一種共價交聯法固定纖維素酶酶解人參皂苷‑Rb1製備人參皂苷‑Rd的方法與流程
2023-06-14 08:35:26 2
本發明屬於酶的固定化技術領域，尤其涉及一種共價交聯法固定纖維素酶及其酶解人參皂苷-Rb1製備人參皂苷-Rd的方法。
背景技術：
人參皂苷-Rd屬於四環三萜達瑪烷型中的原人參二醇型皂苷。研究表明，原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷，在體內的主代謝途徑均是通過脫糖反應生成藥理活性更好的次級苷和苷元，腸道酶把原人參二醇型人參皂苷-Rb1代謝為-Rd。因此，人參皂苷-Rd是原人參二醇型皂苷的代謝後被腸道吸收利用的重要形式之一。
人參皂苷-Rd具有保護心血管系統、抗腫瘤、免疫調節、神經保護等作用。目前，製備次級皂苷主要有酸水解法、鹼水解法、Smith降解和酶解法。前三種方法效率高，但是副產物較多，專一性差，環境汙染嚴重，不易進行工業化生產，而酶解法具有工藝條件溫和、選擇性高及無汙染等特點。然而，游離酶（如游離蝸牛酶、橙皮苷酶等），存在穩定性差、不可回收及生產成本高的缺點。酶固定化後再進行催化反應時，酶具有易回收、易分離、反覆多次使用等優點，可以彌補天然酶在催化反應中的應用缺陷。
酶的固定化技術，是現代生物技術及其工業化環節中的一個核心技術，固定化酶在工業、醫學、分析與分離技術以及化學合成等領域有著廣泛的用途。依據酶的性質和用途，可通過包埋法、交聯法、吸附法和共價結合法來實現酶的固定化（羅貴民，酶工程，北京：化學工業出版社，2003，55-67.）；張琪等人比較瓊脂法、包埋法、海藻酸鈉戊二醛包埋交聯法、交聯包埋法固定β-葡萄糖苷酶轉化人參皂苷-Rg1為人參皂苷-F1的轉化工藝（張琪，趙文倩，孟飛，等. 固定化β-葡萄糖苷酶製備人參皂苷F1的研究[J]. 中國抗生素雜誌，2012，37(1)：49-55.）；於兆慧等採用交聯-包埋法利用多孔二氧化矽吸附固定化蝸牛酶，海藻酸製備成微球，考察固定化蝸牛酶轉化人參皂苷Rb1製備CK的工藝條件（於兆慧，劉其媛，崔莉，等. 微球固定化蝸牛酶轉化人參皂苷Rb1製備人參稀有皂苷Compound K研究[J]. 中草藥，2014，45（21）：3092-3097.）；專利CN101012473A採用海藻酸鈉固定化技術包埋轉化菌及酶，和聚乙烯氧化物為載體共價結合法以三醇型人參皂苷-Rg1製備生產人參皂苷-F1；專利CN101481725A採用殼聚糖吸附及戊二醛交聯轉化人參皂苷-Rb1製備-F2；專利CN 1899336A採用海藻酸鈉包埋β-葡聚糖苷酶、纖維素酶、纖維二糖酶轉化三七莖葉皂苷為CK。然而，上述的現有技術中僅應用包埋法和交聯法，酶存在結合力弱，易失活且接觸表面積小的缺點。
綜上所述，研究一種新型的、能夠提高酶活性的酶固化技術，顯得尤為重要。
技術實現要素：
針對上述現有技術存在的問題，本發明提供一種共價交聯法固定纖維素酶酶解人參皂苷-Rb1製備人參皂苷-Rd的方法。採用共價交聯法，確定纖維素酶的最佳固定工藝，然後以固定化酶轉化西洋參二醇組皂苷，得到較高產率的人參皂苷-Rd。
為了實現上述目的，本發明提供共價交聯法固定纖維素酶酶解人參皂苷-Rb1製備人參皂苷-Rd的方法，包括以下步驟。
步驟1、卡拉膠的胺化：取適量的濃度為10-40 mg/ml的卡拉膠水溶液，溫度為65℃的條件下，攪拌，得卡拉膠混懸液；取4℃的濃度為2% KCl水溶液（重量比），置於燒杯中，放在磁力攪拌器上攪拌，並吸取卡拉膠混懸液緩慢滴入其中，形成透明半球狀凝膠珠，靜置，製成卡拉膠凝膠珠；稱取適量的卡拉膠凝膠珠，加入濃度為0.05-3%的聚乙烯亞胺溶液，滴加鹼溶液，調節pH為7.0-12.0，胺化時間為0.25-4 h，放在滾軸混合器上混合，蒸餾水洗，洗淨殘餘聚乙烯亞胺，備用。
步驟2、交聯反應：取適量的步驟1得到的胺化的卡拉膠凝膠珠，加入濃度為0.1-4%戊二醛溶液，交聯時間為0.5-5.0 h，放在滾軸混合器上混合，用蒸餾水清洗，洗淨殘餘戊二醛，加入纖維素酶溶液，放在滾軸混合器上混合，完成酶的固定化，即得固定纖維素酶，並測定固定化酶的活力。
步驟3、西洋參二醇組皂苷的製備：西洋參乾燥根及根莖粗粉用水煎提取，水液減壓濃縮，然後上D 101大孔吸附樹脂分離，吸附12 h，水洗後用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓蒸除溶劑，製得西洋參二醇組皂苷乾燥粉末。
步驟4、酶解反應：取適量的步驟3製備的西洋參二醇組皂苷粉末，配置成濃度為0.5-5 mg/ml的西洋參二醇組皂苷溶液，加入步驟2得到的固定纖維素酶，用醋酸-醋酸鈉緩衝液調節pH值為3.0-9.0，反應溫度為30-70℃，反應時間為12-24 h；利用高效液相法測定人參皂苷-Rb1轉化情況。
所述的卡拉膠混懸液的滴距為6 cm，滴速為70-80滴/min。
所述的鹼溶液為氫氧化鈉溶液。
所述的醋酸-醋酸鈉緩衝液調節pH值優選為5.0。
本發明的有益效果。
本發明中，提供了一種新的採用固定化酶轉化人參皂苷-Rb1製備人參皂苷-Rd的方法，直接以西洋參二醇組皂苷為底物，所應用的酶為固定化纖維素酶。固定化酶由卡拉膠經聚乙烯亞胺胺化，戊二醛交聯，酶的固定化三步製得；其中，聚乙烯亞胺胺化時，卡拉膠控制滴加速度70-80滴/min。卡拉膠凝膠珠上表面的羥基與聚乙烯亞胺（PEI）上的氨基結合，使得凝膠珠表面孔隙變小，阻止游離酶在凝膠珠內部的進出；戊二醛交聯時，胺化後的卡拉膠凝膠珠與戊二醛上的一個醛基交聯完成活化，戊二醛的另一個醛基與酶蛋白上的氨基發生Schiff反應，使酶牢固地結合在凝膠珠載體上。經聚乙烯亞胺及戊二醛活化後的凝膠珠質地緊密牢固，不易被破壞，且酶與凝膠珠通過共價鍵結合，結合緊密，不易斷裂。
本發明提供的酶固定化方法，易於與反應體系分離；具有一定的機械強度，便於酶催化反應的連續化和自動化操作；重複利用9次後，固定化酶對人參皂苷-Rb1的轉化相對活力依然保持45%以上，極大節約生產成本。與單純使用游離酶相比，本方法具有可回收利用、選擇性高和無汙染等優點，與其他酶固定化方法相比，本方法具有結合牢固、操作穩定、可多次反覆利用等諸多優點，更適合工業化生產。
附圖說明
圖1對硝基苯酚標準曲線。
圖2西洋參二醇組皂苷HPLC圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做詳細的說明。
實施例1。
纖維素酶的共價固定工藝。
稱取0.25g卡拉膠（採購於北京索萊寶公司）加入到25ml蒸餾水中，溫度為65℃條件下，用磁力攪拌器攪拌1h，轉速為300rpm，得卡拉膠混懸液；取4℃的2%的KCl溶液50ml置於燒杯中，放在磁力攪拌器上攪拌，轉速為300rpm，並用5ml注射器吸取卡拉膠混懸液，緩慢滴入其中（滴入過程中固定滴距為6 cm，滴速為80滴/min），瞬時形成透明半球狀凝膠珠，並在2%KCl溶液中放置3h，製成濃度為1%卡拉膠凝膠珠；取1g卡拉膠凝膠珠，加入10ml濃度為1%聚乙烯亞胺溶液，滴加10%的NaOH溶液調節pH值為10，放在滾軸混合器上混合胺化1h，轉速為50rpm，蒸餾水洗3遍，洗淨殘餘聚乙烯亞胺；再加入到的10 ml 0.5%戊二醛中，放在滾軸混合器上混合進行交聯2h，轉速為50rpm，蒸餾水洗3遍，洗淨殘餘戊二醛；加入4ml濃度為2.5U/ml纖維素酶溶液（10U）（採購於北京索萊寶公司，批號923C021），放在滾軸混合器上混合16h，轉速為50rpm，完成酶的固定化。
實施例2。
纖維素酶的共價固定工藝。
稱取0.5g卡拉膠加入到25ml蒸餾水中，溫度為65℃條件下，用磁力攪拌器攪拌，轉速為300rpm，得卡拉膠混懸液；取4℃的2% 的KCl溶液50ml置於燒杯中，放在磁力攪拌器上攪拌，轉速為300rpm，並用5ml注射器吸取卡拉膠混懸液，緩慢滴入其中（滴入過程中固定滴距為6 cm，滴速為80滴/min），瞬時形成透明半球狀凝膠珠，並在2%KCl溶液中放置3h，製成濃度為1%卡拉膠凝膠珠；取1 g卡拉膠凝膠珠，加入10 ml濃度為0.5%聚乙烯亞胺溶液，滴加10%的NaOH溶液調節PH值為8，放在滾軸混合器上混合胺化3h，蒸餾水洗3遍，洗淨殘餘聚乙烯亞胺；再加入到10 ml 3%戊二醛中，放在滾軸混合器上混合進行交聯2h，轉速為50rpm，蒸餾水洗3遍，洗淨殘餘戊二醛；加入4ml（10U）濃度為2.5U/ml纖維素酶溶液，放在滾軸混合器上混合16h，轉速為50rpm，完成酶的固定化。
對實施例1和實施例2製備的固化纖維素酶進行固定化酶酶活力測定方法：分別取0.5 ml不同濃度的10、20、40、80、160、320μmol/L的對硝基苯酚溶液，50℃水浴加熱15 min，加入2 mol/LNa2CO3溶液1 ml，停止反應，冷卻至室溫。採用紫外分光光度計讀取400 nm處的吸光度值，見表1；以對硝基苯酚濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，製作對硝基苯酚濃度標準曲線，見圖1。分別稱取實施例1和實施例2固定化纖維素酶0.1g，分別加入10mM醋酸-醋酸鈉緩衝溶液配製的pNPG（對硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷）0.5 ml，50℃水浴加熱15 min，加入2 mol/LNa2CO3溶液1 ml，停止反應，冷卻至室溫。採用紫外分光光度計，讀取400 nm處的吸光度值，以對硝基苯酚標準曲線，計算樣品中對硝基苯酚的濃度，根據其濃度得出固定化酶酶活力。酶活力單位的定義是：1 g固定化酶在1 min內催化pNPG產生1 μmol對硝基苯酚所消耗的酶量定義為一個酶活單位（1 U）。採用上述固定化酶酶活力測定方法，測得實施例1的吸光度值為0.478，固定化酶酶活力單位為0.03 U；測得實施例2的吸光度值為0.594，固定化酶酶活力單位為0.04 U。
表1 不同濃度對硝基苯酚吸光度值。
實施例3
固定化酶轉化西洋參二醇組皂苷中人參皂苷-Rb1。
一、西洋參二醇組皂苷樣品製備。
西洋參乾燥根及根莖粗粉用水煎提取，濾去殘渣，水液減壓濃縮至西洋參投料量的濃縮液，然後上D 101大孔吸附樹脂分離，大孔吸附樹脂用量為1.5倍濃縮液，於55℃吸附12 h，先用水洗至無甜味，然後用30％和65％乙醇溶液依次解吸，收集65%的洗脫液，減壓旋幹溶劑，進一步減壓乾燥，製得西洋參二醇組皂苷乾燥粉末。
西洋參二醇組皂苷中人參皂苷-Rb1和-Rd的含量測定。
採用高效液相色譜法測定西洋參二醇組皂苷中人參皂苷-Rb1和-Rd的含量。具體方法如下。
1.提取物檢測樣品的製備：稱取乾燥西洋參二醇組皂苷粉末，加甲醇，配製成濃度為2 mg/ml的溶液，0.45μm微孔濾膜濾過，備用。
2.對照品溶液配製：人參皂苷-Rb1（批號：110704-201424）和-Rd （111818-201302）購於中國食品藥品檢定研究院，以甲醇配成濃度為1.15 mg/ml和0.50 mg/ml樣品。
3.高效液相色譜法條件如下。
Agilent1260液相條件：安捷倫ZORBAX SB-C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)柱，二極體陣列檢測器(DAD)，以乙腈(A)-磷酸水溶液(B 0.1%)為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL•min-1，柱溫30℃，檢測波長203nm，洗脫條件見表2。液相色譜圖，見圖2。
表2 人參皂苷梯度洗脫條件。
人參皂苷-Rb1和-Rd的含量計算，均採用外標法計算，Cx=Cr*Ax/Ar（Cx為樣品濃度，Cr為對照品濃度，Ax為樣品峰面積，Ar為對照峰面積），然後根據溶液濃度折算實際含量。
經上述高效液相法測得主要人參皂苷-Rb1和-Rd的含量分別為350mg/g、70mg/g，主要計算數據見表3。
表3西洋參二醇組皂苷中人參皂苷-Rb1及-Rd的峰面積及含量。
二、固定化酶轉化西洋參二醇組皂苷中人參皂苷-Rb1。
（1）酶解反應：取配製的濃度為2 mg/ml的西洋參二醇組皂苷溶液5 ml，加到0.5g實施例1製備的固定化纖維素酶中，用醋酸-醋酸鈉緩衝溶液調節pH為4.0，在50℃恆溫振蕩器下反應24h，得到轉化液；取轉化液1 ml，加入等體積正丁醇，萃取3次，揮幹溶劑，用甲醇溶解，轉移到1 ml量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45μm微孔濾膜濾過，待分析。按照上述高校液相色譜法檢測，分析結果為：人參皂苷Rb1轉化率為95.8%，人參皂苷-Rd的增加率為87.1%。
（2）酶解反應：取配製的濃度為2 mg/ml的西洋參二醇組皂苷溶液5 ml，加到0.5g實施例2製備的固定化纖維素酶中，用醋酸-醋酸鈉緩衝溶液調節pH為5.0，在60℃恆溫振蕩器下反應24 h，得到轉化液；取轉化液1 ml，加入等體積正丁醇，萃取3次，揮幹溶劑，用甲醇溶解，轉移到1 ml量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45μm微孔濾膜濾過，待分析。按照上述高效液相色譜法進行檢測分析，結果：人參皂苷-Rb1轉化率為97.5%，人參皂苷-Rd的增加率89.9%。
（3）酶解反應耐用性實驗：取配製的濃度為2 mg/ml的西洋參二醇組皂苷溶液5 ml，加到0.5g實施例2製備的固定化纖維素酶中，用醋酸-醋酸鈉緩衝溶液調節pH為5.0，在60℃恆溫振蕩器下反應24h，取出，分離固定化纖維素酶和反應液，醋酸-醋酸鈉緩衝溶液洗3遍，洗淨殘餘反應液，繼續採用西洋參二醇組皂苷溶液進行第2次酶解反應，如此重複操作上述過程，共進行9次。每次酶解反應結束後，取轉化液1 ml，加入等體積正丁醇，萃取3次，揮幹溶劑，用甲醇溶解，轉移到1 ml量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45μm微孔濾膜濾過，待分析。按照上述高效液相色譜法對轉化液進行檢測分析。轉化9次之後，固定化酶對人參皂苷-Rb1的轉化相對活力依然保持在45%以上（人參皂苷-Rb1轉化率%=（C空白-C轉化後）/C空白%），以第一次反應測得的轉化率為1，其他則為第一次轉化率的相對值），具體數據見表4。證明酶與載體間的吸附作用較穩定，一直保持在穩定的水平，固定化酶可以連續轉化人參皂苷-Rb1為-Rd，具有較高重複耐用性，用於工業化生產可以節約成本。
表4酶解反應耐用性實驗人參皂苷-Rb1的相對轉化率。
本發明提供的纖維素酶的新固定化方法，並採用固定化的纖維素酶轉化西洋參二醇組皂苷中Rb1為-Rd，方法重複性好，固定化酶可反覆利用，適合工業化生產，為人參皂苷-Rd的開發利用奠定基礎。