兩類羊病原體雙重PCR專用引物及雙重PCR檢測方法與流程
2023-06-14 07:55:11 1
本發明涉及兩類羊病原體雙重PCR專用引物及雙重PCR檢測方法，屬於預防獸醫學領域。
背景技術：
隨著羊現代化養殖規模的提升，羊的疾病也日益增多，且由單一病原引發的疾病越來越少，逐漸呈現出多元化混合感染的趨勢；每年給養羊戶造成的經濟損失上百億元，福建省僅羊口瘡和羊支原體性肺炎造成的經濟損失就達2億元以上。
羊口瘡（contagious ecthyma），是由羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)感染引起的山羊、綿羊和人的一種急性、接觸性和嗜上皮性的人畜共患病。該病的發病率為4%-100%，死亡率為1%-59%。多種支原體可感染山羊而引起胸膜肺炎性疾病，特別是絲狀支原體簇（Mycoplasma mycoides cluster，Mm cluster) 的成員，包括山羊支原體、絲狀支原體和李奇氏支原體亞群，其中山羊支原體山羊亞種、絲狀支原體山羊亞種、山羊支原體山羊肺炎亞種均可感染羊而引起胸膜肺炎性疾病。山羊傳染性胸膜肺炎對山羊養殖業的危害尤為嚴重，新傳入地區嚴重爆發時發病率為80-100％，死亡率高達60～80％。
當前羊病主要以混合感染為主，僅採用一種PCR進行檢測不能全面掌握病原種類，從而無法正確指導臨床用藥和疫苗免疫，而採用兩種PCR技術進行檢測則相對費時、費力，也不利於流行病學的大規模調查。近年來關於Mm cluster成員引起的羊支原體性肺炎和羊口瘡混合感染的報導屢見不鮮，然所使用的檢測方法均為單重PCR，未見有雙重PCR同時鑑定此二病的報導。
當前羊病的單重PCR擴增技術已相對成熟，然多重PCR方法研究相對滯後，文獻報導較少，商品化檢測試劑盒幾乎沒有。因此，根據PCR擴增技術，建立一種快速鑑別羊口瘡病毒和絲狀支原體簇的雙重PCR檢測方法，可為混合感染病原快速、準確診斷及大規模流行病學調查提供有效方法，省時省力省錢，對疫情的控制具有重要意義。
技術實現要素：
由於羊口瘡病毒以及絲狀支原體簇中的絲狀支原體山羊亞種和山羊支原體山羊肺炎亞種可同時感染養殖羊，常規使用的單重PCR檢測方法相對費時、費力，不利於檢測工作的高效開展。基於需快速、準確診斷混合感染病原的需要，本發明提供一種快速、特異、敏感的檢測羊口瘡病毒和絲狀支原體簇的專用引物及雙重PCR方法。
為解決上述技術問題本發明採用如下技術方案：
本發明首先提供了兩類羊病原體雙重PCR專用引物，其核苷酸序列為：
（1）羊口瘡病毒專用引物ORFVB2L：
ORFVB2L 1：5』- ATCGAGAACGCCAAGAACAGCATCG-3』，
ORFVB2L 2：5』- TGTCGTCCACGATGAGCAGCTTAGT-3』；
（2）絲狀支原體簇專用引物Mm-cluster：
Mm-cluster 1：5』-TGAGATGGGGATGCGGCGTATT-3』，
Mm-cluster 2：5』-TGGGAAGCGCTCTCCAAATGGT-3』。
所述羊口瘡病毒專用引物ORFVB2L的擴增產物大小為304bp，所述絲狀支原體簇專用引物Mm-cluster的擴增產物大小為1232bp。
本發明還提供了利用上述兩類羊病原體雙重PCR專用引物進行雙重PCR檢測的方法，包括以下步驟：
（1）待測樣品組織DNA的提取；
（2）將引物對ORFVB2L及Mm-cluster分別配置成濃度為20μM的溶液；
（3）以待測樣品DNA為模板進行雙重PCR：
PCR反應體系為：Premix TaqTM聚合酶10.0μL，引物ORFVB2L 1和ORFVB2L 2各1.1μL、引物Mm-cluster 1和Mm-cluster 2各0.5μL，模板2.0μL、無菌去離子水補足至20.0μL；
PCR反應條件為：94℃預變性2min，94℃變性30sec, 59℃退火15sec, 72℃延伸15sec運行30個循環；72℃延伸7min；
（4）擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測及判斷：PCR反應終止後，取7μL PCR產物，用1％瓊脂糖電泳檢測擴增結果：擴增得到304bp大小產物則判定為檢測出羊口瘡病毒核酸，擴增得到1232bp大小產物則判定為檢測出絲狀支原體簇核酸。
本發明根據羊口瘡病毒B2L基因和絲狀支原體簇16S rRNA基因序列，設計兩對可特異性擴增B2L基因和16S rRNA基因的專用引物，建立了羊口瘡病毒和絲狀支原體簇雙重PCR檢測方法。克服了當前僅採用一種PCR進行檢測不能全面掌握病原種類，從而無法正確指導臨床用藥和疫苗免疫的不足。建立了一種快速鑑別羊口瘡病毒和絲狀支原體簇的雙重PCR檢測方法，可為混合感染病原快速、準確診斷及大規模流行病學調查提供有效方法，省時省力省錢，對疫情的控制具有重要意義。
附圖說明
圖1專用引物ORFVB2L對羊口瘡病毒PCR擴增產物電泳圖。圖中，M為Marker，泳道1為羊口瘡病毒目標片段，泳道2為絲狀支原體山羊亞種、泳道3為山羊支原體山羊肺炎亞種、泳道4為綿羊肺炎支原體、泳道5為豬肺炎支原體、泳道6為大腸桿菌、泳道7為金黃色葡萄球菌、泳道8為沙門氏菌、泳道9為巴氏桿菌和泳道10陰性對照。
圖2 專用引物Mm-cluster對絲狀支原體簇PCR擴增產物電泳圖。圖中，M為Marker，泳道1和泳道2分別為絲狀支原體山羊亞種和山羊支原體山羊肺炎亞種即目標片段，泳道3羊口瘡病毒、泳道4綿羊肺炎支原體、泳道5豬肺炎支原體、泳道6大腸桿菌、泳道7沙門氏菌、泳道8金黃色葡萄球菌、泳道9巴氏桿菌和泳道10陰性對照。
圖3雙重PCR法檢測羊口瘡病毒和絲狀支原體簇結果電泳圖。M為Marker，泳道1為羊口瘡病毒和絲狀支原體山羊亞種的混合模板，泳道2為羊口瘡病毒和山羊支原體山羊肺炎亞種的混合模板，泳道4 為羊口瘡病毒模板，泳道6和泳道7分別為絲狀支原體山羊亞種和山羊支原體山羊肺炎亞種模板；泳道3、5、8為陰性對照。
圖4 雙重PCR敏感性試驗結果電泳圖。圖中：M為Marker，1-7泳道模板濃度分別為10-1-10-7。
圖5 雙重PCR 重複性試驗結果電泳圖。M為Marker，泳道1為羊口瘡病毒和絲狀支原體簇混合模板，泳道2至泳道4為羊口瘡病毒，泳道5和泳道6為絲狀支原體山羊亞種，泳道7為山羊支原體山羊肺炎亞種，泳道8至泳道11分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌陰性對照和空白對照。
具體實施方式
實施例1
以下結合實施例對本發明作進一步闡述，便於更好地理解本發明，但並不限制本發明。
以下實施例對羊口瘡病毒和絲狀支原體簇用單重PCR及雙重PCR方法進行闡述。
實施例1
快速檢測羊口瘡病毒的專用引物ORFVB2L 的設計及其對羊口瘡病毒的檢測。.
(1) 檢測羊口瘡病毒的專用引物ORFVB2L的設計與合成
檢測羊口瘡病毒的專用引物ORFVB2L是根據羊口瘡病毒基因組中B2L基因片段，用Primer 6.0引物設計軟體，設計特異性引物，將其編號為專用引物ORFVB2L，它是由專用上遊引物ORFVB2L 1和專用下遊引物ORFVB2L 2組成，其序列為：
上遊引物ORFVB2L 1：5』- ATCGAGAACGCCAAGAACAGCATCG-3』，
下遊引物ORFVB2L 2：5』- TGTCGTCCACGATGAGCAGCTTAGT-3』；
所述的檢測羊口瘡病毒的專用引物ORFVB2L的目標產物片段長度為304bp。
上述檢測羊口瘡病毒的專用引物ORFVB2L由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
(2) 用檢測羊口瘡病毒的專用引物ORFVB2L檢測羊口瘡病毒的單重方法，按以下步驟進行：
①合成上述步驟(1) 所述的檢測羊口瘡病毒的專用引物ORFVB2L。該專用引物ORFVB2L由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
②羊口瘡病毒的單重PCR 反應
以羊口瘡病毒的DNA為模板，絲狀支原體山羊亞種的DNA、山羊支原體山羊肺炎亞種的DNA、綿羊肺炎支原體的DNA、大腸桿菌的DNA、金黃色葡萄球菌的DNA、巴氏桿菌的NDA、沙門氏菌的DNA、豬肺炎支原體的DNA為陰性對照組，水作為空白對照，按表1 所述單重PCR反應體系進行PCR 擴增，
表1 單重PCR 反應體系
PCR 反應條件為:
94℃預變性2min，從94℃變性30sec, 59℃退火15sec, 72℃延伸15sec運行30個循環；72℃延伸7min。
③電泳檢測
PCR 反應終止後，取7μL PCR 產物，用1％瓊脂糖電泳檢測擴增結果。能夠擴增出304bp 左右的片段即為羊口瘡病毒，如圖1。泳道1為羊口瘡病毒目標片段，泳道2為絲狀支原體山羊亞種、泳道3為山羊支原體山羊肺炎亞種、泳道4為綿羊肺炎支原體、泳道5為豬肺炎支原體、泳道6為大腸桿菌、泳道7為金黃色葡萄球菌、泳道8為沙門氏菌、泳道9為巴氏桿菌和泳道10陰性對照均無條帶。
④克隆和測序
用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（購於康寧生命科學（吳江）有限公司）純化PCR 擴增產物，pMD-19T載體（購於TaRaKa公司）連接，並通過大腸桿菌細胞（Escherichia coli）DH5α（ 購於TaRaKa公司）轉化，用標準生物學操作程序，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。
⑤序列比對
將獲得的序列通過NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 比對分析，與GenBank報導的羊口瘡病毒B2L基因（登錄號KF703747.1）的一致性為100％。證明本發明檢測羊口瘡病毒的專用引物ORFVB2L對於羊口瘡病毒有良好的特異性。
實施例2
快速檢測絲狀支原體簇的專用引物Mm-cluster的設計及其對絲狀支原體簇的PCR檢測。
(1) 檢測絲狀支原體簇的專用引物Mm-cluster的設計與合成
檢測絲狀支原體簇的專用引物Mm-cluster是根據絲狀支原體絲狀支原體簇16S rRNA基因片段，用Primer 6.0引物設計軟體，設計特異性引物，將其編號為專用引物Mm-cluster，它是由專用上遊引物Mm-cluster 1和專用下遊引物Mm-cluster 2組成，其序列為：
Mm-cluster 1：5』-TGAGATGGGGATGCGGCGTATT-3』，
Mm-cluster 2：5』-TGGGAAGCGCTCTCCAAATGGT-3』。
所述的檢測絲狀支原體簇的專用引物Mm-cluster的目標產物片段長度為1232bp。
上述檢測絲狀支原體簇的專用引物Mm-cluster由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
(2) 用檢測絲狀支原體簇的專用引物Mm-cluster檢測絲狀支原體簇的單重PCR方法，按以下步驟進行：
以絲狀支原體山羊亞種PG3和山羊支原體山羊肺炎亞種F38的DNA為模板，以羊口瘡病毒（YT2014）的DNA、綿羊肺炎支原體的DNA、大腸桿菌的DNA、金黃色葡萄球菌的DNA、巴氏桿菌的NDA、沙門氏菌的DNA、豬肺炎支原體的DNA為陰性對照組，水作為空白對照，除合成的專用引物和PCR 反應中使用的專用引物是上述檢測絲狀支原體簇的專用引物Mm-cluster外，其餘操作步驟及其條件等與實施例1所述步驟(2) 中②至④相同，不再贅述。該PCR反應終止後，取7μL PCR產物，用1％瓊脂糖電泳檢測擴增結果，能夠擴增出1232bp 左右的片段即含有絲狀支原體簇的核酸。如圖2，泳道1和泳道2分別為絲狀支原體山羊亞種和山羊支原體山羊肺炎亞種即目標片段，泳道3羊口瘡病毒、泳道4綿羊肺炎支原體、泳道5豬肺炎支原體、泳道6大腸桿菌、泳道7沙門氏菌、泳道8金黃色葡萄球菌、泳道9巴氏桿菌和泳道10陰性對照水均無條帶。
將獲得的序列通過NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 比對分析，與GenBank 報導的絲狀支原體絲狀支原體簇16S rRNA基因（登錄號為HM155915.1）的一致性為99.8％。證明本發明檢測絲狀支原體簇的專用引物Mm-cluster對於絲狀支原體簇有良好的特異性。
實施例3
羊口瘡病毒和絲狀支原體簇雙重PCR特異性試驗
(1) 混合模板樣品的PCR 反應。
以羊口瘡病毒和絲狀支原體簇的混合DNA為模板，以去離子水作陰性對照，各樣品模板分別用表2 所述的本發明最優反應體系進行PCR 擴增。
表2 本發明雙重PCR最優反應體系
反應條件為：95℃預變性2min；從94℃變性30sec, 59℃退火15sec至72℃延伸15sec運行30個循環；72℃延伸10min。
③電泳檢測及判斷
PCR 反應終止後，分別取7μL PCR產物，用1％瓊脂糖電泳檢測擴增結果，能夠擴增得到304bp和1232bp的相應組合片段即可認為對應成功檢測出羊口瘡病毒核酸和絲狀支原體簇核酸。如圖3，圖中：M為Marker，泳道1為羊口瘡病毒和絲狀支原體山羊亞種的混合模板，泳道2為羊口瘡病毒和山羊支原體山羊肺炎亞種的混合模板，泳道4 為羊口瘡病毒模板，泳道6和泳道7分別為絲狀支原體山羊亞種和山羊支原體山羊肺炎亞種模板。泳道3、5、8為陰性對照；泳道1中A位置的條帶、泳道2中A位置的條帶、泳道4中A 位置的條帶都為羊口瘡病毒的目的條帶，目的條帶長度為304bp。泳道1中B 位置的條帶、泳道2中B 位置的條帶、泳道6中B位置的條帶、泳道7中B位置的條帶都為絲狀支原體簇的目的條帶，目的條帶長度為1232bp。
從圖3 可以看出，用本發明中的雙重PCR專用引物和雙重PCR檢測方法能同時檢測出羊口瘡病毒，絲狀支原體山羊亞種和山羊支原體山羊肺炎亞種的混合樣品。
圖3 中泳道1和泳道2能夠很清楚的看見長度為304bp 和1232bp 的條帶，而泳道3的陰性對照無明顯條帶，這說明成功檢測出羊口瘡病毒和絲狀支原體簇。證明本專利同時檢測羊口瘡病毒和絲狀支原體簇的準確性高。
圖3 中泳道4是對羊口瘡病毒模板的檢測，圖上能夠很清楚的看見長度為304bp的條帶，而泳道5的陰性對照無明顯條帶，這說明成功檢測出羊口瘡病毒。說明本專利檢羊口瘡病毒的準確性高。
圖3中泳道6和泳道7是對絲狀支原體山羊亞種和山羊支原體山羊肺炎亞種模板的檢測，圖上能夠很清楚的看見長度為1232bp的條帶，而泳道8陰性對照無明顯條帶，這說明成功檢測出絲狀支原體山羊亞種和山羊支原體山羊肺炎亞種。說明本專利檢測絲狀支原體簇的準確性高。
實施例4
羊口瘡病毒和絲狀支原體簇混合模板的雙重PCR敏感性試驗
羊口瘡病毒和絲狀支原體簇的混合模板用無菌去離子水按10-1-10-7進行稀釋，以去離子水作陰性對照，各樣品模板分別用實施例4中表2所述的本發明最優反應體系進行PCR擴增。
反應條件為：95℃預變性2min；從94℃變性30sec, 59℃退火15sec至72℃延伸15sec運行30個循環；72℃延伸10min。
③電泳檢測及判斷
PCR 反應終止後，分別取7μL PCR 產物，用1％瓊脂糖電泳檢測擴增結果，能夠擴增得到304bp和1232bp的相應組合片段即可認為對應成功檢測出羊口瘡病毒和絲狀支原體簇，如圖4，圖中：M為Marker，泳道1至泳道7為羊口瘡病毒和絲狀支原體山羊亞種混合模板的7個不同稀釋度樣品。
從圖4 可以看出，用本發明中的雙重PCR專用引物和雙重PCR檢測方法能同時檢測出羊口瘡病毒和絲狀支原體簇樣品的最低含量分別為1.25×10-6ng/μL、1.8×10-6ng/μL。
圖4 中泳道1至泳道6 能夠很清楚的看見長度為304bp和1232bp的條帶，而泳道7的能隱約看到1232bp條帶看不到304bp條帶。
此外，羊口瘡病毒和山羊支原體山羊亞種混合的7個不同稀釋度檢測結果與圖4結果一致，不再附圖說明。以上結果說明本專利同時檢測羊口瘡病毒和絲狀支原體簇的敏感性高。
實施例5
羊口瘡病毒和絲狀支原體簇混合模板的雙重PCR 重複性試驗
羊口瘡病毒3份陽性樣品和絲狀支原體山羊亞種2份陽性樣品以及山羊支原體山羊肺炎亞種陽性樣品1份，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、無菌去離子水各1份作陰性對照，各樣品模板分別用實施例4中表2所述的本發明最優反應體系進行PCR擴增。間隔3天檢測1次，共重複3次。
反應條件為：95℃預變性2min；從94℃變性30sec, 59℃退火15sec至72℃延伸15sec運行30個循環；72℃延伸10min。
PCR 反應終止後，分別取7μL PCR 產物，用1％瓊脂糖電泳檢測擴增結果，能夠擴增得到304bp和1232bp的相應組合片段即可認為對應成功檢測出羊口瘡病毒，絲狀支原體山羊亞種和山羊支原體山羊肺炎亞種。如圖5，圖中：M為Marker，泳道1為羊口瘡病毒和絲狀支原體簇混合模板，泳道2至泳道4為羊口瘡病毒，泳道5和泳道6為絲狀支原體山羊亞種，泳道7為山羊支原體山羊肺炎亞種，泳道8至泳道11分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌陰性對照和空白對照無菌去離子水。
從圖5可以看出，用本發明中的雙重PCR專用引物和雙重PCR檢測方法可重複性良好。
圖5中泳道2至泳道4能夠很清楚的看見長度為304bp的條帶，泳道5至泳道7能夠清晰看見長度為1232bp的條帶，而泳道8至泳道10的陰性對照和泳道11的空白對照均無明顯條帶，且重複3次結果都一致。證明本專利檢測羊口瘡病毒和絲狀支原體簇的重複性好。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
SEQUENCE LISTING
福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
兩類羊病原體雙重PCR專用引物及雙重PCR檢測方法
4
4
PatentIn version 3.3
1
25
DNA
ORFVB2L 1
1
atcgagaacg ccaagaacag catcg 25
2
25
DNA
ORFVB2L 2
2
tgtcgtccac gatgagcagc ttagt 25
3
22
DNA
Mm-cluster 1
3
tgagatgggg atgcggcgta tt 22
4
22
DNA
Mm-cluster 2
4
tgggaagcgc tctccaaatg gt 22