製造異源多聚體分子的方法

2023-06-14 10:46:01

專利名稱：製造異源多聚體分子的方法
技術領域：
本發明提供製造諸如雙特異性抗體等異源多聚體分子的方法，和包含所述分子的組合物。所述方法包括在兩條多肽間的界面處相接觸的胺基酸中引入取代。上述取代包括使組成異源多聚體分子的多肽之間的靜電相互作用和/或疏水/親水相互作用發生改變的胺基酸變化。在上述取代所產生的多聚體分子中，同源多聚體分子是不利的，而優選形成異源多聚體分子。
背景技術：
單克隆抗體的特點在於其特異性地結合特定抗原的能力，該能力使其能夠在體內結合其靶標但不結合非抗原部位。一旦與靶標結合，治療性單克隆抗體就能夠遞送毒性有效載量，充當受體的激動劑或拮抗劑，或充當配體的中和劑。還可以對單克隆抗體進行修飾，從而使其在各物種中具有更好的免疫耐受性。一種此類修飾是人源化，其需要將結構區域中的胺基酸置換為存在於人體中的胺基酸。隨後可對人源化抗體進行進一步修飾。一種此類修飾是使人源化抗體帶有額外的細胞毒性機制，其可以是放射性同位素、細菌毒素、炎性細胞因子、化療劑或前藥。越來越多的有功效的癌症治療劑得到了批准，其或者是嵌合抗體(利妥昔單抗 (Rituximab))或人源化IgGl (赫賽汀(Here印tin)和Campath-IH)，或者是帶有化療劑的綴合物(Mylotarg)或帶有放射性同位素的綴合物(Zevalin和Bexxar)。儘管存在這些進展，用於癌症治療的單克隆抗體的功效仍然有限，因此進一步的改進還有巨大的潛力。一類有望對癌症治療具有更強效力的抗體衍生物是雙特異性抗體。在其結合臂中具有雙重特異性的抗體通常在自然界中不存在，因此這種抗體是通過重組DNA或細胞融合技術來開發的。經設計，多數雙特異性抗體可募集有效抵抗病原靶細胞的具有細胞毒性的免疫系統效應細胞。在超過15年的深入研究後，已開發出多種不同類型的雙特異性抗體，但僅有少數進入了臨床試驗階段。在最早的雙特異性抗體當中，有經設計用來使針對癌靶細胞的T細胞重新定向的構建體。當細胞毒性τ淋巴細胞(CLT)附著在腫瘤細胞上並同時被與T細胞受體(TCR)-CD3 複合體相互作用的雙特異性抗體的一個臂觸發時，靶細胞會被殺死。CTL據認為是免疫系統的最強力的殺傷細胞，其因缺乏Fc γ受體而不能被單克隆抗體使用。另一類雙特異性抗體是同時結合腫瘤細胞和激活性Fc Y受體(例如，單核細胞上的CD64/FcyRI)的那些雙特異性抗體。該類型的雙特異性抗體與Fc γ受體的結合能夠引發效應細胞的活化，並且不受到同時結合正常IgG的競爭。一種產生雙特異性抗體的方法稱為「knobs-into-holes (球入洞)」方案(參見例如TO2006/(^8936)。在此技術中，使構成人IgG中CH3結構域的界面的選定胺基酸突變，從而減少了 Ig重鏈的錯配。在CH3結構域內兩條重鏈的直接相互作用的位置上，將具有小側鏈的胺基酸(hole(洞))引入一條重鏈的序列中，並將具有大側鏈的胺基酸(knob(球)) 引入另一條的序列中。結果是，據已描述，knob和hole之間的蛋白相互作用導致了經轉染的哺乳動物宿主細胞形成了多達90%的正確的雙特異性人IgG。本發明通過用疏水性更高的胺基酸殘基置換參與親水相互作用的胺基酸殘基和/ 或通過用另一胺基酸置換參與電荷相互作用的胺基酸來使在兩條多肽間的界面處相互作用的選定胺基酸突變，從而提供了優選形成異源多聚體分子的方法。

發明內容
本發明提供製備包含兩條多肽的異源多聚體多肽的方法，所述兩條多肽都含有人免疫球蛋白CH3結構域，所述方法包括將所述兩條多肽中的一條的CH3結構域內的至少一個胺基酸取代為另一胺基酸，從而促進異源多聚體的形成，所述至少一個胺基酸位於與選自由人IgG2的236位、245位、249位、278位、286位和288位組成的組的位置對應的位置。 在一個實施方式中，本發明提供製備包含兩條多肽的異源多聚體多肽的方法，所述兩條多肽都含有人免疫球蛋白CH3結構域，所述方法包括將所述兩條多肽中的每一條的CH3結構域中的至少一個帶電荷胺基酸殘基取代為帶相反電荷的胺基酸。在另一個實施方式中，取代後的胺基酸對在異源多聚體多肽中形成離子對。在另一個實施方式中，本發明提供製備包含兩條多肽的異源多聚體多肽的方法， 所述兩條多肽都含有人免疫球蛋白CH3結構域，所述方法包括將所述兩條多肽中的一條的 CH3結構域中的至少一個親水胺基酸殘基取代為另一胺基酸。在一個實施方式中，將該親水胺基酸殘基取代為疏水殘基。在某些實施方式中，取代造成了對具有羥基側鏈的胺基酸的置換，所述具有羥基側鏈的胺基酸被不具有羥基側鏈的胺基酸取代。在另一實施方式中，該方法還包括將一條多肽的CH3結構域中的至少一個親水胺基酸殘基取代為另一胺基酸所述兩條多肽的界面處所述兩條多肽中的一條取代為另一胺基酸。在又一實施方式中，取代後的胺基酸在所述兩條多肽的界面處與另一胺基酸相互作用。據預測可在界面處相互作用的代表性胺基酸包括表1中列出的那些胺基酸，或者是位於與表1中列出的那些胺基酸對應的位置上的胺基酸。在一個實施方式中，兩條多肽的人免疫球蛋白CH3結構域選自由IgG、IgA和IgD 的CH3結構域組成的組。在另一實施方式中，免疫球蛋白CH3結構域是IgG2CH3結構域。在一個實施方式中，含有CH3結構域的第一條多肽包含與第一免疫球蛋白輕鏈多肽特異性地結合的第一免疫球蛋白重鏈多肽，含有CH3結構域的第二條多肽包含與第二免疫球蛋白輕鏈多肽特異性地結合的第二免疫球蛋白重鏈多肽。在另一實施方式中，第一免疫球蛋白輕鏈多肽和第二免疫球蛋白輕鏈多肽在胺基酸序列上是同一的。在一個實施方式中，所述方法包括取代一個CH3結構域中的位於與人IgG2的M9 位和288位對應的位置上的胺基酸。在另一實施方式中，用穀氨酸置換位於249位和觀8 位的胺基酸。在另一實施方式中，用天冬氨酸置換位於249位和288位上的胺基酸。在一個實施方式中，所述方法包括取代一個CH3結構域中的位於與人IgG2的249位、286位和 288位對應的位置上的胺基酸。在另一實施方式中，用穀氨酸置換位於249位和288位上的胺基酸，且用苯丙氨酸置換位於286位上的胺基酸。在一個實施方式中，所述方法還包括取代第二個CH3結構域中的位於與人IgG2的236位和278位對應的位置上的胺基酸。在另一實施方式中，用賴氨酸置換位於236位上的胺基酸，且用賴氨酸置換位於278位上的胺基酸。
在一個實施方式中，所述方法包括取代一個CH3結構域中的位於與人IgG2的236 位和278位對應的位置上的胺基酸。在另一實施方式中，用賴氨酸置換位於236位上的胺基酸，且用賴氨酸置換位於278位上的胺基酸。在一個實施方式中，所述方法包括製備一價的異源多聚體多肽。在另一個實施方式中，所述方法包括製備包含可檢測的標籤或表位的一價異源多聚體多肽。在一個實施方式中，所述方法包括製備二價的異源多聚體多肽。在另一個實施方式中，第一條多肽通過其免疫球蛋白抗原結合域結合靶分子，而第二條多肽是免疫粘附素。 在一個實施方式中，相對於同源二聚體的裝配，第一條和第二條多肽優選相互裝配成異源二聚體。在另一個實施方式中，第一條和第二條多肽裝配形成雙特異性抗體。在一個實施方式中，所述方法包括製備異源多聚體分子，其中，含有CH3結構域的第一條多肽包含與第一免疫球蛋白輕鏈多肽特異性地結合的第一免疫球蛋白重鏈多肽，含有CH3結構域的第二條多肽包含與第二免疫球蛋白輕鏈多肽特異性地結合的第二免疫球蛋白重鏈多肽。在另一實施方式中，第一免疫球蛋白輕鏈多肽和第二免疫球蛋白輕鏈多肽在胺基酸序列上是同一的。在又一實施方式中，免疫球蛋白輕鏈多肽與免疫球蛋白重鏈多肽連接。在一個實施方式中，所述方法包括製備特異性地結合兩種不同抗原的雙特異性抗體。在另一個實施方式中，雙特異性抗體結合同一抗原上的兩個不同的表位。在一個實施方式中，所述方法包括製備特異性地結合抗原的異源多聚體多肽，所述抗原選自由 DLL4、VEGF, VEGFR2、Notchl、Notch2、Notch3、Notch4、Notch (全)、JAGl、 JAG2、DLL (全)、JAG (全)、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB (全)、c_Met、IGF_1R、PDGFR、Patched、 Hedgehog 家族多肽、Hedgehog (全)、WNT 家族多肽、WNT (全)、FS)l、FZD2、Fa)3、FZD4、Fa)5、 FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、FZD (全)、LRP5、LRP6、CD20、IL_6、TNFalpha、IL-23、IL-17、 CD80、CD86、CD3、CEA, Muc 16, PSMA, PSCA, CD44、c_Kit、DDR1、DDR2、RSPOl、RSP02、RSP03、 RSP04、RSPO (全)、BMP家族多肽、BMP (全)、BMPRla、BMPRlb及其組合組成的組。在一個實施方式中，所述方法包括製備包含VEGF結合序列的異源多聚體多肽，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID NO 13或SEQ IDNO 15的輕鏈序列。在另一個實施方式中，異源多聚體多肽包含VEGF結合序列，所述VEGF結合序列包含 SEQ ID NO: 11的重鏈序列和SEQ ID NO 13的輕鏈序列。在又一個實施方式中，異源多聚體多肽包含VEGF結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID NO 15的輕鏈序列。在再又一個實施方式中，異源多聚體多肽包含DLL4結合序列，所述DLL4 結合序列包含SEQ ID NO :19ο在一個實施方式中，所述方法包括製備異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽是結合DLL4和VEGF的雙特異性抗體。在一個實施方式中，異源多聚體多肽包含序列同一的輕鏈多肽。在另一實施方式中，輕鏈多肽與重鏈多肽連連接。在又一個實施方式中，所述雙特異性抗體包含VEGF結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11 的重鏈序列和SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 15的輕鏈序列；所述DLL4結合序列包含SEQ ID Ν0:19。在又一個實施方式中，所述異源多聚體多肽包含VEGF結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID NO 13的輕鏈序列；所述 DLL4結合序列包含SEQ ID Ν0:19。在再一個實施方式中，所述異源多聚體多肽包含VEGF結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO=Il的重鏈序列和SEQ ID NO 15的輕鏈序列；所述DLL4結合序列包含SEQ ID NO :19。本發明還提供特異性地結合VEGF的抗體，其中，所述抗體包含(a)包含 GYTFTNYWMH(SEQ ID NO :20)的重鏈 CDRl、包含 SINPSNGGTSYNEKi7KR(SEQID NO 21)的重鏈 CDR2、和包含 HYYDNSYAMDY(SEQ ID NO 22)的重鏈 CDR3 ；和 / 或(b)包含 QASQDISNYVN(SEQ ID NO 23)的輕鏈 CDRl、包含 DASNLQT (SEQ IDNO 24)的輕鏈 CDR2、和包含 QQYDDLPP (SEQ ID NO 25)的輕鏈⑶R3。本發明還提供特異性地結合VEGF的抗體，其中，所述抗體包含 (a)包含 GYTFTNYWMH(SEQID NO :20)的重鏈 CDR1、包含 SINPSNGGTSYNEKi7KR (SEQ ID NO: 21)的重鏈 CDR2、和包含 HYYDNSYAMDY (SEQ ID NO 22)的重鏈 CDR3 ；和 / 或(b)包含 RASQGINNHLAff (SEQ ID NO 26)的輕鏈 CDR1、包含 AASNLHS (SEQ ID NO 27)的輕鏈 CDR2、和包含 QQYDNLPL (SEQ ID NO 28)的輕鏈 CDR3。在一個實施方式中，所述抗體是人VEGF的拮抗劑。在另一個實施方式中，所述抗 VEGF抗體是抗體片段。在一個實施方式中，所述抗體是單克隆抗體或人源化抗體。在一個實施方式中，所述抗VEGF抗體抑制腫瘤生長。在一個實施方式中，所述抗VEGF抗體以約IOOnM以下的Kd結合人VEGF。本發明還提供用本文所述的方法製得的異源多聚體多肽。在一個實施方式中，異源多聚體多肽具有用本文所述的方法製得的異源多聚體多肽的特性。在一個實施方式中，異源多聚體多肽是一價的。在另一個實施方式中，異源多聚體多肽是二價的。在又一個實施方式中，異源多聚體多肽是雙特異性抗體。本發明還提供包含免疫球蛋白CH3結構域的多肽，其中，所述CH3結構域在與人 IgG2的249位和288位對應的位置上具有穀氨酸。本發明還提供包含免疫球蛋白CH3結構域的多肽，其中，所述CH3結構域在與人 IgG2的249位和288位對應的位置上具有穀氨酸，且在與人IgG2的286位對應的位置上具
有苯丙氨酸。本發明還提供包含免疫球蛋白CH3結構域的多肽，其中，所述CH3結構域在與人 IgG2的236位和278位對應的位置上具有賴氨酸。在一個實施方式中，多肽免疫球蛋白CH3結構域是IgG CH3結構域。在一個實施方式中，異源多聚體多肽同時包含下述(i)和(ii) :(i)包含免疫球蛋白CH3結構域的多肽，其中，所述CH3結構域在與人IgG2的249位和288位對應的位置上具有穀氨酸；或包含免疫球蛋白CH3結構域的多肽，其中，所述CH3結構域在與人IgG2的 249位和288位對應的位置上具有穀氨酸且在與人IgG2的286位對應的位置上具有苯丙氨酸；(ii)包含免疫球蛋白CH3結構域的多肽，其中，所述CH3結構域在與人IgG2的236位和278位對應的位置上具有賴氨酸。在一個實施方式中，含有CH3結構域的第一條和/或第二條多肽還包含免疫球蛋白CH2結構域。在一個實施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :4或SEQ ID N0:5的
胺基酸序列。在一個實施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7的胺基酸序列。在一個實施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9的
胺基酸序列。在一個實施方式中，異源多聚體多肽包含選自由SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4,SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7組成的組的第一胺基酸序列；和選自由SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9組成的組的第二胺基酸序列。本發明還提供包含選自SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 9的多肽的異源多聚體多肽。 在一個實施方式中，異源多聚體多肽是異源二聚體。在另一個實施方式中，異源多聚體多肽是雙特異性抗體。在又一個實施方式中，異源多聚體多肽是一價抗體。在一個實施方式中，異源多聚體多肽特異性地結合選自由下述抗原組成的組的抗原DLL4、VEGF、VEGFR2、Notchl、Notch2、Notch3、Notch4、Notch(*)、JAGl、JAG2、DLL(*)、 JAG (全)、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB (全)、c_Met、IGF-1R、PDGFR、Patched、Hedgehog 家族多肽、Hedgehog (全)、WNT 家族多肽、WNT (全)、FZDU FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6、 FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、FZD (全)、LRP5、LRP6、CD20、IL-6、TNFalpha、IL-23、IL-17、CD80、 CD86、CD3、CEA、Muc 16、PSMA、PSCA、CD44、c_Kit、DDRl、DDR2、RSPOl、RSP02、RSP03、RSP04、 RSPO (全)、BMP 家族多肽、BMP (全)、BMPRla, BMPRlb 及其組合。 在一個實施方式中，異源多聚體多肽包含VEGF結合序列，所述VEGF結合序列包含 SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 15的輕鏈序列。在另一個實施方式中，異源多聚體多肽包含VEGF結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO :11的重鏈序列和SEQ ID NO: 13的輕鏈序列。在一個實施方式中，異源多聚體多肽包含SEQ ID N0: 10的VH序列和SEQ ID NO : 或SEQ ID N0:30的VL序列。在另一個實施方式中，異源多聚體多肽包含VEGF結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID NO 15的輕鏈序列。在又一個實施方式中，異源多聚體多肽包含DLL4結合序列，所述DLL4 結合序列包含SEQ IDNO :19ο在一個實施方式中，異源多聚體多肽是結合DLL4和VEGF的雙特異性抗體。在一個實施方式中，VEGF結合序列包含SEQ ID Ν0:17或SEQ ID Ν0:18。在一個實施方式中， DLL4結合序列包含SEQ ID Ν0:19。在另一個實施方式中，所述雙特異性抗體包含VEGF結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID Ν0: 13或SEQ ID NO 15的輕鏈序列；所述DLL4結合序列包含SEQ ID N0:19。在又一個實施方式中，所述異源多聚體多肽包含VEGF結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ IDNO 13的輕鏈序列；所述DLL4結合序列包含SEQ ID NO :19。在再一個實施方式中，所述異源多聚體多肽包含VEGF結合序列和DLL4結合序列， 所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID NO :15的輕鏈序列；所述DLL4 結合序列包含SEQ ID NO :19ο在一個實施方式中，異源多聚體多肽包含胺基酸序列同一的輕鏈多肽。在另一實施方式中，異源多聚體多肽包含與重鏈多肽連接的輕鏈多肽。在一個實施方式中，異源多聚體多肽包含在一個CH3結構域中的位於與人IgG2的 249位和288位對應的位置上的取代胺基酸。在一個實施方式中，用穀氨酸置換異源多聚體多肽在249位和288位上的胺基酸。在另一實施方式中，用天冬氨酸置換位於249位和288位上的胺基酸。在一個實施方式中，異源多聚體多肽包含在第二個CH3結構域中的位於與人IgG2 的236位和278位對應的位置上的取代胺基酸。在一個實施方式中，用賴氨酸置換異源多聚體多肽在236位上的胺基酸，且用賴氨酸置換該異源多聚體多肽在278位上的胺基酸。 在一個實施方式中，異源多聚體多肽包含在一個CH3結構域中的位於與人IgG2的236位和 278位對應的位置上的取代胺基酸。在一個實施方式中，含有CH3結構域的第一條和/或第二條多肽還包含單鏈Fv。本發明還提供分離的多肽，所述分離的多肽包含選自由SEQ ID NO :10、SEQ IDNO
ID NO :30組成的組的胺基酸序列。在一個實施方式中，所述分離的多肽是抗體。在一個實施方式中，異源多聚體多肽還包含細胞毒素或放射性同位素。本發明還提供編碼本發明的多肽或抗體的多核苷酸。本發明還提供在高度嚴格條件下與編碼本發明的多肽或抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。本發明還提供包含本發明的多核苷酸的宿主細胞。本發明還提供製造異源多聚體多肽的方法，所述方法包括在使所述多肽表達的條件下培養所述宿主細胞。本發明還提供包含本發明的異源多聚體多肽和藥物可接受的載劑的藥物組合物。本發明還提供治療病症的方法，所述方法包括向有治療需要的患者施用本發明的異源多聚體多肽或組合物。在一個實施方式中，所述病症是癌症。在另一個實施方式中，所述方法還包括施用第二治療化合物。在一個實施方式中，將所述第二治療化合物用來治療因向患者施用異源多聚體多肽而引起的副作用。在另一實施方式中，所述第二治療化合物是抗癌劑。在又一個實施方式中，將異源多聚體多肽和第二治療化合物同時施用或依次施用。


圖1 抗體CH2和CH3結構域的結構。該結構是存儲在PDB中的抗體fc結構域的結構(文件 1FC1) (Deisenhofer. J. (1981) Biochemistry，20，2361-2370)，在用 Pymol 軟體程序(DeLano Scientific LLC, California USA)生成的帶式視圖中顯示。顯示了二聚體結構中每條鏈的CH2和CH3結構域。Fc段的二聚體化是通過CH3結構域間的相互作用來介導的。圖2 :CH3 二聚體界面。所顯示的是CH3結構域的帶式結構視圖。左側是兩個CH3 結構域的二聚體的圖像。右側是單CH3結構域的圖像，並且繪出了可能參與鏈間相互作用的胺基酸的側鏈。圖3 選定參與鏈間相互作用的胺基酸。顯示了二聚體化的CH3結構域的三個單獨視圖，選擇這些視圖可最佳地觀察特定的胺基酸殘基。該結構示於用Pymol軟體程序 (DeLano Scientific LLC, California USA)生成的帶式視圖中。每個視圖都突出顯示了據推測參與鏈間配對的選定胺基酸。通過繪出側鏈並通過胺基酸標誌和位置，突出顯示了單個的胺基酸。編號方案與人IgG2恆定區相對。圖4 對人IgG同種型的比對。顯示了對人IgG同種型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 的恆定區的比對。CH3結構域由線指示。實心圓標註出了圖2和圖3中所突出顯示的且據推測參與鏈間相互作用的單個胺基酸。圖5 用於評估同源二聚體化和異源二聚體化的測定構造。為了確定Fc變體發生同源二聚體化或與另一 Fc變體發生異源二聚體化的相對傾向，發明人製備了「微抗體 (mini-body)」表達構建體，該構建體編碼連接區和與N端信號序列及FLAG表位連接的IgG2 的CH2-CH3結構域(人IgG2恆定區的胺基酸103 326)。該構建體在轉染細胞時指導分泌型二聚體Fc結構域(此處稱之為「微抗體」)的表達。蛋白質印跡分析揭示出，微抗體的大小遠小於通過用編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉染細胞而產生的完整抗體的大小。通過用編碼完整抗體和微抗體Fc結構域構建體的載體轉染細胞，可以評估異源二聚體的形成。異源二聚體的形成將產生包含一條微抗體鏈和複合有輕鏈的一條全長重鏈的中等大小的分子。圖6:高效形成異源二聚體Fc結構域的抗體變體。製造了編碼含有野生型人 IgG2CH2和CH3結構域(Wt)及變體(Varl (亦稱作13B)，和Var2)的帶FLAG標籤的微抗體的表達載體質粒、編碼含有野生型人IgG2CH2和CH3結構域(Wt)或變體(Var3/13A)的全長重鏈的表達載體質粒和編碼全長輕鏈(U)的表達載體質粒。Varl包含CH3結構域內的 249位Lys至Glu的胺基酸取代和288位Lys至Glu的胺基酸取代。抗體Var2包含CH3結構域內的249位Lys至Glu的胺基酸取代、268位Tyr至Phe的胺基酸取代和288位Lys至 Glu的胺基酸取代。抗體Var3 (亦稱作13A)包含236位Glu至Lys的胺基酸取代和278位 Asp至Lys的胺基酸取代。用上述表達載體的組合瞬時轉染HEK293細胞。用抗FLAG抗體進行了非還原性蛋白質印跡分析，從而揭示分泌出的抗體產物的大小。野生型人IgG2容易展示出同源二聚體化，如右圖所示，其中，容易檢測到表達出的含有野生型人CH2-CH3結構域的帶Flag標籤的「微抗體」。抗體Varl(13B)發生同源二聚體化的能力大幅度降低。抗體Var2沒有或幾乎沒有顯示出同源二聚體化能力。在中圖和左圖中，微抗體變體與全長重鏈變體共表達，並且產生了異源二聚體抗體形式。野生型全長重鏈和野生型微抗體的共表達導致產生了兩種同源二聚體(如中圖中的抗FLAG蛋白質印跡和在右圖抗Fc蛋白質印跡中觀察到的質量中等的條帶所清楚展示的)。這些數據顯示，Varl (13B)和Var3(13A)的共表達使同源二聚體化優先，而Var2和Var3的共表達幾乎只產生異源二聚體。圖7 雙特異性抗體與兩個靶標的結合。進行了酶聯免疫吸附測定(ELISA)來檢查雙特異性抗體變體(Varf-Varf)結合抗原的能力。不用抗原(_)或者用抗FLAG抗體 (0. 05mg/ml，來自SIGMA的克隆似)或重組人DLL4(0. lmg/ml)(帶羧基端8XHis標籤的胺基酸27 519)包被ELISA板。隨後將經包被的板與對照細胞培養基(陰性對照)或與來自轉染有編碼上述Var2、Var3和輕鏈L2的表達載體的細胞的條件培養基溫育。結果顯示， 通過共表達Var2和Var3重鏈和L2輕鏈而產生的雙特異性抗體變體能夠結合DLL4 (即用來產生Var3的親本野生型抗體所識別的抗體)，還能夠因Var重鏈變體臂所呈現的FLAG表位標籤而能夠結合抗FLAG抗體。圖 8 抗 VEGF Fab (219R0302)部分阻斷 VEGF 所誘導的 HUVEC 增殖。在抗 VEGFi^ab 片段219R0302背景下，在第7天對HUVEC細胞進行增殖抑制篩選。用M199_+2% FBS作為飢餓培養基，並將體積標準化至測試樣品的最低濃度。以多種測試抗體、貝伐單抗(Avastin) 和作為對照的重組人VEGF為背景，測試了 219R0302Fab。圖 9 抗 VEGF Fab (219R0302)阻斷 VEGFR2Fc 與 hVEGF 的 biacore 表面的結合。使用標準NHS/EDC化學手段在CM5晶片上生成VEGF表面。使219R0302Fab或對照非結合性 Fab流過該表面，隨後立即注射VEGFR2。如所顯示的，VEGFR2在對照Fab實驗中與VEGF結合良好，而在219R0302Fab實驗中受到阻斷。圖10 抗 VEGF IgG(219R0302 和 219R0202)以與貝伐單抗(Avastin)相似的程度阻斷VEGF所誘導的HUVEC增殖。將21R0302和219R0202IgG重構造為IgG2，並進行表達和純化，用於確認性體外測試。圖11 抗VEGF抗體219R0302和219R0202在PE13乳腺腫瘤異種移植模型中抑制腫瘤生長。用300，000個活的PE13細胞向小鼠右側肋部進行皮下注射。219R0302誘導了比219R0202更強的腫瘤生長延遲。Avastin顯示出了與219R0302無差別的最強力的生長延遲，表明219R0302和Avastin在此模型中具有幾乎相等的效力。與219R0302不同， 219R0202在統計學上不同於Avastin和219R0302。圖12 雙特異性抗體構造。A)單基因雙特異性抗體(SGBSP)。在此構造中，通過 30個胺基酸的連接物(6XGGGGQ將每條輕鏈連接在其相應的重鏈上。B) —價雙特異性抗體(MBSP)。在此構造中，使用了同樣的輕鏈，該同樣的輕鏈可以源自任何一個親本抗體。在與同樣的輕鏈組合時，兩條重鏈之一或全部必須能夠結合其靶標。圖13 =SGBSP和MBSP是超過90%的異源二聚體，並且可以通過改變Var3/Varl比來消除同源二聚體。A)經蛋白A純化的SGBSP(9219R0202_21M18)和MBSP Q19R0202重鏈(13A/Var3),21M18重鏈(13B/Varl), 21M18輕鏈)純度高於90 %，並且包含小部分的 Varl 同源二聚體(SBBSP :21M18S_GBSP 同源二聚體(1!3B/Varl) ；MBSP 帶有 21M18 輕鏈的 21M18重鏈(13B/Varl))。泳道1 標準品，泳道2 :21M18，泳道3 =MBSP,泳道4 空白，泳道 5 :SGBSP。MBSP 異源二聚體 pi 約 7. 1 ；MBSPl3A 同源二聚體 pi 約 8. 3 ；MBSP 13B 同源二聚體 pi 約 6. 2 ；SGBSP 異源二聚體 pi 約 7. 8 ；SGBSP 13A 同源二聚體 pi 約 8. 6 ；SGBSP 13B 同源二聚體Pl約6. 4。B)可以通過使用至少2 1倍的摩爾過量的219R0202重鏈(13A/ Var3) :21M18重鏈(1!3B/Varl)來使MBSP UB/Varl同源二聚體的比例最小化。13A 13B 重鏈比泳道1，1 8;泳道2，1 6;泳道3，1 4;泳道4，1 2 ；泳道5，1 1 ；泳道6， 2 1;泳道7，4 1;泳道8，6 1;泳道9，8 1;泳道10，梯形帶。圖 14 SGBSP 部分阻斷 VEGF 所誘導的 HUVEC 增殖。219R0302_21M18 禾口 219R0202_21M18 SGBSP均部分抑制VEGF所誘導的HUVEC增殖，且後者顯示出明顯比前者更高的活性。圖15 雙特異性抗體與經hDLL4轉染的細胞良好結合。LZ1，非特異性抗體對照；SGBSP，219R0202_21M18單基因雙特異性抗體；MBSP，帶有同樣的21M18LC的 219R0202_21M18—價雙特異性抗體；Homo 13A，僅與 21M18LC—起表達的 219R0202 HC(具有13A突變)；Homo 13B，僅與21M18LC—起表達的21M18HC (具有1 突變)。將結合曲線擬合至非線性變換，從而產生括號中所示的EC50值(NF表示無擬合)。圖16 兩種SGBSP和MBSP以特異性的方式同時結合VEGF和DLL4。通過使用雙靶向測定，219R0302_21M18 和 219R0202_21M18 兩種 SGBSP (圖 A)和 MBSP (圖 B)均顯示出同時與VEGF和DLL4的結合。圖17 =SGBSP在VEGF所誘導的增殖測定中顯示出部分抑制。與貝伐單抗 (Avastin)和rhVEGF對照相比，SGBSP顯示出對VEGF所誘導的增殖的部分抑制。
具體實施例方式本發明提供用於產生諸如雙特異性抗體等異源多聚體多肽的方法、組合物和試劑盒。本發明使得能夠以高產量產生主要是(且在某些實施方式中，幾乎完全是)異源多聚體的分子。本文中提供了關於方法、組合物和試劑盒的詳細內容。「異源多聚體」、「異源多聚體複合體」、「異源多聚體多肽」或「異源多聚體分子」在本文中可互換使用，指的是至少包含第一條多肽和第二條多肽的分子，其中，所述第二條多肽在胺基酸序列上與所述第一條多肽相差至少一個胺基酸殘基。異源多聚體可以包括由所述第一條多肽和第二條多肽形成的「異源二聚體」，或者可以形成更高級的三級結構，在所述三級結構中還存在除所述第一條多肽和第二條多肽以外的多肽。除了上下文另外指明的情況，術語「第一條」多肽和「第二條」多肽及其變形僅是一般性代號，不應將其視作確定本發明的異源多聚體的具體或特定的多肽或組成部分。術語「多肽」、「肽」、「蛋白」和「蛋白片段」在本文中可互換使用，指的是胺基酸殘基的聚合物。這些術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應的天然存在的胺基酸的人造化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。術語「胺基酸」是指天然存在的和合成的胺基酸，以及在功能上與天然存在的胺基酸相似的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來受到修飾的那些胺基酸，例如，羥基脯氨酸、Y-羧基穀氨酸和0-磷酸絲氨酸。 胺基酸類似物是指基礎化學結構與天然存在的胺基酸相同的化合物，例如，與氫、羧基、氨基和R基結合的α碳，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。這種類似物可以具有經修飾的R基(例如正亮氨酸)或經修飾的肽骨架，但保留了與天然存在的胺基酸相同的基礎化學結構。胺基酸模擬物是指結構與胺基酸的通常化學結構不同、但功能與天然存在的胺基酸相似的化合物。帶負電荷的胺基酸包括天冬氨酸(或天冬氨酸鹽) 和穀氨酸(或穀氨酸鹽)。帶正電荷的胺基酸包括精氨酸、組氨酸和賴氨酸。在最廣意義上講，本文所用的術語「抗體」和「免疫球蛋白，，可以互換使用，其包括本文所述的單克隆抗體(例如，全長或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要其表現出所需生物活性即可)和抗體片段。術語「雙特異性抗體」意在包括具有兩種不同的結合特異性的任何抗體，即，該抗體結合兩個不同的表位，這兩個表位可以位於同一靶抗原上，或更常見地位於不同的靶抗原上。天然抗體和免疫球蛋白通常是約150，000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，但不同的免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數量有所不同。每條重鏈和輕鏈還具有規則間隔的鏈內二硫橋。每條重鏈在一端具有可變區(Vh)，之後是多個恆定區。每條輕鏈在一端具有可變區(\)，並在另一端具有恆定區。輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區對齊，而輕鏈的可變區與重鏈的可變區對齊。據信，特定胺基酸殘基構成輕鏈和重鏈可變區間的界面(Clothia 等，J. Mol. Biol. 186，651-66，1985) ；Novotny 和 Haber，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,4592-4596(1985)).根據其重鏈組成，定義了五個人免疫球蛋白類別，即IgG、IgM、 IgA、IgE和IgD。將IgG類和IgA類抗體進一步劃分為亞類，即IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgAl和IgA2。IgG、IgA和IgD抗體中的重鏈具有三個恆定區域，命名為CHI、CH2和 CH3，而IgM和IgE抗體的重鏈具有四個恆定區域，即CHl、CH2、CH3和CH4。因此，重鏈具有一個可變區和三個或四個恆定區，對免疫球蛋白結構和功能的綜述見例如Harlow等編， 《Antibodies :A Laboratory Manual》，第 14 章，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor(1988)。「抗體片段」僅包含完整抗體的一部分，其中該部分優選保留至少一種、優選大部分或全部的存在於完整抗體中時與該部分通常相關的功能。本文所用術語「單克隆抗體」是指從基本同源的抗體群體中獲得的抗體，S卩，除了可能少量存在的可能自然發生的突變外，組成該群體的個體抗體是相同的。單克隆抗體特異性高，且結合單一抗原。此外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製備物不同的是，每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。所述抗體「選擇性地結合」或「特異性地結合」的意思是，該抗體與表位的反應或聯結比與替代性物質(包括不相關蛋白)的反應或聯結更頻繁、更迅速、保持時間更長、親和力更強或上述效果的某種組合。 「選擇性地結合」或「特異性地結合」意思是，例如，抗體與蛋白結合的Kd為至少約0. ImMdfi 更常見為至少約ΙμΜ。「選擇性地結合」或「特異性地結合」有時是指，抗體與蛋白結合的 Kd有些時候為至少約0. 1 μ M或更佳，另外一些時候為至少約0.01 μ M或更佳。由於不同物種中的同源蛋白間存在序列同一性，特異性結合可以包括識別多於一種物種中的腫瘤細胞標誌物蛋白的抗體。術語「表位」或「抗原決定簇」在本文中可互換使用，指的是能夠被特定抗體識別並特異性地結合的抗原的部分。當抗原是多肽時，表位可以由連續胺基酸構成，也可以由藉助蛋白的三級結構摺疊而並置的不連續胺基酸構成。由連續胺基酸構成的表位通常在蛋白變性時得以保留，然而通過三級結構摺疊形成的表位通常在蛋白變性時丟失。表位通常包含獨特空間構象中的至少3個且更常見為至少5個或8 10個胺基酸。本文的抗體具體包括「嵌合」抗體及這種抗體的片段(只要這些片段顯示出所需的生物活性即可)，「嵌合」抗體中，重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的對應序列相同或同源，而上述鏈的剩餘部分則與源自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的對應序列相同或同源(美國專利第4，816，567號；和 Morrison 等，Proc. Natl. Acad, ki USA 81:6851-6855(1984))。非人(例如，鼠)抗體的「人源化」形式是包含最低限度的源自非人免疫球蛋白序列的嵌合抗體。在多數情況下，人源化抗體是其中來自受體超變區的殘基被具有所需特異性、親和力和結合力的來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類等非人物種(供體抗體)的超變區的殘基置換了的人免疫球蛋白(受體抗體)。在一些情況下，將人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基置換為相應的非人殘基。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中都不存在的殘基。做這些修飾是為了進一步改善抗體的性能。通常，人源化抗體基本上會包含至少一個且通常兩個可變區域中的全部，其中，全部或基本上全部超變環都對應非人免疫球蛋白的超變環，且全部或基本上全部FR都是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體可選地還包含免疫球蛋白(通常為人免疫球蛋白)恆定區(Fe)的至少一部分。更多細節參見 Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323-329(1988)； 和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。另外參見以下綜述文章和其中引用的參考文獻Vaswani 禾P Hamilton，Ann. Allergy，Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998)； Harris, Biochem.Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995) ；Hurle 禾口 Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428-433(1994)。「人抗體」是具有與人產生的抗體的胺基酸序列對應的胺基酸序列的抗體和/或已通過使用本文公開的製造人抗體的任何技術製成的抗體。人抗體的該定義特定地排除了包含非人的抗原結合殘基的人源化抗體。「親和力成熟」抗體是在其一個或多個CDR中具有一個或多個修改的抗體，與不具有這些修改的親本抗體相比，所述修改使該抗體與抗原的親和力提高。優選的親和力成熟抗體對靶抗原的親和力將是納摩爾或甚至是皮摩爾級。通過本領域已知的程序來製造親和力成熟抗體。Marks等，Bio/Technology 10 :779-783 (1992)描述了通過VH和VL區改組來進行親和力成熟。對CDR和/或框架殘基的隨機突變在以下文獻中有所描述=Bartas 等，Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809-3813(1994) Jchier 等，Genel69 :147-155(1995)； Yelton 等，J. Immunol. 155 :1994-2004(1995) ；Jackson 等，J. Immunol. 154(7) 3310-9 (1995)；和 Hawkins 等，J. Mol. Biol. 226 :889-896 (1992)。本文所用的術語「Fe區」通常是指包含免疫球蛋白重鏈C端多肽序列的二聚體複合體，其中，C端多肽序列是通過用木瓜蛋白酶消化完整抗體而得到的序列。Fc區可以包括天然或變異的Fc序列。雖然免疫球蛋白重鏈Fc序列的界限可以有所不同，但通常將人 IgG重鏈Fc序列定義為從約Cys2^位基或從約ftx)230位的胺基酸殘延伸至Fc序列的羧基端。免疫球蛋白的Fc序列通常包含兩個恆定的結構域，即CH2結構域和CH3結構域，並可選地包含CH4結構域。本文的「Fe多肽」意為構成Fc區的多肽中的一條。Fc多肽可以從任何適合的免疫球蛋白獲得，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型，IgA、IgE、IgD或IgM。 在一些實施方式中，Fc多肽包含部分或全部的野生型鉸鏈序列(通常位於其N端)。在一些實施方式中，Fc多肽不含功能性的或野生型的鉸鏈序列。本文所用的「鉸鏈區」、「鉸鏈序列」及其變化形式包涵本領域已知的意義，該意義在例如以下文獻中有所說明Janeway等，Immuno Biology :the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd. , NY)(第 4 版，1999) ；Bloom 等，Protein Science (1997)，6 :407-415 ；Humphreys φ, J. Immunol. Methods (1997), 209 :193-202。本文所用的術語「在嚴格條件下雜交」意在描述用於雜交和清洗的條件，在該條件下，彼此至少60%同源的核苷酸序列通常會保持彼此雜交。在一些實施方式中，該條件使得彼此間的同源性為至少約70%、至少約80%、至少約85%或90%的序列通常保持彼此雜交。這種嚴格條件對本領域的技術人員而言是已知的，且可見於Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6 中。嚴格雜交條件的一個非限制性實例是於約45°C在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中的雜交，隨後是於50°C 65°C用0. 2XSSC、0. 1% SDS進行的一次或多次清洗。本文所用的術語「細胞毒素」或「細胞毒劑」是指抑制或阻止細胞功能且/或引起細胞破壞的物質。該術語意在包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、 Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)；化療齊U，例如氨甲喋呤、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼、長春鹼、依託泊苷)、多柔比星、美法侖、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥、道諾菌素(daimorubicin)或其他嵌插劑；酶及其片段，例如核水解酶；抗生素；和毒素，例如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；以及下文公開的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。下文描述了其他細胞毒劑。腫瘤破壞劑(tumoricidal)引起腫瘤細胞的破壞。「藥物可接受」是指聯邦或州政府的管理局已許可或可以許可，或者在美國藥典或其他公認的用於動物(包括人)的藥典中列出。「藥物可接受的載質」是指與本文公開的至少一種抗體一起施用的稀釋劑、佐劑、 賦形劑或載劑。本文所用的術語「受試者」是指任何動物(例如，哺乳動物)，包括但不限於人、非人靈長類動物、嚙齒類動物等，其將是特定治療的接受者。通常，述及人受試者時，術語「受試者」和「患者」在本文中可以互換使用。術語「治療有效量」是指有效「治療」受試者或哺乳動物的疾病或病症的抗體、多肽、多核苷酸、有機小分子或其他藥物的量。對於癌症的情況，治療有效量的藥物可以減少癌細胞數量、減小腫瘤尺寸、抑制或終止癌細胞向周邊器官的浸潤(包括例如癌向軟組織和骨中的擴散)、抑制和終止腫瘤轉移、抑制和終止腫瘤生長、在一定程度上減輕一種或多種癌症相關症狀、降低發病率和死亡率、提高生命質量或這些效果的組合。只要藥劑會阻止生長和/或殺死已存在的癌細胞，就可以稱之為抑制細胞生長的和/或細胞毒性的。本文所用的術語「多核苷酸」或「核酸」是指由通過磷酸二酯鍵連接的多個核苷酸單元(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或相關的結構變體)組成的聚合物，包括但不限於DNA或RNA。該術語涵蓋了包括DNA和RNA的任何已知鹼基類似物的序列，所述鹼基類似物包括但不限於4-乙醯胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、 5_(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、次黃嘌呤核苷(inosine)、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃嘌呤核苷、2，2_ 二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、 7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、 2-甲基巰基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、氧丁醇核苷 (oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2_硫胞嘧啶、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶5-羥乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶和2，6- 二氨基嘌呤。本文所用的術語「載體」意在指核酸分子，其能夠運輸與其連接的另一核酸。一種類型的載體是「質粒」，其是指環狀雙鏈DNA環，其中連接有額外的DNA片段。另一類型的載體是噬菌體載體。再一類型的載體是病毒載體，其中，額外的DNA片段可以連接至病毒基因組中。某些載體能夠在已導入這些載體的宿主細胞中進行自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體，和游離的哺乳動物載體)。在導入宿主細胞時，其他載體(例如，非游離的哺乳動物載體)可以整合到宿主細胞的基因組中，從而隨宿主基因組一起進行複製。此夕卜，某些載體能夠引導與其可操作地連接的基因的表達。本文中將此類載體稱作「重組表達載體」(或簡稱「重組載體」)。一般而言，在重組DNA技術中使用的表達載體通常為質粒形式。由於質粒是最常用的載體形式，在本文中，「質粒」和「載體」可以互換使用。
本發明的異源多聚體多肽可用於治療多種病症。「病症」是指會從用本發明的抗體或方法進行的治療中獲益的任何病況。其包括慢性的或急性的病症或疾病，包括使哺乳動物對所討論的病症有患病傾向的那些病理狀況。本文中要治療的病症的非限制性實例包括細胞增殖症；非白血病和淋巴惡性腫瘤；神經元的、神經膠質的、星形細胞的、丘腦下部和其他腺的、巨噬細胞的、上皮的、間質的和囊胚腔的病症；和炎性、免疫學及其他血管生成相關病症。術語「細胞增殖症」和「增殖症」是指與一定程度的異常細胞增殖有關的病症。 在一個實施方式中，所述細胞增殖症是癌症。本文所用的「腫瘤」是指不論惡性或良性的所有贅生性細胞生長和增殖，以及所有癌前的和癌的細胞和組織。通常，將特定抗原用作本發明的異源多聚體多肽的靶標。在一個實施方式中，所述抗原是腫瘤抗原。本文所用的「腫瘤抗原」包括與正常細胞相比在腫瘤細胞上差異表達的任何分子。在一些實施方式中，與正常細胞相比，在腫瘤細胞中，該分子以可檢測地或顯著地更高或更低的水平進行表達。在一些實施方式中，與正常細胞相比，在腫瘤細胞中，該分子顯示出可檢測地或顯著地更高或更低水平的生物活性。在一些實施方式中，已知或認為該分子對腫瘤細胞的致瘤特性有貢獻。多種腫瘤抗原在本領域中是已知的。還可以根據本領域技術人員所公知的技術和測定來確定分子是否是腫瘤抗原，例如無性系形成測定 (clonogenic assay)、轉化測定、體外或體內腫瘤形成測定、凝膠遷移測定、基因敲除分析寸。術語「癌症」或「癌的」是指或描述哺乳動物的生理病況，其常見特徵為失調的細胞生長/增殖。癌症的實例包括但不限於癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(例如，非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌症的更多具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、 非小細胞肺癌、肺部腺癌、肺部鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌(h印atocellular cancer)、胃腸癌、 胰腺癌、膠質母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤(h印atoma)、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝臟癌Q^patic carcinoma)和多種類型的頭部頸部癌。本文所用的「治療」是指意在改變受治療個體或細胞的自然進程的臨床幹預，可以為了預防而進行治療，或在臨床病理學進程中進行治療。治療的理想效果包括防止疾病的出現和復發、減輕症狀、減少疾病的任何直接或間接的病理學後果、防止轉移、降低疾病進展速度、改善或舒緩疾病狀況和緩解或改進預後。在一些實施方式中，使用本發明的抗體來推遲疾病或病症的發展。「有效量」是指在劑量形式和持續時間方面需要的有效實現所需的治療結果或預防結果的量。本發明的抗體的「治療有效量」可以根據諸如疾病狀況、年齡、性別和個體體重等因素以及該抗體在該個體中引發所需的響應的能力而有所不同。治療有效量還指治療有益效果超過了抗體的任何有毒或有害效果的量。在一方面，本發明提供在其免疫球蛋白Fc的CH3結構域內包含取代的異源多聚體多肽，所述取代促進異源二聚體化。這些取代包括對含有CH3結構域的一條多肽中的至少一個胺基酸的置換。在一個實施方式中，被取代的胺基酸是帶電荷的胺基酸，或者是疏水/ 親水胺基酸。在某些實施方式中，在本發明的第一條或第二條多肽內進行的取代發生在至少一個胺基酸上，所述胺基酸的側鏈從第一條多肽的與第二條多肽的界面伸出或者位於該界面處，並因此位於與第二條多肽的同樣位於這兩條多肽界面處的胺基酸相互作用的位置上。 「界面」意指獨立的多肽發生相互接觸的位置。表1顯示了位於兩條含有CH3結構域的多肽的界面處的胺基酸的預測實例。在一個實施方式中，改變胺基酸側鏈以使第一條和第二條多肽間的靜電相互作用發生變化，可使異源多聚體穩定，並因此使異源多聚體的形成比同源多聚體的形成更佔優勢。同源多聚體分子將包含帶相似電荷的分子，並且將自然地相互排斥。異源多聚體分子包含側鏈會相吸引的胺基酸對，因此有利於異源多聚體的形成。在一方面，本發明展示出，對含有CH3結構域的一條多肽的位於236位、245位、249 位、278位、286位和288位的一個或多個胺基酸進行取代的結果是，相對於所形成的同源二聚體的量，異源多聚體優先形成。以上列出的胺基酸位置是在從人IgG2重鏈恆定區的起點 (即，CHl序列的N端)開始對胺基酸進行編號時位於IgG2的CH3結構域內的位置。胺基酸位置在四種IgG同種型內以及在IgG、IgA和IgD之間是可變的。因此，特定的胺基酸位置並不意味著限於位於任何一種免疫球蛋白中的特定位置上的胺基酸，而是意味著涵蓋所有免疫球蛋白同種型中的位於與在人IgG2CH3結構域中提到的那些位置對應的位置上的胺基酸殘基。位於四種IgG同種型內的胺基酸的這種可變性示於表1中，並圖示在圖2 圖4中。選擇靶位點顯著改變保持多肽的電荷和/或疏水性的效果的取代，從而實現了異源多聚體多肽的優先形成。根據側鏈性質上的相似性，可以將胺基酸分組為 (見 A. L. Lehninger,《Biochemistry》，第 2 版，第 73-75 頁，Worth Publishers, New York (1975))(1)非極性胺基酸Ala(A)，Val (V), Leu (L)，Ile(I), Pro (P), Phe (F)，Trp (W), Met (M)；(2)無電荷的極性胺基酸=Gly (G)，Ser (S)，Thr (T)，Cys (C)，Tyr (Y)，Asn (N)， Gln(Q)；(3)酸性胺基酸=Asp (D)，Glu (E)；(4)鹼性胺基酸=Lys (K)，Arg(R)，His (H)。另一個選擇是，可以根據相同的側鏈性質將天然存在的殘基劃分為以下各組(1)疏水胺基酸正亮氨酸，Met, Ala, Val, Leu, Ile ；(2)中性親水胺基酸:Cys, Ser，Thr，Asn, Gln ；(3)酸性胺基酸Asp，Glu ；(4)鹼性胺基酸:His, Lys，Arg ；(5)殘基影響鏈方向的胺基酸Gly，Pro ；(6)芳香族胺基酸 Jrp，Tyr，Phe。在本發明的一些實施方式中，用具有酸性側鏈的胺基酸置換了具有鹼性側鏈的胺基酸，或反之。例如，用天冬氨酸或穀氨酸置換鹼性胺基酸賴氨酸、精氨酸或組氨酸。在一些實施方式中，用疏水胺基酸取代親水胺基酸(或至少相對親水的胺基酸)。 此類型取代的實例是用苯丙氨酸置換酪氨酸殘基。在某些實施方式中，經過置換，除去了特定胺基酸位置上的aa羥基側鏈並提高了該部位的疏水性，上述特定胺基酸位置位於含有 CH3結構域的多肽之間的界面上或接近該界面。本文所用的「Var3」和「 13A」可互換使用，用來描述包含下述取代的變體用賴氨酸取代236位上的穀氨酸，並且用賴氨酸取代278位上的天冬氨酸。本文所用的「Varl」和 「13B」同樣可互換使用，用來描述包含下述取代的變體用穀氨酸取代249位上的賴氨酸， 並且用穀氨酸取代288位上的賴氨酸。在一個實施方式中，對於第一條多肽修改編碼位於界面的胺基酸的核酸，以改變胺基酸離子配對的電荷。為了達到這一目的，將編碼第一條多肽的界面中的至少一個「原始」胺基酸殘基的核酸置換為編碼至少一個側鏈電荷與所述原始胺基酸殘基相反的胺基酸殘基的核酸。應認識到的是，可以有多於一對的原始殘基和對應的取代殘基。被置換的原始殘基的數量上限是第一條多肽和第二條多肽的界面中的殘基總數。「原始核酸」意思是編碼第一條多肽或第二條多肽的可「修改」(即，遺傳改造) 的核酸。原始核酸或起始核酸可以是天然存在的核酸或者可以包含已經過預先修改的核酸(例如，人源化抗體片段)。「修改」核酸，意思是通過置換至少一個編碼興趣胺基酸殘基的密碼子來改變原始核酸。以此方式對DNA進行遺傳改變的技術已在Mutagenesis :a Practical Approach, MJ. McPherson 編，IRL Press, Oxford, UK. (1991)中有所綜述，並且包括例如定點突變、盒式突變和聚合酶鏈式反應(PCR)突變。通過改變原始核酸，相應地修改了原始核酸所編碼的原始多肽。在本發明的一個實施方式中，異源多聚體多肽是雙特異性抗體。在某些實施方式中，雙特異性抗體包含第一條多肽，即與輕鏈多肽配對的重鏈多肽；和第二條多肽，即與另一輕鏈多肽配對的第二重鏈多肽。還包括具有多於兩個結合價的異源多聚體多肽。例如，使用本文所述的方法還可以製備三特異性抗體(Tutt等，J. Immunol, 147 :60(1991))。在本發明的一個實施方式中，該方法包括製造異源多聚體分子，例如雙特異性抗體，該分子利用能夠與存在於雙特異性分子中的兩個重鏈可變區配對的單一輕鏈。為了鑑定此輕鏈，可以採用多種方案。在一個實施方式中，針對雙特異性抗體所能夠靶定的每個抗原，鑑定出了一系列單克隆抗體，隨後確定了這些抗體所用的輕鏈中的哪一條能夠在與針對第二靶標而鑑定出的任何抗體的重鏈配對時發揮功能。以此方式，可以鑑定出能夠與兩條重鏈一起發揮功能從而能夠與兩個抗原結合的輕鏈。在另一個實施方式中，諸如噬菌體展示等展示技術使得能夠鑑定出能夠與兩條以上重鏈一起發揮功能的輕鏈。在一個實施方式中，構建了由多樣性重鏈可變區庫和單一輕鏈可變區組成的噬菌體文庫。該文庫可以進一步用來鑑定結合各種興趣抗原的抗體。因此，在某些實施方式中，經鑑定的抗體將具有相同的輕鏈。在本發明的某些實施方式中，異源多聚體多肽包含至少一個單鏈Fv (scFv)。在某些實施方式中，異源多聚體多肽包含兩個scFv。例如，scFv可以與異源多聚體多肽中所包含的含有CH3結構域的一條多肽或全部兩條多肽融合。一些方法包括製造下述雙特異性分子其中，使用含有至少一個CH3結構域的重鏈恆定區中的一個或全部兩個來連接單鏈Fv 結構域，從而提供抗原結合。該異源多聚體分子可以包含具有不同特異性的兩個抗原結合臂。例如，可以製造包含作為抗原結合臂的第一條多肽(例如經典免疫球蛋白分子)和作為免疫球蛋白融合蛋白的第二條多肽的異源多聚體分子。可用於本發明的免疫球蛋白融合蛋白的實例是免疫粘附素。
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本文所用的術語「免疫粘附素」是指抗體樣分子，其將異源蛋白(「粘附素」，例如受體、配體或酶)的「結合結構域」與免疫球蛋白恆定區的效應組分結合。在結構上，免疫粘附素包含了具有所需結合特異性的粘附素胺基酸序列和免疫球蛋白恆定域序列的融合物，而所述具有所需結合特異性的粘附素胺基酸序列並非抗體的抗原識別和結合部位(抗原聯結部位)(即，是「異源的」)。免疫粘附素中的免疫球蛋白恆定域序列可以從任何免疫球蛋白獲得，例如 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4 亞型，IgA、IgE、IgD 或 IgM。可以製造結合任何抗原的本發明的異源多聚體多肽。在一些實施方式中，異源多聚體多肽結合選自由下述物組成的組的一個或多個抗原DLL4、VEGF, VEGFR2、NotchU Notch2、Notch3、Notch4、Notch (全)、JAG1、JAG2、DLL (全)、JAG (全)、EGFR、ERBB2、ERBB3、 ERBB (全)、c-Met、IGF-1R、PDGFR、Patched、Hedgehog 家族多肽、Hedgehog (全)、WNT 家族多肽、WNT (全)、FZDU FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FS) 10、FS)(全)、 LRP5、LRP6、CD20、IL-6、TNFalpha, IL-23、IL-17、CD80、CD86、CD3、CEA、Muc 16, PSMA, PSCA, CD44、c-Kit、DDRl、DDR2、RSPO 1、RSP02、RSP03、RSP04、RSP0 (全)、BMP 家族多肽、BMP (全)、 BMPRla、BMPRlb及其組合。本文所用的「全(pan) 」意在描述與來自同一家族中的多種抗原結合的異源多聚體多肽。例如，「Notch (全)」意在描述與Notchl、N0tch2、N0tch3或Notch4 的組中的超過一種抗原結合的異源多聚體多肽。在一個實施方式中，異源多聚體多肽特異性地結合DLL4和VEGF。在一個實施方式中，異源多聚體多肽中的一條多肽結合DLL4的特異性與申請日為2007年9月觀日的共同待決的美國專利申請第11/905，392號(通過援引將其併入本文)中所描述的21M18抗體的特異性相同。在一個實施方式中，本發明提供結合VEGF的抗體。在一個實施方式中，本發明提供特異性地結合VEGF的抗體Q19R0302)，其中，所述抗體包含(a)包含GYTFTNYWMH(SEQ ID NO 20)的重鏈 CDRl，包含 SINPSNGGTSYNEKFKR(SEQID NO 21)的重鏈 CDR2,和包含 HYYDNSYAMDY(SEQ ID NO 22)的重鏈 CDR3 ；和 / 或(b)包含 QASQDISNYVN(SEQ ID NO 23)的輕鏈 CDRl，包含 DASNLQT (SEQ IDNO 24)的輕鏈 CDR2，和包含 QQYDDLPP (SEQ ID NO 25)的輕鏈CDR3。在另一個實施方式中，本發明提供特異性地結合VEGF的抗體 0191 020幻，其中，所述抗體包含(a)包含GYTFTNYWMH (SEQ ID NO :20)的重鏈CDR1，包含 SINPSNGGTSYNEKFKR (SEQ ID NO :21)的重鏈 CDR2，和包含 HYYDNSYAMDY (SEQ ID NO :22)的重鏈 CDR3 ；和 / 或(b)包含 RASQGINNHLAW(SEQ ID NO :26)的輕鏈 CDR1，包含 AASNLHS (SEQ ID NO 27)的輕鏈 CDR2，和包含 QQYDNLPL (SEQID NO :28)的輕鏈 CDR3。在一個實施方式中，VEGF和DLL4異源多聚體多肽包括特異性與21M18相同的抗體和219R0302或219R0202。這些異源多聚體多肽在製成後可以具有與重鏈連接的輕鏈，或使用相同的輕鏈。在一個實施方式中，抗體在其Fc區中包含本文所述的13A/i;3B取代。在一個實施方式中，VEGF結合序列包含SEQ ID N0:17或SEQ ID NO :18。在一個實施方式中，DLL4結合序列包含SEQ ID N0:19。在另一個實施方式中，所述雙特異性抗體包含VEGF結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ IDNO 11的重鏈序列和 SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 15的輕鏈序列；所述DLL4結合序列包含SEQ ID NO :19。在又一個實施方式中，所述異源多聚體多肽包含=VEGF結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF 結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID NO 13的輕鏈序列；所述DLL4結合序列包含SEQ ID N0:19。在再一個實施方式中，所述異源多聚體多肽包含VEGF結合序列和 DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID NO 15的輕鏈序列；所述DLL4結合序列包含SEQ ID NO :19。在另一個實施方式中，VEGF結合序列包含選自由SEQ ID NO 10、SEQ ID NO : 和 SEQ ID NO :30組成的組的多肽。在一個實施方式中，VEGF多肽是抗體。在一些實施方式中，異源多聚體多肽或抗體是完整抗體，例如單克隆抗體或人源化抗體。在另一個實施方式中，所述抗體是抗體片段，例如Fab或scFv。在一個實施方式中，抗VEGF抗體/多肽抑制腫瘤生長。本發明的異源多聚體多肽可以具有雙特異性(二價)，並且能夠同時結合兩種不同的抗原。在一個實施方式中，異源多聚體多肽包含兩個抗體聯結部位。在另一個實施方式中，異源多聚體多肽是二價的免疫粘附素。不同的抗原可以位於不同的細胞上或同一細胞上。可以例如通過以下方法來在體外顯示出抗原的交聯提供已結合有第一抗原的固體表面，添加對第一抗原有特異性的雙特異性抗體並添加第二抗原，該結合蛋白對第二抗原也有特異性，隨後檢測已結合的第二抗原的存在。在某些實施方式中，本發明的異源多聚體多肽可以阻斷兩個受體與其相應配體間的相互作用。例如，對DLL4和VEGF有特異性的雙特異性抗體抑制VEGF所誘導的細胞遷移和Notch受體信號傳導。在此情況下，兩種受體結合特異性的組合在抑制細胞遷移方面比單獨的親本抗體更具功效。本發明的異源多聚體分子還可以是一價的，意思是其具有一個抗原結合部位。在一個實施方式中，一價異源多聚體多肽具有一個可變區，而第二含有CH3結構域的多肽在被截短後不含可變區。這些第二含有CH3結構域的多肽可以具有可檢測的標籤。在一個實施方式中，一價異源多聚體多肽包含FLAG表位。FLAG表位是由8個胺基酸殘基(DYKDDDDK) 組成的合成表位。在另一個實施方式中，一價異源多聚體多肽是免疫粘附素。在一個實施方式中，以稱作單基因雙特異性(SGBSP)的第一種構造製造了本發明的異源多聚體分子。為了產生SBGSP，使用30個胺基酸的連接物來以遺傳手段將輕鏈綁縛或連接到其重鏈上(參見Lee等，Mol. Immunol. 36 :61-71 (1999))。因此，每個SGBSP結合單元可以使用其自身的輕鏈來形成結合其相應靶標的Fab結合單元。在一個實施方式中，所述單基因還包含Var3/13A和Var 1/1 突變。在一個實施方式中，使用抗DLL4和抗VEGF抗體來產生SGBSP。在一個實施方式中，製造21M18和219R0302/219R0202重鏈來作為SGBSP。 在另一個實施方式中，克隆了分別帶有13B和13A突變的21M18和219R0302/219R0202重鏈。在又一個實施方式中，以稱作一價雙特異性(MBSP)的第二種構造製造了本發明的異源多聚體分子。MBSP使用同樣的輕鏈和包含Var3/13A和Varl/UB突變的兩條不同的重鏈。對於MBSP，兩條重鏈之一或全部必須與同樣的輕鏈組合來結合其靶標。在一些實施方式中，該同樣的輕鏈是一條上述重鏈的親本輕鏈。在一個實施方式中，使用抗 DLL4和抗VEGF抗體來產生SGBSP。在一個實施方式中，製造21M18和219R0302/219R0202 重鏈來作為SGBSP。在另一個實施方式中，克隆了分別帶有1 和13A突變的21M18和 219R0302/219R0202 重鏈。為了表達具有\和Vh域的選定組合或隨機組合的本發明的異源多聚體分子，將編碼這些域的V基因裝配到細菌表達載體中。例如，可以使用含有編碼細菌分泌信號序列和肽連接物的序列的、並且含有用於插入\和Vh基因的易用限制性位點的載體。作為另一選擇，可能合乎需要的是，通過例如使用重疊引物的PCR擴增，首先將全部必要的編碼序列 (例如，分泌序列、\、Vh和連接肽)裝配到單一序列中，隨後將其連接到質粒或其他載體中。 當需要提供\和Vh域的特定組合時，使用對編碼這些域的序列有特異性的PCR引物。當需要產生大量\和Vh域的多種組合時，使用引物混合物來擴增多種序列。用於構建和在細菌中表達本發明的異源多聚體多肽的載體是可以獲得的，其包含分泌信號序列和易用的限制性克隆位點。從B細胞雜交瘤的cDNA中分離出編碼對特定抗原有特異性的結合部位的\和Vh基因組合。另一選擇是，從基因組DNA獲得八和 Vh基因的隨機組合，並且篩選與興趣抗原結合的產物。通常，採用聚合酶鏈式反應(PCR) 來進行克隆，並使用與克隆載體中的限制性位點相容的引物。參見例如Dreher，M.L.等 (1991)J. Immunol. Methods 139 :197-205 ；Ward, Ε. S. (1993)Adv. Pharmacol. 24 :1-20 ； Chowdhury, P.S.禾口 Pastan，I. (1999)Nat. Biotechnol. 17 :568_572。在一個實施方式中，本發明提供表達本文所述的多肽或抗體的多核苷酸。在一個實施方式中，本發明提供在嚴格條件下與編碼本發明的多肽或抗體的多核苷酸雜交的多核苷酸。在一個實施方式中，所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO 12,SEQ ID N0:14或SEQ ID NO :16。在一個實施方式中，本發明的雙特異性抗體是通過表達下述物而製成的1)第一條多肽，其包含與第一種特異性對應的重鏈可變域，所述重鏈可變域與第二種特異性的輕鏈可變域連接；和2~)第二條多肽，其包含與第一種特異性對應的輕鏈可變域，所述輕鏈可變域與第二種特異性的重鏈可變域連接。對於本發明的某些異源多聚體多肽，合乎需要的可能是在其他宿主細胞中進行表達。例如，包含恆定域的異源多聚體多肽通常在真核細胞中更高效地表達，包括酵母、昆蟲、 脊椎動物和哺乳動物的細胞。在所表達的產物需要糖基化時，將有必要使用此類細胞。可以將編碼第一條和第二條多肽的DNA片段克隆至例如HCMV載體中，該載體經設計用來在哺乳動物細胞中表達人重鏈的人輕鏈(參見例如Bendig等，美國專利第5，840，299號；Maeda等 (1991)Hum. Antibod. Hybridomas 2，124-134)。此類載體包含用於高水平轉錄輕鏈和重鏈構建體的人巨細胞病毒(HCMV)啟動子和增強子。在優選實施方式中，輕鍊表達載體是編碼人 κ 輕鏈的 pKNIOO (由 S. Tarran Jones 博士惠贈，MRC Collaborative Center, London, England)，重鍊表達載體是編碼人Y _1重鏈的pGlD105 (由S. Tarran Jones博士惠贈)。 兩種載體都包含在哺乳動物細胞和大腸桿菌中具有功能的HCMV啟動子和增強子、複製起點和可選標誌物。可選標誌物是編碼對在選擇性培養基中生長的已轉化的宿主細胞的生存或生長而言必要的蛋白的基因。常見的可選標誌物編碼具有下述作用的蛋白(a)提供對抗生素或其他毒素(例如，氨苄青黴素、新黴素、氨甲喋呤或四環素)的抗性，(b)補充營養缺陷， 或(c)供應不能從複雜培養基中得到的關鍵營養成分，例如，編碼桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。特別有用的可選標誌物提供對氨甲喋呤的抗性。例如，通過在包含氨甲喋呤(Mtx) (DHFR的競爭性拮抗劑)的培養基中培養全部轉化體，轉染有DHFR選擇基因的細胞首先被鑑定。當採用野生型DHFR時，適合的宿主細胞是缺乏DHFR活性的中華倉鼠卵巢(CHO)細胞系，該細胞系的製備和繁殖如 Urlaub 和 Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,4216 所述。隨後使已轉染的細胞暴露於升高水平的氨甲喋呤下。這導致多拷貝的DHFR基因的合成，並且伴隨有多拷貝的構成表達載體的其他DNA的合成，所述其他DNA例如為編碼抗體或抗體片段的DNA。在另一實例中，當使用氨基蝶呤阻斷DNA合成時，缺乏胸腺嘧啶激酶(TK) 的突變骨髓瘤細胞不能使用外源供應的胸腺嘧啶。可用於轉染的載體攜帶完整TK基因，該基因使得可以在補充有胸腺嘧啶的培養基中生長。當需要在酵母中表達基因構建體時，適合用於酵母的選擇基因是存在於酵母質粒 YRp7 中的 trpl 基因。Stinchcomb 等，1979 Nature, 282, 39 ；Kingsman 等，1979，Gene7，141。 trpl基因為沒有能力在色氨酸中生長的酵母突變株(例如，ATCC No. 44076或PEP4-1. Jones (1977)Genetics 85，12.)提供選擇標誌物。酵母宿主細胞基因組中tip I損傷的存在則為通過在無色氨酸情況下生長來檢測轉化提供了有效環境。類似地，缺乏Leu2的酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)通過帶有Leu2基因的已知質粒而得到補充。用於轉化載體和表達本發明的抗體的優選宿主細胞是細菌細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞，例如，C0S-7細胞、中華倉鼠卵巢(CHO)細胞和淋巴起源的細胞系(例如淋巴瘤、 骨髓瘤或雜交瘤細胞)。用本領域已知的方法在液體培養基中培養已轉化的宿主細胞，所述培養基包含可同化的碳源，例如糖類(如葡萄糖或乳糖)；氮源，例如胺基酸、肽、蛋白或其降解產物(如蛋白腖、銨鹽等)；和無機鹽，例如鈉、鉀、鎂和鈣的硫酸鹽、磷酸鹽和/或碳酸鹽。該培養基還包含例如生長促進物質，例如微量元素(如鐵、鋅、錳等)。異源多聚體分子可用於本文所述的診斷和治療方法中。在某些實施方式中，使用本發明的分子來檢測生物樣品(例如，患者組織活檢物、胸膜流出物或血樣)中的腫瘤細胞標誌物蛋白的表達。可以對組織活檢物進行切片，並且使用例如免疫螢光或免疫組化來檢測蛋白。此外，可以分離出來自樣品的單個細胞，並通過FACS分析來在固定細胞或活細胞上檢測蛋白表達。在某些實施方式中，可以在蛋白陣列上使用異源多聚體分子來檢測腫瘤細胞標誌物的表達，例如腫瘤細胞標誌物在腫瘤細胞上、細胞裂解物中或其他蛋白樣品中的表達。在某些實施方式中，在體外細胞水平測定、體內動物模型等中，通過使異源多聚體分子與腫瘤細胞接觸，用本發明的異源多聚體分子來抑制腫瘤細胞的生長。在某些實施方式中，通過施用治療有效量的針對一種或多種腫瘤細胞標誌物的異源多聚體分子，用異源多聚體分子來治療患者的癌症。在本發明的一些實施方式中，異源多聚體分子是人源化的雙特異性抗體。人源化抗體是在構成每條抗體鏈內的三個互補決定區(CDR)的抗原決定區或超變區內包含最低限度的來自非人(例如嚙齒類動物)抗體的序列的抗體。在施用到人受試者中時，此類抗體治療性地用於降低抗原性和HAMA(人抗小鼠抗體)響應。在實踐中，人源化抗體通常是帶有最少的非人序列或基本沒有非人序列的人抗體。人抗體是由人產生的抗體或胺基酸序列與人所產生的抗體對應的抗體。可以使用本領域中已知的各種技術來製造人源化抗體。依照Jones等，1986， Nature, 321 :522-525 ；Riechmann 等，1988，Nature, 332 :323-327 ；Verhoeyen 等，1988， Science, 239 :1534-1536.中的方法，通過用具有所需特異性、親和力和能力(capability) 的非人抗體(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等抗體)的CDR來取代人抗體的CDR，可以使抗體人源化。通過對可變的人框架區中的額外殘基和/或已置換的非人殘基中的額外殘基進行取代，可以進一步修飾人源化抗體，從而精煉和優化抗體的特異性、親和力和/或能力。對製造人源化抗體的人重鏈和/或輕鏈可變域的選擇可能對降低抗原性是重要的。根據「最優滿足(best-fit) 」法，針對已知的人可變域胺基酸序列的整個文庫，對嚙齒類抗體的可變域的序列進行篩選。因此，在某些實施方式中，使用與嚙齒類抗體的同源性最高且去掉了⑶R的人胺基酸序列作為人源化抗體的人框架區(FR) (Sims等，1993，J. Immunol, 151 2296 ；Chothia 等，1987，J. Mol. Biol, 196 :901)。另一方法使用特定 FR,所述特定 FR 源自特定輕鏈或重鏈亞類的全部人抗體的共有序列，並且該方法可以用於若干不同的人源化抗體(Carter 等，1992，PNAS，89，4285 ;Presta 等，1993，J. Immunol，151 :2623)。在某些實施方式中，使用方法的組合來揀選人可變FR，以用於產生人源化抗體。還應理解的是，被人源化的抗體(例如嚙齒類抗體)必須保留對抗原的高親和力以及其他有利的生物學性質。為了實現這一目標，可以通過對來自待人源化的嚙齒類抗體和各種候選人源化序列的親本序列進行分析來製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型對本領域技術人員而言是熟悉且可以獲得的。可以使用電腦程式來圖解和顯示選定的候選抗體序列的很可能的三維構象結構。對這些模型的使用允許對殘基在待人源化抗體功能中的可能作用進行分析，即，對影響候選抗體結合其抗原的能力的殘基進行分析。以此方式，可以將FR殘基從親本抗體中選出並組合至受體人源化抗體中，從而獲得所需的抗體特性。通常，來自親本抗體(例如，具有所需抗原結合性質的嚙齒類抗體)抗原決定區(或超變區) 的CDR中的殘基保留在人源化抗體中，以用於結合抗原。在某些實施方式中，來自親本抗體的可變FR內的至少一個額外殘基保留在人源化抗體中。在某些實施方式中，可變FR內的多達6個來自親本抗體的額外殘基保留在人源化抗體中。將來自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變區的胺基酸分別命名為Hx和Lx，其中，χ是表不Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest,U. S. Department of Health and Human Services，1987，1991.的方案中所述的胺基酸位置的編號。Kabat 列出了每個亞類的抗體的多個胺基酸序列，並且列出了該亞類中每個殘基位置上最常出現的胺基酸，從而產生了共有序列。Kabat使用了為所列序列中的每個胺基酸都分配殘基編號的方法，而且該分配殘基編號的方法已成為本領域的標準。通過參考保守胺基酸，將所討論的抗體與Kabat共有序列中的一個進行比對，從而可以將Kabat的方案擴展至未包括在他的綱要中的其他抗體。通過使用Kabat編號系統，容易鑑定出不同抗體中位於同等位置的胺基酸。例如，在人抗體的L50位置的胺基酸佔據了與小鼠抗體的胺基酸位置L50對等的位置。此外，通過使用Kabat編號系統，可以將任何兩個抗體序列以唯一方式比對，例如， 用來確定百分比同一性，從而使一個抗體序列中的每個胺基酸與另一個序列中的具有相同 Kabat編號的胺基酸對齊。在一些實施方式中，在進行比對後，如果將受試者抗體區(例如， 重鏈或輕鏈的整個成熟可變區)與參照抗體的同一區域進行比較，受試者和參照抗體區域間的百分比序列同一性是受試者和參照抗體區域中的相同胺基酸所佔位置的數量除以兩個區域中比對的位置總數(不計入空位)，再乘以100來轉換成百分比。除了人源化抗體外，使用本領域中已知的各種技術可以直接製備全人抗體。可以製造體外免疫的永生化人B淋巴細胞或從產生針對靶抗原的抗體的免疫化個體分離出的永生化人 B 淋巴細胞(參見例如 Cole 等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，第 77 頁(1985) ；Boemer 等，1991，J. Immunol.，147 (1) :86-95;和美國專利第5，750，373號)。另外，如果噬菌體文庫表達人抗體，可以從噬菌體文庫中選擇人抗體 (Vaughan 等，1996, Nat. Biotech. ，14 :309-314 ；Sheets 等，1998, Proc. Natl. Acad. Sci， 95 :6157-6162 ；Hoogenboom 和 Winter，1991，J. Mol. Biol，227 :381 ；Marks 等，1991，J. Mol. Biol,222 :581)。還可以在含有人免疫球蛋白基因座的轉基因小鼠中製造人抗體，所述小鼠在免疫化時能夠在不產生內源免疫球蛋白的情況下產生全部人抗體。在美國專利第 5，545，807,5, 545，806,5, 569，825,5, 625，126,5, 633，425 和 5，661，016 號中描述了該方法。本發明還涵蓋特異性地識別興趣抗原的雙特異性抗體，所述抗原包括但不限於腫瘤細胞標誌物。雙特異性抗體是能夠特異性地識別並結合至少兩種不同的表位的抗體(參見例如 Wu 等，Simultaneous Targeting of Multiple Disease Mediators by a Dual-Variable-Domain Immunoglobulin, Nature Biotech. , 25 (11) :1290-97)。所述不同的表位可以在同一分子內(例如，同一腫瘤標誌物多肽)或在不同分子上，從而使二者都可以例如特異性地識別並結合腫瘤細胞標誌物。雙特異性抗體可以是完整抗體或抗體片段。示例性的雙特異性抗體可以結合兩種不同的表位。雙特異性抗體還可以用來將細胞毒劑引導至表達特定抗原的細胞。這些抗體具有抗原結合臂和結合細胞毒劑或放射性核素螯合劑(例如E0TUBE、DPTA、D0TA或TETA)的臂。製造雙特異性抗體的技術在本領域中是常見的(Millstein 等，1983，Nature 305 :537-539 ;Brennan 等，1985， Science 229 :81 ;Suresh 等，1986，Methods in Enzymol 121 :120 ;Traunecker 等，1991， EMBO J. 10 :3655-3659 ；Shalaby 等，1992，J. Exp. Med. 175 :217-225 ；Kostelny 等，1992， J. Immunol. 148 :1547-1553 ;Gruber 等，1994，J. Immunol. 152 :5368 ；和美國專利第 5，731，168號)。還包括具有多於兩個結合價的抗體。例如，可以製備三特異性抗體(Tutt 等，J. Immunol. 147 :60 (1991))。在某些實施方式中，提供了異源多聚體多肽的片段，用來例如提高腫瘤穿透。用來產生抗體片段的各種技術是已知的傳統上，通過對完整抗體進行蛋白水解消化來得到這些片段(例如 Morimoto 等，1993， Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24 :107-117 ；Brennan等，1985，Science, 229 :81)。在某些實施方式中，通過重組手段來製造抗體片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可以在大腸桿菌或其他宿主細胞中表達並分泌， 從而使得可以大量地製造這些片段。還可以從上文討論的抗體噬菌體文庫中分離出此類抗體片段。抗體片段還可以是例如美國專利第5，641，870號中所描述的線形抗體，並且可以是單特異性或雙特異性的。對技術人員而言，製造抗體片段的其他技術將是顯而易見的。還可以理想的是，特別是對於抗體片段的情況，對異源多聚體分子進行修飾以提高其血清半衰期。這可以通過例如下述方式來實現通過使適合的區域突變，或通過將表位整合至肽標籤中並隨後將該標籤融合至異源多聚體分子的任一末端或中部(例如通過 DNA合成或肽合成)，從而將救助受體(salvage receptor)結合表位整合到異源多聚體分子中。為了實現本發明的目的，應認識到的是，經修飾的抗體可以包含使異源多聚體與興趣多肽聯結的任何類型的可變區。在這點上，可變區可以包含或源自經誘導可引發體液應答並產生針對所需腫瘤相關抗原的免疫球蛋白的任何類型的哺乳動物。因此，經修飾的抗體的可變區可以源於例如人、鼠、非人靈長類(例如，食蟹猴、獼猴等)或狼。在一些實施方式中，經修飾的免疫球蛋白的可變區和恆定區都是人的。在其他實施方式中，相容抗體的可變區(通常源自非人來源)可以經改造或經特定剪接而提高該分子的結合性質或降低該分子的免疫原性。就此而言，可以通過包含導入的胺基酸序列來人源化或修改可用於本發明的可變區。通過至少部分置換一個或多個⑶R，如有必要，還通過進行部分框架區置換和序列改變，來修改重鏈和輕鏈的可變區。雖然可以從與框架區所源自的抗體屬於同一類別或甚至同一亞類的抗體得到CDR，但將從不同類別的抗體且優選從來自不同物種的抗體得到 ⑶R。可以不必用來自供體可變區的整個⑶R置換全部⑶R來將一個可變域的抗原結合能力轉移至另一個。相反，可以僅需要轉移保持抗原結合部位的活性所必須的那些殘基。鑑於在美國專利第5，585，089、5，693，761和5，693，762號中所給出的證明，本領域的技術人員將完全有能力通過實施常規實驗或通過試錯試驗來獲得免疫原性降低的功能性抗體。儘管對可變區進行了修改，但本領域的技術人員將認識到，本發明的經修飾的異源多聚體可以包含抗體或其免疫反應性片段，其中，與免疫原性大致相同的、包含天然或未修改的恆定區的抗體相比，已經對一個或多個恆定區結構域的至少一部分進行了刪除或修改，從而提供了所需的生物化學特性，例如提高的腫瘤定位或降低的血清半衰期。在一些實施方式中，經修飾的抗體的恆定區將包含人恆定區。對與本發明相容的對恆定區進行的修飾包括一個或多個結構域中的一個或多個胺基酸的添加、缺失或取代。即，本文公開的經修飾的異源多聚體可以包含對三個重鏈恆定域(CHI、CH2或OK)和/或輕鏈恆定域(CL)中的一個或多個的修改或修飾。在本發明的一些實施方式中，包括其中個一個或多個結構域部分或完全缺失了的經修飾的恆定區。在一些實施方式中，經修飾的抗體將包含結構域缺失的構建體或變體，其中已除去了整個CH2結構域(ACH2構建體)。在一些實施方式中，將用短胺基酸間隔物(例如，10個殘基)來置換所除去的恆定區結構域，所述短胺基酸間隔物提供一些通常由缺失的恆定區來賦予的分子柔性。在不限制本發明的範圍的情況下，據信包含經本文所述修飾的恆定區的異源多聚體多肽提供了經修改的效應功能，該功能反過來又影響所施用的多肽的生物學特性。例如， 恆定區結構域的(通過點突變或其他方法造成的)缺失或失活可以減少循環中的經修飾抗體的Fc受體結合，從而提高腫瘤定位。在其他情況下，與本發明一致的是，恆定區修飾可以是調節補體結合，並因此降低血清半衰期和所綴合的細胞毒素的非特異性聯結。可以使用對恆定區的其他修飾來消除二硫鍵或寡糖部分，所述二硫鍵或多糖部分因提高的抗原特異性或抗體柔性而使定位增強。類似地，使用技術人員完全知曉的公知生物化學或分子工程技術，可以容易地做出本發明的恆定區修飾。本發明還涉及包含與細胞毒劑綴合的異源多聚體多肽的異源多聚體分子。細胞毒劑包括化療劑、生長抑制劑、毒素(例如，源於細菌、真菌、植物或動物的具有酶活性的毒素或其片段)、放射性同位素(即放射綴合物)等。可用於產生此類免疫綴合物的化療劑包括例如氨甲喋呤、阿黴素、多柔比星、美法侖、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥、道諾黴素或其他嵌插劑。可以使用的具有酶活性的毒素及其片段包括白喉A鏈、白候毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccirOA鏈、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐蛋白(ALeurites fordii proteins)、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜抑制劑(Momordica charantia inhibitor)、麻風樹毒
29素(curcin)、巴豆毒素、肥皂草抑制劑(sapaonaria officinalis inhibitor)、白樹毒素 (gelonin)、分裂毒素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素、依諾黴素和單端孢黴烯族毒素(tricothecenes)。在一些實施方式中，使用多種公知的螯合劑中的任一種或直接加標籤，可以使異源多聚體分子與放射性同位素綴合，所述放射性同位素例如9°Y、 125I、131I、123I、mh、1(l5Rh、iraSm、67CU、67(}a、16fiH0、177LU、186Re 和 188Re0 在其他實施方式中，所公開的組合物可以包含與藥劑、前藥或淋巴因子(例如幹擾素)偶聯的異源多聚體分子。異源多聚體分子和細胞毒劑的綴合物是使用多種雙官能蛋白偶聯劑製成的，所述雙官能蛋白偶聯劑例如N-琥珀醯亞胺-3-(2-硫代吡啶)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨醯酯的雙官能衍生物(例如鹽酸己二亞胺酸二甲酯)、活性酯(例如二琥珀醯亞胺辛二酸酯)、 醛(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物 (例如雙(對重氮基苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(例如2，6_ 二異氰酸甲苯酯)和雙活性氟化合物(例如1，5_ 二氟-2，4-二硝基苯)。還可以使用抗體和一種或多種小分子毒素(例如卡奇黴素、美登醇、單端孢黴烯和ccioeo及這些毒素的具有毒素活性的衍生物的綴合物。在一些實施方式中，異源多聚體多肽可以與其他具有免疫學活性的配體(例如抗體或其片段)複合，其中，所得的分子結合贅生性細胞和效應細胞(例如T細胞)。不論獲得了如何有用的量，可以將本發明的異源多聚體多肽以多種綴合(即，免疫綴合物)或未綴合的形式中的任何一種形式來使用。另一選擇是，可以以未綴合的或 「裸」形式來使用本發明的異源多聚體多肽，從而利用受試者的天然防禦機制(包括補體依賴型細胞毒作用(CDC)和抗體依賴型細胞毒作用(ADCC))來清除惡性細胞。選用何種綴合或未綴合的異源多聚體多肽將取決於癌症的類型和階段、對附加治療(例如，化療或外部輻射)的使用和患者的狀況。應認識到的是，鑑於本文的教導，本領域的技術人員可以容易地作出這種選擇。可以通過本領域中已知的任何方法來測定本發明的異源多聚體多肽的免疫特異性結合。可以使用的免疫測定包括但不限於使用諸如BIAcore分析、FACS分析、免疫螢光、 免疫細胞化學、蛋白質印跡、放射免疫測定、ELISA、「夾心」免疫測定、免疫沉澱測定、沉澱素反應、凝膠擴散沉澱素反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體結合測定、免疫放射測定、螢光免疫測定和蛋白A免疫測定等技術的競爭和非競爭測定系統。此類測定在本領域中是常規且公知的(參見例如 Ausubel 等編，1994，Current Protocols in Molecular Biology，卷 1，John Wiley & Sons, Inc.，New York，通過援引將其完整地併入本文)。在一些實施方式中，使用ELISA來確定針對腫瘤細胞標誌物的異源多聚體多肽的免疫特異性。ELISA測定包括製備抗原、用抗原包被96孔微滴定板的孔、向孔中添加針對腫瘤細胞標誌物的與諸如酶底物(例如，辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶)等可檢測化合物綴合的抗體、溫育一段時間並檢測抗原的存在。在一些實施方式中，與腫瘤細胞標誌物結合的異源多聚體分子並未與可檢測的化合物綴合，而是向孔中添加了識別該針對腫瘤細胞標誌物的異源多聚體分子的第二綴合抗體。在一些實施方式中，並未用抗原包被孔，而是用針對腫瘤細胞標誌物的抗體包被孔，並且可以在向經包被的孔中添加抗原後，添加與可檢測的化合物綴合的第二抗體。本領域的技術人員將知曉可經修改而提高所檢測到的信號的參數以及本領域已知的其他ELISA變體(參見例如Ausubel等編，1994，Current Protocols in Molecular Biology,卷 1, John Wiley & Sons, Inc. , New York, 11. 2. 1)。
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可以通過競爭結合測定來確定針對腫瘤細胞抗原的異源多聚體多肽的結合親和力和異源多聚體-抗原相互作用的解離速率(off-rate)。競爭結合測定的一個實例是放射免疫測定，其包括在逐漸增加的量的未標記抗原存在時，將帶標記的抗原(例如咕或1251) 或者其片段或變體與所感興趣的異源多聚體多肽溫育，隨後檢測與帶標記的抗原結合的異源多聚體多肽。可以從katchard作圖分析的數據來確定針對腫瘤細胞標誌物的異源多聚體多肽的親和力，和結合的解離速率。在一些實施方式中，使用BIAcore動力學分析來確定針對腫瘤細胞標誌物的異源多聚體多肽的結合速率和解離速率。BIAcore動力學分析包括分析抗體與晶片間的結合和解離，在所述晶片的表面上固定有腫瘤細胞標誌物抗原。在本發明的另一方面，可以以化學手段或生物合成手段將抗體連接到抗腫瘤劑或產生可檢測信號的試劑上。與抗體連接的抗腫瘤劑包括破壞或損壞腫瘤的任何試劑，所述腫瘤已結合有所述抗體，或處在已結合有所述抗體的細胞的環境中。舉例而言，抗腫瘤劑是毒劑，例如化療劑或放射性同位素。適合的化療劑對本領域的技術人員而言是已知的，並且包括蒽環類(例如，道諾黴素和多柔比星)、氨甲喋呤、長春地辛、新制癌菌素、順鉬、苯丁酸氮芥、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、美法侖、蓖麻毒素和卡奇黴素。使用常規方法使化療劑與抗體綴合(參見例如 Hermentin 和 kiler (1988)Behring Inst. Mitt. 82，197-215)。產生可檢測信號的試劑可在體內和體外用於診斷目的。產生可檢測信號的試劑產生可以用外部手段(通常是測量電磁輻射)來檢測的可測量信號。在多數情況下，產生信號的試劑是酶或發色團，或者通過螢光、磷光或化學發光來發射光。發色團包括吸收紫外區或可見光區的光的染料，並且可以是酶促反應的底物或降解產物。本發明還包括連接有靶標部分或報告部分的異源多聚體多肽。靶標部分是結合對中的第一成員。抗腫瘤劑，舉例而言，與所述對中的第二成員綴合，並因此被引導至抗體所結合的部位。上述結合對的常見實例是抗生物素蛋白和生物素。在一個實施方式中，將生物素與本發明的異源多聚體多肽綴合，從而為綴合有抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素的抗腫瘤劑或其他部分提供了靶標。另一選擇是，將生物素或其他此類部分連接到本發明的異源多聚體多肽上，並將其用作例如診斷系統中的報告者，在所述診斷系統中，產生可檢測信號的試劑綴合有抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素。在治療中，可以向腫瘤患者施用足以防止或減少腫瘤進展(例如，腫瘤的生長、侵襲、轉移和/或復發)的量的異源多聚體多肽。將足以實現此目標的量定義為治療有效劑量。對此應用有效的量將取決於疾病的嚴重程度和患者自身免疫系統的總體狀況。劑量實施計劃也會隨著疾病狀況和患者狀態而變化，並且通常為單一推注劑量或持續輸注至每日多次施用(例如，每4 6小時)，或者根據治療醫師的指示或患者的狀況。可以以高達 40mg/kg體重或更高的單劑量來施用本發明的抗體。更優選的是，以0. ang/kg體重 20mg/ kg體重的劑量來施用抗體。然而，應注意的是，本發明並不限於任何特定劑量。本發明可以用來治療任何適合的腫瘤，包括例如乳腺、心臟、肺、小腸、結腸、脾、腎臟、膀胱、頭頸、卵巢、前列腺、腦、胰腺、皮膚、骨、骨髓、血、胸腺、子宮、睪丸、宮頸或肝的腫瘤。通過將純化的本發明的異源多聚體多肽與藥物可接受的載質(例如，載劑、賦形劑)結合，製備了用於儲存和使用的製劑(Remington，The Science and Practice of Wiarmacy第20版，Mack Publishing, 2000) 0適合的藥物可接受的載質包括但不限於無毒緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；鹽，例如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六烴季銨(hexamethonium chloride)；氯化苄烷銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3_戊醇；和間甲酚)；低分子量多肽(例如，小於約10個胺基酸殘基)；蛋白，例如血清白蛋白、 明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；糖類，例如單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑， 例如EDTA ；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子，例如鈉；金屬絡合物(例如Zn-蛋白絡合物)；和非離子表面活性劑，例如吐溫(TWEEN)或聚乙二醇(PEG)。可以以用於局部治療或系統治療的多種方式來施用本發明的藥物組合物。施用可以是局部(例如，向黏膜遞送，包括向陰道和直腸遞送)施用，例如經皮貼、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末；肺部(例如，通過吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括使用噴霧器；氣管內、鼻內、表皮和經皮)施用；口服施用；或胃腸外施用，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；或顱內(例如，鞘內或腦室內)施用。治療性製劑可以為單位劑型。此類製劑包括片劑、丸劑、膠囊、粉末、顆粒、水或非水性介質中的溶液或懸浮液，或者用於口服施用、胃腸外施用、直腸施用或吸入式施用的栓齊U。在諸如片劑等固體組合物中，主要活性成分與藥物載劑混合。常規的成片成分包括玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠和其他稀釋劑(例如水)，從而形成包含本發明的化合物或無毒的其藥物可接受的鹽的均質混合物的固體預製組合物。隨後將該固體預製組合物再分成上述類型的單位劑型。該新型組合物的片劑、丸劑等可以經包衣或復混而提供具有長期作用優點的劑型。例如，該片劑或丸劑可以包含經外部組分包被的內部組合物。此外，這兩種組分可被腸溶層分隔，該腸溶層用來抵抗瓦解並允許內部組分完整地通過胃或推遲釋放。可將多種材料用於此類腸溶層或塗層，所述材料包括多種聚合物酸和聚合物酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇和乙酸纖維素酯等材料的混合物。藥物製劑包含與脂質體複合的本發明的異源多聚體多肽(Epstein等，1985， Proc. Natl. Acad. Sci USA 82 :3688 ;Hwang等，1980，Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4030; 和美國專利第4，485，045和4，544，545號)。美國專利第5，013，556號中公開了具有增強的循環時間的脂質體。用含有磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生化的磷脂醯乙醇胺(PEG-PE) 的液體組合物，可以通過反相蒸發來產生一些脂質體。使脂質體擠壓通過具有確定孔徑的濾器，從而產生具有所需直徑的脂質體。還可以將異源多聚體多肽封裝在微膠囊中。通過例如凝聚技術或通過界面聚合來製備此類微膠囊，例如，分別為，在膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳劑、納米粒和納米膠囊)或在粗乳劑(如Remington，The Science and Practice of Wiarmacy第20版，Mack Publishing (2000)中所述)中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚 (甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。還可以製備持續釋放的製劑。持續釋放的製劑的適合實例包括含有抗體的固體疏水聚合物半透性基質，該基質為定形物體形式(例如，膜或微膠囊)。持續釋放基質的實例包括聚酯、諸如聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚乙烯醇等水凝膠、聚交酯(美國專利第 3，773，919號)、L-穀氨酸和7-乙基-L-穀氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEP0TTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)等可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、蔗糖乙酸酯異丁酸酯和聚D-(-)-3-羥基丁酸。在一些實施方式中，治療涉及到對本發明的異源多聚體多肽和化療劑或多種不同的化療劑的混合物的組合施用。用異源多聚體多肽的治療可以在施用化療劑之前、同步或之後進行。本發明所考慮的化療劑包括本領域已知的並且可以商購獲得的化學物質或藥物，例如多柔比星、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷(「Ara-C」)、環磷醯胺、三胺硫膦 (thiot印a)、白消安、細胞毒素、紫杉醇、氨甲喋呤、順鉬、美法侖、長春鹼、吉西他濱、依立替康和卡鉬。組合施用可以包括在單一藥物製劑中的共施用或使用獨立的製劑的共施用，或以任何順序但通常在使所有活性試劑能夠同時發揮其生物學活性的時期內進行的連續施用。可以使用製造商的操作說明所述的或技術熟練的從業者憑經驗確定的此類化療劑的製備和劑量實施計劃。此類化療劑的製備和劑量實施計劃還在Chemotherapy Service Ed.， Μ. C. Perry, Williams & Wilkins，Baltimore, Md. (1992)中有所描述。在其他實施方式中，治療涉及到對本發明的異源多聚體多肽和放射療法的組合施用。用異源多聚體多肽的治療可以在施用放射療法之前、同步或之後進行。可以使用技術熟練的從業者所確定的此類放射療法的任何劑量實施計劃。在其他實施方式中，治療涉及到將本發明的異源多聚體多肽和針對腫瘤相關抗原的抗體組合施用，所述抗體包括但不限於與EGF受體(EGFR)(西妥昔單抗/Erbitux )結合的抗體、與erbB2受體(HER2)結合的抗體(曲妥單抗/ Herceptin )和與血管內皮生長因子(VEGF)結合的抗體(貝伐單抗/Avastin )。此外，治療可以包括對一種或多種細胞因子的施用，可以伴隨有對癌細胞的手術移除或治療醫師視為必要的任何其他療法。在其他實施方式中，治療可以涉及到將本發明的異源多聚體多肽與第二治療劑組合施用。在一些實施方式中，施用第二治療劑來治療因施用異源多聚體多肽而引起的副作用。對於治療疾病，本發明的異源多聚體多肽的適合劑量取決於待治療的疾病類型、 疾病的嚴重程度和進程、疾病的響應性、施用異源多聚體多肽是為了治療性目的還是預防性目的、之前的療法、患者的臨床史等等，所有這些都由治療醫師來判斷。對異源多聚體多肽的施用可以是一次，也可以通過一系列治療進行，所述一系列治療持續數天至數月或直至實現治癒或疾病狀態的減少(例如，腫瘤尺寸的減小)為止。從對患者體內藥物積累的測量中可以計算出最佳劑量實施計劃，並且該計劃會根據單個抗體的相對效力而發生變化。 施用醫師能夠容易地確定最佳劑量、劑量實施方法和重複率。通常，劑量為0. 01 μ g/kg體重 100mg/kg體重，並且可以在每日、每周、每月或每年給藥一次或多次。治療醫師能夠根據藥物在體液或組織中的測得的停留時間和濃度來估算劑量實施的重複率。本發明提供包含本文所述的異源多聚體多肽的試劑盒，該試劑盒可用來執行本文所述的方法。在某些實施方式中，試劑盒包含在一個或多個容器中的至少一種純化的針對腫瘤標誌物的異源多聚體多肽。在某些實施方式中，試劑盒包含至少兩種異源多聚體多肽。 本領域技術人員將容易知道，可以將本發明公開的抗體容易地加入一種本領域公知的成熟試劑盒形式中。還可以參考以下實施例來明確本公開的實施方式，所述實施例詳細描述了本公開的異源多聚體多肽的製備和使用本公開的異源多聚體多肽的方法。對本領域技術人員顯而易見的是，可以在不脫離本公開的範圍的情況下對材料和方法做出多種修改。在任何可能的地方，在所有附圖中將使用相同的附圖標記來指代相同或相似的部分。除非內容另有明確規定，本文和所附權利要求中所用的單數形式「一個」、「或」和「一種」包含複數的所指代物。因此，例如，述及「抗體」時，其包括多個此類抗體或者一個以上抗體以及本領域技術人員所知的其等價物。此外，除非另有說明，本說明中所用的表示成分的量、反應條件、純度、 多肽和多核苷酸的長度等的所有數字，都被術語「約」修飾。因此，本說明書和權利要求中所述的數值參數是可以根據本發明的所需性質而變化的近似值。可以以任何變化形式和全部變化形式來組合所有本文所述的各種實施方式和選擇。實施例實施例1.對抗體二聚體化界面中的候選物相互作用的鑑定為了更好地理解抗體重鏈CH3結構域之間的二聚體化界面的特性，查看了抗體 CH3 結構域的晶體結構(由 Deisenhofer. J. (1981) Biochemistry，20，2361-2370 報導首次的結構)。在此結構中，CH3結構域間的鏈間相互作用介導二個Fc片段的二聚體化(圖1)。 CH3結構域相互作用的表面包含疏水殘基的中心區，其側翼是親水殘基或具有帶電荷特徵的殘基。在核心疏水區內存在保守的酪氨酸，其含有用於潛在的親水相互作用的羥基，因此其不僅作為疏水殘基，還使親水相互作用能夠形成。圖2顯示了對二聚體化的CH3結構域的結構的描繪。為了清楚，使一條鏈的陰影比另一條的更暗。顯示了在CH3結構域間的相互作用表面上排列的胺基酸的側鏈。圖3在三幅獨立的結構圖中突出顯示了參與潛在的鏈間相互作用的CH3結構域內的選定胺基酸。圖3中的胺基酸位置編號與人IgG2恆定區相對。圖4顯示了對人IgG同種型恆定域的比對。突出顯示了參與鏈間相互作用的且在圖2 中標註出的特定殘基。表1列出了每個人IgG同種型的與潛在地參與鏈間相互作用的這些殘基對應的胺基酸位置，其中的編號命名法與人IgG種系恆定區對應。表 權利要求
1.一種製備包含兩條多肽的異源多聚體多肽的方法，所述兩條多肽都含有人免疫球蛋白CH3結構域，所述方法包括將所述兩條多肽中的一條的CH3結構域內的至少一個胺基酸取代為另一胺基酸，從而促進異源多聚體的形成，所述至少一個胺基酸位於與選自由人 IgG2的236位、245位、249位、278位、286位和288位組成的組的位置對應的位置。
2.一種製備包含兩條多肽的異源多聚體多肽的方法，所述兩條多肽都含有人免疫球蛋白CH3結構域，所述方法包括將所述兩條多肽中的每一條的CH3結構域中的至少一個帶電荷的胺基酸殘基取代為帶相反電荷的胺基酸。
3.如權利要求2所述的方法，其中，取代後的胺基酸對在所述異源多聚體多肽中形成離子對。
4.一種製備包含兩條多肽的異源多聚體多肽的方法，所述兩條多肽都含有人免疫球蛋白CH3結構域，所述方法包括將所述兩條多肽中的一條的CH3結構域中的至少一個親水胺基酸殘基取代為另一胺基酸。
5.如權利要求4所述的方法，其中，所述親水胺基酸殘基被疏水殘基取代。
6.如權利要求4所述的方法，其中，具有羥基側鏈的胺基酸被不具有羥基側鏈的胺基酸取代。
7.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述方法還包括將所述兩條多肽中的一條的 CH3結構域中的至少一個親水胺基酸殘基取代為另一胺基酸所述兩條多肽的界面處所述兩條多肽中的一條取代為另一胺基酸。
8.如權利要求1 7中任一項所述的方法，其中，取代後的胺基酸在所述兩條多肽的界面處與另一胺基酸相互作用。
9.如權利要求1 8中任一項所述的方法，其中，被取代的胺基酸列於表1中，或者是位於與表1中列出的那些位置對應的位置上的胺基酸。
10.如權利要求1 9中任一項所述的方法，其中，所述兩條多肽的所述人免疫球蛋白 CH3結構域選自由IgG、IgA和IgD的CH3結構域組成的組。
11.如權利要求10所述的方法，其中，所述免疫球蛋白CH3結構域是IgG2CH3結構域。
12.如權利要求1 11中任一項所述的方法，其中，含有CH3結構域的第一條多肽包含與第一免疫球蛋白輕鏈多肽特異性地結合的第一免疫球蛋白重鏈多肽，並且含有CH3結構域的第二條多肽包含與第二免疫球蛋白輕鏈多肽特異性地結合的第二免疫球蛋白重鏈多肽。
13.如權利要求12所述的方法，其中，所述第一免疫球蛋白輕鏈多肽和所述第二免疫球蛋白輕鏈多肽在胺基酸序列上是同一的。
14.如權利要求12所述的方法，其中，所述免疫球蛋白輕鏈多肽與所述免疫球蛋白重鏈多肽連接。
15.如權利要求1 14中任一項所述的方法，所述方法包括對一個CH3結構域中的位於與人IgG2的249位和288位對應的位置上的胺基酸進行取代。
16.如權利要求15所述的方法，其中，位於249位和288位上的胺基酸被穀氨酸置換。
17.如權利要求15所述的方法，其中，位於249位和288位上的胺基酸被天冬氨酸置換。
18.如權利要求1 14中任一項所述的方法，所述方法包括對一個CH3結構域中的位於與人IgG2的249位、286位和288位對應的位置上的胺基酸進行取代。
19.如權利要求18所述的方法，其中，位於249位和288位上的胺基酸被穀氨酸置換， 並且位於286位上的胺基酸被苯丙氨酸置換。
20.如權利要求13 19中任一項所述的方法，所述方法還包括對第二個CH3結構域中的位於與人IgG2的236位和278位對應的位置上的胺基酸進行取代。
21.如權利要求20所述的方法，其中，位於236位上的胺基酸被賴氨酸置換，並且位於 278位上的胺基酸被賴氨酸置換。
22.如權利要求1 14中任一項所述的方法，所述方法包括對一個CH3結構域中的位於與人IgG2的236位和278位對應的位置上的胺基酸進行取代。
23.如權利要求22所述的方法，其中，位於236位上的胺基酸被賴氨酸置換，並且位於 278位上的胺基酸被賴氨酸置換。
24.如權利要求1 23中任一項所述的方法，其中，所述異源多聚體多肽是一價的。
25.如權利要求M所述的方法，其中，所述的一價的異源多聚體多肽包含可檢測的標籤或表位。
26.如權利要求1 23中任一項所述的方法，其中，所述異源多聚體多肽是二價的。
27.如權利要求1 23中任一項或權利要求沈所述的方法，其中，所述第一條多肽通過其免疫球蛋白抗原結合域來結合靶分子，並且所述第二條多肽是免疫粘附素。
28.如權利要求1 27中任一項所述的方法，其中，與同源二聚體的裝配相比，所述第一條多肽和第二條多肽優先相互裝配成異源二聚體。
29.如權利要求1 23和沈 28中任一項所述的方法，其中，所述第一條多肽和第二條多肽裝配形成雙特異性抗體。
30.如權利要求四所述的方法，其中，所述雙特異性抗體特異性地結合兩種不同的抗原。
31.如權利要求四所述的方法，其中，所述雙特異性抗體結合同一抗原上的兩個不同的表位。
32.如權利要求1 31中任一項所述的方法，其中，所述異源多聚體多肽特異性地結合選自由下述抗原組成的組的抗原DLL4、VEGF, VEGFR2、Notchl、Notch2、Notch3、Notch4、 Notch (全)、JAGl、JAG2、DLL (全)、JAG (全)、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB (全)、c_Met、 IGF-1R、PDGFR、Patched、Hedgehog 家族多肽、Hedgehog (全)、WNT 家族多肽、WNT (全)、 FZDUFZD2.FZD3, FZD4,FZD5, FZD6,FZD7, FZD8、FZD9、腳 10、腳(全)、LRP5、LRP6、CD20、 IL-6、TNFalpha、IL-23、IL-17、CD80、CD86、CD3、CEA、Mucl6、PSMA、PSCA、CD44、c-Kit、DDRl、 DDR2、RSPOl、RSP02、RSP03、RSP04、RSPO (全)、BMP 家族多肽、BMP (全)、BMPRla、BMPRlb 及其組合。
33.如權利要求30所述的方法，其中，所述異源多聚體多肽是特異性地結合DLL4和 VEGF的雙特異性抗體。
34.如權利要求32所述的方法，其中，所述異源多聚體多肽特異性地結合VEGF並包含 SEQ ID N0:17 或 SEQ ID NO :18。
35.如權利要求32所述的方法，其中，所述異源多聚體多肽特異性地結合DLL4並包含 SEQ ID NO :19。
36.如權利要求33所述的方法，其中，所述輕鏈多肽在胺基酸序列上是同一的。
37.如權利要求33所述的方法，其中，所述輕鏈多肽與所述重鏈多肽連接。
38.如權利要求30 33中任一項所述的方法，所述方法包括對一個CH3結構域中的位於與人IgG2的249位和288位對應的位置上的胺基酸進行取代。
39.如權利要求38所述的方法，其中，位於249位和288位上的胺基酸被穀氨酸置換。
40.如權利要求38所述的方法，其中，位於249位和288位上的胺基酸被天冬氨酸置換。
41.如權利要求33 40中任一項所述的方法，所述方法還包括對第二個CH3結構域中的位於與人IgG2的236位和278位對應的位置上的胺基酸進行取代。
42.如權利要求41所述的方法，其中，位於236位上的胺基酸被賴氨酸置換，並且位於 278位上的胺基酸被賴氨酸置換。
43.如權利要求33 42中任一項所述的方法，所述方法包括對一個CH3結構域中的位於與人IgG2的236位和278位對應的位置上的胺基酸進行取代。
44.如權利要求43所述的方法，其中，位於236位上的胺基酸被賴氨酸置換，並且位於 278位上的胺基酸被賴氨酸置換。
45.如權利要求33所述的方法，其中，異源多聚體多肽包含VEGF結合序列，所述VEGF 結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列、和SEQ ID NO 13或SEQ IDNO 15的輕鏈序列。
46.如權利要求45所述的方法，其中，所述輕鏈與所述重鏈連接。
47.如權利要求33所述的方法，其中，所述異源多聚體多肽包含DLL4結合序列，所述 DLL4結合序列包含SEQ ID NO: 19。
48.如權利要求45 47中任一項所述的方法，其中，所述異源多聚體多肽包含VEGF 結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列、和SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 15的輕鏈序列，所述DLL4結合序列包含SEQID NO :19。
49.一種特異性地結合VEGF的抗體，其中，所述抗體包含(a)包含GYTFTNYWMH(SEQ ID NO :20)的重鏈 CDRl、包含 SINPSNGGTSYNEKi7KR (SEQ ID NO 21)的重鏈 CDR2 和包含 HYYDNSYAMDY (SEQ ID NO 22)的重鏈 CDR3 ；禾口 / 或(b)包含QASQDISNYVN (SEQ ID NO 23)的輕鏈 CDRl、包含 DASNLQT (SEQ IDNO 24)的輕鏈 CDR2 和包含 QQYDDLPP (SEQ ID NO 25)的輕鏈 CDR3。
50.一種特異性地結合VEGF的抗體，其中，所述抗體包含(a)包含GYTFTNYWMH(SEQ ID NO :20)的重鏈 CDRl、包含 SINPSNGGTSYNEKi7KR (SEQ ID NO 21)的重鏈 CDR2 和包含 HYYDNSYAMDY (SEQ ID NO :22)的重鏈 CDR3 ；禾口 / 或(b)包含RASQGINNHLAW(SEQ ID NO :26)的輕鏈 CDR1、包含 AASNLHS (SEQID NO 27)的輕鏈 CDR2 和包含 QQYDNLPL (SEQ ID NO 28)的輕鏈 CDR3。
51.如權利要求49或50所述的抗體，所述抗體為人VEGF的拮抗劑。
52.如權利要求49或50所述的抗體，所述抗體為抗體片段。
53.如權利要求49或50所述的抗體，所述抗體為單克隆抗體。
54.如權利要求49或50所述的抗體，所述抗體為人源化抗體。
55.如權利要求49或50所述的抗體，所述抗體抑制腫瘤生長。
56.如權利要求49 56中任一項所述的抗體，所述抗體以約IOOnM或更低的Kd結合人 VEGF。
57.一種用權利要求1-48中任一項所述的方法製得的異源多聚體多肽。
58.一種異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽具有用權利要求1-48中任一項所述的方法製得的異源多聚體多肽的特性。
59.如權利要求57或58所述的異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽為一價的。
60.如權利要求57或58所述的異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽為二價的。
61.如權利要求57、58或60所述的異源多聚體多肽，其中，所述多肽是雙特異性抗體。
62.一種包含免疫球蛋白CH3結構域的多肽，其中，所述CH3結構域在與人IgG2的M9 位和288位對應的位置上具有穀氨酸。
63.一種包含免疫球蛋白CH3結構域的多肽，其中，所述CH3結構域在與人IgG2的M9 位和288位對應的位置上具有穀氨酸，並且在與人IgG2的286位對應的位置上具有苯丙氨酸。
64.一種包含免疫球蛋白CH3結構域的多肽，其中，所述CH3結構域在與人IgG2的236 位和278位對應的位置上具有賴氨酸。
65.如權利要求62 64中任一項所述的多肽，其中，所述免疫球蛋白CH3結構域是 IgGCH3結構域。
66.一種異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽包含(i)權利要求62或63所述的多肽和(ii)權利要求64所述的多肽。
67.如權利要求57 61中任一項或權利要求66所述的異源多聚體多肽，其中，含有 CH3結構域的第一條多肽和/或第二條多肽還包含免疫球蛋白CH2結構域。
68.一種多肽，所述多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO =USEQ ID NO :4或SEQ IDNO :5。
69.一種多肽，所述多肽包含胺基酸序列SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :6或SEQ IDNO :7。
70.一種多肽，所述多肽包含胺基酸序列SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :8或SEQ IDNO :9。
71.一種異源多聚體多肽，所述多肽包含選自由SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7組成的組的第一胺基酸序列；和選自由 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9組成的組的第二胺基酸序列。
72.一種異源多聚體多肽，所述多肽包含權利要求62 65或68 70中任一項所述的多肽。
73.如權利要求57 61、66、67、71或72中任一項所述的異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽為異源二聚體。
74.如權利要求66、67、71或72所述的異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽為雙特異性抗體。
75.如權利要求66、67、71或72中所述的異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽為一價抗體。
76.如權利要求57 61、66、67或71 75中任一項所述的異源多聚體多肽，其中， 所述多肽特異性地結合選自由下述抗原組成的組的抗原DLL4、VEGF, VEGFR2、NotchU Notch2、Notch3、Notch4、Notch (全)、JAG1、JAG2、DLL (全)、JAG (全)、EGFR、ERBB2、ERBB3、 ERBB (全)、c-Met、IGF-1R、PDGFR、Patched、Hedgehog 家族多肽、Hedgehog (全)、WNT 家族多肽、WNT (全)、FZDU FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FS) 10、FS)(全)、LRP5、LRP6、CD20、IL-6、TNFalpha, IL-23、IL-17、CD80、CD86、CD3、CEA,Muc 16, PSMA, PSCA, CD44、c-Kit、DDRl、DDR2、RSPOl、RSP02、RSP03、RSP04、RSPO (全)、BMP 家族多肽、BMP (全)、 BMPRla、BMPRlb 及其組合。
77.如權利要求76所述的異源多聚體多肽，其中，異源多聚體多肽包含VEGF結合序列， 所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列、和SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 15的輕鏈序列。
78.如權利要求76所述的異源多聚體多肽，其中，異源多聚體多肽包含VEGF結合序列， 所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID NO 13的輕鏈序列。
79.如權利要求76所述的異源多聚體多肽，其中，異源多聚體多肽包含VEGF結合序列， 所述VEGF結合序列包含SEQ ID NO 11的重鏈序列和SEQ ID NO 15的輕鏈序列。
80.如權利要求76所述的異源多聚體多肽，其中，所述異源多聚體多肽包含DLL4結合序列，所述DLL4結合序列包含SEQ ID NO :19。
81.如權利要求76所述的異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽為結合DLL4和VEGF 的雙特異性抗體。
82.如權利要求77 81中任一項所述的異源多聚體多肽，其中，所述輕鏈多肽在胺基酸序列上是同一的。
83.如權利要求77 82中任一項所述的異源多聚體多肽，其中，所述輕鏈多肽與所述重鏈多肽連接。
84.如權利要求77 83中任一項所述的異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽包含在一個CH3結構域中的位於與人IgG2的249位和288位對應的位置上的取代胺基酸。
85.如權利要求84所述的異源多聚體多肽，其中，位於249位和288位上的胺基酸被穀氨酸置換。
86.如權利要求84所述的異源多聚體多肽，其中，位於249位和288位上的胺基酸被天冬氨酸置換。
87.如權利要求77 84中任一項所述的異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽還包含在第二個CH3結構域中的位於與人IgG2的236位和278位對應的位置上的取代胺基酸。
88.如權利要求87所述的異源多聚體多肽，其中，位於236位上的胺基酸被賴氨酸置換，並且位於278位上的胺基酸被賴氨酸置換。
89.如權利要求77 88中任一項所述的異源多聚體多肽，所述異源多聚體多肽包含在一個CH3結構域中的位於與人IgG2的236位和278位對應的位置上的取代胺基酸。
90.如權利要求89所述的異源多聚體多肽，其中，位於236位上的胺基酸被賴氨酸置換，並且位於278位上的胺基酸被賴氨酸置換。
91.如權利要求81 83中任一項所述的異源多聚體多肽，其中，所述異源多聚體多肽包含選自由SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 19組成的組的序列。
92.如權利要求81 83中任一項所述的異源多聚體多肽，其中，所述異源多聚體多肽包含VEGF結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ IDNO 11的重鏈序列、 和SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 15的輕鏈序列，所述DLL4結合序列包含SEQ ID NO :19。
93.如權利要求81 83中任一項所述的異源多聚體多肽，其中，所述異源多聚體多肽包含VEGF結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ IDNO 11的重鏈序列和SEQ ID NO 13的輕鏈序列，所述DLL4結合序列包含SEQ IDNO :19。
94.如權利要求81 83中任一項所述的異源多聚體多肽，其中，所述異源多聚體多肽包含VEGF結合序列和DLL4結合序列，所述VEGF結合序列包含SEQ IDNO 11的重鏈序列和 SEQ ID NO 15的輕鏈序列，所述DLL4結合序列包含SEQ IDNO :19。
95.如權利要求57 61、66、67或71 94中任一項所述的異源多聚體多肽，其中，含有CH3結構域的第一條多肽和/或第二條多肽還包含單鏈Fv。
96.如權利要求57 61、66、67或71 95中任一項所述的異源多聚體多肽，其中，所述多肽還包含細胞毒素或放射性同位素。
97.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼權利要求49 96中任一項所述的抗體或多肽。
98.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含在高度嚴格條件下與權利要求98所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。
99.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求97或98所述的核酸。
100.一種製造異源多聚體多肽的方法，所述方法包括在使所述多肽表達的條件下培養權利要求99所述的宿主細胞。
101.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求50 M、59、60或64 81中任一項所述的異源多聚體多肽和藥物可接受的載劑。
102.一種治療病症的方法，所述方法包括向有治療需要的患者施用權利要求57 61、 66,67或71 95中任一項所述的異源多聚體多肽或權利要求101所述的組合物。
103.如權利要求102所述的方法，其中，所述病症是癌症。
104.如權利要求102或103所述的方法，所述方法還包括施用第二治療化合物。
105.如權利要求104所述的方法，其中，所述第二治療化合物被用來治療因向患者施用所述異源多聚體多肽而引起的副作用。
106.如權利要求104或105所述的方法，其中，所述第二治療化合物是抗癌劑。
107.如權利要求104 106中任一項所述的方法，其中所述異源多聚體多肽和所述第二治療化合物被同時施用或依次施用。
108.一種分離的多肽，所述多肽包含選自由SEQ ID NO 10, SEQ ID NO : 和SEQ ID NO 30組成的組的胺基酸序列。
109.如權利要求108所述的分離的多肽序列，所述多肽序列為抗體。
110.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含在高度嚴格條件下與選自由SEQID NO 12、SEQ ID NO :14和SEQ ID NO 16組成的組的多核苷酸雜交的多核苷酸。
全文摘要
本發明提供製造諸如雙特異性抗體等異源多聚體分子的方法以及包含所述分子的組合物。該方法包括在兩條多肽的界面處相接觸的胺基酸中引入突變，從而修改離子對間的靜電相互作用。
文檔編號C12N5/10GK102459346SQ201080026552
公開日2012年5月16日 申請日期2010年4月27日 優先權日2009年4月27日
發明者奧斯丁·L·格尼, 阿龍·肯·薩拓 申請人:昂考梅德藥品有限公司