一種假環多肽及其合成方法和應用的製作方法

2023-06-14 13:34:51 3

專利名稱：一種假環多肽及其合成方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗菌藥物領域，具體涉及一種具有抗菌功能的假環多肽及其合成方法 和應用。
背景技術：
抗菌肽是生物體經誘導產生的一種具有生物活性的小分子多肽。傳統抗生素類藥 物一般而言，其抗菌譜一般較窄且通常只對細菌有效，對真菌、病毒等病原體無效且易產生 耐藥性；抗菌肽則不僅具有高效、廣譜的抗菌活性，而且具有潛在的抗病毒、抗腫瘤活性、不 易產生耐藥性等特點。因此抗菌肽在生物醫學、藥學、免疫學等許多方面有著可觀的發展前 景。迄今為止，已經從動物、植物、微生物和人體上發現超過300多種抗菌肽。Loloatins抗菌肽家族包含4個成員，即Loloatin A、B、C和D，它們是在實驗室 條件下由採集於巴布亞紐幾內亞南部海灘沿岸大堡礁上的海洋微生物的發酵液中分離出 來的一類環十肽抗菌素。研究發現，該家族中的Loloatin C[結構式為CyCl0-(-L-Val-L -Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Trp-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Trp)]不僅對革蘭氏陽性菌(G+) 表現出和tyrocidine C—致甚至更好的抗菌活性，還對革蘭氏陰性菌(G)Escherichia coli 表現出明顯的抗菌活性(Gerard, J. Μ.，etal. J. Nat. Prod. 1999，62，80-85)。Chen 隨 後的研究發現Loloatin C的藥核結構為-D-Tyr-Pro-Trp-D-Phe-，即該四肽序列結構對 Loloatin C抑菌活性的發揮起著關鍵的作用(Chen H. Preparation and Evaluation of the Loloatins and Their Analogues. Ann Arbor, Mich :UMI,2003)。
研究結果表明，抗菌肽是通過破壞細菌細胞膜的完整性從而使得膜的穿透性增加而殺死細菌(Ghadiri，M. R. et al. ，Nature, 2001,412 452-455 ；Zasloff, M. ，Nature, 2002,415 :389-395)。因此，以Loloatin C的藥核結構作為模板，設計不同邊鏈環化的假環 多肽化合物，以此調控環的三維結構，使其具有更剛性的α-螺旋結構特徵或納米管狀結 構，將是構建具有更強抗菌活性的抗菌肽的有效途徑。

發明內容
本發明的目的在於根據現有的抗菌素類藥物中存在的抗菌譜較窄且通常只對細 菌有效，對真菌、病毒等病原體無效，易產生耐藥性的缺點，提供一種高效、廣譜、不易產生 耐藥性的抗菌假環多肽。本發明另一目的在於提供上述假環多肽的合成方法。本發明還有一個目的在於提供上述假環多肽的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現本發明假環多肽是在對來自海洋微生物代謝物Loloatin C抗菌藥核結構研究的 基礎上設計合成的，該假環多肽包含Loloatin C的藥核序列結構-Α1-Α2-Α3-Α4-。作為一種優選方案，所述Al為L-酪氨酸或D-酪氨酸；所述Α2為L-脯氨酸或 D-脯氨酸；所述A3為L-色氨酸或D-色氨酸；所述Α4為L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸。
作為一種最優選方案，本發明假環多肽對邊鏈骨架進行環化，Loloatin C的藥核 結構具體序列為-D-Tyr-Pro-Trp-D-Phe-，如式(I)所示，其中，m可以是2、3、或4 ;n可以 是 2、3、4 或 6 ； 式(I)。本發明假環多肽的合成方法是採用液相法合成結構構件，固相法合成線性假多 肽，最後經稀溶液環化法合成得到假環多肽。式⑴所示的假環多肽的合成途徑如下1 · H2N (CH2) nNH2 — Cbz-HN (CH2) nNH2 作為一種優選方案，本發明假環多肽的具體合成步驟如下所示(1)構件Cbz-NH (CH2) n_NH2的合成室溫下將二胺H2N (CH2) nNH2溶解於二氯甲 烷中，冷至0°C，滴加氯甲酸苄酯(CbZ-Cl)進行反應。二胺和氯甲酸苄酯的摩爾比為 1.0 (0.5 0.3)，最好為1.0 0.33，保持0°C反應過夜，然後撤去冰浴，升至室溫反 應1 3h。反應完成後，反應液經過濾、洗滌、乾燥、減壓蒸餾，最後快速柱層析純化，製得 Cbz-NH (CH2)n-NH2，產率見表 1 ；表1構件Cbz-NH (CH2) n_NH2的合成產率 (2)構件HOOC(CH2)m-CO2BzI的合成將相應的酸酐加熱至熔融狀態，逐滴滴加苄 醇，酸酐與苄醇的摩爾比為1.0 (1.0 3.0)，最後為1.0 1.5。滴加完畢，繼續攪拌反 應lh，冷卻，加入飽和氯化鈉溶液，二氯甲烷萃取，合併有機相，經水洗、乾燥、減壓蒸餾除溶 劑，快速柱層析純化，製得目標產物，產率見表2 ；表2構件HOOC (CH2) m_C02Bzl的合成產率 (3)線性假多肽的合成胺基酸的裝配從C端到N端逐個進行，由人工控制或合成 儀(美國應用系統生物公司生產的Pioneer多肽合成儀)設定自動控制。首先稱取0. Immol 結合了第一個胺基酸即D-Phe的Wang樹脂(購自吉爾生化(上海)有限公司)，裝於多肽反 應器中，用20%體積比的二氯甲烷(DCM) 二甲基甲醯胺(DMF)溶液溶脹30min，然後用30% 體積比的哌啶二甲基甲醯胺溶液脫保護基(Fmoc)，DMF清洗3次。將9-芴甲氧羰基(Fmoc) 保護的胺基酸溶於三吡咯基膦氧苯駢三氮唑六氟合磷鹽(PyBOP)，羥基苯駢三唑(HOBt)和 二異丙基乙基胺(DIPEA)，溶解後的溶液加於反應器中偶合反應60 120min，DMF清洗3 次；重複以上脫保護、偶合反應、清洗等步驟直到製備結束，製備完成後，線性假多肽經如下 步驟從樹脂上剪切取下反應後的肽樹脂，加入切肽試劑(其組成為95%三氟醋酸，2.5% 二氯甲烷，2. 5%三乙基矽烷)，室溫反應2h，過濾，濾液在室溫下用旋轉蒸發儀蒸除易揮發 溶劑，加適量冷乙醚洗滌，殘留物加少量水，冷凍乾燥得線性假多肽粗品；線性假多肽的純 化採用反相高效液相法(RP-HPLC)，洗脫液為甲醇-0. 三氟醋酸水溶液，收集洗脫峰，冷 凍乾燥，產品經質譜分析鑑定，線性假多肽的序列結果及產率見表3 ；表3線性假多肽的結構及產率 (4)抗菌假環多肽的合成準確稱取線性假多肽溶解於乾燥的乙腈中，使得溶液 濃度在10_2 10_4mol/L之間，分批加入4 6倍量、一般為5倍量的環合試劑，環合試劑一 般為0-苯駢三氮唑基-N，N，N' ,N'-四甲基脲四氟合硼鹽(TBTU)/羥基苯駢三唑(HOBt)/ 二異丙基乙胺(DIPEA)。旋轉蒸除溶劑，粗品用反向高效液相(RP-HPLC)分離純化，假環多 肽的結構及產率見表4。表4抗菌假環多肽的結構及產率
本發明假環多肽可以用於製備抗菌藥物，特別是用於製備治療革蘭氏陽性菌或革 蘭氏陰性菌感染的藥物。利用96孔板法檢測抗菌肽的抗菌活性，並以預先合成的天然抗菌 肽Loloatin C為對照，進行抗菌活性檢測。結果表明，本發明所設計合成的抗菌假環多肽 CHR-2、CHR-5、CHR-9保留了 Loloatin C的抗菌活性，抗菌假環多肽CHR-6比Loloatin C 具有更好的抗菌活性。此外，本發明還檢測了合成抗菌假環多肽對人體紅細胞的溶血活性，實驗表明，抗 菌假環多肽的溶血率值很低，證實本發明所涉及的合成抗菌假環多肽的溶血毒性很小。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果(1)本發明假環多肽用於製備抗菌藥時，具有高效、廣譜、不易產生耐藥性的特點， 其中假環多肽CHR-6的抗菌活性比Loloatin C更好；(2)實驗證實，本發明假環多肽的溶血毒性很小，用於抗菌藥時，對人體的毒副作 用小，適合推廣應用；(3)本發明假環多肽的製備方法反應條件溫和，操作簡便安全，產品純度高，容易 自動化，總收率穩定。


圖1為線性假多肽L的質譜圖；圖2為假環多肽CHR-2的質譜圖。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例1抗菌假環多肽CHR-2的製備及分離純化抗菌假環多肽CHR-2的結構見通式I和表4，經4個步驟合成。(I)Cbz-NH(CH2)2NH2 的製備將 1. 8g(30mmol)乙二胺溶解在 250mL 的二氯甲烷 中，充分攪拌，冰浴冷卻至0°c，隨後向此溶液中緩慢滴加溶有IOmmol苄氧羰基氯的IOmL 二氯甲烷溶液，約需要lh，滴加完後，繼續保持在0°C下反應過夜。撤去冰浴，反應液升至 室溫，繼續攪拌反應2h。反應結束後，將白色懸浮物過濾除去，濾液用飽和氯化鈉水溶液洗 滌(3X50mL)，無水硫酸鈉乾燥後，旋轉蒸發除去溶劑，快速柱層析純化，得3. 92g N-苄氧 羰基乙二胺，產率為67. 2%。產物經NMR和MS譜鑑定。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 7. 34 (m, 5H)，5. 18 (br, 1H, -C0NH-)，5. 08 (s, 2H)，3. 25 (d, J = 6. OHz, 1H)，3. 20 (d, J = 6. OHz, 1H)， 2. 80 (t, J = 6. 0Hz, 2H)，1. 48(s，2H，-NH2) ；ESI-MS m/z :calc fOrC10H14N2O2 194. 1 ；found for [M+H]+ 195.3。(2)HOOC(CH2)2CO2Bzl 的製備將 1. 5g(15mmol) 丁二酸酐加入到 50mL 的圓底燒 瓶中，油浴加熱到120°C讓其剛好熔解，保持120°C，攪拌下逐滴滴加1.08g(10mmOl)苄醇， 15min內滴完，繼續反應lh。隨後加入50mL飽和氯化鈉水溶液終止反應，並用二氯甲烷萃取 (3X50mL)，合併有機相，有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌(3X50mL)、無水硫酸鈉乾燥後， 旋轉蒸發除去溶劑，快速柱層析純化，得丁二酸單苄酯2. 84g，產率為91.3%。產物經匪R和 MS 鑑定。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ :7· 37-7. 34 (m，5Η)，5· 15 (s，2Η)，2· 74-2. 66 (m，4Η) ； 13C NMR (400MHz, CDCl3) δ :178· 4，172. 0，135. 6，128. 5，128. 2，128. 1,66. 6,28. 9,28. 8 ； ESI-MS m/z :calc for C11H13O4 208. 2 ；found for [M+Na]+231. 7。(3)線性假多肽 HOOC (CH2) 2C0-D-Tyr-Pro_Trp-D-Phe-NH (CH2) 2NH2 (L)的製備採 用固相多肽合成法，胺基酸的裝配從C端到N端逐個進行，由人工控制。首先稱取0. Immol 結合了第一個胺基酸即D-Phe的Wang樹脂(購自吉爾生化(上海)有限公司)，加到多肽 合成反應器中，用20%體積比的二氯甲烷(DCM) 二甲基甲醯胺(DMF)溶液溶脹30min，然後 用30%體積比的哌啶二甲基甲醯胺溶液脫保護基(Fmoc)，DMF清洗3次。將9-芴甲氧羰基 (Fmoc)保護的胺基酸即Fmoc-Trp-OH溶於三吡咯基膦氧苯駢三唑六氟合磷鹽(PyBOP)Ji 基苯駢三唑(HOBt)和二異丙基乙基胺(DIPEA)，溶解後的溶液加入多肽反應器中偶合反應 60 120min，DMF清洗3次；重複以上脫保護、偶合反應、清洗等步驟，依次偶合Pro，D-Tyr， 丁二酸單苄酯，得肽樹脂。取下反應後的肽樹脂，加入切肽試劑(其成分為95%三氟醋酸，2. 5%二氯甲烷， 2. 5%三乙基矽烷)，室溫反應2h，過濾，濾液在室溫下用旋轉蒸發儀蒸除易揮發溶劑，加少 量水，冷凍乾燥得中間體化合物Δ。稱取80. 2mg (0. Immol)中 間 # A, 57. 2mg PyBOP (0. 1 Immo 1)及13. 5mgH0Bt (0. llmmol)，分別加到IOmL的西林瓶中，同時加入5mL新鮮乾燥的DCM/DMF混 合溶液和0.06mL DIEA，避光攪拌反應15min。用滴管將所生成的活潑酯溶液轉移至溶有 64. Img (0. 33mmol) I-N-苄氧羰基_1，2_乙二胺的5mL 二氯甲烷溶液，避光偶合反應2h，旋 轉蒸發將溶劑儘量除去，然後將其溶解在IOmL甲醇中，加入0. 2g 5% Pd/C，並通入氫氣，進 行脫苄氧羰基保護基及脫苄酯保護基，攪拌反應8h，旋轉蒸發將溶劑除去，得線性假多肽L 粗品。線性假多肽粗品的純化採用反相高效液相法(RP-HPLC)，洗脫液為甲醇-0. 三 氟醋酸水溶液，採用梯度洗脫，收集各洗脫峰餾分，室溫下旋轉蒸發除去甲醇，水溶液經冷 凍乾燥，得 44. Img 線性假多肽 HOOC (CH2) 2CO-D-Tyr-Pro-Trp-D-Phe_NH (CH2) 2NH2 純品 L， 產率為58. 4%。產品經質譜分析鑑定目標線性假多肽的理論分子量M值為753. 84，質譜 圖1中顯示的分子量為754. 5，為[M+H]+峰。(4)抗菌假環多肽CHR-2的合成準確稱取75. 4mg (0. lmmol)線性假多肽樣品L， 溶解在IOOmL無水乙腈，室溫攪拌下分批加入環化劑0. 6mmolTBTU/H0BT/DIPEA,攪拌環化 24h。室溫下旋轉蒸發將溶劑除去，得相應的假環多肽粗品。粗品的純化採用反相高效液相 法(RP-HPLC)，洗脫液為甲醇-0. 三氟醋酸水溶液，採用梯度洗脫，收集各洗脫峰餾分， 室溫下旋轉蒸發除去甲醇，水溶液經冷凍乾燥，得4. 5mg抗菌假環多肽CHR-2，產率6. 1 %。 產品經質譜分析鑑定目標假環多肽的理論分子量M值為735. 93，質譜圖2中顯示的分子 量為735. 7和736. 6，分別為[M]+和[M+H]+峰。實施例2合成抗菌假環多肽的抗菌活性檢測以下實施例中所使用的各種菌株購於中國生物製品鑑定所。採用96孔板法對合成的抗菌肽的抗菌活性進行檢測，具體步驟是將菌種復甦， 接種斜面37°C培養過夜，挑菌體於MH培養基中，37°C培養過夜，稀釋菌液使其濃度為IO4 105CFU/ml，按每孔100 μ 1菌液接種於96孔板中，隨後將多肽按一定比例稀釋後，每孔中加 入10 μ 1，將96孔板置於37°C培養過夜，酶標儀檢測OD57tl值。檢測結果列於表5。含有抗菌肽的細菌的生長濃度(OD57tl)與不加抗菌肽的細菌的生長濃度(OD57tl)的 差值相比於後者的比值若大於90%時，其抗菌肽濃度即近似等同於最小抑制濃度(MIC)。 MIC被定義為顯著抑制細菌生長的最低濃度。表5中，MIC值越小，表示抗菌假環多肽的抗菌能力越強。表5五種抗菌環肽對不同細菌的最小抑菌濃度(MIC) 實施例3體外溶血活性檢測本實施例用於檢測合成抗菌假環肽對人體紅細胞的溶血活性，使用的血樣取於正 常人血。具體的檢測步驟是人血紅細胞經PBS緩衝溶液(35mM磷酸緩衝液/0. 15mol/L NaCl, pH 7.0)洗滌，取100 μ 1的8%人血紅細胞懸液於96孔板中，每孔中加入100 μ 1抗 菌肽溶液，37°C搖蕩Ih後，1500rpm離心5min，轉移100 μ 1上清液於新的96孔板中，通過 酶標儀檢測414nm波長下的吸收。陽性對照採用0. 1% Triton X-100,陰性對照採用PBS。 檢測結果列於表6。表6中抗菌肽的溶血率值越小，表示其溶血毒性越小。表6五種抗菌環肽的溶血活性
權利要求
一種假環多肽，其特徵在於該假環多肽包含Loloatin C的藥核序列結構 A1 A2 A3 A4 。
2.根據權利要求1所述的假環多肽，其特徵在於所述Al為L-酪氨酸或D-酪氨酸。
3.根據權利要求1所述的假環多肽，其特徵在於所述A2為L-脯氨酸或D-脯氨酸。
4.根據權利要求1所述的假環多肽，其特徵在於所述A3為L-色氨酸或D-色氨酸。
5.根據權利要求1所述的假環多肽，其特徵在於所述A4為L-苯丙氨酸或D-苯丙氨酸。
6.根據權利要求1所述的假環多肽，其特徵在於所述假環多肽對邊鏈骨架進行環化， 其結構如式(I)所示，其中，m= 2、3、或4 ;n = 2、3、4或6 ； 式⑴。
7.權利要求1 6中任意一條權利要求所述假環多肽的合成方法，其特徵在於所述方 法是採用液相法合成結構構件，固相法合成線性假多肽，最後經稀溶液環化法合成得到假 環多肽。
8.根據權利要求7所述假環多肽的合成方法，其特徵在於所述方法包括如下步驟(1)構件Cbz-NH(CH2)n-NH2的合成室溫下將二胺H2N(CH2)nNH2溶解於二氯甲烷中，冷 至0°C，滴加氯甲酸苄酯進行反應，保持0°C反應過夜，撤去冰浴，升至室溫反應1 3h，反 應完成後，反應液經過濾、洗滌、乾燥、減壓蒸餾，最後快速柱層析純化，製得Cbz-NH(CH2)n-NH2 ；(2)構件HOOC(CH2)m-CO2BzI的合成將相應的酸酐加熱至熔融狀態，逐滴滴加苄醇，滴 加完畢，繼續攪拌反應lh，冷卻，加入飽和氯化鈉溶液，二氯甲烷萃取，合併有機相，經水洗、 乾燥、減壓蒸餾除溶劑，快速柱層析純化，製得HOOC (CH2)ffl-C02Bzl ；(3)線性假多肽的合成胺基酸的裝配從C端到N端逐個進行，將結合了第一個胺基酸 的Wang樹脂裝於多肽反應器中，用二氯甲烷二甲基甲醯胺溶液溶脹30min，再用哌啶二甲 基甲醯胺溶液脫保護基，二甲基甲醯胺清洗3次，將9-芴甲氧羰基保護的胺基酸溶於三吡 咯基膦氧苯駢三氮唑六氟合磷鹽、羥基苯駢三唑和二異丙基乙基胺，溶解後的溶液加於反 應器中偶合反應60 120min，二甲基甲醯胺清洗3次，重複以上步驟直到合成結束；合成 完成後，從樹脂上剪切線性假多肽，過濾、蒸除易揮發溶劑、洗滌、冷凍乾燥，得線性假多肽 粗品；將線性假多肽粗品進行純化，得到線性假多肽；(4)假環多肽的合成將線性假多肽溶解於乙腈中，加入環合試劑，旋轉蒸除溶劑，所 得粗品經分離純化，得到假環多肽。
9.權利要求1 6中任意一條權利要求所述假環多肽在製備抗菌藥物中的應用。
10.根據權利要求9所述假環多肽的應用，其特徵在於所述假環多肽用於製備治療革 蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種假環多肽及其合成方法和應用。本發明假環多肽為包含了Loloatin C藥核序列結構-A1-A2-A3-A4-，即包含了Tyr、Pro、Trp和Phe的序列片段，四個胺基酸殘基為L-或D-構型。本發明假環多肽的合成方法是採用液相法合成結構構件，固相法合成線性假多肽，最後經稀溶液環化法合成得到假環多肽，總收率5～12％。本發明假環多肽的製備方法具有反應條件溫和、操作簡便安全、產品純度高、容易自動化、總收率穩定的優點，合成的假環多肽可以用於製備治療革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染的藥物。
文檔編號A61K38/07GK101906138SQ20101022652
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者江振友, 陳河如, 陳道煌 申請人:暨南大學