日本血吸蟲1zd11基因的克隆的製作方法
2023-06-14 19:49:01 1
專利名稱：日本血吸蟲1zd11基因的克隆的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的核苷酸序列、日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的克隆。
背景技術：
血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的分布廣泛、危害嚴重的人獸共患寄生蟲病。是亟待解決的嚴重的公共衛生問題。目前血吸蟲病的主要防治策略是在易感地區大規模化療、滅螺及健康教育，但由於治療藥物不能解決血吸蟲病重複感染的難題，使得人、畜的重複感染問題突出，特別是本病的主要傳染源家畜的重複感染，難以實現對該病的長期有效控制。因此，人用特別是家畜用的抗血吸蟲病疫苗的研究與應用成為血吸蟲病防治的重要發展戰略。
血吸蟲在生長發育方面的表現非常特殊、複雜，在整個生活史循環過程中，呈現顯著的生物學和形態學變化。這種不同發育階段的形態學上和生物學上的變化必然伴隨著不同的基因差異表達模式，導致血吸蟲獨特的代謝和發育過程，同時也使血吸蟲的抗原性十分複雜，血吸蟲疫苗的研製也因此成為一個世界性難題。為從分子水平探索血吸蟲生長、發育、生殖及與宿主的相互作用等生命活動的機理，增加對病原體重要的功能分子的了解，以使血吸蟲疫苗的開發能有所突破，開展了日本血吸蟲發育期別差異表達基因的篩選研究工作。首先應用抑制性消減雜交和cDNA微陣列分析獲得了不同發育階段的差異表達基因的基礎材料，選擇一批克隆測序獲得了相應基因的ESTs(表達序列標籤)，經同源性分析證實與資料庫中已有的數據無明顯同源性的，可視為血吸蟲新基因。新基因的獲取、鑑定以及所編碼蛋白的功能研究，有助於發現與血吸蟲的生長發育、致病性等密切相關的功能分子，可為血吸蟲高效疫苗、診斷製劑以及新藥的開發開拓新途徑。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於應用抑制性消減雜交技術，以日本血吸蟲尾蚴為實驗組，日本血吸蟲成蟲為驅動組構建了尾蚴消減質粒文庫，經cDNA微陣列分析獲得了日本血吸蟲尾蚴階段高表達的1ZD11基因，並對其進行了克隆和核苷酸序列分析。
本發明提供了日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的基因序列，它具有序列1的核苷酸序列及相應的胺基酸序列。
本發明的另一目的是提供了日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的核苷酸序列的篩選方法，該方法是以日本血吸蟲尾蚴為實驗組，成蟲為驅動組，構建日本血吸蟲尾蚴消減質粒文庫，由消減文庫隨機挑克隆定製cDNA微陣列，經cDNA微陣列雜交分析後再挑選克隆測序，獲得了1ZD11基因的表達序列標籤。
本發明應用抑制性消減雜交技術，以日本血吸蟲尾蚴為實驗組，成蟲為驅動組，構建了尾蚴消減質粒文庫，由該文庫挑選克隆定製cDNA微陣列，經雜交分析，獲得一批在尾蚴和成蟲間差異表達的cDNA克隆。選擇部分克隆進行了ESTs測序，然後利用NCBI的BLAST進行基因序列的同源性分析，結果發現一個基因克隆與資料庫中已有的數據無顯著同源性(Score值＜50bits)，表明該基因為一血吸蟲新基因，命名為1ZD11。以該基因的ESTs序列為模板，應用RACE技術對這一基因的cDNA片段分別進行了3′和5′延伸。DNA序列分析表明該基因(1ZD11)的開放閱讀框含261bp的序列，推測編碼86個胺基酸的蛋白質。經DNAMAN軟體分析，1ZD11 DNA序列分析表明該基因(1ZD11)的開放閱讀框含261bp的序列，推測編碼86個胺基酸的蛋白質，理論分子量為9.9249ku，等電點為7.77，為中性蛋白。有5個抗原位點，具有信號肽，推測信號肽裂解位點在24-25位胺基酸之間，具有1個典型疏水性區域，無跨膜結構。具有1個蛋白激酶C磷酸化位點，在23-82位間胺基酸與多花文昌魚的Wnt7b蛋白具有34％的同源性，與人的Wnt7a蛋白具有33％的同源性。
本發明的又一目的是提供了日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的核苷酸序列的篩選方法，該方法獲得了序列3的日本血吸蟲1ZD11基因完整核苷酸序列。
其編碼的蛋白具有序列2的胺基酸序列。
圖1重組質粒pCR2.1-TOPO/1ZD11的EcoR I酶切鑑定電泳圖譜MDNA Marker 2,000；1重組質粒的酶切產物圖2重組質粒pCR2.1-TOPO/1ZD11的PCR鑑定電泳圖譜MDNA Marker 2,000；1重組質粒的PCR產物具體實施方式
實施例1一、日本血吸蟲尾蚴消減文庫的構建及cDNA微陣列分析1.材料1.1.實驗動物紐西蘭大白兔購自中科院上海分院實驗動物中心，體重2.5kg，用作日本血吸蟲中國大陸株的感染宿主。
1.2.日本血吸蟲中國大陸株安徽品系尾蚴中國農科院上海家畜寄生蟲病研究所釘螺室提供。
1.3.質粒、菌種pCR2.1-TOPO克隆載體購自Invitrogen公司、DH5α感受態細胞購自博大泰克公司。
1.4.主要試劑及工具酶總RNA提取試劑TRIzol、GeneRacerTMKit購自Invitrogen公司，mRNA分離試劑盒oligotex mRNA midikit為Qiagen產品。PCR-selectTMcDNA subtraction kit，Advantage cDNAPolymerase，NucleoSpinExtraction Kit為Clontech公司產品。小量質粒抽提試劑盒購自上海賽百盛基因技術有限公司。Percoll、氨苄青黴素購自華美生物工程公司。Trypsin、Collagenase II購自上海生工生物工程有限公司。限制性內切酶EcoRI、Xho I、T4DNA連接酶、ExTaq DNA高保真DNA聚合酶、DL2000marker購自寶生物工程(大連)有限公司。Cy3-dCTP和Cry5-dCTP以及random primer labeling system購自Amersham Phamacia生物技術有限公。晶片雜交試劑盒為博星基因晶片有限公司產品。cDNA微陣列的製作、探針標記、晶片雜交、晶片掃描以及數據採集委託上海博星基因晶片有限公司完成。
1.5.引物3′RACE特異引物1ZD1NP 5′ACGCTTCTCTTACACTATCCTTCCA 3′(404-428)1ZD1P 5′TTGTAACGCTTCTCTTACACTATCC 3′(399-423)5′RACE特異引物1ZD 1RP5′CACGCCATTTGAGATATCATGAATG 3′(71-95)1ZD 1NRP 5′ATCAATGATGCGATGAGGACTTTGC 3′ (41-65)RT-PCR引物Upper 5′TTGGATCCATGTTAAGTACAGCCTGC 3′(25-42)Down 5′CTCTCGAGTCACTGGCACAATTCTTTC 3′ (258-276)1ZD11P、1ZD11NP為1ZD11基因3′RACE的第一輪和第二輪PCR引物；1ZD11RP、1ZD11RNP為1ZD11基因5′RACE的第一輪和第二輪PCR引物；upper和down為擴增1ZD11基因編碼區的上下遊引物。括號內的數字表示該引物在此基因片段中的位置。引物由英俊生物技術有限公司合成。
2.方法2.1.日本血吸蟲尾蚴和成蟲的收集尾蚴的收集感染的陽性釘螺置於加滿去氯水的15ml試管中，於25℃室溫條件下光照過夜，次日早晨尾蚴逸出浮於水面。將含有尾蚴的水轉入35mlDEPC處理過的聚丙烯離心管中，12000rpm離心10min，收集的尾蚴立即用於RNA抽提。
成蟲的收集紐西蘭大白兔腹部貼皮感染每隻2000條尾蚴，於感染後7周剖殺，以肝門靜脈灌注法收集成蟲。
2.2.日本血吸蟲尾蚴和成蟲總RNA的提取按TRIzol試劑盒操作手冊進行。取少量RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳分析完整性。紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度。
2.3.日本血吸蟲尾蚴和成蟲mRNA的分離利用oligotex試劑盒分離總RNA中的mRNA。操作按試劑盒使用說明書進行。取樣瓊脂糖凝膠電泳分析RNA樣品的完整性。
2.4.尾蚴消減雜交文庫構建以尾蚴為實驗組，成蟲為驅動組，構建尾蚴消減文庫，富集尾蚴階段高表達的轉錄本。具體構建方法按Clontech PCR-selectTMcDNAsubtraction kit操作手冊進行。
2.5.用於晶片製備的消減雜交克隆的篩選滅菌牙籤挑取消減文庫中的單菌落接種於每孔含150μl LB(Kan+)的96孔細胞培養板，37℃過夜培養。以過夜培養菌液2μl為模板，用載體pCMV-SCRIPT多克隆位點兩端的通用引物T3和T7進行PCR擴增，反應體系為10×PCR reaction buffer 2μl，dNTP Mix(10μM)1μl，T3primer和T7primer各0.2μl(10μM)，Taq酶0.2μl(5U/μl)，加水至20μl。循環條件為95℃5min；30個循環94℃30sec；50℃30sec；72℃1min。1％瓊脂糖凝膠電泳觀察插入片斷的有無及大小。為能更多的獲得編碼區的信息，並避免因序列過短影響晶片雜交結果，本研究選擇插入片斷大於500bp的克隆用於cDNA微陣列製作。
2.6.cDNA微陣列的製作對於被選擇用於微陣列製作的克隆，循環參數保持不變，放大PCR擴增體系以便獲得足夠的產物。以瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，確證插入片斷的存在並估計PCR產物的量。所得PCR產物經過柱純化後，溶解於含3×SSC溶液的緩衝液中。然後用Omnigrid Arrayer點樣儀將此含PCR產物的溶液點到矽化玻片上，每個樣品點一次。該玻片置70％溼度條件下水合2hr，室溫乾燥並紫外耦合30min後，於室溫條件下依次在0.2％SDS溶液中浸泡10min，滅菌水浸泡10min，0.2％NaBH4溶液浸泡10min，再經室溫乾燥後，cDNA微陣列製作完畢。
2.7.晶片雜交實驗2.7.1.晶片預雜交1)配製預雜交液雜交試劑1加入到Eppendorf管中，振蕩混勻後，加入雜交試劑2混勻；2)將配製好的預雜交液放入95℃水浴鍋內變性2min，將待預雜交的玻片放入95℃水浴鍋內變性30sec，玻片取出後即浸入無水乙醇中30sec，晾乾；
3)將已變性的預雜交液加到玻片的點樣區域內，蓋上蓋玻片，放入雜交箱內42℃預雜交5～6hr。
2.7.2.螢光標記探針(以下在冰浴中進行)經過反轉錄標記螢光探針，以Cy5-dCTP標記成蟲RNA，以Cy3-dCTP標記蟲卵RNA。具體操作步驟如下1)於一已滅菌的1.5mL Eppendorf管內依次加入以下試劑(反應終體積為50μL，以下試劑均為RNase-free)ddH2O23μL逆轉錄引物 5μL總RNA 50～100μg振蕩混勻，置於70℃水浴10min。取出後，迅速置於冰上；2)再分別加入以下試劑逆轉錄酶緩衝液 10μLDTT(1mM) 5μLdNTPs(10μM) 4μL3)而後在暗室中加入以下試劑逆轉錄酶 2μLCy5-dCTP或Cy3-dCTP 3μL4)用手指彈打管壁以混勻樣品，手浴2min。將Eppendorf管置於42℃水浴2hr；5)依次在Eppendorf管中加入標記試劑I 4μL，65℃水浴10min後加入標記試劑II 4μL。混勻，合併對照組、實驗組。避光，真空抽乾至50μL左右；6)使用DNA純化柱(或乙醇沉澱)純化DNA；7)將柱體在旋渦混合器上劇烈振蕩搖勻，懸浮其中的樹脂。將柱頂端的小帽旋鬆四分之一圈，掰斷柱下端的密封頭；8)將柱置於一個1.5mL的Eppendorf管中，以3000rpm離心1min將柱置於另一個新的1.5mL Eppendorf管中，去掉頂端的帽，將樣品慢慢加到樹脂上表面的中間，注意不要攪動柱體。以3000rpm離心2min，經純化的樣品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中；9)加入標記試劑III 8μL，真空抽乾。
2.7.3.晶片雜交1)在抽乾的探針管中加6.5μL雜交試劑I，充分混勻，使探針溶解。再加入6.5μL雜交試劑II，混勻備用；2)將預雜交的玻片取出，用ddH2O衝去蓋玻片；3)將探針置於95℃水浴中變性2min；玻片置於95℃水浴中變性30sec，玻片取出浸無水乙醇30sec，探針取出後迅速置於冰上；4)將探針置於晶片上，用蓋玻片覆蓋，置於雜交艙中，用Parafilm密封，放入42℃雜交箱內雜交過夜(16～18h)。
2.7.4.洗片1)用0.5％的洗滌液1衝洗玻片，去除蓋玻片；2)準備兩個染色缸，分別裝有0.5％的洗片試劑1+2％的洗片試劑2、5％的洗片試劑3，放入60℃水浴鍋中備用；3)將玻片依次浸入以上兩個染色缸中洗滌10min；4)用0.5％的洗滌液1衝洗玻片，晾乾後掃描。
2.8.晶片掃描及數據處理用ScanArray 4000掃描儀在610nm和590nm兩個波長下對晶片進行掃描，設置LaserPower80，PMT Value80。分別檢測Cy3和Cy5發射光，獲得晶片灰度掃描圖。晶片上每個點在兩個波長下的光強分別代表Cy3-dCTP和Cy5-dCTP的量。然後採用GenePix Pro 3.0圖像處理軟體提取Cy3、Cy5螢光信號強度，用GenePix Pro 3軟體的比值中位數法計算並分析Cy5/Cy3值。
2.9.差異表達基因的測序和生物信息學分析晶片雜交後，根據雜交結果選擇差異表達克隆進行測序。測序引物為載體pCMV-SCRIPT多克隆位點兩端的T3或T7通用引物。測序委託上海申能博採生物科技有限公司完成。獲得的EST序列去除載體後用BLASTn(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GenBank/EMBL/DDBJ的EST資料庫中，以及GenBank/EMBL/DDBJ/PDB的非冗餘性核酸資料庫中分別進行同源性搜索。再用InterPro release 9.0軟體(http//www.ebi.ac.uk/interpro/)在PDBdata資料庫中在線查詢，預測該序列編碼的蛋白質分子可能參與的生物學過程及可能的分子功能。
2.10.日本血吸蟲中國大陸株1ZD11全長基因的克隆及測序1)3′RACEA.反轉錄合成第一鏈cDNA，體系如下
65℃5min以解離RNA二級結構。冰上冷卻至少1min後，加入下列試劑
溫和混勻，55℃反轉錄60min。立即70℃15min，滅活反轉錄酶。再向反應體系中加入1μl RNase H(2U)，37℃20min，去除雜交體中的mRNA。
B.第一輪PCR，體系如下
循環參數
C.第二輪PCR通過第二輪PCR擴增可大大增加RACE產物的特異性和產量，體系如下
循環參數
取10μl物，1％瓊脂糖凝膠電泳分析RACE產物。
2)5′RACEA.mRNA的去磷酸化，反應體系如下
反應條件50℃1hr。結束後迅速離心，冰上暫放。加酚∶氯仿抽提，乙醇沉澱後，溶於7μl DEPC水中，進行下一步反應。
B.mRNA去帽子結構，反應體系如下
反應條件37℃反應1hr。反應結束後迅速離心，冰上暫放。加酚∶氯仿抽提，乙醇沉澱後，溶於7μl DEPC水中。
C.Oligo RNA與去帽mRNA的連接，反應體系如下將步驟B製備的7μl去除帽子結構的RNA加入到含有凍幹GeneRacerRNA Oligo(0.25μg)的離心管中，輕輕吹打混勻，65℃5min使RNA的二級結構解離。置冰上冷卻至少2min後，加入下列試劑
反應條件37℃反應1hr。置冰上冷卻後，加酚∶氯仿抽提，乙醇沉澱，溶於10μl DEPC水中，進行下一步反應。
D.反轉錄合成第一鏈cDNA，反應體系及條件與3′RACE相同。
E.第一輪及第二輪PCR。反應體系及條件與3′RACE相同。
3)RACE產物的測序及全長序列的拼接將RACE產物克隆到GeneRacer試劑盒提供的pCR2.1-TOPO載體中，挑選陽性克隆，委託英俊生物技術有限公司測序。利用GeneTool軟體，查找3′、5′RACE產物序列與原ESTs序列的重疊部分，將三段序列拼接。
4)全長基因的RT-PCR擴增、克隆利用在線分析軟體ORF(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析上一步驟的序列，找出cDNA的編碼框區域。於cDNA序列編碼框上下遊區域設計上下遊引物，RT-PCR擴增全長基因。產物克隆至載體pCR2.1-TOPO中。
5)陽性克隆的PCR、酶切鑑定挑取轉化菌落，鹼裂解法小量製備質粒DNA，-20℃保存備用。PCR鑑定取5μl質粒溶液作為PCR模板以1ZD11基因的特異引物進行PCR擴增。取5μl PCR擴增產物於1％的瓊脂糖凝膠上電泳。同時用EcoRI對製備的質粒進行酶切鑑定，酶切產物於1％的瓊脂糖凝膠上電泳分析。經鑑定為重組的質粒再用Sangers雙脫氧核糖核酸末端終止法測序。
6)全長基因編碼蛋白的生物信息學分析利用DNAMAN軟體計算編碼蛋白的理論分子量、等電點。利用SignalP3.0在線分析軟體(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析編碼蛋白有無信號肽。ProtScale在線分析軟體(http//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)分析編碼蛋白的疏水性。TMHMM伺服器(http//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析編碼蛋白有無跨膜結構。BLASTp軟體(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)及FASTA軟體(http//www.ebi.ac.uk/fasta33/)用於同源蛋白搜索。Motif_scan軟體(http//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif scan)、PROSITE軟體(http//au.expasy.org/prosite/)、InterproScan綜合分析軟體(http//www.ebi.ac.uk/InterProScan/)及CDD等在線分析軟體用於分析編碼蛋白(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)的結構功能域。
3.結果3.1.差異表達基因的ESTs測序晶片雜交後，根據雜交結果選擇差異表達克隆測ESTs序列。利用NCBI的Blast進行基因序列的同源性搜索，獲得一序列與資料庫中已有序列無顯著同源性(Score值＜50bits)，為血吸蟲新基因序列，命名為1ZD11基因。
3.2.RACE擴增1ZD11全長基因序列及序列分析經3′、5′RACE對1ZD11ESTs片段分別向3′及5′方向延伸，獲得1ZD11基因的全長序列，見序列1。DNA序列分析表明該基因(1ZD11)的開放閱讀框含261bp的序列，推測編碼86個胺基酸的蛋白質，理論分子量為9.9249ku，等電點為7.77，為中性蛋白。有5個抗原位點，具有信號肽，推測信號肽裂解位點在24-25位胺基酸之間，具有1個典型疏水性區域，無跨膜結構。具有1個蛋白激酶C磷酸化位點，在23-82位間胺基酸與多花文昌魚的Wnt7b蛋白具有34％的同源性，與人的Wnt7a蛋白具有33％的同源性。
3.3.1ZD11編碼區的基因克隆的PCR及酶切鑑定如圖1、圖2所示，經酶切及PCR鑑定，重組子插入片段約250bp，與1ZD11編碼區長度相符，表明已獲得1ZD11編碼區基因的陽性克隆。
3.4.核苷酸序列測定經過PCR和酶切鑑定為陽性的重組質粒，以Sangers雙脫氧核糖核酸末端終止法測序，序列結果見序列3。
序列表SEQUENCE LISTING110中國農業科學院上海家畜寄生蟲病研究所農業部動物寄生蟲學重點開放實驗室上海動物生物技術研究中心120日本血吸蟲1ZD11基因的克隆130說明書 權利要求書1603170PatentIn version 3.12101211655212DNA213日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的基因序列220
221CDS222(25)..(282)223
4001ctccaataag ccaaaattaa aaca atg tta agt aca gcc tgc aaa gtc ctc 51Met Leu Ser Thr Ala Cys Lys Val Leu1 5atc gca tca ttg att gtt tca ttc atg ata tct caa atg gcg tgt aat99Ile Ala Ser Leu Ile Val Ser Phe Met Ile Ser Gln Met Ala Cys Asn10 15 20 25tcg aat tgt cca tgt gaa aat cga gat tgt gat aag tat tgc ttc aaa 147Ser Asn Cys Pro Cys Glu Asn Arg Asp Cys Asp Lys Tyr Cys Phe Lys30 35 40cag ggt tac gat aac tgt cac cca ttc ttt cca tgg caa ttt agt tta 195
Gln Gly Tyr Asp Asn Cys His Pro Phe Phe Pro Trp Gln Phe Ser Leu45 50 55aaa cta aaa cga tgc gat gac tgc ttc aca agc tgc tta aat aaa acc 243Lys Leu Lys Arg Cys Asp Asp Cys Phe Thr Ser Cys Leu Asn Lys Thr60 65 70caa acc ata tgc ttg gaa aaa acg aaa gaa ttg tgc cag tgatgtaagt292Gln Thr Ile Cys Leu Glu Lys Thr Lys Glu Leu Cys Gln75 80 85ggtatgccgg accactagag aatagtaaca aactatcaga actgtgttgt tgaacactat 352ttcaattatt ttaactgtgg ataatttgaa catttcattt caatgattgt aacgcttctc 412ttacactatc cttccaagtt tttatgtatt cttattatgc tgtcacttac aatgaactac 472aattcactgg ttgtgtacaa gtaatctcta ttcactgaca ctattttctt tgttctgttt 532taatgataat ttcctaattg gtatgctgtg ttgtctgctt tgatataaat acaaacgaat 592gtttgaaata taatcaaatt ctgtctgttc gctctataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 652aaa 655210221186212PRT213日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的基因序列4002Met Leu Ser Thr Ala Cys Lys Val Leu Ile Ala Ser Leu Ile Val Ser1 5 10 15Phe Met Ile Ser Gln Met Ala Cys Asn Ser Asn Cys Pro Cys Glu Asn20 25 30
Arg Asp Cys Asp Lys Tyr Cys Phe Lys Gln Gly Tyr Asp Asn Cys His35 40 45Pro Phe Phe Pro Trp Gln Phe Ser Leu Lys Leu Lys Arg Cys Asp Asp50 55 60Cys Phe Thr Ser Cys Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ile Cys Leu Glu Lys65 70 75 80Thr Lys Glu Leu Cys Gln852103211655212DNA213日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的核苷酸序列4003ctccaataag ccaaaattaa aacaatgtta agtacagcct gcaaagtcct catcgcatca 60ttgattgttt cattcatgat atctcaaatg gcgtgtaatt cgaattgtcc atgtgaaaat 120cgagattgtg ataagtattg cttcaaacag ggttacgata actgtcaccc attctttcca 180tggcaattta gtttaaaact aaaacgatgc gatgactgct tcacaagctg cttaaataaa 240acccaaacca tatgcttgga aaaaacgaaa gaattgtgcc agtgatgtaa gtggtatgcc 300ggaccactag agaatagtaa caaactatca gaactgtgtt gttgaacact atttcaatta 360ttttaactgt ggataatttg aacatttcat ttcaatgatt gtaacgcttc tcttacacta 420tccttccaag tttttatgta ttcttattat gctgtcactt acaatgaact acaattcact 480ggttgtgtac aagtaatctc tattcactga cactattttc tttgttctgt tttaatgata 540atttcctaat tggtatgctg tgttgtctgc tttgatataa atacaaacga atgtttgaaa 600tataatcaaa ttctgtctgt tcgctctata aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 65權利要求
1.一種編碼日本血吸蟲中國大陸株1ZD11基因的核苷酸序列，其特徵在於它具有序列1的核苷酸序列及相應的胺基酸序列。
2.一種如權利要求1所述的日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的核苷酸序列的篩選方法，其特徵在於以日本血吸蟲尾蚴為實驗組，成蟲為驅動組，構建日本血吸蟲尾蚴消減質粒文庫，由消減文庫隨機挑克隆定製cDNA微陣列，經cDNA微陣列雜交分析後再挑選克隆測序，獲得了1ZD11基因的表達序列標籤。
3.一種如權利要求1所述的日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的核苷酸序列的克隆方法，其特徵在於獲得日本血吸蟲1ZD11基因完整ORF的核苷酸序列，所設計的引物有下列核苷酸序列Upper5′TTGGATCCATGTTAAGTACAGCCTGC 3′Lower5′CTCTCGAGTCACTGGCACAATTCTTTC 3′。
4.一種如權利要求1所述的日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的完整ORF具有序列3的核苷酸序列。
全文摘要
本發明提供了日本血吸蟲(中國大陸株)1ZD11基因的基因序列篩選方法和克隆。本發明應用抑制性雜交技術，以日本血吸蟲尾蚴為實驗組，成蟲為驅動組，構建了尾蚴消減質粒文庫，由該文庫挑選克隆定製cDNA微陳列，經雜交分析，獲得一批在尾蚴和成蟲間差異表達的cDNA克隆。
文檔編號C07K14/44GK1940071SQ20051003020
公開日2007年4月4日 申請日期2005年9月29日 優先權日2005年9月29日
發明者苑純秀, 林矯矯, 陸珂, 馮新港, 傅志強, 劉金明, 蔡幼民 申請人:中國農業科學院上海家畜寄生蟲病研究所, 農業部動物寄生蟲學重點開放實驗室, 上海動物生物技術研究中心