例1的細胞片疊層化次數與厚度的關係的圖。圖8是顯示在實施例2的細胞片疊層化物的上下具有流路的血管床的概要的圖。圖9是顯示用實施例2的在細胞片疊層化物的上下具有流路的血管床製作細胞片疊層化物時的概要的圖。(A)是顯示從流路流出紅血球的圖，(B)是顯示用在細胞片疊層化物的上下具有流路的血管床製作的細胞片疊層化物的剖面圖的圖。圖10是顯示用實施例1和實施例2的血管床製作細胞片疊層化物時的概要的圖。
具體實施方式
`本發明的目的是簡便地製作有厚度的細胞片疊層化物。為此，優選如上所述在細胞片疊層化物中構建血管網。已知在本發明中，通過在凝膠內部設置流路，向該流路灌注培養基，從而簡便地在凝膠內的流路與表面之間構建血管網。作為其一種技術，可列舉例如，如果向凝膠表面粘貼包含血管內皮細胞的細胞片，向凝膠內的流路灌注培養基，則細胞片內的血管內皮細胞在凝膠內向著流路排列，作為結果而可以在凝膠內構建血管網。作為其他技術，可列舉:如果在灌注於凝膠內的流路中的培養基中懸浮血管內皮細胞，則可在凝膠內的流路與表面之間構建血管網。在凝膠內部設置流路時，只要做出未填充凝膠的區域即可，對為此所利用的物質不特別限定，例如，不鏽鋼絲、矽樹脂線、金屬、高分子化合物等，不特別限定。血管床是在活體組織、臟器中可見的結構，是指合併了毛細血管與其周圍的組織的結構。血管床介由在血管床內無數延伸的毛細血管的薄壁，實現交換活體組織內的氧、葡萄糖、其他營養素的功能。像二氧化碳這樣的老廢物向血管床的毛細血管內滲出。在活體組織中組織液相對保持一定是因為存在通過毛細血管的物質交換。本發明中，在活體外人工地製作、利用在細胞片內有效地進行交換氧、葡萄糖、其他營養素的功能的血管床。製作具有在凝膠內部灌注培養基等的流路的血管床時，可以在凝膠中混合細胞來製作。此時對於與凝膠混合的細胞種、細胞數、比例等沒有任何限定，根據移植的活體的組織、臟器、部位、用途等來適宜選擇或調整即可。例如，在以心肌組織的再生、或者評價心肌功能的方法為目的的情況下，作為使用的細胞，可列舉心肌細胞、成心肌細胞、成肌細胞、間充質系幹細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、成纖維細胞、來自骨髓的細胞、來自脂肪的細胞的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。在以肝組織的再生、模擬肝組織的人工肝臟的製作、或者評價肝組織的功能的方法等為目的的情況下，例如，作為使用的細胞，可列舉肝實質細胞、竇內皮細胞、庫普弗細胞、星狀細胞(Kupffer cell)、陷窩細胞(pit cell)、膽管上皮細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、成纖維細胞、來自骨髓的細胞、來自脂肪的細胞、間充質系幹細胞的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。在以腎組織的再生、模擬腎組織的人工腎臟的製作、或者評價腎功能的方法為目的的情況下，例如，作為使用的細胞，可列舉腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁層上皮細胞、足細胞、繫膜細胞、平滑肌細胞、尿細管細胞、中間細胞、腎小球細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、成纖維細胞、來自骨髓的細胞、來自脂肪的細胞、間充質系幹細胞的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。在以腎上腺組織的再生、模擬腎上腺的人工腎上腺的製作、或者評價腎上腺功能的方法為目的的情況下，例如，作為使用的細胞，可列舉腎上腺髓質細胞、腎上腺皮質細胞、球狀帶細胞、束狀帶細胞、網狀帶細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、成纖維細胞、來自骨髓的細胞、來自脂肪的細胞、間充質系幹細胞的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。在以皮膚的再生、或者評價皮膚功能的方法為目的的情況下，例如，作為使用的細胞，可列舉表皮角質形成細胞、黑素細胞、豎毛肌細胞、毛囊細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、成纖維細胞、來自骨髓的細胞、來自脂肪的細胞、間充質系幹細胞的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。在以黏膜組織的再生、或者評價黏膜組織的功能的方法為目的的情況下，例如，作為使用的細胞，使用從構成黏膜的組織採取的細胞。作為黏膜的種類，可列舉頰黏膜、胃黏膜、腸管黏膜、嗅上皮、口腔黏膜、子宮黏膜等。可列舉從黏膜組織採取的細胞中任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。對本發明中使用的凝膠不特別限定，在以將所得的細胞片疊層化物向活體內用於移植治療的情況下，優選由生物降解性聚合物形成的凝膠。另外，這種情況下，生物降解性聚合物部在活體內消失，從而本發明的細胞片疊層化物與活體通過血管而連接起來。對這樣的生物降解性聚合物的種類不特別限定，可列舉膠原、纖維蛋白、凝膠、多糖類、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、殼多糖、脫乙醯殼多糖等的單獨物質、或者2種以上的混合物。可列舉等。本發明利用這樣所得的具 有血管網的凝膠，將其作為血管床並向在其上生著的細胞片構建血管網。即，本發明提供即使利用凝膠這樣的人工物也能在細胞片內構建血管網的技術。此時，在血管床內循環的為培養基、血液、血清等，不特別限定，作為操作簡便的物質可列舉培養基。對於該培養基的種類不特別限定，優選適合構成在血管床上培養的細胞片的細胞的培養基。例如，如果將由心肌細胞形成的細胞片在血管床上疊層化，則優選培養心肌細胞的M199培養基等。對本發明的細胞片中使用的細胞的種類不特別限定，只要使用所得的細胞片疊層化物，並使用來自要移植的部位的細胞、或要評價的臟器或者來自組織的細胞即可。例如，在以心肌組織的再生、或者評價心肌功能的方法為目的的情況下，作為使用的細胞，可列舉心肌細胞、成心肌細胞、成肌細胞、間充質系幹細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、成纖維細胞、來自骨髓的細胞、來自脂肪的細胞的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。在以肝組織的再生、模擬肝組織的人工肝臟的製作、或者評價肝組織的功能的方法等為目的的情況下，例如，作為使用的細胞，可列舉肝實質細胞、竇內皮細胞、庫普弗細胞、星狀細胞、陷窩細胞、膽管上皮細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、成纖維細胞、來自骨髓的細胞、來自脂肪的細胞、間充質系幹細胞的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。在以腎組織的再生、模擬腎組織的人工腎臟的製作、或者評價腎功能的方法為目的的情況下，例如，作為使用的細胞，可列舉腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁層上皮細胞、足細胞、繫膜細胞、平滑肌細胞、尿細管細胞、中間細胞、腎小球細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、成纖維細胞、來自骨髓的細胞、來自脂肪的細胞、間充質系幹細胞的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。在以腎上腺組織的再生、模擬腎上腺的人工腎上腺的製作、或者評價腎上腺功能的方法為目的的情況下，例如，作為使用的細胞，可列舉腎上腺髓質細胞、腎上腺皮質細胞、球狀帶細胞、束狀帶細胞、網狀帶細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、成纖維細胞、來自骨髓的細胞、來自脂肪的細胞、間充質系幹細胞的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。在以皮膚的再生、或者評價皮膚功能的方法為目的的情況下，例如，作為使用的細胞，可列舉表皮角質形成細胞、黑素細胞、豎毛肌細胞、毛囊細胞、血管內皮細胞、血管內皮前體細胞、成纖維細胞、來自骨髓的細胞、來自脂肪的細胞、間充質系幹細胞的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。在以黏膜組織的再生、或者評價黏膜組織的功能的方法為目的的情況下，例如，作為使用的細胞，使用從構成黏膜的組織採取的細胞即可。作為黏膜的種類，可列舉頰黏膜、胃黏膜、腸管黏膜、嗅上皮、口腔黏膜、子宮黏膜等。可列舉從黏膜組織採取的細胞中的任I種、或者2種以上的細胞混合而成的混合物等，對於其種類沒有任何限制。對於上述的細胞的含有比率不特別限定。此時，優選細胞片內血管內皮細胞、血管內皮前體細胞等一被混合，就在細胞片內高效地進行血管網的構建。本發明中使用的細胞可列舉從活體組織直接採取的細胞、直接採取並用培養系等使其分化後的細胞、或者細胞株，對其種類沒有任何限制。對這些的細胞的來源不特別限制，可列舉例如，人、或者大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、貓、綿羊、豬、山羊、猴、黑猩猩或它們的免疫缺陷動物等，在將本發明的細胞片疊層化物用於人的治療的情況下，優選使用來自人、豬、猴、黑猩猩的細胞。對本發明中所利用的細胞不特別限定，例如可以是將細胞通過試劑、蛋白質、基因等的至少I種以上方法進行螢光染色和/或色素染色而得的細胞。在利用導入了報告基因的細胞時，只要檢測由報告基因表達而形成的報告蛋白產生的螢光、或報告蛋白與特異性底物反應時放出的螢光，就可以知道細胞片或細胞片疊層體的活性。對利用的報告基因、或報告蛋白質不特別限定，可列舉例如，綠色螢光蛋白質(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、DsReD, β -葡糖醛酸糖苷酶、LacZ、力工於''、螢光素酶、鹼性磷酸酶等。向細胞導入基因的方法只要按照常規即可，不特別限定，可列舉例如，脂質體轉染法、病毒載體法、磷酸鈣法、電穿孔法、DEAE葡聚糖法、微注射法等。另外，可以利用這些基因導入法，也可以利用來自報告基因已經被導入宿主基因組內的基因導入動物(轉基因動物)的細胞。對於調節報告基因的表達的啟動子序列不特別限定，根據報告 基因表達的檢測目的適宜選擇即可。本發明中的細胞片可以如下得到的:在表面包覆了水合力在O 80°C的溫度範圍變化的聚合物的細胞培養支撐體上，在聚合物的水合力弱的溫度域培養細胞，然後，將培養基變化至聚合物的水合力強的狀態的溫度，從而將培養的細胞剝離成片狀。此時，細胞在表面包覆了水合力在O 80°C的溫度範圍變化的聚合物的細胞培養支撐體上，在聚合物的水合力弱的溫度域被培養。該溫度通常優選作為培養細胞的溫度的37°C。本發明中使用的溫度應答性高分子可以使均聚物、共聚物的任一者。作為這樣的高分子，可列舉例如，日本特開平2-211865號公報所記載的聚合物。具體例如，可通過以下單體的均聚或共聚來獲得。作為可使用的單體，可列舉例如，(甲基)丙烯醯胺化合物、N-(或者N，N-二)烷基取代(甲基)丙烯醯胺衍生物、或乙烯基醚衍生物，在共聚物的情況下，可以使用其中任意2種以上。進而，還可以使用與除了上述單體以外的單體類的共聚物、聚合物彼此的接枝或共聚、或聚合物、共聚物的混合物。另外，在不損害聚合物本來的性質的範圍內還可以進行交聯。此時，由於被培養、剝離的是細胞，因而分離在5°C 50°C的範圍進行，因此作為溫度應答性聚合物，可列舉聚-N-正丙基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度21°C )、聚-N-正丙基甲基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度27V )、聚-N-異丙基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度32°C )、聚-N-異丙基甲基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度430C )、聚-N-環丙基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度45°C )、聚-N-乙氧基乙基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度約35V )、聚-N-乙氧基乙基甲基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度約45°C )、聚-N-四氫糠基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度約280C )、聚-N-四氫糠基甲基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度約35°C )、聚-N，N-乙基甲基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度56°C )、聚-N，N- 二乙基丙烯醯胺(均聚體的下限臨界溶解溫度32°C )等。作為用於本發明中使用的共聚的單體，可列舉聚丙烯醯胺、聚-N，N-二乙基丙烯醯胺、聚-N，N-二甲基丙烯醯胺、聚氧化乙烯、聚丙烯酸及其鹽、聚甲基丙烯酸羥基乙酯、聚丙烯酸羥基乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、纖維素、羧甲基纖維素等含水聚合物等，但不特別限制。對本發明中使用的、向上述各聚合物的基材表面的包覆方法不特別限制，可以通過例如，將基材和上述單體或聚合物通過電子線照射(EB)、Y射線照射、紫外線照射、等離子體處理、電暈處理、有機聚合反應的任一方法，或者塗布、混煉等物理性吸附等來進行。向培養基材表面的溫度應答性聚合物的包覆`量可以為1.1 2.3yg/cm2的範圍，優選為1.4 1.9 μ g/cm2,進一步優選為1.5 1.8 μ g/cm2。當包覆量少於1.1 μ g/cm2時，即使給予刺激也難以剝離該聚合物上的細胞，操作效率顯著變差，因而不優選。相反如果為2.3 μ g/cm2以上，則細胞難以附著到該區域，使細胞充分附著變得困難。這種情況下，如果在溫度應答性聚合物包覆層之上進一步包覆細胞粘附性蛋白質，則基材表面的溫度應答性聚合物包覆量也可以為2.3 μ g/cm2以上，此時的溫度應答性聚合物的包覆量可以為
9.0 μ g/cm2以下,優選為8.0 μ g/cm2以下,最優選7.0 μ g/cm2以下。如果溫度應答性聚合物的包覆量為9.0 μ g/cm2以上，則即使在溫度應答性聚合物包覆層之上進一步包覆細胞粘附性蛋白質，細胞也難以附著，因而不優選。對這樣的細胞粘附性蛋白質的種類沒有任何限定，可列舉例如，膠原、層粘連蛋白、層粘連蛋白5、纖連蛋白、基質凝膠(Matrigel)等的單獨、或者2種以上的混合物。另外，這些細胞粘附性蛋白質的包覆方法按照常規方法即可，通常採取將細胞粘附性蛋白質的水溶液塗布在基材表面，然後除去該水溶液淋洗的方法。本發明是利用溫度應答性培養皿儘可能利用細胞片本身的技術。因此，溫度應答性聚合物層上的細胞粘附性蛋白質的包覆量極度多是不優選的。溫度應答性聚合物的包覆量、以及細胞粘附性蛋白質的包覆量的測定按照常規方法即可，可列舉例如，使用FT-1R-ATR直接測量細胞附著部的方法、將預先標記化的聚合物用同樣的方法固定化而通過固定化於細胞附著部的標記化聚合物量來推測的方法等，可以使用任一方法。在本發明的方法中，培養時接種的細胞數根據使用細胞的動物種不同而不同，一般可以為0.4 X IO6 2.5 X IO6個/cm2，優選為0.5 X IO6 2.1 X IO6個/cm2，進一步優選為
0.6X106 1.7X106個/cm2。接種濃度為0.4 X IO6個/cm2以下時，一般細胞的增殖差，所得的細胞片的功能的表達程度惡化，在實施本發明的方面不優選。在本發明中，為了從溫度應答性基材剝離回收培養的細胞片，通過使培養的細胞附著的培養基材的溫度為培養基材上的包覆聚合物的上限臨界溶解溫度以上或者下限臨界溶解溫度以下，而可以使其剝離。此時，可以在培養基中進行，也可以在其他等滲液中進行，可以根據目的選擇。更快、更高效地剝離、回收細胞，可以單獨或合併使用輕敲、搖晃基材的方法、以及使用移液器攪拌培養基的方法等。除溫度以外的培養條件按照常規方法即可，不特別限制。例如，對於使用的培養基，可以是添加了公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培養基，另外，也可以是未添加這樣的血清的無血清培養基。作為溫度應答性聚合物，以聚(N-異丙基丙烯醯胺)為例來說明以上內容。聚(N-異丙基丙烯醯胺)作為在31°C具有下限臨界溶解溫度的聚合物被已知，在游離狀態下，在水中在31°C以上的溫度發生脫水合而聚合物鏈凝集、白濁。相反在31°C以下的溫度下聚合物鏈水合，變成溶於水的狀態。在本發明中，將該聚合物包覆、固定於培養皿等的基材表面。因此，在31°C以上的溫度下，基材表面的聚合物也同樣地脫水合，由於聚合物鏈包覆、固定於基材表面，因而基材表面顯示疏水性。相反，在31°C以下的溫度下，基材表面的聚合物水合，由於聚合物鏈被包覆、固定於基材表面，因而基材表面顯不親水性。這時的疏水表面是細胞能夠附著、增殖的適度的表面，另外，親水表面成為細胞不能附著程度的表面，培養中的細胞、或者細胞片也僅通過冷卻就可以使其剝離。作為被施加了包覆 的基材，可以使用通常細胞培養中使用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物，以及一般能夠賦予形態的物質，例如，可以使用除上述以外的聚合物化合物、陶瓷類等所有物質。對本發明中的培養基材的形狀不特別限制，可列舉例如在皿、多板、燒瓶、多孔膜上培養的細胞插入樣形態的基材、或者平膜狀的基材等。作為被施行包覆的基材，可以使用通常細胞培養中使用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物，以及一般能夠賦予形態的物質，例如，可以使用除上述以外的高分子化合物、陶瓷類等所有物質。本發明中的細胞片在培養時不會受到由以分散酶(Dispase)、胰蛋白酶等為代表的蛋白質分解酶所產生的損傷。因此，從基材被剝離的細胞片具有粘附性蛋白質，在使細胞剝離成片狀時以某種程度保持細胞-細胞間的橋粒結構。由此，可以在向血管床上裝載時良好地粘附，高效生著。一般關於作為蛋白質分解酶的分散酶，已知對於細胞-細胞間的橋粒結構可以以10 40%保持的狀態剝尚,但由於基本破壞了細胞-基材間的基底I旲樣蛋白質等，因而所得的細胞片強度弱。與此相對，本發明的細胞片是橋粒結構、基底膜樣蛋白質共同60%以上殘存的狀態，因而可以獲得如上所示的各種效果。對於製作本發明中的細胞片的疊層體的方法不特別限定，例如，可通過將培養細胞以片狀剝離，根據需要使用培養細胞移動夾具使培養細胞片彼此疊層化來獲得。此時，關於培養基的溫度，在包覆於培養基材表面的上述聚合物具有上限臨界溶解溫度的情況下，為該溫度以下，另外在上述聚合物具有下限臨界溶解溫度的情況下，只要為該溫度以上就不特別限制。但是，自不待言，培養細胞不增殖那樣的低溫域、或培養細胞死滅那樣的高溫域下培養是不合適的。除溫度以外的培養條件按照常規方法即可，不特別限制。例如，對於使用的培養基，可以是添加了公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培養基，另外，也可以是未添加這樣的血清的無血清培養基。另外，根據需要，還可以利用用於使細胞片移動的夾具。作為這樣的夾具，只要能夠捕捉剝離的細胞片，則對材質、形狀都沒有任何限定，作為這些材質，通常，聚1，1-二氟乙烯(PVDF)、矽、聚乙烯基醇、聚氨酯、纖維素及其衍生物、殼多糖、脫乙醯殼多糖、膠原、凝膠、纖維蛋白膠等材料製成膜狀、多孔膜狀、無紡布狀、機織布狀使其與細胞片接觸來使用。這樣通過本發明，可得到有厚度的細胞片疊層化物。未像本發明這樣構建血管網的情況下，為了疊層化的細胞片繼續生存，只能疊層3層左右。根據本發明，可以將細胞片4層以上疊層化。此時，對疊層化方法不特別限定，與一次疊層化細胞片相比，優選將3層以下的細胞片分多次疊層化。另外，其疊層化時間優選為與血管床聯繫的血管網被充分構建時。疊層化次數適宜根據細胞片疊層化物的使用目的即可，不特別過問，優選為5層以上，更優選為10層以上，進一步優選為15層以上。如果細胞片疊層化物的厚度增加，則可以顯著獲得本發明的效果，另外可以在被移植位置移植大量的細胞，因而優選。另外，在本發明中，通過使2片的細胞片疊層化物的頂面彼此重合，可以獲得在細胞片疊層化物的上面側和下面側雙方具有 流路的結構體，通過將該流路與活體側連接，還可以在高效細胞片疊層物內導入營養、氧。作為其他方法，可以通過在向血管床上疊層化的細胞片上，進一步疊層設有流路的凝膠，從而得到在細胞片疊層化物的上面和下面的雙方具有流路的結構體。製作的細胞片疊層化物具有在上面和下面與細胞片內部連接的血管樣結構的流路。通過該流路與活體側的血管連接，還可以在高效細胞片疊層物內導入營養、氧。在本發明中，對於該血管網的構建方法沒有任何限定。此時，對在凝膠中灌注的培養基的流速不特別限定，將凝膠內的流路不被破壞的程度的流速作為最大流速，灌注的培養基向凝膠內浸出，將培養基能夠到達凝膠表面的流速作為最小流速即可。作為其數值受流路的大小和/或凝膠的性質等因子較大影響，因此不能具體顯示。在向血管床上疊層化的細胞片上，進一步疊層設有流路的凝膠，從而製作在上面和下面的雙方具有流路的細胞片疊層化物時，還可以在細胞片疊層化物的上下的流路中改變培養基的流速而進行灌注。在細胞片疊層化物的上下的流路中改變培養基的流速而進行灌注培養的情況下，向著培養基更快地灌注的側的流路可見血管內皮細胞遊走的現象。因此，通過血管內皮細胞的遊走被促進，可得到具有成熟的毛細血管網的細胞片疊層化物。由於血管內皮細胞在細胞片疊層化物的上側和下側的兩方的流路中遊走，因而還可以是將灌注的培養基的流速每一定時間上下切換的方法。灌注培養細胞片疊層化物時的溫度、溼度、氣氛按照培養細胞時所利用的常規即可，無任何限定。此時，在血管床上疊層化的細胞片疊層化物可以採用從形成於血管床中的凝膠的流路灌注培養基而培養的方法，也可以採用使其浸潰在充滿於溫度、溼度、氣氛保持一定的密閉容器的培養基中浸潰而培養的方法，還可以是在浸潰於培養基的狀態下從形成於血管床中的凝膠中的流路灌注培養基而培養的方法。在浸潰於培養基中的狀態下，如果通過從形成於血管床中的凝膠中的流路灌注培養基方法培養，則血管床中的血管形成、和/或細胞片疊層體內的血管形成被促進，是優選的。如果一邊將溫度、溼度、氣氛保持一定的密閉容器加壓，一邊培養在血管床上疊層化的細胞片疊層化物，則培養基的溶存氧濃度上升，血管形成被促進，是優選的。加壓力根據容器的大小、培養的細胞片疊層化物的大小、培養基的量不同而受到各種因子較大影響，因而只要適宜最適化即可。在本發明中，可以為5mmHg以上,優選為IOmmHg以上,最優選為15mmHg 以上。作為促進細胞片疊層化物內、和細胞片疊層化物與血管床之間的毛細血管網的構建的方法，可列舉在灌注於血管床的培養基、或浸潰血管床全體的培養基、或者這兩方的培養基中添加促進血管新生的因子的方法。作為這裡添加的因子，只要是誘導血管新生的因子即可，不特別限定。例如，血管內皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、促血管生成素、轉化生長因子-β (TGF-β)、胎盤生長因子(PIGF)、ΜΜΡ、或上述因子的家族蛋白等。作為在培養基中添加的促進血管新生的因子，可以從上述中選擇一種，也可以二種以上組合。在培養基中添加的促進血管新生的因子的濃度受到細胞片所含的細胞的種類、數、細胞片的大小、血管床的種類以及各種因子較大影響，因而只要適宜最適化即可，這裡不能具體顯示。將細胞片疊層化物進行灌注培養時的溫度、溼度、氣氛按照培養細胞時所利用的常規即可，無任何限定。此時，細胞片疊層化物可以從在血管床中的凝膠中形成的流路灌注培養基來培養，也可以在滿足溫度、溼度、氣氛保持一定的密閉容器的培養容器中充滿培養基，在其中浸潰來培養。作為最優選的方法，是在滿足溫度、溼度、氣氛保持一定的密閉容器的培養容器中充滿培養基，在其中一邊浸潰，一邊從形成於血管床中的凝膠的流路灌注培養基來培養的方法。作為在本發明所製作的細胞片疊層化物上構建成熟的血管網的方法，可列舉將在凝膠的血管床上疊層化 的細胞片疊層體，從凝膠的血管床剝離，再移植到來自從包含人的動物的活體切除的活體組織片的具備血管床、皮瓣、或動脈和靜脈的人工血管床上的方法。來自活體組織片的具備血管床、皮瓣、或動脈和靜脈的人工血管床保有來自活體的動脈和靜脈，介由這些動脈和靜脈，本發明中得到的細胞片疊層化物通過毛細血管網連接，從而可獲得能夠移植到活體內的規定部位的細胞片疊層化物。此外，對製作來自活體的血管床的方法不特別限定，可列舉將分別連接著動脈和靜脈的活體組織片用電子手術刀等切開，製成活體組織片與動脈、靜脈各I根連接的狀態，維持該狀態，在活體內留置一周左右的方法。另外，人工血管床是指構建了毛細血管網，並將毛細血管網之間用凝膠和/或細胞填充而得的血管床樣結構物。對製作人工血管床的方法不特別限定，例如，在用無菌的容器內劃界的區域內，內包與活體內的動脈和靜脈吻合的動脈一靜脈環，在劃界後區域內填充凝膠，留置在活體內，從而構建毛細血管網的方法。對人工血管床所含的細胞不特別限定，可根據移植的部位、用途適宜選擇。可以將本發明所得的細胞片疊層化物移植到活體內的規定部位。對其方法不特別限制，可列舉將設置在本發明的細胞片疊層化物中的流路與活體側的血管連接的方法、使細胞片疊層化物表面向活體附著的方法等，此時，也可以在移植部位預先進行血管誘導，不特別限定。這裡，對施行血管誘導的方法也不特別限定，可列舉例如:將作為血管增殖因子的FGF包埋於微球，一邊改變該微球的組成、大小、注入範圍，一邊對活體作用8 10天的方法；將聚對苯二甲酸乙二醇酯篩網切割成任意大小，製成袋狀，在該袋的內側加入溶解於高濃度瓊脂糖溶液的FGF，8 10天後，除去該袋，從而製作血管誘導的空間的方法等。如果對人利用本發明的細胞片疊層體，則移植的細胞片疊層體在人的活體內長時間表達功能。而且，可以通過剝離的細胞片疊層體的大小、形狀、或者兩者來控制功能的表達量。這樣的細胞片疊層體,例如如果構成的細胞為心肌細胞、成心肌細胞、成肌細胞、間充質系幹細胞，則可以用於伴有選自心力衰竭、缺血性心臟病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、月巴厚型心肌病、擴張期肥厚型心肌病和擴張型心肌病中的疾患或障害的各疾患的治療，可根據使用的細胞種不同而適宜特定移植位置，不特別限定。如果對動物移植本發明的細胞片及其三維結構體，則可製成藥物評價用動物。並且，可以通過剝離的細胞片疊層體的大小和/或形狀來控制功能的表達量。這裡使用的動物可列舉大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、豬、黑猩猩或它們的免疫缺陷動物等，不特別限定。這樣的移植動物，例如，可以將被檢物質施與該動物，用於判定該被檢物質對心功能的影響的心功能評價系統等，不特別限定。
實施例以下，基於實施例更詳細地說明本發明，但本發明不受這些實施例任何限制。實施例1(心肌細胞片的製作方法)本實驗使用從出生後O天的SD系大鼠的心臟分離培養的心肌細胞。從仔大鼠摘出心臟後，使用作為分解組織主要構成要素膠原的酶的II型膠原酶(Worthington社制)，分離心肌細胞。將分離的心肌細胞以320X IO4細胞/皿的濃度接種於溫度應答性培養皿(Φ 35mm、Dish Upcell Type-E (CellSeed社制))。4天後,心肌細胞在培養皿表面形成匯合狀態，使溫度下降到20°C，從而回收片狀的心肌細胞群。在本實驗中，使用通過移液器疊層為3層的組織。(設有流路的凝膠的製作方法)如圖1所示，在丙烯酸系框中設置不鏽鋼絲，向該框內注入膠原凝膠溶液使其固化而凝膠化。然後，取出不鏽鋼絲，得到具有微流路的凝膠。說明使用相當於圖1的E的裝置的圖片和該裝置在細胞片內構建血管網的方法的示意圖示於圖2。圖3顯示通過膠原凝膠形成流路的圖。另外，用於向此物中灌注培養基的裝置概要的示意圖(左)和裝置的一例的圖片(右)示於圖4。圖4(左)所示的箭頭表示培養基流動的方向。(膠原凝膠上的細胞片的疊層化)使細胞片多疊層而粘附於膠原凝膠。作為具體的方法，使培養皿上浮遊2 6層心肌細胞片，用Pipet-Aid使培養基出入而在培養皿上一次堆積之後,溫育30分鐘而使其粘附一體化。然後，粘附在膠原凝膠上。在圖5(右)所示的灌注培養生物反應器中，一邊將疊層化於血管床的細胞片疊層化物浸潰在培養基中，一邊從流路灌注培養基而進行培養。(細胞片與膠原凝膠血管床之間的血管新生)
在血管床上灌注培養細胞片，則從大鼠的心臟分離的細胞中所含的血管內皮細胞向流路遊走，在血管床與細胞片的之間形成毛細血管網(圖5A)。在流路中注入丙烯酸系樹脂使其固化，從而觀察新生的血管的樣子。其結果可知，在血管床與細胞片之間形成了無數的毛細血管網(圖5B)。(膠原凝膠血管床上細胞片的加壓灌注培養法)隨著細胞片的疊層化片數的增加，細胞代謝所需的氧量也增加。於是，為了增加灌注培養的溶存氧量，在設置血管床的密閉容器中增加具備加壓機構的裝置，在上述方法的基礎上進行加壓灌注培養。在以20mmHg加壓的情況下，與不加壓培養時相比，培養基中的溶存氧量也增加，細胞片內的血管網構建以及血管床與細胞片疊層化物之間的血管網形成被促進(數據未顯示)。在以後的實驗中，以20mmHg的加壓培養進行實驗。(一次疊層化的方法)在膠原凝膠血管床上將細胞片灌注培養5天後，從灌注裝置卸下帶有疊層心肌細胞片的膠原凝膠，用4%低聚甲醛進行組織固定後，用石蠟切成切片。將石蠟切片通過HE染色觀察而得的各層的剖面的圖像示於圖5(A)。圖5的(A)中顯示的黑色箭頭表示細胞片所含的血管內皮細胞向凝膠的血管床中的流路遊走而形成的毛細血管。圖5(B)顯示在凝膠的流路中注入丙烯酸系樹脂使其固化，然後除去凝膠和細胞片而得的圖。各層的組織的厚度的測定方法為將HE染色圖像2值化而測定10處的厚度。其結果是，2層、3層的厚度與疊層數成比例地厚度增加，但4層以上則組織厚不增加、無厚度變化。測定值為I層:約7 μ m、2層:約18 μ m、3層:約24 μ m、4層:約23 μ m、5層:約26 μ m、6層:約23 μ m這樣的結果。即，到3層位置與疊層數成比例地組織的厚度增加，但3層以上疊層的組織厚全部與3層的厚度基本同樣(圖6A)。認為其原因是，依靠細胞片內的擴散的氧及營養的供給、老廢物的除去僅能到達3層，第4層以上的細胞片壞死。(多階段的疊層化方法)因此，考察了通過膠原凝膠內人工流路和細胞片來血管網，然後進行反覆疊層。初代培養心肌細胞片中除了心肌細胞以外還含有成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞，因而期待細胞片內具有血管並且一進行凝膠培養就進行血管新生。因此，考慮在膠原凝膠內製作灌注培養基的流路，在該膠原凝膠流路上培養初代培養心肌細胞片，則如果從細胞片新生血管而與人工流路連接，則即使在厚的組織中也能給心肌細胞供給新鮮的培養基。於是構建了供給的血管，然後反覆進行細胞片的疊層。通過上述實驗，參照灌注培養時I次疊層的極限數為3層的事實，和人工流路與細胞片之間血管網構建連接需要5天的事實反覆進行了實驗。其結果示於圖6B。具體地，進行了以5天的間隔疊層數以3片以內累加下去的方法。這次，觀察:(I) 3層+3層:6層計10天培養而得的組織、(2) 3層+ 3層+ 2層:8層計15天培養而得的組織、以及(3) 3層+ 3層+ 3層:9層計15天灌注培養而得的組織，與單次疊層(3層、5天)的組織相比，厚度怎樣變化。培養後，樣 本用4%低聚甲醛固定，將石蠟切片用HE染色。將染色的各組織示於圖7。3層+3層+3層以5天的間隔設置培養時間，進行計15天的反覆疊層。其結果觀察到78±11μπι的厚度。而且，將3層+3層+3層經15天進行灌注培養的結果是9層無壞死，維持了 115±10μπι的厚度。該厚度超過由從表面的擴散實現的氧及營養的供給厚度，因而顯示構建血管而向上部供給培養基然後反覆進行細胞片疊層的方法的有效性。顯示如果使用本實驗的培養裝置，則構建可移植的組織構建是可能的。實施例2(設有流路的凝膠的製作方法)如圖8所示，製作以在細胞片疊層化物的上下製作流路的方式設計的血管床形成容器。在丙烯酸系框中設置不鏽鋼絲，向該框內注入膠原凝膠溶液使其固化而凝膠化，取出下部的不鏽鋼絲，得到具有微流路的凝膠。然後，通過實施例1的方法將3層心肌細胞片疊層化。然後，在細胞片疊層化物的上部設置不鏽鋼絲，向該框內注入膠原凝膠溶液使其凝膠化，取出上部的不鏽鋼絲，在上部的流路中也製作流路。本實驗中，以下部的流路的流速為500 μ L/分鐘(圖8 (左)、微流路Α)、上部的流路的流速為250 μ L/分鐘(圖8 (左)、微流路B)進行培養，在圖4的生物反應器中進行5天的灌注培養。灌注培養後，為了確認細胞片內的毛細血管網與血管床的流路是否連接，從下部的流路灌注血液(圖9Α)。其結果可知，細胞片的上部的顏色變化，在凝膠與細胞片疊層化物的之間形成了流路。進而，確認上下的流路的形成的血管樣結構(圖9Β)。其結果可知，血管內皮細胞向著流速快的下部的流路遊走而形成血管網(圖9Β)。在將細胞片疊層化物的上下的流速與上述相反的情況下，血管內皮細胞向著流速快的上部的流路遊走。由此啟示，利用血管內皮細胞的血管網構建受培養基的流速這樣的物理特性影響而構建血管網。進而其實，如果細胞片與流路之間的距離為100 μ m以內，則血管內皮細胞有效地遊走,從而構建血管樣組織。(細胞片疊層化物的血管新生模型)圖10是顯示使用血管床製作細胞片疊層化物時所誘導的血管網的構建的概要的圖。血管內皮細胞從安放於膠原凝膠上的細胞片(圖10A)向著流路遊走(圖10B)，血管內皮細胞覆蓋流路的內壁，形成管腔結構(圖10C)。然後，進一步在上層移植細胞片疊層體(圖10D)，則與凝膠流路連接的管腔結構、與新疊層化的細胞片內的血管內皮細胞連接，進行血管形成(圖10E)。可以通過 重複該過程來製作有厚度的細胞片疊層物(圖10E)。產業可利用性根據本發明所示的製造方法，在細胞片內構建血管網，將該細胞片疊層化，則可以簡便地製作有厚度的細胞片疊層化物。這樣的有厚度的細胞片疊層化物作為活體內組織樣的物質，在各種組織的再生醫療中是有用的。
權利要求
1.胞片疊層化物的製造方法，其特徵在於，在凝膠內部設置用於灌注培養基的流路，誘導血管內皮細胞，製作在凝膠內構建了血管網的血管床，通過向該血管床上疊層細胞片，從而在細胞片內構建血管網。
2.根據權利要求1所述的細胞片疊層化物的製造方法，其中，在凝膠內構建血管網的方法，是使包含血管內皮細胞的細胞片附著於凝膠表面的方法。
3.根據權利要求1或2所述的細胞片疊層化物的製造方法，其中，凝膠是生物降解性聚合物和/或細胞。
4.根據權利要求3所述的細胞片疊層化物的製造方法，其中，生物降解性聚合物是膠原凝膠和/或纖維蛋白凝膠。
5.根據權利要求1 4的任I項所述的細胞片疊層化物的製造方法，其中，在能夠將溫度、氣氛保持一定的密閉容器的培養基中，浸潰疊層化了細胞片的血管床。
6.根據權利要求5所述的細胞片疊層化物的製造方法，其中，對密閉容器內部進行加壓。
7.根據權利要求1 6的任I項所述的細胞片疊層化物的製造方法，其中，培養基包含促進血管新生的因子，是提高毛細血管密度的培養基。
8.根據權利要求1 7的任I項所述的細胞片疊層化物的製造方法，其中，細胞片是將如下培養後的細胞以片狀剝離而得的:在表面包覆有水合力在O 80°C的溫度範圍變化的聚合物的細胞培養支撐體上，在 聚合物的水合力弱的溫度域培養細胞，然後，使培養基變化到聚合物的水合力強的狀態的溫度培養細胞。
9.根據權利要求1 8的任I項所述的細胞片疊層化物的製造方法，其中，水合力在O 80°C的溫度範圍變化的聚合物是聚(N-異丙基丙烯醯胺)。
10.根據權利要求1 9的任I項所述的細胞片疊層化物的製造方法，其特徵在於，使2片細胞片疊層化物的頂面彼此重合。
11.根據權利要求1 10的任I項所述的細胞片疊層化物的製造方法，其特徵在於，在向血管床上疊層化的細胞片上，進一步疊層設有流路的凝膠。
12.根據權利要求11所述的細胞片疊層化物的製造方法，其中，在細胞片疊層化物的上下的流路中，灌注的培養基的流速不同。
13.有血管網的細胞片疊層化物，其是由權利要求1 12的製造方法得到的。
14.根據權利要求13所述的細胞片疊層化物，其中，細胞片被疊層化的次數為4以上。
15.根據權利要求13或14所述的細胞片疊層化物，其中，細胞是心肌細胞、成心肌細胞、成肌細胞和間充質系幹細胞中的任I種，或者2種以上的細胞混合而成的混合物。
16.根據權利要求15所述的細胞片疊層化物，其中，包含血管內皮細胞。
17.根據權利要求13 16的任I項所述的細胞片疊層化物的利用方法，其特徵在於，將所得的細胞片疊層化物向活體內移植。
18.根據權利要求17所述的細胞片疊層化物的利用方法，其目的是向心肌組織移植，治療選自心力衰竭、缺血性心臟病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、擴張期肥厚型心肌病和擴張型心肌病中的至少I種心臟疾患或障害。
全文摘要
灌注灌注一種細胞片疊層化物的製造方法，其特徵在於，製作從設置在凝膠內部的用於灌注培養基的流路向表面構建了血管網的血管床，通過向該血管床上疊層細胞片，而在細胞片內構建血管網。根據製造方法，可以在細胞片內構建血管網，如果將該細胞片疊層化，則可以簡便地製作有厚度的細胞片疊層化物。這樣的有厚度的細胞片疊層化物作為活體內組織樣的物質，在各種組織的再生醫療中是有用的。
文檔編號A61K35/34GK103097518SQ201180044349
公開日2013年5月8日 申請日期2011年9月14日 優先權日2010年9月14日
發明者坂口勝久, 清水達也, 關根秀一, 梅津光生, 岡野光夫 申請人:學校法人東京女子醫科大學