一種檢測11種常見感染性腹瀉病原體的基因晶片及其應用的製作方法

2023-06-14 07:49:56

一種檢測11種常見感染性腹瀉病原體的基因晶片及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種基因晶片及其應用，屬於生物檢測領域。本發明針對11種臨床常見感染性腹瀉病原微生物設計了一組檢測探針，以及含有該組探針的基因晶片。本發明的檢測探針包括副溶血弧菌探針、創傷弧菌探針、霍亂弧菌探針、溶藻弧菌探針、弗尼斯弧菌探針、志賀氏菌探針、大腸桿菌探針、氣單胞菌探針、沙門氏菌探針、彎曲菌探針，以及變形桿菌探針；前述探針序列如SEQ?ID?NO：1-117所示。本發明的基因晶片及探針能夠檢測11種臨床常見致腹瀉病原菌，檢測通量高，特異性強，靈敏度高，檢測快速有效。
【專利說明】一種檢測11種常見感染性腹瀉病原體的基因晶片及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基因晶片，尤其涉及一種用於區分和檢測11種臨床常見感染性腹瀉致病菌的基因晶片，屬於生物檢測領域。
【背景技術】
[0002]腹瀉是一種發病率高並流行於世界各地的胃腸道傳染病，其發病率僅次於上呼吸道感染，在我國感染性腹瀉發病率居所有傳染病首位。感染性腹瀉是我國的常見病和多發病，病因比較複雜，可由病毒、細菌和原蟲引起，近年來時有暴發流行，已經成為當前世界上不斷增多的公共衛生問題之一，因此亟需建立多種常見腹瀉致病菌快速高效的診斷方法。
[0003]目前，腹瀉致病菌的傳統檢測方法主要包括以下幾種:(1)糞便常規檢查；(2)病原學檢查；(3)血清學檢查；(4)分子生物學——PCR檢測方法；(5)分子生物學——基因晶片法。其中，基因晶片是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規律地排列固定於矽片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，利用這類晶片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。基因晶片技術的優點在於:1)高通量並行檢測:當一個樣品同時需要檢測多種病原菌時，一次實驗即可得出全部結果；2)操作簡便快速:整個檢測只需4-8小時基本可以出結果；但同時基因晶片技術也存在重複性差，靈敏度較低等問題。
[0004]16s rRNA在細菌及其他微生物(真菌中為18s rRNA)的進化過程中高度保守，被稱之為細菌的「分子化石」，同時其序列保守性又是相對的，在保守區之間又存在著9個高變區，不同細菌的科、屬、種之間存在著不同程度的差異，故16s rRNA可以作為細菌分類的標誌，又可以作為細菌檢測和鑑定的靶分子。而且，隨著微生物研究的不斷發展，16s rRNA的數量也在不斷的增加，更加完整，採用16s rRNA分類鑑定微生物也更加可靠。
[0005]16s rRNA序列對微生物進行分類鑑定存在一定的局限性，16s rRNA對於親緣關係較近的細菌可能解析度不夠，常不能反映關係較近的種間關係。因此，需要採用其他基因進行微生物分類鑑定分析，與16s rRNA起到相互補充的作用。最近研究發現，蛋白編碼基因gyrB是用於細菌鑑定和分類的又一理想的靶基因。gyrB基因是編碼DNA解旋酶B亞基的基因，該基因進化速率較快，鹼基替換頻率較高，能比16s rRNA基因更好地區分相似種。
[0006]由於出血性大腸桿菌0157:H7和志賀氏菌兩種微生物的16s rRNA與gyrB基因與普通大腸桿菌的基因序列相似度極高，無法根據這兩種基因序列設計探針。根據文獻調研得知，出血性大腸埃希氏菌0157:H7的wzy基因與志賀氏菌的ipaH基因為兩種微生物所特有的功能基因，可以用來特異性檢測兩種微生物。

【發明內容】

[0007]本發明針對現有技術的不足，提供一種複合基因晶片，用於同時檢測11種臨床上常見的感染性腹瀉病原體。[0008] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下:一組針對十一種感染性腹瀉病原體的基因晶片檢測探針，包括副溶血弧菌探針、創傷弧菌探針、霍亂弧菌探針、溶藻弧菌探針、弗尼斯弧菌探針、志賀氏菌屬探針、大腸桿菌探針、氣單胞菌探針、沙門氏菌探針、彎曲菌探針，以及變形桿菌探針；其中，所述副溶血弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:1-10中的任意一種或多種，所述創傷弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:11-18中的任意一種或多種，所述霍亂弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:19-30中的任意一種或多種，所述溶藻弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:31-40中的任意一種或多種，所述弗尼斯弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:41-51中的任意一種或多種，所述志賀氏菌探針的序列選自SEQ ID NO:52-64中的任意一種或多種，所述大腸桿菌探針的序列選自SEQ ID NO:65-76中的任意一種或多種，所述氣單胞菌探針的序列選自SEQ ID NO:77-86中的任意一種或多種，所述沙門氏菌探針的序列選自SEQ ID NO:87-96中的任意一種或多種，所述彎曲菌探針的序列選自SEQ ID NO =97-107中的任意一種或多種，所述變形桿菌探針的序列選自SEQ ID NO:108-117中的任意一種或多種。
[0009]本發明第二方面公開了一種檢測十一種感染性腹瀉病原體的基因晶片，所述基因晶片上整合了前述基因晶片檢測探針。
[0010]進一步，所述基因晶片還包括晶片基片。
[0011]所述晶片基片可選自氣基基片(玻片表面為氣基基團修飾)、醒基基片(玻片表面為醒基基團修飾)、疏基基片(玻片表面為疏基基團修飾)、瓊脂糖基片(玻片表面以瓊脂糖覆蓋)、葡聚糖基片(玻片表面以葡聚糖覆蓋)等。
[0012]更進一步，所述基因晶片為氨基基片。
[0013]本發明第三方面公開了一種檢測十一種感染性腹瀉病原體的方法，包括以下步驟:
[0014]1)提取待測樣本的模板DNA ；
[0015]2 )模板DNA的擴增與標記；
[0016]3)擴增標記產物與前述基因晶片雜交；
[0017]4)雜交後的晶片掃描和結果判讀。
[0018]進一步，步驟2)所述模板DNA的擴增採用通用PCR引物，所述通用PCR引物的序列如 SEQ ID NO:118-119 所示。
[0019]進一步，步驟2)所述模板DNA的擴增，其擴增的聚合酶鏈反應的反應體系如下:
[0020]
【權利要求】
1.一組針對十一種感染性腹瀉病原體的基因晶片檢測探針，包括副溶血弧菌探針、創傷弧菌探針、霍亂弧菌探針、溶藻弧菌探針、弗尼斯弧菌探針、志賀氏菌屬探針、大腸桿菌探針、氣單胞菌探針、沙門氏菌探針、彎曲菌探針，以及變形桿菌探針；其中，所述副溶血弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:1-10中的任意一種或多種，所述創傷弧菌探針的序列選自SEQID NO:11-18中的任意一種或多種，所述霍亂弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:19-30中的任意一種或多種，所述溶藻弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:31-40中的任意一種或多種，所述弗尼斯弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:41-51中的任意一種或多種，所述志賀氏菌探針的序列選自SEQ ID NO:52-64中的任意一種或多種，所述大腸桿菌探針的序列選自SEQ IDNO:65-76中的任意一種或多種，所述氣單胞菌探針的序列選自SEQ ID NO:77-86中的任意一種或多種，所述沙門氏菌探針的序列選自SEQ ID NO:87-96中的任意一種或多種，所述彎曲菌探針的序列選自SEQ ID NO:97-107中的任意一種或多種，所述變形桿菌探針的序列選自SEQ ID NO =108-117中的任意一種或多種。
2.一種檢測十一種感染性腹瀉病原體的基因晶片，其特徵在於，所述基因晶片上整合了權利要求1所述的基因晶片檢測探針。
3.如權利要求2所述的基因晶片，其特徵在於，所述基因晶片還包括晶片基片。
4.如權利要求3所述的基因晶片，其特徵在於，所述晶片基片為氨基基片。
5.一種檢測十一種感染性腹瀉病原體的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)提取待測樣本的模板DNA； 2)模板DNA的擴增與標記； 3)擴增標記產物與權利要求2-4任一權利要求所述基因晶片雜交； 4)雜交後的晶片掃描和結果判讀。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟2)所述模板DNA的擴增採用通用PCR引物，所述通用PCR引物的序列如SEQ ID NO:118-119所示。
7.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟2)所述模板DNA的擴增，其擴增的聚合酶鏈反應的反應體系如下:組分體積模板 DΝΑI μ L
10χPCR buffer2 μ L上遊引物(IOmM)0.5 μL下遊引物(10 11Μ)0.SpLDNTP ( 10 DiM)0.4 ML
rtaq ( 511/ul )0.2 μ L
加水至總體積20 μ L,
8.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟2)所述模板DNA的擴增，其擴增的聚合酶鏈反應程序為:94°C 5min;然後按94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 90s做35個循環；最後72°C 1Omin。
9.權利要求1所述針對十一種感染性腹瀉病原體的基因晶片檢測探針，以及權利要求2-4任一權利要求所述檢測十一種感染性腹瀉病原體的基因晶片在製備腹瀉病原體檢測製劑中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911443SQ201410101768
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月18日 優先權日:2014年3月18日
【發明者】孫成銘, 欒材富, 劉傑, 伊茂禮, 李少君, 吳金英, 張守信, 段麗君, 孫雋, 龔磊, 張成林 申請人:煙臺毓璜頂醫院