鏈黴菌及其在防治十字花科根腫病中的應用的製作方法

2023-06-14 14:20:36

專利名稱：鏈黴菌及其在防治十字花科根腫病中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物農藥技術領域，具體是指一種鏈黴菌及其在防治十字花科根腫病中的應用。
背景技術：
十字花科根腫病(plasmodiophoa brassicae Woron)是一種世界性土傳病害，致病菌為芸苔根腫菌，屬於一種專性寄生低等鞭毛菌(也有學者將其歸入粘菌)，目前尚無法人工培養。主要危害十字花科蔬菜如:大白菜、甘藍、蘿蔔等。其病菌以孢子囊在土壤或未腐熟的廄肥中越冬越夏，對不良環境抵抗力強，一般能存活十年以上。田間最初侵染源來自土壤和未腐熟的廄肥帶菌。病菌又可隨菜苗、泥土攜帶傳播到無病區。病菌從菜苗的幼根或根毛侵入，並刺激根部細胞加速分裂，造成根部畸形腫大，導致植株輸導組織受阻，地上部生長緩慢，葉片萎蔫，重者根部腐爛，植株死亡。近年，根腫病在湖北、雲南、四川、貴州、浙江、福建等地高山十字花科蔬菜種植區發生嚴重，已成為制約我國高山大白菜、甘藍、蘿蔔反季節生產的主要因素之一，其中尤以大白菜、甘藍受害最重，嚴重地塊甚至絕收，每畝損失3000元以上。目前，防治十字花科根腫病常用方法主要包括撒石灰調節土壤pH、輪作、種植抗病品種等，但由於存在土壤板結、經濟效益差、不耐儲運等缺點，上述措施均未大面積推廣。常規殺菌劑有多菌靈、福美雙、代森錳鋅等，但防效均不明顯，防效表現較好的是日本石原株式會社的50%氟啶胺SC與10%氰霜唑SC組合，但由於抑制種子萌發及使用成本高昂(每畝近400元)等原因，也尚未得到大面積推廣應用。關於十字花科根腫病生物農藥在真菌、放線菌、芽孢桿菌等方面均有一定的研究報導，並且取得了一定的成績，如日本研究者將大白菜播種在從麥田、油菜田、白菜地及草地採回的土壤中，從大白菜根中分離得到大量內生真菌，通過盆栽試驗篩選獲得2株內生真菌(Heteroconium chaetospira)H4007,M4006,病指分別為23，15， 顯著高於其他屬種處理及空白對照，通過種子處理顯示有促生作用；有研究者利用(Phoma glomerata) JCM 9972有效控制根腫病的發生；也有國外研究者通過溫室和田間試驗得到可抑制根腫病菌的3個木黴菌株(TC32，TC45和TC63)和I個鏈黴菌菌株(S99);韓國研究人員從大白菜根部分離獲得81株內生放線菌，通過大白菜根腫病盆栽試驗，獲得3株具有開發潛力的內生放線菌,其中2株(Microbispora rosea)和(subsp.rosea)防效分別為 58% 和 33%, I 株(Streptomyces olivochromogenes)防效達 42% ;我國四川農大研究人員從四川根際土中分離出I株灰紅鏈黴菌(Streptomyces griseoruber),其對大白菜根腫病盆栽實驗防效達到73.69%;何月秋等研究人員從大白菜根際土壤中分離到I株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XF-l，其對根腫病的室內防效達85%，田間防效達68.6^84.8% ;長江大學將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)與固氮類芽孢桿菌(Paenibacillus azotofixans)用於根腫病綜合防治，防效達到85%。鏈黴菌具有抗生作用，還具有可田間定殖等作為生物農藥予以開發的優點。美國環境保護署美國環保局2012年公布了 I項瘡痂鏈黴菌(Streptomyces acidiscabies)RL-1lO用於除草的生物農藥研究計劃。全球已登記在冊的鏈黴菌農藥共有6種，登記國家和地區分別為韓國、歐盟、烏克蘭、加拿大、美國，具體為(Streptomyces colombiensis)(韓國)、(Streptomyces kasugaensis)(韓國)、(Streptomyces griseoviridis)K61 (歐盟、力口拿大、美國)、(Streptomyces albus)(烏克蘭)、(Streptomyces avermitilis)(烏克蘭)、(Streptomyces lydicus) WYEC 108 (加拿大、美國)，防治對象主要為真菌病害包括葉部病害與土傳性病害(其中S.avermitilis用於防治甲蟲與葉蟎)。但截至目前，尚無防治十字花科根腫病的鏈黴菌農藥登記。

發明內容
本發明的目的之一是要提供一種具有防治十字花科根腫病用途的鏈黴菌，該鏈黴菌包括瘡痂鏈黴菌(Sti ^ptomyces scabiei ) WS-24926 CCTCC NO:M 2012393 和 / 或尖孢鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus)WS_29246 CCTCC NO:M 2012413。本發明所提供的瘡痂鏈黴菌(Streptomyces scabiei)WS_24926已於2012年10月10日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC);保藏登記號為CCTCC M 2012393 ;保藏地點為:中國、武漢、武漢大學。尖抱鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus)WS_29246 已於 2012 年 10 月 18 日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC);保藏登記號為CCTCC M 2012413，保藏地點為:中國、武漢、武漢大學。所述瘡痂鏈黴菌(Streptomyces scabiei) WS-24926是從湖南瀏陽遠郊植物根際土壤中分離得到的。綜合瘡痂鏈黴菌(Streptomyces scabiei)WS_24926的形態學特徵、生理生化特性和16S rDNA序列分析的結果，將其鑑定為瘡痂鏈黴菌。具體鑑定結果如下:( I)菌體的形態特徵瘡痂鏈黴菌(Streptomyces scabiei) WS-24926菌株在ISP-2固體培養基上，菌落乾燥、表面不光滑，有突起，淺灰色；孢子多，鏈狀，短棍狀，大小(長1.5 μ m-2 μ m，寬
0.6 μ m-0.8 μ m)，灰色，氣絲乳白色或灰色，有螺旋孢子絲產生；色素不明顯；在察氏固體培養基上無色素產生，氣絲及孢子堆白色，基絲無色。在天門冬素固體培養基上培養基絲黃色，氣絲及孢子堆灰白色，無色素產生。(2)生理生化特性不產生黑色素，能利用糊精、吐溫40、L 一阿拉伯糖、D-木糖、琥珀酸單甲酯、丙酮酸、丙二醇、D-核糖、D-L-α -憐酸甘油。不能利用:吐溫80、α _環糊精、糖原、甘露聚糖、D-阿拉伯糖、D-果糖、D-纖維二糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露醇、a -D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、麥芽糖、乳果糖、D-甘露糖、L-丙氨酸、D-丙氨酸、琥珀酸、L-丙氨醯甘氨酸、L-丙氨酸胺、L-穀氨酸、腺苷、肌苷、胸苷、L-鼠李糖、尿苷、蔗糖、水楊苷、6-磷酸-D-果糖、6-磷酸-D-葡萄糖。(3) 16SrDNA 序列分析瘡痂鏈黴菌(Streptomyces scabiei)WS_24926菌株經PCR技術,DNA測序儀分析，該菌株的16SrDNA序列由1391個鹼基組成。用BLAST程序對瘡痂鏈黴菌(Sti^ptomycesscabiei) WS-24926的16SrDNA序列和GenBank中已登錄的16SrDNA序列進行核昔酸同源性比較，結果與已報導的瘡痂鏈黴菌(S.scabiei) ATCC 49173 (T)(登錄號AB026199)的16SrDNA序列同源性達到100%，鑑定其為瘡痂鏈黴菌。所述尖孢鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus) WS-29246是從安徽嶽西遠郊植物根際土壤中分離得到的。綜合尖孢鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus)WS_29246的形態學特徵、生理生化特性和16SrDNA序列分析的結果，將其鑑定為尖孢鏈黴菌。具體鑑定結果如下:(I)菌體的形態特徵尖抱鏈黴菌(Streptomycescuspidosporus)WS_29246 在 ISP-2 固體培養基上，菌落乾燥、表面不光滑，有突起，有褶皺，乳白色或微黃色，有螺旋狀孢子絲，2-5圈不等；基絲黃褐色，無分隔，不斷裂，呈波浪型，多分枝，直徑0.4 μ m-0.6 μ m。在察氏固體培養基上無色素產生，菌落表面光滑，不產孢。在PDA培養基上產生朽1檬黃色素。(2)生理生化特性不產生黑色素，利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇、D-甘露醇以及D-半乳糖、乳糖、甘露糖、蜜二糖、海藻糖、D-麥芽糖、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉。(3) 16SrDNA 序列分析尖抱鏈黴菌(Streptomycescuspidosporus) WS-29246 經 PCR 技術，DNA 測序儀分析，獲得該菌株的16S rDNA序列，然後用BLAST程序對尖孢鏈黴菌(Str印tomycescuspidosporus)WS_29246的16S rDNA序列和GenBank中已登錄的16S rDNA序列進行核苷酸同源性比較，結果與已報導的尖孢鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus)的16S rDNA序列同源性達到100%,鑑定其為尖孢鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus)。所述瘡痂鏈黴菌(Streptomyces scabiei) WS-24926和所述尖孢鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus) WS-29246採用液體發酵培養,其使用的培養基如下:(I)斜面培養基:培養基配方如下:稱取麥芽提取物:1.(Γ2.0g/L，可溶性澱粉:0 5g/L，酵母提取物:0.4 1.0g/L,葡萄糖:0 2.0g/L,蔗糖:0 2.0g/L,瓊脂:1.5 2.0g/L,pH 值 7.0 8.0,定容至 IOOOmL0(2)種子培養基:甘露醇:l(T20g/L，大豆蛋白腖:5 20g/L，魚粉:(T5.0g/L，豆油:
0.5 5.0g/L, K2HPO4:0.15 0.5g/L, CaCO3:0.Γθ.4g/L, pH 值 7.0 8.0,定容至 IOOOmL0(3)發酵培養基:葡萄糖:2 8g/L，葡萄糖:2 8g/L，可溶性澱粉:5 10g/L，大豆粉:(Tl0g/L，棉子粉:0 25g/L，酵母提取物:1 3g/L，CaCO3:2 5g/L，NaCl:2 5g/L，pH 值
7.0 8.0，定容至 IOOOmL0培養流程:(I)將所述瘡痂鏈黴菌(Streptomyces scabiei) WS-24926和所述尖孢鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus) WS-29246菌種分別接種試管斜面培養基上，在溫度28 ± I °C條件下，活化培養5d;(2)將活化的菌種接種至種子培養基中，在溫度28±1°C的搖床內培養3 4d ；(3)將步驟2)中培養的菌種接種到發酵培養基中，在溫度28±1°C的條件下發酵培養3 4d。

本發明提供了所述鏈黴菌在防治十字花科根腫病中的應用。本發明還提供了所述鏈黴菌製備而成的防治十字花科根腫病的生防懸浮劑及其製備方法。所述生防懸浮劑按重量百分比由1(Γ80%的發酵菌液、0.4 10%的分散劑、0.5^5%的乳化劑、0.Γ10%的增稠劑、0.Γ10%的防腐劑、(Γ3.0%的消泡劑、(Γ10.0%的防凍劑和餘量的水組成，其中，所述發酵菌液是由所述鏈黴菌發酵得到的菌液。進一步地，所述分散劑選用木質素磺酸鈉、木質素磺酸鈣、萘磺酸鈉甲醛縮合物、脂肪醯胺-N-甲基牛磺酸鹽、烷基磺基琥珀酸鈉鹽、二丁基萘磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、多芳基酚聚氧乙烯醚和乙二胺四乙酸鹽中的任選一種或者幾種；所述乳化劑為烷基苯磺酸鹽、烷基醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、山梨酸酯和多元醇脂肪酸酯中任選一種或者幾種；所述增稠劑選用黃原膠、明膠、阿拉伯膠、瓜膠、海藻酸鈉、可溶性澱粉、雜多糖、羧甲基纖維素鈉、羧乙基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚丙烯酸胺、尿素、矽酸鎂鋁、二氧化矽、硅藻土、膨潤土和凹凸棒任選一種或者幾種；所述防腐劑選用苯甲酸鈉、山梨酸鉀和對羥基苯甲酸乙酯任選一種或者幾種；所述防凍劑為乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇中的任選一種或者幾種；所述的消泡劑為異辛醇、異戊醇、硬脂酸、月桂酸、聚乙二醇醚和有機矽中任選一種或者幾種。所述生防懸浮劑的製備方法，包括以下步驟:I)將所述鏈黴菌發酵得到的發酵液，在400(Tl0000r/min條件下離心5 20min,得到發酵菌液；2)按照所述重量百分比將所述發酵菌液、分散劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、消泡齊U、防凍劑和餘量的水混合均勻，得到混合物料；3)將混合物料剪切分散均勻後，研磨至90%以上物料粒度度達到5Mm以下，攪拌均勻，調節PH至4.(Γ5.0,即得到生防懸浮劑。實驗表明:本發明的生防懸浮劑對十字花科根腫病田間試驗防治效果達55 80%，其盆栽試驗防治效果為75 90%，高於氟啶胺與氰霜唑等對照藥劑。

本發明的生防懸浮劑使用方法為:噴霧法:移栽前採用噴霧法進行土壤處理，按畝用所述懸浮劑1000 2000mL的使用量將所述懸浮劑稀釋5(Γ200倍噴霧使用f 2次。灌根法:移栽時採用灌根法處理，將懸浮劑稀釋5(Γ200倍，按每株灌根所述稀釋後的懸浮液5(Tl00mL，畝用所述懸浮劑劑量為100(T3000mL，整個生長期灌根廣3次。本發明還提供了一種所述鏈黴菌製備而成的防治十字花科根腫病的生防緩釋膠囊劑及其製備方法。所述生防緩釋膠囊劑包括包括廣3份重量的發酵菌液、f 3份重量的阿拉伯膠或者海藻膠、Γ3份重量的明膠或者羧甲基纖維素鈉，其中，所述發酵菌液是由所述鏈黴菌發酵得到的菌液。所述生防緩釋膠囊劑的製備方法:包括以下步驟:I)先將所述鏈黴菌發酵得到的發酵液，在400(Tl0000r/min條件下離心5 20min,
得到發酵菌液，取f 3份重量的發酵菌液加入反應容器；2)其次，取f 3份重量的明膠或者羧甲基纖維素鈉加水配置成重量百分比為3 8%的水溶液後，加入反應容器，並用醋酸溶液調節反應物的PH值至3飛；3)再次，取f 3份重量的阿拉伯膠或者海藻膠加水配製成重量百分比為2 8%的水溶液後，加入然應容器，繼續攪拌l(T30min ；4)然後，向反應容器中中加入甲醛水溶液固化囊壁，繼續攪拌l(T30min，即得微膠囊水溶液；
5)最後，將得到微膠囊水溶液離心處理後噴霧乾燥後即可獲得生防緩釋膠囊劑。實驗證明:本發明的生防緩釋膠囊劑，對大白菜根腫病田間防效為65 80%，田間使用技術為大白菜或者甘藍移栽時每穴撒施2g生防緩釋膠囊劑。


圖1為瘡痂鏈黴菌(Streptomyces scabiei) WS-24926在ISP-2固體培養基上菌落形態。圖2 為尖抱鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus) WS-29246 在 ISP-2 上的菌落形態。
具體實施例方式為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例和說明書附圖對本發明的鏈黴菌及其在防治十字花科根腫病中的應用作進一步詳細說明。實施例1瘡痂鏈黴菌(Streptomyces scabiei) WS-24926及尖孢鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus) WS-29246 菌株的分離、篩選取土樣，採用常規法進行分離、純化和保存。我們從土壤中共分離出30000株放線菌，採用先導化合物活性追蹤的辦法，結合HPLC-MS天然產物化合物資料庫，選擇相對低毒、易培養具有產業化趨勢的109株放線菌，通過大白菜根腫病盆栽試驗及田間試驗，實驗結果見表I。最終確定WS-24926及WS-29246最優，其病情指數最小，校正防效分別為95%和 79%。盆栽試驗實施步驟:將各供試菌株菌種活化後，採用二級搖瓶發酵法，初級搖瓶發酵採用種子培養基，培養溫度 為28°C，150rpm，二級發酵採用發酵培養基，接種量為5 10%，培養條件28°C，轉速150rpm，培養時間4 6d，裝液量每500mL三角瓶中裝入培養液100mL。每菌株培養5瓶，每瓶裝IOOmL發酵培養基。採用穴盤培養大白菜健康苗，長至2 3片真葉期供實驗用。盆栽試驗採用菌土法接種，將收集的大白菜根腫切碎與盆栽土按1:100 (v/v)混合均勻，裝入花缽(Φ ±=15cm, Φ T =IOcm, h=13cm)中供實驗用。移栽時，灌入各菌株搖瓶發酵液，每缽IOOmL,之後每隔IOd灌根I次，每次IOOmL,整個生長期共灌根4次。結果顯示WS-24926及WS-29246對大白菜根腫病的防治效果最好，校正防效分別為95%和79%。根腫病分級標準:O級:沒有附著根腫；I級:根腫附著在側根上，數量佔f 25% ；2級:主根上有根腫附著，側根上根腫數量佔25%以上；3級:根腫數量佔5(Γ75% ;主根上有根腫附著；4級:主根上有根腫附著，根腫數量佔75%以上的根系。計算公式:
權利要求
1.一種鏈黴菌，包括瘡痂鏈黴菌(Sti^ptomyces scabiei ) WS-24926 CCTCC NO:M 2012393 和 / 或尖孢鏈黴菌(Sti^ptomyces cuspidosporus) WS-29246 CCTCC NO:M2012413。
2.—種權利要求1所述鏈黴菌在防治十字花科根腫病中的應用。
3.一種利用權利要求1所述鏈黴菌製備而成的防治十字花科根腫病的生防懸浮劑，其特徵在於:所述生防懸浮劑按重量百分比由1(Γ80%的發酵菌液、0.riO%的分散劑、0.5^5%的乳化劑、0.riO%的增稠劑、0.riO%的防腐劑、(Γ3.0%的消泡劑、(Γ10.0%的防凍劑和餘量的水組成，其中，所述發酵菌液是由所述鏈黴菌發酵得到的菌液。
4.一種利用權利要求1所述鏈黴菌製備而成的防治十字花科植物根腫病的生防緩釋膠囊劑，其特徵在於:所述生防緩釋膠囊劑包括f 3份重量的發酵菌液、f 3份重量的阿拉伯膠或者海藻膠、Γ3份重量的明膠或者羧甲基纖維素鈉，其中，所述發酵菌液是由所述鏈黴菌發酵得到的菌液。
5.根據權利要求3所述的生防懸浮劑，其特徵在於:所述分散劑為木質素磺酸鈉、木質素磺酸鈣、萘磺酸鈉甲醛縮合物、脂肪醯胺-N-甲基牛磺酸鹽、烷基磺基琥珀酸鈉鹽、二丁基萘磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、多芳基酚聚氧乙烯醚和乙二胺四乙酸鹽中的任選一種或者幾種；所述乳化劑為烷基苯磺酸鹽、烷基醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、山梨酸酯和多元醇脂肪酸酯中任選一種或者幾種；所述增稠劑為黃原膠、明膠、阿拉伯膠、瓜膠、海藻酸鈉、可溶性澱粉、雜多糖、羧甲基纖維素鈉、羧乙基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚丙烯酸胺、尿素、矽酸鎂鋁、二氧化矽、硅藻土、膨潤土和凹凸棒任選一種或者幾種；所述防腐劑為苯甲酸鈉、山梨酸鉀和對羥基苯甲酸乙酯任選一種或者幾種；所述的消泡劑為異辛醇、異戊醇、硬脂酸、月桂酸、聚乙二醇醚和有機矽中任選一種或者幾種；所述防凍劑為乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇中的任選一種或者幾種。
6.一種權利要 求3所述生防懸浮劑的製備方法，其特徵在於，它包括以下步驟: 1)將所述鏈黴菌發酵得到的發酵液，在400(Tl0000;r/min條件下離心5 20min,得到發酵菌液； 2)按照所述重量百分比將所述發酵菌液、分散劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、消泡劑、防凍劑和餘量的水混合均勻，得到混合物料； 3)將混合物料剪切分散均勻後，研磨至90%以上物料粒度度達到5Mm以下，攪拌均勻，調節PH至4.(Γ5.0,即得到生防懸浮劑。
7.—種權利要求4所述生防緩釋膠囊劑的製備方法，其特徵在於，它包括以下步驟: 1)先將所述鏈黴菌發酵得到的發酵液，在400(Tl0000;r/min條件下離心5 20min,得到發酵菌液，取廣3份重量的發酵菌液加入反應容器； 2)其次，取f3份重量的明膠或者羧甲基纖維素鈉加水配置成重量百分比為3 8%的水溶液後，加入反應容器，並用醋酸溶液調節反應物的PH值至3飛； 3)再次，取f3份重量的阿拉伯膠或者海藻膠加水配製成重量百分比為2 8%的水溶液後，加入然應容器，繼續攪拌l(T30min ； 4)然後，向反應容器中加入甲醛水溶液固化囊壁，繼續攪拌l(T30min，即得微膠囊水溶液； 5)最後，將得到微膠囊水溶液離心處理後噴霧乾燥處理，即可獲得生防緩釋膠囊劑。
全文摘要
本發明公開了一種鏈黴菌及其在防治十字花科根腫病中的應用，該鏈黴菌菌種包括瘡痂鏈黴菌(Streptomyces scabiei)WS-24926 CCTCC NOM 2012393和/或尖孢鏈黴菌(Streptomyces cuspidosporus)WS-29246 CCTCC NOM 2012413。所述鏈黴菌經過發酵後產生具有強烈抑菌作用的發酵菌液，該發酵菌液可用於製備抗植物十字花科根腫病的生防懸浮劑和生防緩釋膠囊劑，用於十字花科根腫病的生物防治。
文檔編號A01N25/04GK103173385SQ20131004974
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月7日 優先權日2013年2月7日
發明者龍同, 萬中義, 王開梅, 楊自文, 曹春霞, 張志剛, 張亞妮, 閔勇, 廖先清, 方偉, 江愛兵, 朱志剛, 姚經武, 張遵霞 申請人:湖北省生物農藥工程研究中心