一種乾燥症候群小鼠模型的造模方法與流程

2023-06-14 05:35:26 5

本發明涉及醫藥實驗領域，尤其涉及一種乾燥症候群小鼠模型的造模方法。

背景技術：

乾燥症候群(Sjogren Syndrome,SS)是一種以侵犯唾液腺和淚腺為主要特徵的慢性炎症性自身免疫病。乾燥症候群根據發病原因可分為原發性和繼發性兩種。原發性乾燥症候群(primary Sjogren Syndrome,pSS)是一種全球性疾病，好發於女性和老年人，男女比例約為1:9～1:20。口乾、眼乾是該病典型的臨床症狀，部分患者還會出現間歇性腮腺炎和後期的猖獗性齲齒；此外包括其他不典型的腺外系統症狀。

目前國內外主要的乾燥症候群動物模型為鼠類，包括兩大類，即自髮型和誘髮型。自髮型動物模型，主要有非肥胖型糖尿病(NOD，non-obese diabetic disease)小鼠、紐西蘭黑鼠(NZB，New Zealand black)和紐西蘭白鼠(NZW,New Zealand white)雜交F1代小鼠、MRL/lpr小鼠等。自髮型動物模型的選擇一般繼發於一種瀰漫性結締組織病，因其在發病前期或者發病過程都表現出與人類乾燥症候群相似的症狀而被用於動物模型進行研究。誘髮型動物模型是一種主要在局部模擬人類乾燥症候群的方法，主要包括注射抗原、接種病毒或組織勻漿等。目前有用Balb/c小鼠頜下腺勻漿與弗氏完全佐劑混合製成的抗原注射入同種小鼠足墊和背部皮下，並且用百日咳疫苗背部皮下加強免疫，以及用C57BL/6小鼠頜下腺勻漿與弗氏完全佐劑或不完全佐劑混合製成的抗原注射入同種小鼠的背部皮下等。在誘髮型動物模型中，利用涎腺組織勻漿免疫同種或異種小鼠是一種比較常見的模型的構建方法。對於自髮型動物模型雖其並發的許多器官受損與人類的乾燥症候群頗為相似，但其高成本、長周期、不易控制以及成模率較低使得實驗室的研究遇到諸多困難。而目前國內外的幾種誘導的動物模型中存在不足，如用大鼠造模需要較高的經濟成本，並且周期較長會導致大鼠的各組織器官功能漸退，從而影響了實驗的準確性。此外，小鼠抗原誘導的途徑、劑量、時間、次數以及佐劑的選擇等均會影響模型的成功率。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種較為理想的乾燥症候群動物模型，相比其它模型有較高的成模率，易於掌握，給研究人類乾燥症候群提供更可靠的模型。

本發明中將C57BL/6小鼠的頜下腺勻漿與弗氏佐劑製成乳化劑，通過皮內多點注射進入同種小鼠的尾背部，介導炎症免疫反應，使小鼠頜下腺產生淋巴細胞浸潤，幹擾其免疫系統。皮內多處注射的方式可以產生較強的免疫應答。抗原的注射分3次進行，在第0天和第7天用弗氏完全佐劑調整抗原濃度，第14天用弗氏不完全佐劑平行操作，加強局部免疫應答。

本發明是通過以下技術方案來達到目的：

一種乾燥症候群小鼠模型的造模方法，包括以下步驟：

步驟一，小鼠頜下腺抗原的製備：按需要取C57BL/6小鼠，脫頸椎處死，新潔爾滅消毒，無菌條件下取出雙側頜下腺，剝離包膜及結締組織，用PBS洗淨後放入無菌青黴素小瓶中，按照每個頜下腺加入0.5ml PBS的量，向無菌青黴素小瓶中加入PBS，將瓶內的頜下腺剪碎，在冰浴中充分勻漿，3000r/15min/4℃的條件離心，棄去上層脂質，取上清液，採用BCA蛋白定量法定量頜下腺抗原濃度，用PBS將頜下腺抗原濃度調整至4mg/ml，加入等量FCA弗氏完全佐劑或FIA弗氏不完全佐劑，將小鼠頜下腺抗原濃度稀釋至2mg/ml，反覆吹打直至兩液相互溶並呈乳白色狀，即製得注射用的2mg/ml小鼠頜下腺抗原；

步驟二，將C57BL/6小鼠隨機分組，保證各組的小鼠數量、體重、狀態儘可能地相近；用剪刀或電動剃鬚刀將小鼠尾背部的毛剃掉以備註射抗原，正常對照組小鼠不作處理；

步驟三，分別在第0天，第7天於小鼠的尾背部皮內多點注射步驟一製備的FCA配製的2mg/ml小鼠頜下腺抗原，注射量為0.1ml/只；在第14天用同樣的方法注射等量的步驟一製備的FIA配製的頜下腺抗原；對照組小鼠用同樣的方法注射等量的生理鹽水；

步驟四，造模6周左右，檢測指標，篩選造模成功的小鼠。

優選的，步驟一中的C57BL/6小鼠為8周齡的雌性C57BL/6小鼠。

優選的，步驟四中的檢測指標包括：

飲水量檢測：於造模前一周開始檢測，每周測一次；造模後飲水量開始逐漸上升；

小鼠狀態觀察：在造模後第3周前後開始，小鼠出現搔抓口唇、舔爪現象，隨後這種現象逐漸明顯。

唾液量檢測：在造模第5周進行；在造模第5周及此後，模型組小鼠的唾液應比正常組低，並且逐漸減少。

頜下腺組織病理學檢測：在第6周，分別從模型組和正常組中取出2～3隻小鼠，處死，取頜下腺做病理檢查，用H&E染色法檢測，模型組頜下腺存在明顯的淋巴細胞浸潤、成灶，而正常組無明顯浸潤。

優選的，所述唾液量檢測：方法是測量前小鼠腹腔注射2.4％的戊巴比妥鈉0.05ml，以呼吸平穩，眼角膜反射消失，四肢肌群鬆弛為麻醉標準；完全麻醉後使小鼠處於頭低的稍稍傾斜狀態,可以用取暖器給予溫度，腹腔注射0.025mg/mL毛果芸香鹼溶液0.1ml，5min後，將事先稱好的棉花小球塞入小鼠口中，10min後取出；用溼重法求出小鼠唾液重量。

優選的，所述頜下腺組織病理學檢測，在第6周，分別從模型組和正常組中取出2～3隻小鼠，處死，取頜下腺做病理檢查，用H&E染色法檢測，頜下腺的處理應先放於10％的福馬林中浸泡24h後，依次進行衝洗、脫水和透明、浸蠟、包埋、石蠟切片以及最終的H&E染色；模型組頜下腺存在明顯的淋巴細胞浸潤、成灶，而正常組無明顯浸潤。

本發明的優點是：

(1)本發明的乾燥症候群小鼠模型的造模方法，注射方式為皮內注射，因皮內注射刺激免疫系統產生的應答強於皮下注射及其他途徑。

(2)本發明的乾燥症候群小鼠模型的造模方法，以2mg/ml的濃度給予0.1ml/只較適宜，過高或過低易誘導免疫耐受。

(3)本發明的乾燥症候群小鼠模型的造模方法，注射抗原的次數和間隔適宜，頻繁注射可能引起小鼠生理和精神狀態低下，易於死亡。

(4)本發明的乾燥症候群小鼠模型的造模方法，8周齡的雌性C57BL/6小鼠為較理想的動物。

本發明的乾燥症候群小鼠模型的造模方法成模率高，造模時間短；理想的動物模型會給研究乾燥症候群提供更好的實驗方法。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發明作進一步說明：

實施例

1頜下腺抗原的製備：

取4隻C57BL/6小鼠，脫頸椎處死，置於新潔爾滅中消毒15min，在超淨臺裡無菌取出雙側頜下腺，分離包膜及結締組織，用PBS洗淨後放入無菌青黴素小瓶中，向瓶中加入2ml PBS，用眼科剪將瓶中的頜下腺剪碎，在冰浴中用電動勻漿器充分勻漿，轉入EP管中離心，離心條件為3000r/15min/4℃，棄去上層脂質，取上清液，進行BCA蛋白定量，用PBS將抗原濃度調整至4mg/ml，加入等量的弗氏完全佐劑(FCA)或弗氏不完全佐劑(FIA)，將抗原濃度稀釋至2mg/ml，反覆吹打直至兩液相互溶並呈乳白色狀即可，若不及時注射，則可放於4℃冰箱保存備用，使用前仍需反覆搖晃均勻。

2分組：

將40隻C57BL/6小鼠隨機分組，保證各組的小鼠數量、體重、狀態儘可能地相近；用剪刀或電動剃鬚刀將小鼠尾背部的毛剃掉以備註射抗原，正常對照組小鼠可不作處理。

3抗原的注射：

分別在第0天，第7天於小鼠的尾背部皮內多點注射FCA配製的頜下腺抗原0.1ml/只；在第14天用同樣的方法注射等量的FIA配製的頜下腺抗原。對照組小鼠不作處理或用同樣的方法注射等量的生理鹽水。

4模型的檢測指標

4.1觀察：3次造模後，觀察小鼠的狀態，約在第3周前後開始，小鼠出現搔抓口唇、舔爪現象，並且這種現象逐漸明顯；

4.2飲水量：從造模前開始測，每周測一次，造模後飲水量逐漸上升；

4.3唾液量：約在造模第5周進行。方法是測量前小鼠腹腔注射2.4％的戊巴比妥鈉0.05ml，以呼吸平穩，眼角膜反射消失，四肢肌群鬆弛為麻醉標準。完全麻醉後使小鼠處於頭低的稍稍傾斜狀態，需要時用取暖器給予溫度，腹腔注射0.025mg/mL毛果芸香鹼溶液0.1ml，5min後，將事先稱好的棉花小球置入小鼠口中，10min後取出。用溼重法求出小鼠唾液重量。在造模第5周及此後，模型組小鼠的唾液量比正常組低，並且逐漸減少；

4.4頜下腺組織病理學檢測：

在第6周，分別從模型組和正常組中取出2～3隻小鼠，處死，取頜下腺做病理檢查(H&E染色)。頜下腺的處理應先放於10％的福馬林中浸泡24h後，依次進行衝洗、脫水和透明、浸蠟、包埋、石蠟切片以及最終的H&E染色。模型組頜下腺存在明顯的淋巴細胞浸潤，成灶，並且正常組無浸潤或存在輕度浸潤。

頜下腺Chisholm和Mason評判標準分級

註：一個淋巴細胞浸潤灶是指有50個或更多的淋巴細胞

5.造模完成

造模6周左右，根據造模組小鼠的唾液量和頜下腺組織病理學評分分級判斷造模是否成功；將造模組的小鼠唾液量與對照組小鼠唾液量對比，造模組的小鼠唾液量明顯減少的，且頜下腺組織病理學評分Ⅱ級以上判斷為造模成功的小鼠。