非天然共有白蛋白結合結構域的製作方法

2023-06-14 05:32:11

非天然共有白蛋白結合結構域的製作方法
【專利摘要】本發明公開了可用於控制治療劑分子對於患者的半衰期的非天然白蛋白結合結構域、編碼其的多核苷酸以及製備和使用這些結構域和多核苷酸的方法。
【專利說明】非天然共有白蛋白結合結構域

【技術領域】
[0001] 本發明涉及白蛋白結合結構域及其製備和使用方法。更具體地講，本發明涉及非 天然白蛋白結合結構域共有序列及其如本文所述的變體。

【背景技術】
[0002] 經由腎清除的生物治療劑分子快速消除導致有限的臨床效果或更頻繁地對患者 給藥。腎小球過濾所導致的腎清除與較小的生物治療劑最為相關，因為對於分子量大於 50, 000道爾頓的分子而言腎過濾速率大大降低（Kontermann，Curr Opin Biotechnol 22 : 868-76,2011)。若干種已獲批的生物治療藥物包含本身會降至過濾極限以下並因此被快速 清除的活性部分。為了克服此限制，已引入多種技術來有效增加治療劑分子的大小以減少 腎過濾和所產生的半衰期。
[0003] 治療劑聚乙二醇化（PEG)是增加蛋白的流體動力學半徑和減少腎小球過濾的有 效方法。一條或若干條PEG鏈可偶聯至蛋白，最常見的方式是通過與蛋白表面上的游離 硫醇或胺基團共軛。腺苷脫氨酶、L-天冬醯胺酶、幹擾素 a _2b、G-CSF、人類生長激素、 促紅細胞生成素、尿酸酶和抗-TNFa抗體片段的聚乙二醇化型式已被批准用於人類治療 (Kontermann，Curr Opin Biotechnol，22 :868_76,2011)。聚乙二醇化的缺陷包括生成異質 產物並且難以控制連接到某些蛋白的PEG分子的數量。聚乙二醇化對治療性蛋白的製備引 入附加的共軛步驟以及純化步驟，從而導致產率下降以及產品成本增加。聚乙二醇化還可 導致動物和患者的腎小管空泡，因為PEG鏈在腎臟中是不可降解的（Gaberc-Porekar等人， Curr Opin Drug Discov Devel 11 :242_250,2008)。
[0004] 將治療劑與抗體Fc區偶聯以生成Fc-融合蛋白可用於增加治療劑分子的血清半 衰期。免疫球蛋白由於其較大的尺寸和透過FcRn的再循環可在人體內表現出大約數周的 長半衰期（Kuo 等人，J Clin Immunol 30 :777-789,2010)。TNF 受體 2、LFA-3、CTLA-4、 IL-IR和TPO-擬肽分子均為獲批的製備為Fc-融合物的治療劑（Kontermann，Curr Opin Bi〇techn〇l，22 :868-76,2011)。由於若干原因，Fe-融合蛋白並非對所有治療劑類別均是 理想的。Fc區的同型二聚體性質導致產生二聚體治療性蛋白，這可能由於受體聚簇而導致 細胞活化。Fc-融合物還可在比原核系統更昂貴的哺乳動物表達系統中製成。
[0005] 除了 Fc之外，白蛋白由於FcRn再循環而表現出體內長半衰期。在約40g/L的濃 度下，人血清白蛋白（HSA)是存在於血液中的最豐富的蛋白。FcRn再循環導致人體內約 19天的長半衰期。另外，生物學分布研究表明白蛋白可在體內分布至對於靶標疾病（諸如 發炎關節或腫瘤）而言重要的區域（Wunder等人，J Immunol 170:4793-4801,2003)。因 此，多種蛋白的血清半衰期已通過將其製備為對HSA的C-端或N-端融合物而增加。成功 的融合物包括幹擾素 α (Flisiak and Flisiak，Expert Opin Biol Ther 10 :1509-1515， 2010)、人類生長激素 （Osborn 等人，Eur J Pharmacol 456 :149_158, 2002)、腫瘤壞死因子 (Muller 等人，Biochem Biophys Res Commun396:793-799,2010)、凝結因子 IX(Metzner 等 人，Thromb Haemost 102 :634_644,2009)、凝結因子 VIIa(Schulte，Thromb Res 122Suppl 4 :S14-19, 2008)、胰島素 （Duttaroy 等人，Diabetes 54 :251-258, 2005)、尿激酶（Breton 等人，Eur J Biochem 231 :563_569，1995)、水輕素 （Sheffield 等人，Blood Coagul Fibrinolysis 12 :433-443,2001)和雙特異性抗體片段（Muller 等人，J Biol Chem 282 : 12650-12660,2007)。HSA融合蛋白可具有長血清半衰期，然而這些融合蛋白的較大規模的 製備主要限於酵母表達系統。另外，HSA的大尺寸可由於空間位阻而導致治療劑的活性損 失。
[0006] 治療劑蛋白也可製備為與肽的融合蛋白或與血流中的血清白蛋白結合的蛋白，從 而增加其半衰期。此類白蛋白結合肽包括半胱氨酸限制性肽或白蛋白的抗體片段。Fab抗 體片段表達為與半胱氨酸限制性肽的融合物，其顯著增加了 Fab的血清半衰期（Dennis等 人，J Biol Chem，277:35035-35043,2002;US2004/0253247A1)。與靶標同一抗原的 Fab 和 mAb分子相比，半胱氨酸限制性肽與抗體片段偶聯導致更佳的峰值腫瘤積聚和更均勻的腫 瘤分布（Dennis 等人，Cancer Res 67 :254-261，2007;US2005/0287153Al)。另外，已將特 異性結合白蛋白的多個抗體片段偶聯至治療部分以增加治療劑的半衰期。結合HSA的駱 馬它科動物Vhh抗體片段（Nanobodies?)與結合TNF-α的另一 Nanobody? (Coppieters 等人，Arthritis Rheum 54 :1856-1866, 2006)或抗-EGFR Nai.i〇b〇diesii: (Tijink 等人， Mol Cancer Ther 7:2288-2297,2008)融合。已生成結合白蛋白的抗-白蛋白結構域抗 體（dAbs)，並且已與例如白介素-1受體（Holt等人，Protein Eng Des Sel 21 :283-288, 2008)和幹擾素 a 2b (Walker 等人，Protein Eng Des Sel，23 :271-278,2010)融合以改善 其半衰期。
[0007] 已知來自細菌的多種天然存在的蛋白結構域可與白蛋白相互作用，據推測有助於 此類細菌在整個宿主生物體中分布。存在大小為約6kDa的3-螺旋束蛋白結構域，其使 用3-螺旋束的一個面與血清白蛋白相互作用（Cramer等人，FEBS Lett 581:3178-3182， 2007 ;Lejon 等人，Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69， 2008) Johansson 等人，FEBS Lett，374 :257-261,1995 Johansson 等人，J Mol Biol 266: 859-865,1997 Johansson 等人，J Biol Chem，277 :8114-8120, 2002)。來源於鏈球菌蛋 白G的一種此類白蛋白結合結構域（Jonsson等人，Protein Eng Des Sel, 21 :515-527, 2008)已被廣泛用於延長蛋白的血清半衰期。與此結構域的融合已被證實用於增加以下各 項的半衰期：1型可溶性補體受體（Makrides等人，J Pharmacol Exp Ther 277 :534_542， 1996)、雙特異性抗體（Stork 等人，Protein Eng Des Sel，20:569-576,2007)、CD4(Nygren 等人，Vaccines 91 :363-368,1991 ;US 6267,964B1)，PH55/RESA (Stahl 等人，J Immunol Methods 124 :43-52,1989)、G-CSF(Frejd，F. PEGS Europe，October 5, 2010)和結合多個靶 的抗體分子（Andersen 等人，J Biol Chem，286 :5234_5241，2011) (Frejd，F.PEGS Europe， 2010年10月5日）。然而，針對結構域的抗體製備已在患者中有所報導，因此使用分子進 行治療劑應用可為具有挑戰性的（Goetsch等人，Clin Diagn Lab Immunol 10:125-132， 2003 ;Libon 等人，Vaccine，17 :406-414,1999)。
[0008] 結合白蛋白的多種蛋白結構域或肽能夠延長血清半衰期並且產生更有益的治療 劑蛋白生物學分布模式。為了將這些白蛋白結合結構域用於治療應用中，需要滿足多個生 物物理要求，例如在宿主中的高表達水平、溶解度和穩定性以及最低免疫原性。白蛋白結合 部分應以對血清半衰期和生物學分布與結合或不結合白蛋白時的治療部分的活性進行有 效平衡的親和力結合血清白蛋白。


【發明內容】

[0009] 本發明的一個方面為一種蛋白，其包含具有SEQ ID NO :21的胺基酸序列的分離的 非天然白蛋白結合結構域。本發明的另一個方面為一種分離的非天然白蛋白結合結構域， 其包含與 SEQ ID N0:21 至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100相問的氣基酸序列。
[0010] 本發明的另一個方面為一種分離的非天然白蛋白結合結構域，其包含在1、2、3、4、 5和/或6個殘基處具有取代的SEQ ID NO :21的胺基酸序列，優選地，其中1、2、3、4、5和/ 或6個殘基處的取代可發生在SEQ ID NO :21的胺基酸位置Y21、Y22, L25、K30, T31、E33、 G34、A37、L38、E41、I42 和 / 或 A45 處或在 SEQ ID N0:21 的胺基酸位置 Y21、Y22、K30、T31、 Α37和/或Ε41處。
[0011] 本發明的另一個方面為一種分離的非天然白蛋白結合結構域，其包含胺基酸序 列：Lkeakekaieelkkagitsdx1X2Fdlinkax3X 4Vegvnx5Lkdx6Ilka(seq id no :22);其中 X1'χ2、 χ3、χ4、\和X 6可為任意胺基酸或某些胺基酸的子集。
[0012] 在本發明的另一個方面，所述分離的非天然白蛋白結合結構域包含在其N-端的5 個胺基酸的延長。
[0013] 本發明的另一個方面為一種製備本發明的非天然白蛋白結合結構域的方法，所述 方法包括：提供編碼所述非天然白蛋白結合結構域的多核苷酸；在宿主中或體外表達所述 多核苷酸；以及回收所述非天然白蛋白結合結構域。本發明的另一個方面為一種編碼本發 明的白蛋白結合結構域的分離的多核苷酸。本發明的另一個方面為一種包含SEQ ID NO: 35的多核苷酸的分離的多核苷酸。
[0014] 本發明的另一個方面為一種包含本發明的分離的多核苷酸的分離的載體以及一 種包含本發明的分離的載體的宿主細胞。
[0015] 本發明的另一個方面為一種融合蛋白，其包含本發明的白蛋白結合蛋白和生物活 性劑。
[0016] 本發明的另一個方面為一種藥物組合物，其包含本發明的融合蛋白和至少一種藥 學上可接受的載體或稀釋劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1示出經純化的ABDCon的SDS-PAGE分析。樣品如下：泳道I) SeeBlue+2標記 物、2)總細胞裂解液、3)可溶性細胞裂解液、4)柱流通液、5-12)洗脫級分。標記物帶中一 些的分子量在左邊不出。
[0018] 圖2示出經純化的ABDCon樣品的電噴霧電離質譜。
[0019] 圖3示出如在PBS中運行的經純化的ABDcon的尺寸排阻色譜法分析。
[0020] 圖4示出如通過在PBS中的DSC所測量的熔融溫度A)和ABDCon解摺疊的可逆 性B)。第一次掃描的扣除數據的歸一化基線在A中示出。在第一次掃描後，使樣品冷卻至 20°C並且重複掃描以測定摺疊可逆性。第一次掃描和第二次掃描的原始數據跡線在B部分 中疊加。
[0021] 圖5示出當以2mg/kg靜脈內給藥時小鼠體內Tencon25-ABDCon融合蛋白的藥代 動力學。
[0022] 圖6示出當以2mg/kg靜脈內給藥時小鼠體內與ABDCon (SEQ ID NO :21)、 ABDCon3(SEQ ID N0:26)、ABDcon5(SEQ ID N0:28)、ABDCon7(SEQ ID N0:30)和 ABDCon9(SEQIDN0:32)融合的Tencon25(SEQIDN0:39的殘基l-90)分子的藥代動力學。
[0023] 圖7示出當在PBS中在37°C下孵育0或28天時的A)某些FN3結構域ABDCon (SEQ ID NO :1)融合蛋白和B)在ABDCon處具有延伸的N-端螺旋的FN3結構域-ABDConl2 (SEQ ID NO :46)融合蛋白的穩定性。

【具體實施方式】
[0024] 如本文所用，術語"白蛋白結合結構域"或"結構域"是指在體內或體外結合白蛋 白的多肽。白蛋白可來源於任何動物物種，例如人、猴類或齧齒動物。
[0025] 如本文所用，術語"Kd "是指白蛋白與白蛋白結合結構域之間的解離常數。
[0026] 如本文所用，術語"K。/是指白蛋白結合結構域與白蛋白締合形成白蛋白結合結構 域/白蛋白複合物的結合速率常數。
[0027] 如本文所用，術語"K#"是指白蛋白結合結構域與白蛋白結合結構域/白蛋白復 合物解離的解離速率常數。
[0028] 如本文所用，術語"非天然"是指合成的（即，具有不存在於原生多肽中的胺基酸 序列）的結構域。
[0029] 如本文所用，術語"取代的"或"取代"是指在多肽或多核苷酸序列中改變、缺失或 插入一個或多個胺基酸或核苷酸，或一個或多個胺基酸或核苷酸的改變、缺失或插入，以生 成所述序列的變體。
[0030] 如本文所用，術語"變體"是指不同於參考多肽或參考多核苷酸一處或多處修飾， 例如取代、插入或缺失的多肽或多核苷酸。
[0031] 如本文所用，術語"生物活性劑"是指當施用給動物患者時向所述患者提供有益效 果的蛋白、抗體、肽、核苷酸、小分子藥物，等等。通過合成製得的、天然源的或重組產生的部 分也包括在該術語中。生物活性劑可為生物活性劑的類似物、衍生物、激動劑、拮抗劑、對映 體或配藥學上可接收的鹽。
[0032] 如本文所用，術語"穩定性"是指在生理條件下分子保持摺疊狀態使得其保持其正 常功能活性中的至少一種例如半衰期的能力。
[0033] 術語"載體"是指能夠在生物系統內複製或可以在此類系統間移動的多核苷酸。載 體多核苷酸通常含有諸如複製起點、聚腺苷酸化信號或選擇標記的元件，其功能是促進這 些多核苷酸在生物系統中的複製或保持。此類生物系統的例子可包括細胞、細菌、病毒、動 物、植物和用能夠複製載體的生物組分再造的生物系統。包含載體的多核苷酸可以是DNA 或RNA分子或這些分子的雜合分子。
[0034] 術語"表達載體"是指可用於在生物系統或再造生物系統中指導由存在於表達載 體中的多核苷酸序列所編碼的多肽的翻譯的載體。
[0035] 如本文所用，術語"操作性連接的"是指使得元件以其預期方式起作用的元件布 置。
[0036] 胺基酸在本文中採用它們的標準三字母或單字母代碼提及：
[0037] 白蛋白結合結構域鉬合物
[0038] 本發明提供一種合成白蛋白結合結構域（ABDCon) (SEQ ID NO :21)及其變體。 ABDCon可操作性連接至生物活性劑以增強治療劑的血清半衰期和生物學分布。ABDCon及 其變體可在大腸桿菌（E. coli)中以高水平表達，為可溶性的並且具有高熱穩定性。本發明 提供編碼ABDCon及其變體的多核苷酸或其互補核酸、載體、宿主細胞以及製備和使用它們 的方法。
[0039] 本發明還提供合成白蛋白結合結構域（ABDCon)，其在N-端具有5個胺基酸延長的 延長。所述延長改善ABDCon的穩定性。
[0040] ABDCon結合結構域如下設計：使用來自鏈球菌屬G148蛋白G(SEQID NO :1)的 ABD作為模板對保藏在無冗餘蛋白質資料庫中的某些3-螺旋束白蛋白結合結構域（ABD) 序列的共有胺基酸序列進行計算，並選擇每個序列位置處的最常見胺基酸（表6)。當用 本文指定的條件進行測試時，ABDCon對人白蛋白具有高親和力，其中K d為75pM，1(。"為 3. 02X 1(T51/S，因此可操作性連接至ABDCon的生物活性劑一旦施用給動物患者就可主要 地結合白蛋白。在人類患者中，過弱結合血清白蛋白的分子將由於腎過濾而具有短血清半 衰期（Hopp，Protein Eng Des Sel, 23 :827-834, 2010)，而過緊密地結合血清白蛋白的分子 將無法從優選作用位點處的白蛋白中釋放，因此在一些情況下可降低對所需靶的活性調節 能力並且提供治療有益效果。因此本發明的一個方面是具有並且能夠生成對白蛋白具有親 和力譜的ABDCon變體和結合結構域並因此提供對可操作性地連接至ABDCon變體和結合結 構域的生物活性劑的半衰期進行調節的能力。
[0041] 本發明的一個實施例為一種分離的非天然白蛋白結合結構域，其包含與SEQ ID N0:21(ABDCon) :LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA 至少 85 %、86 %、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同的 胺基酸序列。
[0042] 本發明的另一個實施例為一種分離的白蛋白結合結構域，其包含在1、2、3、4、5和 /或6個殘基處具有取代的SEQ ID NO :21的胺基酸序列。
[0043] ABDCon變體可如下設計：檢驗與白蛋白複合的示例性3-螺旋束白蛋白結合蛋白 的晶體結構並且假設ABDCon可以類似於示例性蛋白的方式結合白蛋白。可採用的示例性 晶體結構為與人白蛋白複合的厭氧細菌大芬戈爾德菌（Finegoldia magna)(原先稱為大 消化鏈球菌（Peptostreptococcus magnus))的蛋白PAB的GA模塊（蛋白G-相關白蛋 白-結合模塊）的結構（蛋白質資料庫（PDB)代碼lTF0(Leion等人，JBiol Chem 279 : 42924-42928,2004)。
[0044] 具有對白蛋白的降低的親和力的ABDCon變體可通過各種策略進行設計，諸如通 過破壞預計的疏水性接觸；破壞芳族殘基之間的預計的Pi-堆疊；通過用較大的胺基酸取 代來引入空間位阻；通過去除帶電荷的殘基來破壞鹽橋；以及破壞預計在ABDCon與白蛋白 之間進行的氫鍵合。對引入的改變進行設計以降低結合親和力，而不以消除結合的方式改 變結合表面。例如，殘基Y21可取代帶電荷的胺基酸（Ly S、Arg、Asp、Glu)或較小的胺基酸 (Ala、Gly)以減小此殘基與白蛋白殘基V325和F326之間的疏水性相互作用。此外，ABDCon 的Y21與白蛋白殘基N318和D324的主鏈形成氫鍵，使得微小的變化（諸如Phe的突變） 可略微減弱相互作用。預計ABDCon的殘基Y22與白蛋白殘基F309和F326形成疏水的以 及pi-堆疊的相互作用。因此，Y22取代較小的中性胺基酸Ala、Ser、Val或帶電荷的氨基 酸Lys、Arg、Asp或Glu可降低疏水性接觸並且降低ABDCon變體對白蛋白的親和力。預計 ABDCon中的殘基K30與白蛋白殘基E227形成鹽橋，因此K30可取代Asp或Glu以引入排斥 電荷並且可能降低對白蛋白的ABDCon親和力。任何不帶電荷的胺基酸的突變還可通過消 除鹽橋降低親和力。預計ABDCon殘基T31與白蛋白殘基N267形成分子間氫鍵並且對Ala 或Gly的取代可用於破壞分子間氫鍵而不引入可顯著使相互作用不穩定的大的空間位阻。 ABDCon殘基A37可取代Val、Tyr或其它較大的胺基酸以引入空間位阻。殘基E41可取代 Gln或Asn以去除電荷。帶正電荷的殘基諸如Lys或Arg的引入可預期進一步降低結合親 和力。預計ABDCon殘基L25、E33、G34、L38、142和A45形成與白蛋白的直接接觸，並且這 些殘基處的取代很有可能調節對白蛋白的ABDCon親和力。殘基位置是指SEQ ID NO :21的 ABDCon和SEQ ID NO :36的人白蛋白。
[0045] 或者，可使用胺基酸的無規混合物，利用例如NNK密碼子進行識別位置處的取代， 並且使用標準方法和本文所述的方法來測量所得變體與白蛋白的結合。
[0046] 示例性 ABDCon 變體為在選自 SEQ ID NO :21 的 Y21、Y22、L25、K30、T31、E33、G34、 A37、L38、E41、142和A45的至少一種殘基中具有取代的變體。
[0047] 示例性ABDCon變體為在選自SEQIDN0:21的Y21、Y22、K30、T31、A37和E41的 至少一種殘基中具有取代的變體。
[0048] 示例性 ABDCon 變體包含胺基酸序列 Lkeakekaieelkkagitsdx1X2Fdlinkax3X 4Vegvn X5LKDX6ILKA(SEQ ID N0:22;其中父1、父2、父3、父4、父 5和父6可為任意胺基酸。
[0049] 在其它實施例中，示例性ABDCon變體包含胺基酸序列Lkeakekaieelkkagitsdx1X2 FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA(SEQ ID N0:23)，其中
[0050] DX1S賴氨酸（K)、精氨酸（R)、天冬氨酸（D)、穀氨酸（E)、丙氨酸（A)、甘氨酸（G)、 苯丙氨酸（F)或酪氨酸（Y);
[0051] ii)X2S丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、纈氨酸（V)、賴氨酸（K)、精氨酸（R)、天冬氨酸 (D)、穀氨酸（E)或酪氨酸（Y);
[0052] iii)X3為天冬氨酸（D)、穀氨酸（E)或賴氨酸（K);
[0053] iv) X4為丙氨酸（A)、甘氨酸（G)或蘇氨酸（T);
[0054] v)X5S纈氨酸（V)、酪氨酸（Y)或丙氨酸（A);並且
[0055] vi) X6為穀氨醯胺（Q)、天冬醯胺（N)、賴氨酸（K)、精氨酸（R)或穀氨酸（E)。
[0056] 在其它實施例中，示例性ABDCon變體包含胺基酸序列Lkeakekaieelkkagitsdx1X2 FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA(SEQ ID N0:24)，其中
[0057] DX1S賴氨酸（K)、丙氨酸（A)或酪氨酸（Y);
[0058] ii)X2S丙氨酸（A)、絲氨酸（S)、纈氨酸（V)或酪氨酸（Y);
[0059] iii)X3為天冬氨酸（D)或賴氨酸（K);
[0060] iv) X4為丙氨酸（A)或蘇氨酸（T);
[0061] v)X5S纈氨酸（V)、酪氨酸（Y)或丙氨酸（A);並且
[0062] vi) X6為穀氨醯胺（Q)或穀氨酸（E)。
[0063] 另外的示例性ABDCon變體包含SEQ ID NO :25-34中示出的胺基酸序列。使用熟知 的方法，例如在採用等離振子共振的體外測定（BIAcore，GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 中測試ABDCon變體的白蛋白結合。如果在不同的條件（例如，同滲容摩、pH)下測量，特 定ABDCon變體/白蛋白抗原相互作用的測量的親和力可變化。因此，親和力和其它結合 參數（例如，K D、Km、Ktjff)的測量優選地用ABDCon變體和白蛋白的標準溶液，以及標準緩衝 液，諸如本文所述的緩衝液進行。ABDCon變體對白蛋白的親和力可在至少約IX 1(Γ5Μ、至 少約I X 1(Γ6Μ、至少約I X 1(Γ7Μ、至少約I X 1(Γ8Μ、至少約I X 1(Γ9Μ、至少約I X KTwIVU至少約 IX 1(ΓηΜ、至少約IX KT12M或至少約IX KT13M的範圍內。例如，在ABDCon (SEQ ID NO :21) 的Y22處的各種取代將變體對白蛋白的親和力降低約300-1，000倍，這取決於取代（表4)。 在定義位置或位置組合處具有取代的另外的變體可由本領域的技術人員設計和生成並且 使用常規方法測試所需的白蛋白結合親和力。
[0064] 可通過向ABDCon或ABDCon變體的N-端添加5個胺基酸延長來對ABDCon及其變 體進行進一步修飾。所述5個胺基酸延長可由胺基酸序列TIDEWL (SEQ ID NO :43)或SEQ ID NO :42或45-55中示出的任意胺基酸序列組成。將N-端5個胺基酸延長併入ABDCon及 其變體中可提高分子的穩定性。所述N-端5個胺基酸延長可在結構上排序作為ABDCon和 變體的第一 α螺旋的一部分。因此穩定螺旋的整體結構可改善N-端延伸分子的穩定性。 N-端ABDCon變體可使用標準方法製備，其穩定性例如熱穩定性如本文所述進行評估。任何 白蛋白結合結構域（ABD)均可通過添加5個N-端胺基酸進行修飾以使ABD結構穩定並改 善所得分子的穩定性，諸如熱穩定性。
[0065] ABDCon及其變體可進一步在不影響與白蛋白結合的殘基處進行修飾以例如改善 穩定性、降低免疫原性、改善溶解度或任何其它合適的特性。在實現這一目的的一種方式 中，可通過使用親本和工程改造序列的三維模型分析親本序列和各種概念上的工程改造產 物的過程任選地製備ABDCon及其變體。三維模型是本領域技術人員可公共獲得的和熟悉 的。電腦程式可供圖解和展示選定的候選序列的可能三維構象結構並可測量可能的免疫 原性（例如，Immunofilter程序（Xencor，Inc.，Monrovia, CA))。對這些顯示的檢測允許 分析對候選序列的功能起作用的殘基的可能作用，例如，影響ABDCon結構域的穩定性的殘 基。按此方式，可由親本和參考序列選擇並組合殘基以實現期望的特性，諸如獲得改善的穩 定性。另選地，或除了以上過程，可如本領域所已知使用其它合適的工程改造方法。
[0066] 本發明的白蛋白結合結構域的所需物理特性包括高熱穩定性以及熱摺疊和解折 疊的可逆性。多種方法已應用於增加蛋白質和酶的表觀熱穩定性，包括基於與高度相似的 熱穩定序列比較的合理設計、穩定二硫橋的設計、增加 α -螺旋傾向的突變、對鹽橋進行工 程改造、蛋白質表面電荷的改變、定向進化和共有序列的構成（Lehmann和Wyss，Curr Opin Biotechnol，12 :371-375,2001)。高度的熱穩定性可增加所表達蛋白的產量、改善溶解度或 活性、降低免疫原性並且使生產中對冷鏈的需要最小化。
[0067] 可通過進行取代並測定白蛋白結合結構域的所需特性來確定可被取代以改善本 發明的白蛋白結合結構域的任何特性的殘基。例如，可採用丙氨酸掃描來識別可影響白蛋 白結合結構域穩定性的ABDCon及其變體中的位置。
[0068] 根據穩定性的喪失，即，蛋白的"變性（denaturing/denaturation) "意指其中賦予 蛋白的功能特性的三維構象的一些或全部已伴隨活性和/或溶解性的喪失而喪失的過程。 在變性過程中被破壞的力包括分子內鍵，例如，靜電力、疏水力、範德華力、氫鍵和二硫鍵。 蛋白變性可由施加於蛋白或包含蛋白的溶液的力以及由化學變性劑引起，所述力諸如機械 力（例如壓力或剪切力），熱、滲透應力、pH的變化、電場或磁場、電離輻射、紫外線輻射和脫 水。
[0069] 蛋白穩定性和蛋白易變性的測量可視為蛋白完整性的相同或不同方面。蛋白對由 熱、由紫外線或電離輻射、環境同滲容摩和pH(如果在液體溶液中）的變化、由小孔徑過濾 施加的機械剪切力、紫外線輻射、電離輻射（諸如由Y輻射）、化學或熱脫水或任何其它可 造成蛋白結構破壞的作用或力引起的變性敏感或"易變"。可使用標準方法測定分子的穩定 性。例如，可通過使用標準方法測量熱熔融（T m)溫度，即一半的分子變為解摺疊的以攝氏 度（°C)表示的溫度來測定分子的穩定性。通常，Tm越高，分子越穩定。除了熱之外，化學 環境也改變蛋白的穩定性以保持特定的三維結構。
[0070] 可通過多種方法同樣地測量化學變性。化學變性劑包括鹽酸胍、硫氰酸胍、脲、丙 酮、有機溶劑（DMF、苯、乙腈）、鹽（硫酸銨、溴化鋰、氯化鋰、溴化鈉、氯化鈣、氯化鈉）；還原 劑（例如二硫蘇糖醇、β -巰基乙醇、二硝基硫苯和氫化物，諸如硼氫化鈉）、非離子和離子 型去汙劑、酸（例如鹽酸（HC1)、乙酸（CH3C00H)、滷代乙酸）、疏水分子（例如，磷脂）和靶 向變性劑。變性程度的定量可依賴於功能特性的喪失，諸如結合靶分子的能力，或通過物理 化學特性定量，諸如聚集的趨勢、先前溶劑不可及殘基的暴露或二硫鍵的破壞或形成。
[0071] ABDCon結合結構域及其變體可操作性地連接至生物活性劑。示例性生物活性 劑為可使用熟知的連接子可操作性地連接至ABDCon及其變體的肽和蛋白，所述連接子為 例如包含聚-甘氨酸、甘氨酸和絲氨酸（Gly-Ser連接子）或丙氨酸和脯氨酸的連接子。 使用天然存在的以及人工肽連接子在文獻中是熟知的（Hallewell等人，J Biol Chem， 264 :5260-5268,1989 ;Alfthan 等人，Protein Eng 8 :725-731,1995 ;Robinson&Sauer, Biochemistry, 35 :109-116,1996 ;美國專利 5, 856, 456)。生物活性劑可從ABDCon 或變體的 C-端或N-端與其連接。多特異性生物活性劑還可連接至ABDCon。在這些情況中，ABDCon 可連接至分子的N-端或C-端。ABDCon還可位於此類多特異性劑的內部，使得其連接至一 種劑的C-端以及另一種劑的N-端。使用本領域熟知的化學交聯，例如使用腙或縮氨基脲 鍵，也可以使生物活性劑與本發明的白蛋白結合結構域偶聯。示例性生物活性劑為特異性 結合靶抗原的蛋白，諸如從III型纖連蛋白（FN3)重複蛋白文庫（諸如W02011/137319A2 和TO2010/093627A2中所述的基於Tencon25的文庫）中識別的蛋白。
[0072] 另外的部分可結合到本發明的ABDCon或其變體，諸如用於期望特性的毒素綴合 物；聚乙二醇（PEG)分子，諸如PEG5000或PEG20, 000 ;不同鏈長的脂肪酸和脂肪酸酯，例 如，月桂酸酯、肉豆蘧酸酯，硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二 酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚賴氨酸、辛烷、糖類（葡聚糖、纖維素、寡 糖或多糖）。這些部分可與ABDCon編碼序列直接融合併且可通過標準的克隆和表達技術生 成。另選地，熟知的化學偶聯方法可用於將這些部分連接至本發明的重組製備的ABDCon。
[0073] 可使用熟知的藥代動力學特性以體內模型評估ABDCon及其變體以及生物活性劑 與ABDCon的融合蛋白的半衰期。示例性ABDCon及其變體以約介於IpM-I μ M之間、介於 75ρΜ-860ηΜ之間、介於100ρΜ-500ηΜ之間或介於InM-IOOnM之間的KD結合白蛋白。
[0074] ABDCon及其奪體的牛成和制各
[0075] 本發明的白蛋白結合結構域的生成通常使用標準方法在核酸水平上實現。使用標 準PCR克隆方法，或根據美國專利No. 6, 521，427和美國專利No. 6, 670, 127中描述的方法 的化學基因合成，或使用 Kunkel 誘變（Kunkel 等人，Methods Enzymol，154 :367_382,1987) 來合成在一個或多個特異性殘基處具有取代的密碼子的ABDCon變體。如果要對任意殘基 位置使用隨機化密碼子，則可使用熟知的方法例如匹配設計多樣性的簡併寡核苷酸，或例 如使用NNK密碼子（其編碼所有20種天然存在的胺基酸）來實現隨機化。在其它多樣化方 案中，DVK 密碼子可用於編碼胺基酸 Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、 Gly和Cys。另選地，NNS密碼子可用於產生所有20種胺基酸殘基並同時降低終止密碼子 的頻率。密碼子命名根據熟知的IUB密碼。
[0076] 用某些位置處所選的核苷酸"簡併性"合成寡核苷酸是本領域熟知的，例如TRM 方法（Knappek 等人，J Mol Biol，296 :57-86,1999 ;Garrard&Henner，Gene，128 :103-109， 1993)。可使用可商購獲得的核苷酸或核苷試劑和設備來合成具有某些密碼子組的核苷酸 的此類組。
[0077] 標準的克隆和表達技術用於將ABDCon或其變體克隆進載體或合成ABDCon的雙 鏈cDNA以在體外表達或翻譯蛋白。可使用熟知的方法使生物活性劑可操作性地連接至 ABDCon或其變體。
[0078] 核酸分子和裁體
[0079] 本發明將編碼本發明的ABDCon或其變體的核酸提供為分離的多核苷酸或表達載 體的部分或線性DNA序列的部分，包括用於體外轉錄/翻譯的線性DNA序列，與原核、真核 或絲狀噬菌體表達、組合物的分泌和/或展示相容的載體。某些示例性多核苷酸在本文 中公開，然而，考慮到遺傳密碼的簡併性和給定表達系統中的密碼子偏好，編碼本發明的 ABDCon或其變體的其它多核苷酸也在本發明的範圍內。
[0080] 本發明的多核苷酸可以通過化學合成（諸如在自動化多核苷酸合成儀上的固相 多核苷酸合成）來生產，並裝配成完整的單鏈或雙鏈分子。另選地，本發明的多核苷酸可以 通過其它技術來生產，諸如PCR之後進行常規克隆。製備或獲得具有給定的已知序列的多 核苷酸的技術是本領域熟知的。
[0081] 本發明的多核苷酸可包含至少一個非編碼序列，諸如啟動子或增強子序列、內含 子、聚腺苷酸化信號等。多核苷酸序列還可包含編碼另外的胺基酸的另外序列，其編碼例如 標記物或標籤序列，諸如六-組氨酸或HA標籤以促進蛋白質的純化或檢測；信號序列；融 合蛋白配偶體諸如編碼生物活性劑的cDNA，等等。
[0082] 示例性多核苷酸包含編碼ABDCon的序列、針對核糖體結合位點的序列、啟動子序 列、終止子序列、抗生素抗性基因和細菌複製起點（ori)。編碼本發明的白蛋白結合結構域 的示例性多核苷酸在SEQ ID NO :35中示出。
[0083] 本發明的另一實施例是包含至少一種本發明的多核苷酸的載體。此類載體可以是 質粒載體、病毒載體、杆狀病毒表達載體、基於轉座子的載體或任何其它適用於通過任何手 段將本發明的多核苷酸引入給定生物體或遺傳背景的載體。此類載體可以是包含可控制、 調節、引起或允許由這種載體編碼的多肽的表達的核酸序列元件的表達載體。此類元件可 包含轉錄增強子結合位點、RNA聚合酶起始位點、核糖體結合位點以及有利於被編碼多肽在 給定表達系統中的表達的其它位點。此類表達系統可以是本領域熟知的基於細胞的系統或 無細胞系統。
[0084] 宿豐細朐詵擇或宿豐細朐工稈改誥
[0085] 本發明的ABDCon及其變體可任選地通過細胞系、混合的細胞系、無限增殖化細胞 或無限增殖化細胞的克隆群體來生產，這是本領域熟知的。參見例如，Ausubel等人編輯， Current Protocols in Molecular BiologyjJohn ffiley&Sons, Inc. , NY, NY(1987-2001)； Sambrook 等人，Molecular Cloning ：A Laboratory Manual,2ndEdition, Cold Spring Harbor, NY(1989) ；Harlow 和 Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY(1989) ;Colligan 等人編輯，Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons, Inc. , NY(1994-2001) ;Colligan 等人，Current Protocols in Protein Science, John Wiley&Sons，NY，NY，（1997-2001)。
[0086] 選擇用於表達的宿主細胞可以是哺乳動物起源的或可選自C0S-1、C0S-7、HEK293、 BHK21、CH0、BSC-1，!fep G2、653、SP2/0、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆蟲或植物細胞，或它 們的任何衍生物、無限增殖化細胞或轉化的細胞。另選地，宿主細胞可選自不能夠使多肽 糖基化的物種或生物體，例如原核細胞或生物體，諸如BL21、BL21 (DE3)、BL21-G0LD(DE3)、 XLl-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)以及任何天然或工程改造的大腸桿菌屬（E. coli spp)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella spp.)或假單胞菌屬（Pseudomonas spp)菌株。
[0087] 本發明的白蛋白結合結構域的用塗
[0088] 本發明的非天然白蛋白結合結構域ABDCon及其變體的組合物可用於通過可操作 性地連接ABDCon和生物活性劑來調節所述生物活性劑在動物組織內的半衰期和/或生物 學分布，並且其中給動物施用所述組合物所導致的生物活性劑半衰期和/或生物學分布與 單獨施用活性劑時所獲得的組織分布不同。
[0089] 何含ABDCon或其奪體的藥物糹目合物
[0090] 可操作性地連接至生物活性劑的結合白蛋白的ABDCon或其變體可使用本領域熟 知的用於捕獲、固定、分配或沉澱的分離工序分離，並將其純化至商業適用所必需的程度。
[0091] 對於治療劑的用途，可將生物活性分子-ABDCon融合蛋白製備為藥物組合物，所 述藥物組合物包含有效量的生物活性劑-ABDCon融合蛋白作為藥學上可接受的載體中的 活性成分。術語"載體"是指活性化合物與其一起施用的稀釋劑、輔助劑、賦形劑或媒介物。 此類媒介物可以是液體，諸如水和油，包括那些來源於石油、動物、植物的油或合成的油，諸 如花生油、大豆油、礦物油和芝麻油等。例如，可使用0.4%鹽水溶液和0.3%甘氨酸。這些 溶液是無菌的，並且通常不含顆粒物。它們可通過常規的已知的滅菌技術（例如過濾）進 行滅菌。所述組合物可根據需要包含配藥學上可接受的輔助性物質，以接近生理條件，諸 如pH調節劑和緩衝劑、穩定劑、增稠劑、潤滑劑和著色劑等。在此類藥物製劑中生物活性 劑-ABDCon融合蛋白的濃度可廣泛改變，按重量計，即從小於約0. 5%，通常為或至少約1 % 至多達15或20%，且將根據所選擇的具體施用方式，主要基於所需劑量、流體體積、粘度等 進行選擇。合適的媒介物和製劑描述於例如Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 21 版，Troy, D. B.編輯，Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA2006,第 5 部分，Pharmaceutical Manufacturing 第 691-1092 頁，特別參見第 958-989 頁。
[0092] 生物活性劑-ABDCon融合蛋白的治療用途的施用方式可以是將藥劑遞送至宿主 的任何合適的途徑，諸如非腸道施用，例如，真皮內、肌內、腹膜內、靜脈內或皮下、肺部；經 黏膜（口腔、鼻內、陰道內、直腸）；使用片劑、膠囊、溶液、懸浮劑、粉末、凝膠、顆粒形式的制 齊IJ ;以及包含在注射器、植入裝置、滲透泵、盒、微型泵中；或技術人員所理解的本領域熟知 的其它方式。可通過例如以下方式實現位點特異性施用：胃腸外、支氣管內、腹內、囊內、軟 骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、頸管內、胃內、肝內、心臟內、骨內、骨盆內、心 包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮 內、血管內、膀胱內、病灶內、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內或經皮遞送。
[0093] 雖然以一般的術語描述了本發明，但是本發明的實施例還將在以下的實例中公 開，所述實例不應理解為對本權利要求所保護的範圍的限制。
[0094] 實例L非天然白蛋白結合結構域的牛成
[0095] 非天然白蛋白結合結構域共有序歹Il (ABDCon)的設計
[0096] 通過對保藏在無冗餘蛋白質資料庫中的3-螺旋束ABD序列的共有胺基酸序列 進行計算來設計非天然白蛋白結合結構域（ABD)。為了測定共有序列，將來自鏈球菌屬 (Streptococcus sp)G148蛋白G(SEQID NO :1)的ABD用作針對無冗餘NCBI蛋白質資料庫 進行 BLAST 檢索的模板序列（http :_//blast_ncbi_nlm_nih_gov/Blast_cgi)。所有默認設 置均用於BLAST檢索；預期閾值=10 ;字長=3 ;矩陣=BL0SUM62 ;空位權重=存在11，延 長1 ;組合調整=有條件的組合評分矩陣調整。從此檢索中，選擇20個密切相關的蛋白結構 域，在表1中列出（SEQ ID NO :1-20)以包含在多序列對比中，以便測定共有序列。僅選擇 無冗餘序列。若干個蛋白登錄號在表1中多次列出，表明一些蛋白包含若干個密切相關的 ABD結構域。SEQ ID NO :4為源於噬菌體展示和基因改組的非天然ABD。（He等人，Protein Sci，16 :1490-1494,2007)。
[0097] 表 L
[0098]

【權利要求】
1. 一種分離的非天然白蛋白結合結構域，其包含與SEQ ID NO: 21的胺基酸序列至少 85〇/〇、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的氨基 酸序列。
2. -種分離的非天然白蛋白結合結構域，其包含在1、2、3、4、5或6個殘基處具有取代 的SEQ ID NO: 21的胺基酸。
3. 根據權利要求2所述的分離的白蛋白結合結構域，其中1、2、3、4、5或6個殘基處的 所述取代發生在 SEQ ID NO: 21 的胺基酸位置 Y21、Y22、L25、K30、T31、E33、G34、A37、L38、 E41、142和A45中的一處或多處。
4. 根據權利要求2所述的分離的白蛋白結合結構域，其中1、2、3、4、5或6個殘基處的 所述取代發生在SEQ ID NO: 21的胺基酸位置Y21、Y22、K30、T31、A37和E41中的一處或 多處。
5. 根據權利要求1所述的分離的白蛋白結合結構域，還包含在其N-端的5個胺基酸的 延長。
6. 根據權利要求5所述的分離的白蛋白結合結構域，其中所述5個胺基酸的延長包含 選自SEQ ID NO: 42、43和45-55的胺基酸序列。
7. 根據權利要求5所述的分離的白蛋白結合結構域，其中所述5個胺基酸的延長包含 SEQ ID NO: 43的胺基酸序列。
8. -種分離的非天然白蛋白結合，其包含選自SEQ ID NO: 21-34或44的胺基酸序列。
9. 根據權利要求8所述的分離的白蛋白結合結構域，還包含在其N-端的5個胺基酸的 延長。
10. 根據權利要求9所述的分離的白蛋白結合結構域，其中所述5個胺基酸的延長包含 SEQ ID NO: 42、43或45-55的胺基酸序列。
11. 根據權利要求9所述的分離的白蛋白結合結構域，其中所述5個胺基酸的延長包含 SEQ ID NO: 43的胺基酸序列。
12. 根據權利要求1所述的分離的白蛋白結合結構域，其中所述白蛋白結合結構域具 有結合人白蛋白的介於約50pM至1剛之間的解離常數（Kd)，所述解離常數是採用Prote化TM XPR-36蛋白相互作用陣列系統炬io-Rad)使用GLC傳感器晶片測量的，流速為100化/min， 使用PBST (PBS，0. 005%的Tween20)作為運行緩衝液。
13. 根據權利要求1所述的分離的白蛋白結合結構域，其中所述白蛋白結合結構域具 有結合人白蛋白的在3. 6 X 1(T5至1. 1 X l(Ti的解離速率常數化off)，所述解離速率常數是 採用Prote化TM XPR-36蛋白相互作用陣列系統炬io-Rad)使用GLC傳感器晶片測量的，流 速為lOOML/min，使用PBST (PBS，0. 005%的Tween20)作為運行緩衝液。
14. 一種製備權利要求1所述的分離的白蛋白結合結構域的方法，所述方法包括 a) 提供編碼所述分離的白蛋白結合結構域的多核巧酸； b) 在宿主中或體外表達所述多核巧酸；W及 C)回收所述分離的白蛋白結合結構域。
15. -種分離的多核巧酸，其編碼權利要求1所述的白蛋白結合結構域。
16. -種分離的多核巧酸，其包含編碼選自SEQ ID NO: 21-34或44的白蛋白結合結構 域的多核巧酸。
17. -種分離的多核巧酸，其包含SEQ ID NO: 35的多核巧酸。
18. -種分離的載體，其包含權利要求15、16或17所述的分離的多核巧酸。
19. 一種宿主細胞，其包含權利要求18所述的分離的載體。
20. -種融合蛋白，其包含權利要求1、5或8中任一項所述的白蛋白結合結構域和生物 活性劑。
21. 根據權利要求20所述的融合蛋白，其中所述生物活性劑為特異性結合祀分子的蛋 白質支架。
22. 根據權利要求21所述的融合蛋白，其中所述蛋白質支架基於包含SEQ ID NO: 39 的胺基酸殘基1-90或其變體的Tencon25。
23. 根據權利要求21所述的融合蛋白，其中所述白蛋白結合蛋白和所述生物活性劑使 用連接子操作性連接。
24. 根據權利要求23所述的融合蛋白，其中所述連接子包含Gly-Ser連接子。
25. 根據權利要求24所述的融合蛋白，其中所述連接子包含SEQ ID NO: 40的胺基酸 序列。
26. -種藥物組合物，其包含權利要求20所述的融合蛋白和至少一種藥學上可接受的 載體或稀釋劑。
27. 本文描述的任何發明。
【文檔編號】C07K14/00GK104470944SQ201380039335
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年5月23日 優先權日:2012年5月25日
【發明者】賈科布斯 S. 申請人:詹森生物科技公司