調節植物葉片轉綠過程的蛋白、其編碼基因及應用的製作方法

2023-06-14 01:40:01 1

專利名稱：調節植物葉片轉綠過程的蛋白、其編碼基因及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，更具體地，本發明涉及調節植物葉片轉綠過程的蛋白、 其編碼基因及應用。
背景技術：
葉片是植物進行光合作用的重要器官，影響農作物的生物產量和經濟產量。人工 控制植物葉片顏色變化對快速改良或者培育新的園藝植物品種具有重要意義。葉綠體是植物進行光合作用的場所，因此，延長葉綠體的功能對於提高生物產量 或者經濟產量具有重要的意義。另外，在園藝觀賞植物中，觀葉植物也是越來越受到人們的 重視。目前，這些觀賞植物都是從自然突變體或者通過人工誘變後篩選獲得的突變體。隨 著生物技術的不斷發展，通過轉基因定向培育植物新品種顯示出快速、效率高等特點。但是，目前在植物中發現的控制葉片顏色變化的基因還為數不多。在擬南芥整個 生育期中，到目前為止只有少數幾個基因已被報導能控制葉片逐漸轉綠。因此，本領域還有必要進行深入的研究，以找到效果明顯的可調控植物葉片顏色 變化的基因，從而為轉基因技術改良農作物或者園藝植物提供良好的基因資源。

發明內容
本發明的目的在於提供一種調節植物葉片調節植物葉片的顏色性狀(如促進植 物葉片的轉綠)的蛋白、其編碼基因及應用。在本發明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽選自下組(a)如SEQ ID NO 3所示的胺基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO :3所示的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失 或添加而形成的，且具有(a)所述多肽的功能的由(a)衍生的多肽。在一個優選例中，(a)所述多肽的功能是調節植物葉片的顏色性狀(如促進植物 葉片的轉綠)。在本發明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，所述的多 核苷酸選自下組(a)編碼所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。在一個優選例中，所述的多核苷酸編碼SEQ ID NO 3所示胺基酸序列的多肽。在另一優選例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示的核苷 酸序列。在本發明的另一方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞含有所述的載體；或基因組中整合有所述的多核苷酸。
在本發明的另一方面，提供一種所述的多肽的製備方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養所述的宿主細胞，獲得培養物；(b)從培養物中分離出所述的多肽。在本發明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用於調節植物葉片的顏色性狀。在一個優選例中，所述的調節植物葉片的顏色性狀是調節(如促進)植物葉片的轉綠。在另一優選例中，所述的植物選自下組禾本科、薔薇科、或十字花科。在另一優選例中，所述的植物包括(但不限於)擬南芥、水稻、菸草、瓜果、蔬菜、
油菜等。在本發明的另一方面，提供一種製備轉基因植物的方法，所述的方法包括(1)將所述的多核苷酸轉入植物細胞、組織、器官或種子，獲得轉化入所述的多核 苷酸的植物細胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉入了所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官或種子再生 成植物。在一個優選例中，所述的方法包括步驟(si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有所述的多核苷酸；(s2)將植物細胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農桿菌接觸，從而使所述的 多核苷酸轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(s3)選擇出轉入了所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(S3)中的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。在本發明的另一方面，提供一種轉基因的植物，其由所述的製備轉基因植物的方 法製備。在本發明的另一方面，提供一種所述的多肽或其編碼基因的激動劑或拮抗劑。在一個優選例中，所述的多肽的拮抗劑選自(但不限於)抗所述多肽的抗體，幹 擾所述多肽的編碼基因表達的幹擾分子。在另一優選例中，所述的多肽的拮抗劑是含有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列的 幹擾分子。在本發明的另一方面，提供一種製備植物的方法，所述植物的葉片具有黃化(部 分葉片黃化或全部葉片黃化)的性狀，所述的方法包括降低植物中所述的多肽的表達量；或使植物中所述的多肽不表達。在一個優選例中，所述的方法包括(1)將幹擾所述的多核苷酸表達的幹擾分子轉入植物細胞、組織、器官或種子，獲 得轉化入所述幹擾分子的植物細胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉入了所述幹擾分子的植物細胞、組織、器官或種子再生成 植物。在另一優選例中，所述的幹擾所述的多核苷酸表達的幹擾分子是在植物體內形成 microRNA的分子；優選的，所述的幹擾分子含有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。在本發明的另一方面，提供一種植物，所述的植物葉片具有黃化的性狀，其由以下
5方法製備獲得降低植物中所述的多肽的表達量；或使植物中所述的多肽不表達。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。


圖1顯示了野生型擬南芥(WT)，突變型擬南芥(clpr4)，在突變型擬南芥中轉化野 生型的ClpR4基因後獲得的轉基因擬南芥(ClpR4in clpr4)，在野生型擬南芥中轉入幹擾 野生型擬南芥中ClpR4基因表達的幹擾分子後獲得的轉基因擬南芥(Ami-clpr4)的表型。 其中，箭頭所指為黃色葉片。圖2顯示了擬南芥AtClpR4_GFP融合蛋白定位於葉綠體中。圖3顯示了野生型擬南芥以及AtClpR4功能缺失的突變型擬南芥的葉綠體超微結 構。圖4顯示了 AtClpR4基因在擬南芥中表達的組織特異性分析。
具體實施例方式本發明人經過長期的研究，找到一種新的基因一ClpR4基因，並且將之與植物的 葉片轉綠過程相關聯，發現ClpR4基因的低表達或缺失表達使得植物對新生葉片轉綠變慢 (植物新生葉片黃化)。並且，本發明人還發現，ClpR4蛋白是一個定位於葉綠體中的蛋白 水解酶。利用本發明的ClpR4基因可調節植物葉片顏色性狀，調節植物光合作用效率。如本文所用，所述的「植物」包括但不限於十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述 的「植物」包括但不限於十字花科蕓薹屬的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、禾本科的水 稻、玉米、薔薇科的櫻桃，此外還包括菸草、瓜果、蔬菜、油菜等等。如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原 始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化 的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化 的。如本文所用，「分離的ClpR4蛋白」或「分離的ClpR4多肽」是指ClpR4蛋白基本上 不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白 質純化技術純化ClpR4蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主 帶。「AtClpR4蛋白」或「AtClpR4多肽」是指擬南芥的「ClpR4蛋白」或「ClpR4多肽」。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選的是重組多肽。本發明 的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主 (例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿 主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括 起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括ClpR4蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍 生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的ClpR4蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。 本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基 (優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成 熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多 肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或 用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和 類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。任何一種ClpR4蛋白的生物活性片段都可以應用到本發明中。在這裡，ClpR4蛋白 的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的ClpR4蛋白的全部或部分 功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長ClpR4蛋白的活性。在更優 選的條件下，所述活性片段能夠保持全長ClpR4蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、 或100%的活性。在本發明中，術語「ClpR4蛋白」指具有ClpR4蛋白活性的SEQ ID NO 3序列的多 肽。該術語還包括具有與ClpR4蛋白相同功能的、SEQ ID NO :3序列的變異形式。這些變 異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最 佳地1-10個，還更佳如1-8個、1-5個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/ 或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨 基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的 功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功 能。該術語還包括ClpR4蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突 變體、在高或低的嚴緊度條件下能與ClpR4蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗 ClpR4蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含ClpR4蛋白或其 片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了 ClpR4蛋白的可溶性片段。通 常，該片段具有ClpR4蛋白序列的至少約20個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸， 較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續 胺基酸。發明還提供ClpR4蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然ClpR4蛋白的差別可 以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些 多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴 露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物 還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在 的或合成的胺基酸(如β、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例 舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙 醯化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨 酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化 了溶解性能的多肽。在本發明中，「ClpR4蛋白保守性變異多肽」指與SEQ ID NO 3的胺基酸序列相比， 有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近 的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表 1 本發明還提供了編碼本發明ClpR4蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成 熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO :1或SEQID NO 2所示的編碼區序列相同或者是簡 並的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID N0:3的蛋白 質，但與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的編碼區序列有差別的核酸序列。編碼SEQ ID NO 3的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成 熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列) 以及非編碼序列。術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼所述多肽的多核苷酸，也可以是還包 括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或 非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多 核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫 度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν) 甲醯胺，0. 小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在 90%以上，更好是95%以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO 3所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至 少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核 苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼ClpR4蛋白 的多聚核苷酸。應理解，雖然本發明的ClpR4基因優選獲自擬南芥，但是獲自其它植物的與擬南 芥ClpR4基因高度同源(如具有80%以上，如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的 其它基因也在本發明考慮的範圍之內。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的， 例如BLAST。本發明的ClpR4蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或 人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開 放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制 備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR 擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。—旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生
9物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載 體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或ClpR4蛋白 編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。通過常規的重組DNA技術(Science，1984 ；224 1431)，可利用本發明的多聚核苷 酸序列來表達或生產重組的ClpR4蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼ClpR4蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸 的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本發明中，ClpR4蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載 體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他 載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重 要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含ClpR4蛋白編碼DNA序列和合適的轉 錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組 技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表 達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的 宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋 白(GFP)，或用於大腸桿菌的卡那黴素或氨苄青黴素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適 當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母； 植物細胞等。本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將 會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用 於啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔 的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械 方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方 法，例如噴灑法、葉盤法、水稻幼胚轉化法等。對於轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規 方法再生成植株，從而獲得葉片顏色性狀發生改變的植物。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用 的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導) 誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用 蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
I=I O重組的ClpR4蛋白或多肽有多方面的用途。例如用於篩選促進或對抗ClpR4蛋白 功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組ClpR4蛋白篩選多肽庫可用於尋找有價值的 能抑制或刺激ClpR4蛋白功能的多肽分子。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或 DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析。用ClpR4蛋白 特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測ClpR4蛋白的轉錄產物。本發明提供了所述的ClpR4蛋白的用途，用於調節植物葉片的顏色性狀(如促進 植物葉片轉綠)；或用於篩選對於調節植物葉片的顏色性狀有用的物質(即所述物質通過 調節ClpR4蛋白的表達來調節植物葉片的顏色性狀)。作為一種優選方式，所述的ClpR4蛋 白可用於促進植物葉片轉綠或提高植物光合作用效率。比如，對於某些ClpR4蛋白表達低 下的植物或植株，可通過製備該種植物或植株的ClpR4蛋白提高表達的轉基因植株，來促 進植物葉片轉綠或提高植物光合作用效率，達到改良植物的目的。所述的ClpR4蛋白還可用於製備促進植物葉片轉綠或提高植物光合作用效率的 組合物。本發明還涉及ClpR4的激動劑或拮抗劑及其用途。由於ClpR4的激動劑或拮抗劑 可調節ClpR4的表達和/或調節ClpR4的活性等，因此，所述的ClpR4的激動劑或拮抗劑也 可通過對ClpR4的影響來調節植物葉片的顏色性狀或調節植物光合作用效率，從而達到改 良植物的目的。任何可提高ClpR4蛋白的活性、提高ClpR4蛋白的穩定性、促進ClpR4蛋白的表 達、延長ClpR4蛋白有效作用時間、或促進ClpR4的轉錄和翻譯的物質均可用於本發明，作 為可用於促進植物葉片轉綠或提高植物光合作用效率的有效物質。任何可降低ClpR4蛋白 的活性、降低ClpR4蛋白的穩定性、抑制ClpR4蛋白的表達、減少ClpR4蛋白有效作用時間、 或降低ClpR4的轉錄和翻譯的物質均可用於本發明，作為ClpR4的拮抗劑，如抗所述ClpR4 蛋白的抗體，幹擾所述ClpR4蛋白的編碼基因表達的幹擾分子(如可形成microRNA的幹擾 分子)。所述的拮抗劑可用於製備葉片顏色性狀改變的植物，如葉片黃化的植物。在得知了 靶序列後，製備幹擾特定基因表達的幹擾分子的方法是本領域人員熟知的。本發明還涉及一種改良植物的方法，該方法包括調節所述植物中ClpR4基因或其 同源基因的表達。一方面，本發明提供了一種促進植物葉片轉綠或提高植物光合作用效率的方法， 所述的方法包括使所述植物過量表達ClpR4蛋白。另一方面，本發明還提供了一種製備葉片具有黃化性狀的植物的方法，所述的方法包括降低所述植物中ClpR4蛋白的表達(包括使ClpR4蛋白不表達或低表達)。在得知了所述的ClpR4蛋白的用途後，可以採用本領域人員熟知的多種方法來調 節所述的ClpR4蛋白的表達。比如可通過本領域人員已知的途徑將攜帶ClpR4基因的表達 單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，並使之表達活性的ClpR4蛋白。此外，也可以採用本領域人員熟知的多種方法來降低ClpR4蛋白的表達或使之缺 失表達，比如將攜帶反義ClpR4基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上， 使得細胞或植物組織不表達或降低表達ClpR4蛋白。作為本發明的一種實施方式，將編碼ClpR4蛋白的基因通過常規的方法克隆到適 當的載體中，將所述的帶有外源基因的重組載體導入到可表達所述ClpR4蛋白的植物細胞 中，使所述的植物細胞表達ClpR4蛋白。可通過將所述植物細胞再生成植物，獲得過量表達 ClpR4蛋白的植物。優選的，提供了一種製備轉基因植物的方法，包括(1)將外源的ClpR4蛋白的編碼基因轉入植物細胞、組織、器官或組織，獲得轉化 入ClpR4蛋白的編碼基因的植物細胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉入了外源ClpR4蛋白的編碼基因的植物細胞、組織、器官 或種子再生成植物植株。作為一種優選的實例，所述的方法包括步驟(si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有ClpR4蛋白的編碼基因；(s2)將植物細胞、組織、器官與步驟(si)中的農桿菌接觸，從而使ClpR4蛋白的編 碼基因轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(S3)選擇出轉入ClpR4蛋白的編碼基因的植物細胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。其它增加ClpR4基因或其同源基因表達的方法是本領域周知的。例如，可通過用 強啟動子驅動從而增強ClpR4基因或其同源基因的表達。或者通過增強子(如水稻waxy 基因第一內含子、Actin基因第一內含子等)來增強該ClpR4基因的表達。適用於本發明 方法的強啟動子包括但不限於35s啟動子，水稻、玉米的Ubi啟動子等。優選的，提供了一種製備葉片具有黃化性狀的植物的方法，包括降低植物中 ClpR4蛋白的表達量；或使植物中ClpR4蛋白不表達。更優選地，所述的方法包括(1)將 幹擾ClpR4基因表達的幹擾分子轉入植物細胞、組織、器官或種子，獲得轉化入所述幹擾分 子的植物細胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉入了所述幹擾分子的植物細 胞、組織、器官或種子再生成植物。其它抑制ClpR4基因或其同源基因表達的方法是本領域周知的。本發明還包括利用前述任一種方法獲得的植物，所述的植物包括轉入了 ClpR4 基因或其同源基因的轉基因植物；或者ClpR4蛋白表達量(包括低表達或不表達)降低的 植物等。可採用任何適當的常規手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施所述的方法。此外，本發明還涉及利用植物葉片轉綠性狀作為一種基因轉化植株後代的追蹤標 記。此外，還可利用ClpR4基因相關的葉片轉綠特性作為雜交制種過程中真雜種的指示標記。
此外，本發明還提供篩選可調節植物葉片顏色性狀或植物光合作用效率的潛在物 質的方法。在得知了所述的ClpR4蛋白的用途後，可以採用本領域熟知的多種方法來篩選 調節植物葉片顏色性狀或調節植物光合作用效率的潛在物質。在本發明的一種優選方式中，提供一種篩選調節植物葉片顏色性狀或植物光合作 用效率的潛在物質的方法，所述的方法包括將候選物質與表達ClpR4蛋白的體系接觸，檢 測候選物質對ClpR4蛋白的影響；若所述候選物質可提高或降低ClpR4蛋白的表達，或促進 或抑制ClpR4蛋白的活性，則表明其是可用於調節調節植物葉片顏色性狀或植物光合作用 效率。這些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫，以便於人們最終可以從中篩選出能夠對 於調節植物葉片顏色性狀或植物光合作用效率有用的物質。因此，本發明還包括通過所述的篩選方法獲得的物質，所述的物質可用於調節植 物葉片顏色性狀或植物光合作用效率。在本發明的一個實例中，提供了 一種獲自擬南芥的ClpR4基因(AtClpR4)，該基因 的基因組序列全長2681bp，cDNA序列全長918bp，編碼305AA的一條多肽，所述的基因如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示。其編碼的蛋白如SEQ IDNO :3所示。本發明的主要優點在於(1)本發明的基因調節植物葉片顏色性狀的效果明顯，為轉基因技術改良農作物 或者園藝植物提供了很好的基因資源。(2)使用本發明的基因可以通過轉基因技術提高作物的產量或者快速培育出植物 葉片顏色性狀改變(如葉片顏色變綠或黃化)的新品種。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1、植物葉片轉綠調控基因的鑑定本發明人用0. 2% (V/V)的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變擬南芥野生型Col-O生態型 (獲自美國 ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center))，經M2代篩選與M3代鑑定， 獲得一個穩定的葉色逐漸轉綠株系(突變體)。與Col-O相比，突變體的新葉為黃色，而老 葉則轉為綠色，在整個生長過程中均如此，並且其葉緣呈鋸齒型，植株生長速率相對較慢。將野生型Col-O作為父本、突變體作為母本雜交得到的Fl代或將突變體作為父 本、野生型Col-O作為母本雜交得到的Fl代，植株均同野生型一樣，無葉片黃化表型，表明 該基因為細胞核編碼的隱性基因。播種從Fl代植株上收穫的種子得到F2代植株，在隨機取 的植株中，葉片逐步轉綠植株與正常植株的比例為1比3，表明該基因為單位點隱性突變。將該突變體與擬南芥野生型Ler生態型(獲自美國ABRC (ArabidopsisBiological Resource Center))雜交得到Fl代，Fl代自交獲得F2代圖位克隆群體，利用基於擬南 芥DNA多態性資料庫(http://www.arabidopsis.org/)中簡單序列長度多態性(simplesequence length polymorphism, SSLP)的InDel標記對突變基因進行定位。隨機選取60 個突變植株抽提DNA，每30個突變體DNA混成一個DNA池，進行基因的BSA (分群分析法， Bulk segregate analysis)分析。用覆蓋基因組的20對分子標記進行PCR擴增，同時擴增 Col-O,Ler.Fl的DNA作為對照，將突變基因初步定位在4號染色體下臂。然後擴大群體進 行精細定位，檢測到一個點突變，該突變位點位於ClpR4基因第二個內含子的第一個鹼基， 從而影響到RNA前體的剪切。在突變體中，可以檢測到3個轉錄本，其中最小的一條的錯誤 剪切導致多於野生型5個胺基酸，推測其可能會有部分功能。ClpR4蛋白是葉綠體Clp蛋白 酶體的核心亞基之一，此複合體參與葉綠體蛋白的降解。ClpR4基因在各種組織與發育時期 都能檢測到表達。AtClpR4 基因編碼區基因組(genomic DNA)序列如下(SEQ ID NO 1)(註明小寫斜體字為5』UTR，內含子和3』UTR，大寫正體字為外顯子序列(SEQ ID NO 2))agatcgttatcgtttcggggtcacagggactttcactctttctctctctctgcaacaaagaagaaATGG AGGTAGCAGCAGCGACTGCGACGAGCTTCACAACGCTTCGAGCTCGTACGTCAGCGATTATCCCGTCTTCTACACGT AATCTGAGATCTAAACCGAGATTTTCTTCATCTTCATCTCTCAGAGCTTCTCTTTCGAATGGCTTTCTTTCGCCGTA TACCGGAGGAAGCATCTCTAGTGACTTATGCGGCGCTAAGCTTCGTGCGGAATCGCTTAATCCGTTAAATTTTTCCA GTTCCAAGCCTAAACGCGGAGTTGTCACTATGgtactcgaatttatactttttttcagtttcttaattaacgagctc cctattctgttaggattttgaaattgaggttttcgttgctatagctgagatttatgcttctgtggtagtgaattttc agaaattgtatttgtcgagaaatggtgttccttagttttgaaccaatggattagattgactctagatataggctatt agattgcaagggggagtaatgctcattcattctatagctgagatttatgcttctgtggtggtgtaattgagggaaaa tttatgggtcgaatcttaccaacggttgctacttagctttaaacggcgaattaatggattagagttactattgatat atgcaattagatagcaaagacggctcattcatttctgttgtttaattgatcggaaatggtacatgtttagttagaga gttgagtatgaagattaaataatgcagtttcggaagaaattatgctgtgtgtttggctggtaaggaagaagttgagt tattatgtggcagaggtttcacttgattgtgtgtgccacttataatatgcatcaattgctctgattatgattatgat agagaatttggaggctgctatattcttcacatatagtcttttgtttattgttgttattatatgattcttatcttcgt gcttccgtcttatcaacagGTTATACCTTTCTCAAAGGGAAGTGCACACGAACAACCTCCTCCTGATTTGGCATCAT ATTTGTTCAAGAACCGAATTGTATATTTGGGAATGTCTCTCGTACCTTCAGTTACTGAGTTGATACTTGCGGAGTTT CTTTACCTTCAGTATGAAGACGAGGAAAAGCCTATTTACCTTTACATAAACTCGACTGGGACAACCAAGgtgggctt ccattatgtagtccatcatattaagaacgcatactgaatagtaaaattgaaactgtggtttgtttcaaatgaatgac taaaagcttagaaatcattacctatcgttcaaactgtttttaagagaatttatcttctcccttttcagAATGGTGAA AAGTTGGGCTATGATACTGAGGCTTTTGCAATCTATGATGTCATGGGgtaattgatcttcatctctttcctcaactt acttcttcccgtaatagcatcgataacaagacttggatacttaaactgctttcccaaatattcaaaattgcacttgg agacagttttcatatccagcatattttggggagaacgaccaattatcaatgcaacaatcaactcttaccttatcttt gaatttcagGTATGTCAAACCACCAATCTTTACTCTTTGCGTCGGGAATGCTTGGGGTGAAGCTGCTTTGCTTCTGA CTGCTGGTGCAAAAGGAAATCGATCTGCGTTGCCCTCATCAACTATTATGATAAAGCAGgttctttctgatcgtttc ttttaaatattaggtggcgtcttttccccctgctagaagattttggttttctttttcaagttggaagaatctaaggt 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AESLNPLNFSSSKPKRGVVTMVIPFSKGSAHEQPPPDLASYLFKNRIVYLGMSLVPSVTELILAEFLYLQYEDEEK PIYLYINSTGTTKNGEKLGYDTEAFAIYDVMGYVKPPIFTLCVGNAWGEAALLLTAGAKGNRSALPSSTIMIKQP IARFQGQATDVEIARKEIKHIKTEMVKLYSKHIGKSPEQIEADMKRPKYFSPTEAVEYGIIDKVVYNERGSQDRG VVSDLKKAQLI實施例2、擬南芥AtClpR4功能缺失的表型與遺傳互補鑑定1.遺傳互補鑑定為證實葉色逐步轉綠的表型確實與ClpR4基因有關，本發明人進行了遺傳互補分 析。通過PCR擴增，克隆了它的全長cDNA，構建花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子驅動的重 組表達載體。以 5，-CACCATGGAGGTAGCAGCAGCGACT-3，(SEQ ID NO 5)和 5，-AGTTCTGACATTCAAAT GAGTTGTGC-3，(SEQ ID NO 6)為引物，從擬南芥野生型Col-O生態型的cDNA文庫中PCR擴 增獲得ClpR4基因的全長cDNA，利用Getaway克隆系統導入pENTR/SD/D-TOPO克隆載體(購 自 Invitrogen 公司)，測序正確後通過 LR 反應(LR CLONASE Enzyme Mix，購自 Invitation 公司)至表達載體PGWB2(Invitr0gen)，獲得重組表達質粒。將重組表達質粒常規方法轉入 農桿菌 GV3101 (購自 Invitrogen)。擬南芥轉化採用噴灑法，將含有重組表達質粒的農桿菌均勻噴灑擬南芥，至葉片 上有液滴落下，將植物避光過夜。之後將植物轉移到正常條件下生長。7天後按上述方法重 復轉化1次。待種子成熟後將植株混合採收，在乾燥器中放置7天。Tl代種子消毒後播種 在含有50μ g/ml Kan的V2XMS培養基上，4°C放置72h，然後正常光照培養。結果，在實施例1獲得的突變體植物中轉化野生型的ClpR4基因後，獲得了多個葉 色轉綠恢復的轉基因株系，其表型見圖l(ClpR4 in clpr4)。2.功能缺失表型的建立針對AtClpR4基因的序列特異性，根據WMD 2-ffeb MicroRNA Designer設計了產 生人工microRNA(AmiRNA)的PCR引物如下MIR-VAR2-I miR-s(SEQ ID NO 7)5， -GaTAAACTCGGAAAGAATTGCGCtctctcttttgtattcc-3，；MIR-VAR2-II miR_a(SEQ ID NO 8)5， -GaGCGCAATTCTTTCCGAGTTTAtcaaagagaatcaatga-3，；MIR-VAR2-III miR*s(SEQ ID NO 9)
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5， -GaGCACAATTCTTTCGGAGTTTTtcacaggtcgtgatatg-3，；MIR-VAR2-IV miR*a(SEQ ID NO: 10)5，-GaAAAACTCCGAAAGAATTGTGCtctacatatatattcct-3，。通過對出發質粒pRS300 (Tubingen University, Germany)的 PCR 突變(參見 Tubingen University 提供的使用說明書，或 The Plant Cell, Vol. 18，1121—1133，May 2006提供的方法)，獲得了含針對AtClpR4的人工迴文序列的片段，然後用A、B引物擴增出 含有ClpR4靶向序列的片段克隆到pENTR/SD/D-TOPO載體，LR反應至表達載體PGWB2。A 引物(SEQ ID NO 11)5， -CACCCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3，；B 引物(SEQ ID NO 12)5 』 -GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3』。將上述載體通過農桿菌轉化野生型Col-O生態型，結果獲得了多個葉片轉綠明顯 變慢的轉基因Tl株系，其表型見圖l(Ami-clpr4)，其新生葉片顯示黃色。其中，ClpR4TargetmicroRNA 的特異性序列為(SEQ ID NO 4)5』 -TAATCGCTGACGTACGAGGTC-3』。實施例3、擬南芥AtClpR4_GFP融合蛋白定位於葉綠體中本發明人用前述的方法克隆AtClpR4不含終止子的全長cDNA到pENTR/SD/D-TOPO 載體，引物序列為 5，-CACCATGGAGGTAGCAGCAGCGAC T-3』 (SEQ ID NO 5)和 5，-AATGAGTTGT GCCTTTTTAAGGTCAG(SEQ ID NO 13)-3，，LR反應至PGWB5表達載體。將此融合表達載體通 過農桿菌轉化野生型Col-O生態型。轉化ClpR4_GPF的陽性植株後代5天的小苗用於觀察亞細胞定位，GFP螢光通過 雷射共聚焦掃描顯微鏡(FITC488，Zeiss LSM500)觀察。GFP螢光檢測激發波長為488nm， 發射波長為505至545nm。葉綠素自發螢光檢測激發波長為488nm，發射波長為585nm。結果如圖2所示，可見擬南芥AtClpR4_GFP融合蛋白定位於葉綠體中。實施例4、擬南芥AtClpR4功能缺失對葉綠體超微結構的影響利用透射電鏡對野生型Col-O和突變體擬南芥的葉綠體進行觀察，Col-O的葉綠 體可以觀察到完整的雙層膜結構，以及內部相互連接的基粒與間質類囊體；來自突變體擬 南芥外周(ClpR4 outer)葉色正常葉片的葉綠體超微結構與野生型沒有明顯區別，但來自 內周(ClpR4 inner)黃色葉片的葉綠體發育有缺陷，葉綠體變小。見圖3。實施例5、AtClpR4基因表達的組織特異性為了了解AtClpR4基因表達的特點，本發明人分別檢測了抽薹時期植株中的根、 莖、莖生葉、花及果莢等組織中的基因轉錄水平。另外，還對不同生長時期(10天、30天、60 天)的植株葉片進行了分析，其中生長60天的植物葉片被分成外周和內周葉片兩組。常規方法提取樣品中的RNA，並常規方法製備cDNA文庫。基因表達的檢測通過設 計基因特異性引物ClpR4-RT-F(SEQ ID NO: 14) :5，-TCAGCGATTATCCCGTCTTCTAC-3，；ClpR4-RT-R(SEQ ID NO 15) :5，-AGCCTCAGTATCATAGCCCAAC-3，。經PCR擴增基因產物，然後由瓊脂糖凝膠電泳分離，圖像分析通過GIS-2010 (天 能)進行。將Actin的表達水平作為內標，為了預防DNA汙染，同時將基因組的DNA作為目
16的帶擴增對照。結果見圖4。實驗結果表明ClpR4在地上部組織中的表達水平比地下根中的表達 明顯要高。但是，地上部各組織之間的表達量沒有很大的差異。實施例6、AtClpR4基因的變異基因及其功能重複實施例2中第1部分，不同點在於額外地對實施例2中第1部分中獲得的重 組質粒進行定點誘變，其中所含有的外源cDNA序列即SEQ ID NO 2序列中第910位由c變 為a (從而使得第304位胺基酸由Leu變為lie)的基因，構成可表達AtClpR4基因的變異 基因Mut. 1的重組質粒。將該重組質粒轉化農桿菌並噴灑實施例1獲得的突變體擬南芥， 製備後代轉基因植物。觀察上述獲得的轉基因植物的葉片性狀，結果發現，所獲得的轉基因植物的葉片 轉綠情況與野生型植物相同。本發明人在擬南芥AtClpR4基因功能研究過程中發現，基因下調及上調植株表型 明顯，性徵可以遺傳。並且，對ClpR4基因的調節作用還可用於其它植物例如水稻、菸草、蔬 菜、油菜等的葉片顏色調控。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。序列表中國科學院上海生命科學研究院調節植物葉片轉綠過程的蛋白、其編碼基因及應用<130)09243915PatentIn version 3.312681DNA 擬南芥(Arabidopsis thaliana)1
0190]agatcgttatCgtttCggggtcacagggactttcactctttctctctctctgcaacaaag600191]aagaaatggaggtagcagcagcgactgcgacgagcttcacaacgcttcgagctcgtacgt1200192]cagcgattatcccgtcttctacacgtaatctgagatctaaaccgagattttcttcatctt1800193]catctctcagagcttctctttcgaatggctttctttcgccgtataccggaggaagcatct2400194]ctagtgacttatgcggcgctaagcttcgtgcggaatcgcttaatccgttaaatttttcca3000195]gttccaagcctaaacgcggagttgtcactatggtactcgaatttatactttttttcagtt3600196]tcttaattaacgagctccctattctgttaggattttgaaattgaggttttcgttgctata4200197]gctgagatttatgcttctgtggtagtgaattttcagaaattgtatttgtcgagaaatggt4800198]gttccttagttttgaaccaatggattagattgactctagatataggctattagattgcaa5400199]gggggagtaatgctcattcattctatagctgagatttatgcttctgtggtggtgaattga600
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外顯子
(1)．．(918)
2
atggaggtag cagcagcgac tgcgacgagc ttcacaacgc ttcgagctcg tacgtcagcg60
attatcccgt cttctacacg taatctgaga tctaaaccga gattttcttc atcttcatct1 20
ctcagagctt ctctttcgaa tggctttctt tcgccgtata ccggaggaag catctctagt180
gacttatgcg gcgctaagct tcgtgcggaa tcgcttaatc cgttaaattt ttccagttcc240
aagcctaaac gcggagttgt cactatggtt atacctttct caaagggaag tgcacacgaa300
caacctcctc ctgatttggc atcatatttg ttcaagaacc gaattgtata tttgggaatg360
tctctcgtac cttcagttac tgagttgata cttgcggagt ttctttacct tcagtatgaa420
gacgaggaaa agcctattta cctttacata aactcgactg ggacaaccaa gaatggtgaa480
aagttgggct atgatactga ggcttttgca atctatgatg tcatggggta tgtcaaacca540
ccaatcttta ctctttgcgt cgggaatgct tggggtgaag ctgctttgct tctgactgct600
ggtgcaaaag gaaatcgatc tgcgttgccc tcatcaacta ttatgataaa gcagcccatt660
gctcgatttc aaggccaagc aactgatgtt gaaattgcaa ggaaagaaat caagcacata720
aagacagaaa tggtcaagct gtattcaaag catattggta aatccccgga gcagattgaa780
gctgacatga aacgcccgaa atattttagt cccactgagg ctgttgaata tgggatcatt840
gataaggtgg tttacaatga aaggggcagc caagacagag gagttgtgtc tgaccttaaa900
aaggcacaac tcatttga9 18
3
305
PRT
擬南芥(ArabidopsiS thaiiana)
3
Met Gh Val Ala Ala Ala Thr Ala Thr Set Phe Thr Thr Leu Arg Ala
l5lo15
Arg Thr Set Ala Ile Ile Pro Set Set Thr Arg Asn Leu Arg Set Lys
202530
Pro Arg Phe Set Set Set Set Set Leu Arg Ala Set Leu Set Asn Gly
354045
Phe Leu Set Pro Tyr Thr Gly Gly Set I le Set Set Asp Leu Cys Gly
505560
Ala Lys Leu Arg Ala Gh Set Leu Asn Pro Leu Asn Phe Set Set Set
65707580
Lys Pro Lys Arg Gly Val Val Thr Met Val I le Pro Phe Set Lys Gly
859095
Set Ala HiS Gh Gin Pro Pro Pro Asp Leu Ala Set Tyr Leu Phe Lys
100105110
Asn Arg Ile Val Tyr Leu Gly Met Set Leu Val Pro Set Val Thr Gh
115120125
Leu lie Leu AlaGluPheLeuTyrLeuGlnTyrGluAspGluGluLys
130135140
Pro lie Tyr LeuTyrlieAsnSerThrGlyThrThrLysAsnGlyGlu
145150155160
Lys Leu Gly TyrAspThrGluAlaPheAlalieTyrAspValMetGly
165170175
Tyr Val Lys ProProliePheThrLeuCysValGlyAsnAlaTrpGly
180185190
Glu Ala Ala LeuLeuLeuThrAlaGlyAlaLysGlyAsnArgSerAla
195200205
Leu Pro Ser SerThrlieMetlieLysGlnProlieAlaArgPheGln
210215220
Gly Gln Ala ThrAspValGlulieAlaArgLysGlulieLysHislie
225230235240
Lys Thr Glu MetValLysLeuTyrSerLysHislieGlyLysSerPro
245250255
Glu Gln lie GluAlaAspMetLysArgProLysTyrPheSerProThr
260265270
Glu Ala Val GluTyrGlylielieAspLysValValTyrAsnGluArg
275280285
Gly Ser Gln AspArgGlyValValSerAspLeuLysLysAlaGlnLeu
290295300
lie
305
4
21
DNA
人工序列
misc_feature
寡核苷酸
4
taatcgctga cgtacgaggt c21
5
25
DNA
人工序列
misc_feature
引物
5caccatggag gtagcagcag cgact25626DNA人工序列misc_feature 引物6agttctgaca ttcaaatgag ttgtgc26740DNA人工序列misc_feature 引物7gataaactcg gaaagaattg cgctctctct tttgtattcc 40840DNA人工序列misc_feature 引物8gagcgcaatt ctttccgagt ttatcaaaga gaatcaatga 40940DNA人工序列misc_feature 引物9gagcacaatt ctttcggagt ttttcacagg tcgtgatatg 401040DNA人工序列misc_feature
21
misc_feature 引物15agcctcagta tcatagccca ac2權利要求
一種分離的多肽，其特徵在於，該多肽選自下組(a)如SEQ ID NO3所示的胺基酸序列的多肽；或(b)將SEQ ID NO3所示的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述多肽的功能的由(a)衍生的多肽。
2.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，所述的多核苷酸選自下組(a)編碼如權利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特徵在於，所述的多核苷酸編碼SEQIDNO :3所示 胺基酸序列的多肽。
4.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求2或3所述的多核苷酸。
5.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，所述的宿主細胞 含有權利要求4所述的載體；或基因組中整合有權利要求2或3所述的多核苷酸。
6.一種權利要求1所述的多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求5所述的宿主細胞，獲得培養物；(b)從培養物中分離出權利要求1所述的多肽。
7.權利要求1所述的多肽的用途，其特徵在於，用於調節植物葉片的顏色性狀。
8.如權利要求7所述的用途，其特徵在於，所述的調節植物葉片的顏色性狀是調節植 物葉片的轉綠。
9.一種製備轉基因植物的方法，其特徵在於，所述的方法包括(1)將權利要求2或3所述的多核苷酸轉入植物細胞、組織、器官或種子，獲得轉化入權 利要求2或3所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉入了權利要求2或3所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官 或種子再生成植物。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的方法包括步驟(si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有權利要求2或3所述的多核苷酸；(s2)將植物細胞、組織、器官或種子與步驟(si)中的農桿菌接觸，從而使權利要求2或 3所述的多核苷酸轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(s3)選擇出轉入了權利要求2或3所述的多核苷酸的植物細胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
11.一種權利要求1所述的多肽或其編碼基因的激動劑或拮抗劑。
12.如權利要求11所述的激動劑或拮抗劑，其特徵在於，所述的多肽的拮抗劑是含有 SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的幹擾分子。
13.一種製備植物的方法，所述植物的葉片具有黃化的性狀，其特徵在於，所述的方法 包括降低植物中權利要求1所述的多肽的表達量；或使植物中權利要求1所述的多肽不表達。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述的方法包括(1)將幹擾權利要求2所述的多核苷酸表達的幹擾分子轉入植物細胞、組織、器官或種 子，獲得轉化入所述幹擾分子的植物細胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(1)獲得的轉入了所述幹擾分子的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
全文摘要
本發明公開了一種調節植物葉片轉綠過程的蛋白、其編碼基因及應用。本發明還公開了利用所述的基因製備葉片轉綠性狀改變的植物的方法。本發明的蛋白對於植物培植領域具有廣泛的應用價值，可用於調節植物葉片的顏色性狀，或調節植物光合作用效率，為轉基因技術改良農作物或者園藝植物提供了很好的基因資源。
文檔編號C12N15/82GK101906154SQ200910052370
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月2日 優先權日2009年6月2日
發明者吳文娟, 黃繼榮 申請人:中國科學院上海生命科學研究院