用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法
2023-06-14 08:24:21 2
用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法，其包括：用炎性刺激物處理免疫細胞；用候選物質處理皮膚細胞；用經炎性刺激物處理的免疫細胞處理經候選物質處理的皮膚細胞；以及，測定經免疫細胞處理的皮膚細胞中的基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）濃度。
【專利說明】用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法。
【背景技術】
[0002]通常，慢性皮膚炎症是皺紋產生的主要原因，因為它會降低皮膚的彈性。皮膚一旦出現炎症，炎症部位一般會因黑色素的色素沉澱的積累而呈現暗褐色。這種炎症反應會促進皮膚老化。老化的皮膚會因免疫的下降，尤其因皮膚細胞免疫的降低，而對各種皮膚感染較為脆弱，而且由於血清中自身抗體的不斷增加，還會提高自身免疫性皮膚疾病的患病率。此外，內在性老化的皮膚中的郎格罕細胞(Langerhans cells)數量少於年輕人皮膚中的郎格罕細胞數量，而在光老化的皮膚中其數量會更少。因此，老化的皮膚甚至在微弱的刺激下也很容易發生炎症，而此炎症又會觸發皮膚老化。由此，這種惡性循環將會延續下去。
【發明內容】
[0003]技術問題
[0004]本發明涉及提供一種有效的用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法。
[0005]技術方案
[0006]在總方面，本發明提供一種用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法，該篩選方法包括:用炎性刺激物處理免疫細胞；用候選物質處理皮膚細胞；用經炎性刺激物處理的免疫細胞處理以候選物質處理的皮膚細胞；以及，測定經免疫細胞處理的皮膚細胞中的基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)的濃度。
[0007]有益效果
[0008]在本發明的一方面，用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法能夠有效地篩選出用於抑制炎性皮膚老化的物質。由於本發明的方法可確定能否抑制基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)，其中基質金屬蛋白酶-1不是一般的MMP-1，而是由炎性細胞因子所引發的MMP-1，因此能夠更精確地篩選出用於抑制炎性皮膚老化的物質。此外，會使用通過實際刺激免疫細胞而生成的細胞因子，而不會使用特定的細胞因子，從而可篩選出具有更高生物相關性的、用於抑制炎性皮膚老化的物質。進一步，由於一次就能確定能否抑制由多種炎性細胞因子所複合誘導的MMP-1生成，因此可更加簡便且有效地篩選出用於抑制炎性皮膚老化的物質。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1展示了根據脂多糖(LPS)濃度和種類、以及幹擾素-Y (INF-Y )濃度的THP-1細胞中TNF-a的產量。
[0010]圖2展示了根據LPS濃度的THP-1細胞存活率。
[0011]圖3展示了根據INF- y濃度的THP-1細胞存活率。
[0012]圖4展示了經LPS和INF- y處理的THP-1細胞的存活率。[0013]圖5展示了經LPS和INF- Y處理的炎性細胞因子的生產水平。
[0014]圖6展示了根據以LPS和INF- Y處理的THP-1細胞的NHF細胞中MMP-1的產率。
[0015]圖7展示了經黃豆黃素處理的THP-1細胞的存活率。
[0016]圖8展示了經黃豆黃素、LPS和INF- Y處理的THP-1細胞的存活率。
[0017]圖9展示了經黃豆黃素處理的THP-1細胞中TNF-α的產量。
[0018]圖10展示了用黃豆黃素以及有選擇地用LPS和INF-y處理的炎性細胞因子的產量。
[0019]圖11展示了經黃豆黃素處理的NHF細胞的存活率。
[0020]圖12展示了經LPS和INF- Y處理的THP-1細胞中MMP-1的產量、以及經黃豆黃素處理的NHF細胞中MMP-1的產量。
【具體實施方式】
[0021 ] 在本發明中，所述術語「皮膚」使用了廣義上的概念，是指覆蓋動物體表的組織，其不僅包括臉、身體等的覆蓋面，還包括頭皮和頭髮。
[0022]在本發明中，所述術語「炎性皮膚老化」包括由炎症引發或伴隨的皮膚老化。
[0023]下面，具體地描述本發明。
[0024]由炎症反應產生的細胞因子，如TNF-a、IL-1 β等，能夠通過與血管內皮上的受體結合而激活幾種與炎症相關的信號轉導途徑。期間，細胞粘附因子的表達在增加，從而引起炎性細胞的外滲。經過所述炎性細胞的滲透，會生成例如若干種細胞因子或趨化因子等化學趨化活性，然後它們朝著炎症區域移動，從而誘導免疫反應。
[0025]由於這些炎性細胞因子會通過促進基質金屬蛋白酶的表達來誘導膠原蛋白的降解，它們對皮膚老化起著關鍵作用，並且通過與受體的結合來引發連鎖反應。因此，如有任一物質能夠抑制炎性細胞因子的生成，進而能夠抑制由炎性細胞因子誘導的基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)的生成時，該物質就能當作用於抑制炎性皮膚老化的物質。
[0026]在一方面，本發明提供一種用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法，其包括:用炎性刺激物處理免疫細胞；用候選物質處理皮膚細胞；用經炎性刺激物處理的免疫細胞處理經候選物質處理的皮膚細胞；以及，測定經免疫細胞處理的皮膚細胞中的基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)濃度。
[0027]用炎性刺激物進行處理時，所述免疫細胞會產生各種炎性細胞因子。因此，經炎性刺激物處理的免疫細胞，更為具體地，經炎性刺激物處理的免疫細胞的培養基包含各種炎性細胞因子。如用免疫細胞處理皮膚細胞時，炎性細胞因子會促進皮膚細胞中加速細胞膠原蛋白降解的MMP-1表達。如上所述，炎症及MMP-1生成是引起皮膚老化的主要原因，然而不妙的是，一旦開始生成，這種惡性循環將會持續下去。因此，通過用候選物質對皮膚細胞進行預處理，再用含有炎性細胞因子的免疫細胞處理皮膚細胞，然後測量皮膚細胞中的MMP-1濃度，由此可以確認所述候選物質是否為用於抑制炎性皮膚老化的物質。由於這種方法可篩選用於抑制由炎性細胞因子誘導而生成MMP-1的物質，而不是篩選用於抑制生成一般MMP-1的物質，因 此能夠更加精確地確認所述候選物質是否為用於抑制炎性皮膚老化的物質。
[0028]在本發明的一個示例性實施例中，由所述炎性刺激物生成的細胞因子包含多種炎性細胞因子。在本發明的另一個示例性實施例中，所述細胞因子包含選自GROa (CXCL1，趨化因子(C-X-C基序)配體1)、1-309(CCL-1，趨化因子(C-C基序)配體I)、sICAM_l (可溶性細胞粘附分子-1)、IL(白細胞介素)-13、11-1^、11-6、11-8、11-23、1?-10、103-1(單核細胞趨化蛋白-1)、MIF (巨噬細胞移動抑制因子)、MIP (巨噬細胞炎性蛋白)-1 a ,MIP-1 3、絲氨酸蛋白酶抑制劑EURANTES (調節激活，由正常T細胞表達並分泌)和TNF(腫瘤壞死因子)-a中的一種或多種，但不限於此。
[0029]在本發明的一個示例性實施例中，免疫細胞包含用炎性刺激物處理時能夠生成炎性細胞因子的細胞。在本發明的另一個示例性實施例中，所述免疫細胞包含THP-1細胞(人急性單核細胞白血病細胞株)。單核吞噬細胞是組成免疫系統的主要細胞群中的一種，已知其能發揮吞噬作用。在吞噬細胞中，將那些存在於血液中的細胞稱作單核細胞，而將那些存在於組織中的細胞稱作巨噬細胞。THP-1細胞為源於人體的單核細胞，其在組織中可被分化成巨噬細胞。由於THP-1細胞的培養時間很長，由此THP-1細胞可有益地用於細胞實驗。因此，它更適於本發明。
[0030]在本發明的一個示例性實施例中，皮膚細胞包括正常人成纖維細胞(NHF)。分布於真皮中的成纖維細胞對傷口癒合起著重要作用，並根據由組織損傷引起的炎症迅速地增殖。所述成纖維細胞是細胞外基質(ECM)蛋白的主要來源，而且還能生成組成肉芽組織的膠原蛋白和纖維連接蛋白。此外，可以通過與毛細血管或其他血管形成網絡來對炎性細胞因子進行迅速反應。因此，它更適於本發明。
[0031]在本發明的一個示例性實施例中，炎性刺激物包括能夠生成炎性細胞因子的物質。在本發明的另一個示例性實施例中，所述炎性刺激物包括脂多糖(LPS)和幹擾素-Y(INF-y )0
[0032]LPS是包圍肽聚糖層的革蘭陰性菌外膜的主要成分。LPS向細胞核內傳送NF-K B。NF-k B可通過與基因的啟動子位點(PROMOTER SITE)結合來表達多種參與炎症和免疫反應的基因。由此可知，LPS可刺激 體內的免疫調節物質和炎症引發物質。誘導刺激的程度會根據細菌來源而不同。在本發明的一個示例性實施例中，LPS包括源自大腸桿菌和沙門氏菌中至少一種細菌的LPS。在本發明的另一個示例性實施例中，源自大腸桿菌(E.Coli)的LPS包括源自E.ColiOlll:B4、E.Coli055:B5和E.Coli EHlOO中至少一種細菌的LPS。在本發明的另一個示例性實施例中，源自沙門氏菌的LPS包括源自傷寒沙門氏菌(S.typhosa)和鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)中至少一種細菌的LPS。
[0033]在本發明的一個示例性實施例中，LPS的濃度可以為0.001-20 iiM，具體為
0.01-15 u M，更具體為0.1-10 u M，以確保生成充足的炎性細胞因子，但沒有細胞毒性。
[0034]在本發明的一個示例性實施例中，幹擾素-Y (INF-Y)是用LPS來增強炎症刺激反應的，而不是通過直接介導炎症反應來促進炎性細胞因子的生成的。因此，用LPS與INF-Y 一同處理時，能更容易地生成炎性細胞因子，從而更加靈敏地篩選出用於抑制炎性皮膚老化的物質。
[0035]在本發明的一個示例性實施例中，INF-Y的濃度可以為1-2000單位，具體為5-1500單位，更具體為10-1000單位，以確保獲得本發明所預期的效果，但沒有細胞毒性。
[0036]在本發明的一個示例性實施例中，測定皮膚細胞中的MMP-1濃度之後，用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法可進一步包括，如經候選物質處理的皮膚細胞中的MMP-1濃度低於未經候選物質處理的皮膚細胞中的MMP-1濃度時，可以確定所述候選物質為用於抑制炎性皮膚老化的物質。在本發明的另一個示例性實施例中，所述方法進一步包括，如經候選物質處理的皮膚細胞中的MMP-1濃度高於未經候選物質處理的皮膚細胞中的MMP-1濃度時，可以確定所述候選物質不是用於抑制炎性皮膚老化的物質。在本發明的另一個示例性實施例中，所述方法可進一步包括，當經候選物質處理的皮膚細胞中的MMP-1濃度與未經候選物質處理的皮膚細胞中的MMP-1濃度相比越低時，可確定所述候選物質具有更高的抑制炎性皮膚老化的效果。
[0037]在本發明的一個示例性實施例中，候選物質為目標物質，可用來確定是否為用於抑制炎性皮膚老化的物質。在本發明的另一個示例性實施例中，候選物質包括任何自然產品，可以為植物、植物提取物或化學合成物質。
[0038]下面，本發明將通過測試實施例詳細地進行說明。然而，以下測試實施例僅以說明為目的，本發明的範圍不限於測試實施例，這對本領域的技術人員來說是顯而易見的。
[0039]【測試實施例1】對作為刺激物的、合適的LPS來源的細菌的確認
[0040]由於LPS所誘導的刺激程度會根據來源細菌而不同，以下實驗是為選取適於篩選用於抑制炎性皮膚老化的物質的LPS而實施的。
[0041]在6孔板中接種THP-1細胞(從韓國細胞株庫獲得)，每孔有5 X IO5個細胞，並且在37°C和5%C02的條件下，在含有10%(v/v)FBS、100U/mL青黴素和100 μ g/mL鏈黴素的RPM1-1640培養基(從Lonza獲得)內培養24小時。隨後，經源自濃度O、0.1和I μ g/mL的大腸桿菌(E.coli 0111:Β4、Ε.coli 055:B5和E.coli EH100)的三種LPS和源自沙門氏菌[傷寒沙門氏菌(S.typhosa)和鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)，從Sigma Aldrich獲得]的兩種LPS、以及0,250,500和1000單位的INF- Y (從Sigma Aldrich獲得)的處理後，再培養所述細胞24小時。而後，在1000rpm下將所述培養基離心分離3分鐘，並取其上清液，然後用TNF-a ELISA試劑盒檢測所述上清液中的TNF-α濃度。其結果在圖1中展示。
[0042]如圖1所示，用LPS處理所述細胞時，TNF- α產量的大小順序為E.col i0111: B4>E.coli055:B5>E.coli H1100>傷寒沙門氏菌〉鼠傷寒沙門氏菌，而且即使LPS濃度有變化也同樣能夠維持此順序。用I μ g/mL LPS處理細胞時與用0.1 μ g/mL LPS處理細胞時相比，TNF-α的絕對產量會更高。由此可見，就炎性細胞因子的生成而言，人免疫細胞對源自大腸桿菌，尤其對源自E.coli0111:B4的LPS最為敏感。
[0043]經發現，INF-Y在任何濃度下均不會影響TNF-α的生成。然而，將I μ g/mL LPS與500單位的INF-gamma —同進行處理時與只用LPS處理時相比，TNF-α的產量會得到顯著提高。其產量的大小順序為E.coli0111:B4>E.coli055:B5>E.coliEH100>鼠傷寒沙門氏菌>傷寒沙門氏菌。由此可見，INF-gamma能夠加強由LPS引起的刺激。
[0044]【測試實施例2】刺激物的最佳濃度的確定
[0045]以下實驗是為確定用於篩選能夠抑制炎性皮膚老化的物質的最佳濃度而實施的。
[0046]在96孔板中接種THP-1細胞(從韓國細胞株庫獲得)，每孔有3 X IO4個細胞，並且在37°C和5%C02的條件下，在含有10%(v/v)FBS、100U/mL青黴素和100μ g/mL鏈黴素的RPM1-1640培養基(從Lonza獲得)內培養24小時。隨後，經0、0.01、0.1、I和10 μ g/mL的、源自大腸桿菌(E.coli 0111:B4、從 Sigma Aldrich 獲得)的 LPS 和 0、50、100、500 和 1000單位INF- Y (從Sigma Aldrich獲得)的處理後，將所述細胞培養24小時。用細胞計數試劑盒試劑處理每孔體積的1/10後，繼續培養2小時，然而用SpectraMax測量0.D.值來確定細胞存活率。其結果在圖2-4中展示。
[0047]如圖2所示，用0、0.01、0.1、1和10 μ g/mL的LPS處理所述細胞時，會根據濃度促進所述細胞的增殖，但沒有細胞毒性。此外，如圖3所示，用0、50、100、500和1000單位的INF-Y處理所述細胞時沒有發現細胞毒性。而且，如圖4所示，用LPS與INF-Y —同處理所述細胞時，沒有發現細胞毒性，並且發現所述細胞的增殖與LPS濃度之間有正相關性。
[0048]【測試實施例3】用刺激物處理後的炎性細胞因子生成的確認
[0049]以下實驗是為確認根據用刺激物處理時的炎症反應所生成的炎性細胞因子而實施的。
[0050]在6孔板中接種THP-1細胞(從韓國細胞株庫獲得)，每孔有5 X IO5個細胞，並且在37°C和5%C02的條件下，在含有10%(v/v)FBS、100U/mL青黴素和100 μ g/mL鏈黴素的RPM1-1640培養基(從Lonza獲得)內培養24小時。隨即，經I μ g/mLLPS (來自E.coli0111:B4,從 Sigma Aldrich 獲得)和 500 單位的 INF- Y (從 Sigma Aldrich 獲得)的處理後，將所述細胞培養24小時。在1000rpm下將所述培養基離心分離3分鐘，取其上清液，然後用細胞因子陣列試劑盒(cytokine array kit)來確認所述上清液中與對照組相比時所增加的炎性細胞因子的種類。圖5展示了炎性細胞因子的表達水平，在以下表中描述了與坐標相對應的炎性細胞因子。
[0051]【表1】
[0052]
【權利要求】
1.用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法，該方法包括: 用炎性刺激物處理免疫細胞； 用候選物質處理皮膚細胞； 用經炎性刺激物處理的免疫細胞處理經候選物質處理的皮膚細胞；以及，測定經免疫細胞處理的皮膚細胞中基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)濃度。
2.根據權利要求1所述的用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法，其特徵在於，所述免疫細胞包括THP-1細胞(人急性單核細胞白血病細胞)。
3.根據權利要求1所述的用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法，其特徵在於，所述皮膚細胞包括正常人成纖維細胞(NHF)。
4.根據權利要求1所述的用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法，其特徵在於，所述炎性刺激物包括脂多糖(LPS)和幹擾素-Y (INF- Y )。
5.根據權利要求4所述的用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法，其特徵在於，所述LPS包括源自大腸桿菌的LPS。
6.根據權利要求4所述的用於抑制炎性皮膚老化的物質的篩選方法，其特徵在於，所述LPS的濃度為0.001-20 μ Μ，所述INF- Y的濃度為1-2000單位。
【文檔編號】G01N33/15GK103797127SQ201280028652
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年4月13日 優先權日:2011年4月13日
【發明者】金智成, 李真鍈, 樸俊星, 崔向兌, 金寒星, 裵芝賢 申請人:株式會社愛茉莉太平洋