包含腫瘤抗原和佐劑組合物的疫苗組合物的製作方法

2023-06-14 10:22:21

專利名稱：包含腫瘤抗原和佐劑組合物的疫苗組合物的製作方法
本申請為分案申請，原申請的申請日為2000年4月4日，申請號為200510109698.1，發明名稱為「包含皂甙和免疫刺激寡核苷酸的佐劑組合物」。
本發明涉及用於疫苗的新型佐劑組合物。具體來說，本發明佐劑組合物包含組合的皂甙和免疫刺激寡核苷酸，所述組合還任選包含載體。本發明還提供包含本發明佐劑組合物和至少一種抗原的疫苗。還提供生產本發明佐劑組合物和疫苗的方法及其用作藥物的用途。此外，本發明提供通過胃腸外或黏膜給予本發明疫苗治療疾病易感個體或患病個體的方法。
本領域已知含未甲基化的CpG二核苷酸(「CpG」)的免疫刺激寡核苷酸當通過系統和黏膜途徑給予時用作佐劑(WO 96/02555，EP468520，Davis等，J.Immunol，1998，160(2)870-876；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1998，161(9)4463-6)。CpG是DNA中存在的胞嘧啶-鳥苷二核苷酸基元的縮寫。從前觀測到BCG的DNA部分能夠發揮抗腫瘤作用。在進一步的研究中，證實得自BCG基因序列的合成寡核苷酸能夠誘導免疫刺激作用(在體外和體內)。這些研究的作者的結論是某些迴文序列，包括中央的CG基元，具有這種免疫刺激活性。後來，Krieg在Nature 374，p5461995中發表文章闡明了CG基元在免疫刺激中的主要作用。詳細的分析證實，CG基元必須處於一定的序列環境中，而且這種序列是細菌DNA中的常見序列，但是在脊椎動物DNA中非常罕見。免疫刺激序列通常為嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中所述二核苷酸CG基元是未甲基化CG基元，但是已知其它未甲基化CpG序列是免疫刺激序列而且可用於本發明。
在所述6個核苷酸的某些組合中存在迴文序列。在同一個寡核苷酸中可存在若干個這種基元，或者為重複的一個基元或組合的不同基元。含一個或多個這樣的免疫刺激序列的寡核苷酸可激活不同免疫亞組細胞，包括天然殺傷細胞(它產生γ幹擾素而且具有裂解細胞活性)和巨噬細胞(Wooldrige等，第89卷(第8期)，1977)。儘管目前證實不具有該共有序列的含其它未甲基化CpG的序列是免疫調節序列。
當CpG配製成疫苗時，一般以自由溶液和自由抗原一起(WO96/02555；McCluskie和Davis，同上)或者與抗原共價結合(PCT公布號WO 98/16247)或者用載體如氫氧化鋁配製後((肝炎表面抗原)Davis等，同上；Brazolot-Millan等，Proc.Natl.bcad.Sci.，USA，1998，95(26)，15553-8)給予。
在Lacaille-Dubois，M和Wagner H(1996，關於皂甙的生物和藥理活性的綜述。Phytomedicine第2卷第363-386頁)中介紹了皂甙。皂甙是廣泛分布於植物和海洋動物的類固醇糖苷或三萜烯糖苷。皂甙因為形成膠體水溶液以及沉澱膽固醇而引起人們的注意，所述膠體水溶液振蕩時形成泡沫。當皂甙接近細胞膜時，它們在膜上形成孔樣結構，引起細胞膜破裂。紅細胞溶血就是這種現象的一個實例，它是某些皂甙但是不是所有皂甙的一個特性。
已知皂甙用作系統給予疫苗的佐劑。本領域深入研究了各種皂甙的佐劑活性和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner，同上)。例如US5,057,540和「皂甙用作疫苗佐劑」，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther DrugCarrier Syst，1996，12(1-2)1-55和EP 0362279B1介紹了Quil A(從南美洲的樹Quillaja Saponaria Molina樹皮分離製得)及其部分。包含QuilA部分的顆粒結構稱為免疫刺激複合物(ISCOMS)，它具有溶血活性，而且已經將其用於生產疫苗(Morein，B.，EP 0 109 942 B1)。據報導這些結構具有佐劑活性(EP 0 109 942 B1；WO 96/11711)。
溶血性皂甙QS21和QS17(HPLC純化的Quil A部分)被描述為有效系統佐劑，美國專利號5,057,540和EP 0 362 279 B1公開了其生產方法。這兩種參考文獻還介紹了用作系統疫苗有效佐劑的QS7(Quil-A的非溶血性部分)的作用。Kensil等(1991，J.Immunology第146卷，431-437)還介紹了QS21的作用。QS21和聚山梨酯或環糊精的組合是已知的(WO 99/10008)。WO 96/33739和WO 96/11711介紹了包含部分Quil A如QS21和QS7的顆粒性佐劑系統。
用於系統免疫接種研究的其它皂甙包括得自其它植物種如絲石竹屬(Gypsophila)和肥皂草屬(Saponaria)的皂甙(Bomford等，Vaccine，10(9)572-577，1992)。
此外，已知皂甙用於黏膜用疫苗研究，它在誘導免疫反應方面獲得了不同程度的成功。以前證實，當鼻內給予抗原時，Quil-A皂甙對誘導免疫反應沒有作用(Gizurarson等1994，Vaccine Research 3，23-29)。而部分其他作者應用這種佐劑獲得了成功(Maharaj等，Can.J.Microbiol，1986，32(5)414-20；Chavali和Campbell，Immunobiology，174(3)347-59)。在胃腸道和鼻內疫苗製劑中使用了包含Quil A皂甙的ISCOM，顯示它具有佐劑活性(McI Mowat等，1991，Immunology，72，317-322；McI Mowat和Donachie，Immunology Today，12，383-385)。
QS21為Quil A的無毒性部分，還介紹它用作口服或鼻內給藥的佐劑(Sumino等，J.Virol.，1998，72(6)4931-9；WO 98/56415)。
已有關於其它皂甙在鼻內免疫接種研究中應用的介紹。例如昆諾藜(Chenopodium quinoa)皂甙既用於鼻內疫苗，又用於胃腸道疫苗(Estrada等，Comp.Immunol.Microbiol.Infect.Dis.，1998，21(3)225-36)。
本發明涉及令人驚奇的發現，即免疫刺激寡核苷酸(CpG)和皂甙組合是極其有效的佐劑。因此，本發明提供包含組合的皂甙和免疫刺激寡核苷酸的佐劑組合物。最好是本發明的佐劑還包含載體。在一個優選形式的本發明中，所述佐劑和疫苗組合物中的皂甙和寡核苷酸在誘導抗原特異性抗體中協同作用，而且強力誘導通常與Th1型免疫系統有關的免疫反應。因此，所述佐劑組合不僅適用於免疫預防疾病，而且令人驚奇地免疫治療疾病，例如持續病毒、細菌或寄生蟲感染，此外還適用於慢性病症如癌症。
用於本發明佐劑或疫苗的優選寡核苷酸優選包含2個或2個以上二核苷酸CpG基元，這些基元被至少3個、更優選至少6個或更多核苷酸間隔開。本發明寡核苷酸通常為脫氧核苷酸。在一個優選實施方案中，所述寡核苷酸中的內部核苷酸為二硫代磷酸酯、或更優選為硫代磷酸酯鍵，儘管磷酸二酯和其它內部核苷酸鍵屬於本發明範疇，包括具有混合內部核苷酸鍵的寡核苷酸。US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204介紹了生產硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法。
優選寡核苷酸實例具有以下序列。所述序列優選包含硫代磷酸酯修飾的內部核苷酸鍵。
OLIGO 1(SEQ ID NO1)TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG1826)OLIGO 2(SEQ ID NO2)TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)OLIGO 3(SEQ ID NO3)ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGCACC ACGOLIGO 4(SEQ ID NO4)TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTCGTT(CpG 2006)OLIGO 5(SEQ ID NO5)TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG1668)替代CpG寡核苷酸可包含以上優選序列，因為其中含有不重要的缺失或添加。可用本領域已知的任何方法(例如EP 468520)合成用於本發明的CpG寡核苷酸。通常可應用自動合成儀合成這樣的寡核苷酸。
用於本發明的寡核苷酸通常為脫氧核苷酸。在一個優選實施方案中，所述寡核苷酸中的內部核苷酸鍵是二硫代磷酸鍵、或更優選硫代磷酸鍵，儘管磷酸二酯鍵屬於本發明範疇。設計了包含不同內部核苷酸鍵的寡核苷酸，例如混合的硫代磷酸酯磷酸二酯。可使用穩定所述寡核苷酸的其它內部核苷酸鍵。
可用於本發明佐劑組合的皂甙包括得自皂樹(Quillaja SaponariaMolina)樹皮的稱為Quil A的皂甙及其部分，它們介紹於US 5,057,540和「用作疫苗佐劑的皂甙」，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug CarrierSyst，1996，12(1-2)1-55和EP 0 362 279 B1中。特別優選的Quil A部分為QS21、QS7和QS17。
β-七葉素是另一種用於本發明佐劑組合物的優選溶血性皂甙。默克索引(Merck index)(第12版，條目3737)介紹的七葉素為歐洲七葉樹(Aesculus hippocastanum)種子中天然存在的皂甙混合物。據介紹，其分離方法為層析法(Fiedler，Arzneimittel-Forsch，4，213(1953))，其純化方法為離子交換樹脂層析(Erbring等，US 3,238,190)。純化獲得了七葉素α和七葉素β部分，而且證實它們具有生物活性(Yoshikawa M，等(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996年8月；44(8)1454-1464))。β-七葉素也稱為七葉素。
用於本發明的另一種優選溶血性皂甙為洋地黃皂甙。默克索引(第12版，條目3204)將洋地黃皂甙描述為皂甙，洋地黃皂甙得自紫花洋地黃(Digitalis purpurea)的種子，而且按照Gisvold等，J.Am.Pharm.Assoc.，1934，23，664和Ruhenstroth-Bauer，Physiol.Chem.，1955，301，621介紹的方法純化。據介紹，其用途為臨床膽固醇測定試劑。
本發明的佐劑組合還可包含載體，使得皂甙或CpG或二者可與顆粒載體結合，增強所述組合的佐劑活性。例如特別優選的系統疫苗包含載體分子。
用於本發明佐劑組合的CpG可為自由溶液或者可以複合在顆粒載體上，例如礦物鹽(例如但不限於鋁鹽或鈣鹽)、脂質體、ISCOM、乳液(水包油、油包水、水包油包水)、聚合物(例如但不限於聚乳酸、聚乙醇酸、聚磷腈(polyphosphazine)、聚胺基酸、藻酸鹽、殼聚糖)或微型顆粒。所述載體優選為陽離子載體。本發明疫苗還包含可與CpG-載體複合物結合的抗原、或者不能與CpG-載體複合物結合的抗原。在這種情況下，所述抗原可以為自由懸浮液或可與另外的載體結合的抗原。
構成本發明組成部分的皂甙可以為獨立的微膠粒，或者當用膽固醇和脂質配製時它可以為大的有序結構，例如ISCOM(EP 0 109 942 B1)或脂質體(WO 96/33739)，或者它為水包油乳液(WO 95/17210)。皂甙優選與金屬鹽結合，例如氫氧化鋁或磷酸鋁(WO 98/15287)。另一方面，皂甙可與顆粒載體如殼聚糖結合。皂甙也可以為固態如粉末。當最終製劑給予到疫苗接受者的黏膜表面時，最好是它為天然溶血性製劑。皂甙可以與抗原通過直接鍵合或共同作用於同一顆粒載體分子而物理性結合，或者皂甙可以不與抗原結合(GB 9822712.7；WO98/16247)。本發明佐劑或疫苗中的CpG和皂甙本身可以是獨立的製品，或者它們結合在一起。例如CpG和皂甙可以為自由懸浮液，或者可以通過載體結合在一起，更優選通過顆粒載體如氫氧化鋁或陽離子脂質體或ISCOM結合在一起本發明的優選佐劑組合由在2個相鄰CG基元之間含有至少3個、優選至少6個核苷酸的1個或多個CpG寡核苷酸和QS21以及顆粒載體組成，所述顆粒載體選自水包油乳液或DQ。最優選佐劑組合包含與QS21混合的CpG 2006(SEQ ID NO4)或CpG 1758(SEQ ID NO2)或CpG 1826(SEQ ID NO1)以及選自水包油乳液或DQ的顆粒載體。因此，特別優選的疫苗例如包括這樣的佐劑組合和抗原。本發明的優選疫苗用於通過系統途徑給予個體後產生系統免疫反應。
本發明的佐劑組合既可以用作系統佐劑，也可以用作黏膜佐劑。在本發明的一個具體形式中，提供通過系統途徑或胃腸外途徑給予的系統疫苗，所述途徑例如肌肉、皮內、透皮、皮下、腹膜內或靜脈內給予。給予疫苗的優選途徑是通過透皮途徑，例如皮膚貼片。
本發明的系統疫苗製劑可用來通過肌肉、腹膜內、皮內、透皮、靜脈內或皮下給予所述疫苗的方法而保護或治療疾病易感哺乳動物或患病哺乳動物。系統給予疫苗製劑的方法包括常規注射器和針頭、或設計用於衝擊性給予固體疫苗的裝置(WO 99/27961)、或無針壓力式液體噴射裝置(US 4,596,556；US 5,993,412)、或透皮貼片(WO 97/48440；WO 98/28037)。本發明還可用來增強用於皮膚的抗原的免疫原性(透皮或經皮給藥WO 98/20734；WO 98/28037)。因此，本發明提供預裝有本發明疫苗或佐劑組合物的系統給予傳遞裝置。因此提供對個體誘導免疫反應的方法，該方法包括給予所述個體包含抗原和免疫刺激寡核苷酸、皂甙和載體的疫苗，其中所述疫苗通過胃腸外途徑或系統途徑給予。誘導免疫反應的優選方法包括給予這樣的疫苗它包含SEQ IDNO1、2、3、4或5中一種寡核苷酸和得自Quil A的皂甙如QS21以及載體，例如水包油乳液、含膽固醇的脂質體或明礬。
另一方面，本發明疫苗製劑可用來通過黏膜途徑如口腔/消化道途徑或鼻途徑給予所述疫苗的方法保護或治療疾病易感哺乳動物或患病哺乳動物。可選擇的黏膜途徑有陰道內或直腸內途徑。優選的黏膜給藥途徑是通過鼻途徑，稱為鼻內免疫接種。鼻內免疫接種的方法是本領域周知的，包括將所述疫苗滴鼻劑、噴霧劑或乾粉劑給予到需要免疫個體的鼻咽部。霧化疫苗製劑也構成本發明的一部分。腸製劑如口服給予的胃耐受膠囊劑和顆粒劑、直腸或陰道給予的栓劑也構成本發明的一部分。
本發明的佐劑組合為一類通過黏膜免疫接種代替系統免疫接種的適用於人類的黏膜佐劑。在一個優選形式的本發明中，純皂甙與免疫刺激寡核苷酸的組合用作黏膜給予抗原的佐劑，以實現系統免疫反應，所述皂甙例如為Quil A或其衍生物，包括QS21、七葉素、洋地黃皂甙或滿天星皂甙或昆諾藜(Chenopodium quinoa)皂甙。
本發明的佐劑組合可用於配製通過系統途徑或黏膜途徑給予的疫苗。當疫苗用於黏膜給予時，所述佐劑組合優選包含溶血性皂甙。
對於黏膜給予而言，本發明組合物最好包含溶血性皂甙。參照以下測定方法測定本發明目的的溶血性皂甙或皂甙製劑1.用磷酸緩衝鹽水(PBS)以臺式離心機洗滌豚鼠新鮮血液3次。重懸浮至原體積後，再用PBS將血液稀釋10倍。
2.在800μl含2倍稀釋的表面活性劑或皂甙的PBS中加入50μl該血液懸浮液。
3.8小時後肉眼或通過檢測上清液光密度評價溶血。存在於570nm吸收光的紅色上清液說明存在溶血。
4.結果以不再出現溶血的第一個皂甙稀釋液的濃度表示。
對於本發明目的，如果皂甙佐劑製劑溶解紅細胞的濃度為0.1％以下時，則認為它是溶血性的。按照此參考標準，根據該測定方法定義，大致純Quil A、QS21、QS7、洋地黃皂甙和β-七葉素樣品均為溶血性皂甙。在這種生物測定的固有實驗變異內，本發明皂甙的溶血活性優選為約0.5-0.00001％、更優選0.05-0.00001％、甚至更優選0.005-0.00001％、最優選0.001-0.0004％、理想的是，所述皂甙的溶血活性與QS21的溶血活性相似(即在10倍差異範圍內)。
本發明疫苗也可以通過口服途徑給予。在這種情況下，藥學上可接受的賦形劑也可以包括鹼性緩衝劑或腸溶膠囊或微型顆粒。本發明疫苗也可以通過陰道途徑給予。在這種情況下，藥學上可接受的賦形劑也可以包括乳化劑、聚合物如CARBOPOL以及陰道乳膏和栓劑的其它已知穩定劑。本發明疫苗也可以通過直腸途徑給予。在這種情況下，所述賦形劑也可以包括用於製備直腸栓劑的本領域已知的蠟和聚合物。
在本發明的佐劑組合中1種以上的皂甙的製劑也構成本發明的一部分。例如至少2種以下皂甙的組合，所述皂甙包括QS21、QS7、Quil A、β-七葉素或洋地黃皂甙。另外，本發明組合物可包含1種以上的免疫刺激寡核苷酸的組合。
在本發明的一個類似實施方案中，用於系統給予和黏膜給予的CpG/皂甙組合還可以與其它佐劑組合，所述其它佐劑包括單磷醯脂質A及其無毒衍生物3-脫氧醯化單磷醯脂質A。另一方面，皂甙製劑可與以下物質組合殼聚糖或其它聚陽離子聚合物組成的疫苗載體、聚交酯和聚交酯-共-乙交酯顆粒、聚-N-乙醯葡糖胺基聚合物基質、多糖或化學修飾多糖組成的顆粒、脂質體和脂質基顆粒、甘油一酯組成的顆粒等。也可以在存在膽固醇情況下配製皂甙成顆粒結構，例如脂質體或ISCOM。此外，皂甙可與聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯配製為非顆粒性溶液或懸浮液，或者配製為顆粒結構，例如薄層(paucilamelar)脂質體或ISCOM。皂甙也可以用諸如CarbopolR的賦形劑配製，以提高粘度，或者可以用粉型賦形劑如乳糖配製成乾粉。
3脫氧醯化單磷醯脂質A是眾所周知的佐劑，由RibiImmunochem(Montana)生產。可用GB 2122204B介紹的方法製備3脫氧醯化單磷醯脂質A。3脫氧醯化單磷醯脂質A的優選形式為直徑小於0.2μm的小顆粒乳液(EP 0 689 454 B1)。特別優選的佐劑為3D-MPL和QS21的組合(EP 0 671 948B1)、包含3D-MPL和QS21的水包油乳液(WO 95/17210，WO 98/56414)或用其他載體配製的3D-MPL(EP 0689 454 B1)。
本發明的疫苗製劑最好包含能夠引發對抗人類病原體的免疫反應的抗原或抗原組合物，所述抗原或抗原組合物得自HIV-1(如tat、nef、gp120或gp160)、人類皰疹病毒(如gD或其衍生物或立即早期蛋白如HSV1或HSV2的ICP27)、巨細胞病毒((特別是人類)(如gB或其衍生物))、輪狀病毒(包括活減毒病毒)、埃-巴二氏病毒(如gp350或其衍生物)、水痘-帶狀皰疹病毒(如gp I、II和IE63)，或者所述抗原或抗原組合物來自肝炎病毒如B型肝炎病毒(例如B型肝炎表面抗原或其衍生物)、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或者所述抗原或抗原組合物來自其它病毒性病原體，如副粘病毒呼吸道合胞病毒(如F蛋白和G蛋白及其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒(例如HPV6、11、16和18等)、黃病毒(如黃熱病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒)或流感病毒(以卵或MDCK細胞培養的完整活病毒或滅活病毒、分裂的流感病毒，或完整的流感病毒體(如R.G1uck，Vaccine，1992，10，915-920介紹)或其純化或重組蛋白，例如HA、NP、NA或M蛋白或其各種組合)，或者所述抗原或抗原組合物來自細菌病原體，如奈瑟氏菌屬菌(Neisseriaspp.)，包括淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhea)和腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)(例如莢膜多糖及其偶聯物、運鐵蛋白結合蛋白、乳鐵蛋白結合蛋白、PilC、粘附素)；釀膿鏈球菌(S.pyogenes)(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁質)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、變異鏈球菌(S.mutans)；杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；莫拉氏菌屬菌(Moraxellaspp.)，包括黏膜炎莫拉氏菌(M.catarrhalis)，也稱為卡他布蘭漢氏菌(Branhamella catarrhalis)(例如高分子量粘附素和低分子量粘附素及侵染素)；博德特氏菌屬菌(Bordetella spp.)，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、絲狀血凝素、腺苷酸環化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)；分枝桿菌屬菌(Mycobacterium spp.)，包括結核分枝桿菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、85A抗原、85-B抗原或85-C抗原)、牛分枝桿菌(M.bovis)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、鳥分枝桿菌(M.avium)、副結核分枝桿菌(M.paratuberculosis)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)；軍團菌屬菌(Legionella spp.)，包括嗜肺軍團菌(L.pneumophila)；埃希氏菌屬菌(Escherichia spp.)，包括腸毒性大腸桿菌(E.coli)(例如定居因子、熱不穩定毒素或其衍生物、熱穩定毒素或其衍生物)、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如志賀毒素樣毒素或其衍生物)；弧菌屬菌(Vibrio spp.)，包括霍亂弧菌(V.cholera)(例如霍亂毒素或其衍生物)；志賀氏菌屬菌(Shigella spp.)，包括宋內氏志賀氏菌(S.sonnei)、痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志賀氏菌(S.flexnerii)；耶爾森氏菌屬菌(Yersinia spp.)，包括小腸結膜炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)、假結核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；彎曲桿菌屬菌(Campylobacterspp.)，包括空腸彎曲桿菌(C.jejuni)(例如毒素、粘附素和侵襲素)和大腸彎曲桿菌(C.coli)；沙門氏菌屬菌(Salmonella spp.)，包括傷寒沙門氏菌(S.typhi)、副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)、腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)；李斯特氏菌屬菌(Listeria spp.)，包括單核細胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)；螺旋桿菌屬菌(Helicobacterspp.)，包括幽門螺旋桿菌(H.pylori)(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素(vacuolating toxin))；假單胞菌屬菌(Pseudomonas spp.)，包括銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌屬菌(Staphylococcus spp.)，包括金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；腸球菌屬菌(Enterococcus spp.)，包括糞腸球菌(E.faecalis)、屎腸球菌(E.faecium)；梭菌屬菌(Clostridium spp.)，包括破傷風梭菌(C.tetani)(例如破傷風毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)、艱難梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素A或梭菌毒素B及它們的衍生物)；芽孢桿菌屬菌(Bacillus spp.)，包括炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)(例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)；棒桿菌屬菌(Corynebacterium spp.)，包括白喉棒桿菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋體屬菌(Borrelia spp.)，包括布氏疏螺旋體(B.burgdorferi)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、嘎氏疏螺旋體(B.garinii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋體(B.afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.andersonii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏蜱疏螺旋體(B.hermsii)；埃裡希氏體屬菌(Ehrlichia spp.)，包括馬埃裡希氏體(E.equi)和人粒細胞增多埃裡希病的病原體；立克次氏體屬菌(Rickettsia spp.)，包括立氏立克次氏體(R.rickettsii)；衣原體屬菌(Chlamydia spp.)，包括沙眼衣原體(C.trachomatis)(例如MOMP、肝素結合蛋白)、肺炎衣原體(C.pneumoniae)(例如MOMP、肝素結合蛋白)、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)；鉤端螺旋體屬菌(Leptospira spp.)，包括問號鉤端螺旋體(L.interrogans)；密螺旋體屬菌(Treponema spp.)，包括蒼白密螺旋體(T.pallidum)(例如稀有外膜蛋白)、齒垢密螺旋體(T.denticola)、豬痢疾密螺旋體(T.hyodysenteriae)；或所述抗原或抗原組合物得自寄生蟲，例如瘧原蟲屬寄生蟲(Plasmodium spp.)，包括惡性瘧原蟲；弓漿蟲屬寄生蟲(Toxoplasma spp.)，包括鼠弓漿蟲(T.gondii)(例如SAG2、SAG3、Tg34)；內阿米巴屬寄生蟲(Entamoeba spp.)，包括痢疾內變形蟲(E.histolytica)；巴貝蟲屬寄生蟲(Babesia spp.)，包括田鼠巴貝蟲(B.microti)；錐蟲屬寄生蟲(Trypanosoma spp.)，包括克魯茲錐蟲(T.cruzi)；賈第鞭毛蟲屬寄生蟲(Giardia spp.)，包括吸吮賈第蟲(G.lamblia)；Leshmania屬寄生蟲，包括L.major；肺囊蟲屬寄生蟲(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊蟲(P.carinii)；毛滴蟲屬寄生蟲(Trichomonas spp.)，包括陰道毛滴蟲(T.vaginalis)；Schisostoma屬寄生蟲，包括S.mansoni，或所述抗原或抗原組合物得自酵母，例如念珠菌屬酵母(Candida spp.)，包括白色念珠菌(C.albicans)；隱球酵母屬酵母(Cryptococcus spp.)，包括新型隱球菌酵母(C.neoformans)。
其它優選的結核分枝桿菌具體抗原有例如Tb Ra12、Tb H9、TbRa35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。結核分枝桿菌的蛋白還包括其融合蛋白和變異體蛋白，其中至少2種、優選3種結核分枝桿菌多肽融合為更大的蛋白。優選融合蛋白包括Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99/51748)。
最優選的衣原體抗原包括例如高分子量蛋白(HWMP)(WO99/17741)、ORF3(EP 366412)和推定的膜蛋白(Pmp)。所述疫苗製劑的其它衣原體抗原可選自WO 99/28475介紹的衣原體抗原。
優選細菌疫苗包含得自包括肺炎鏈球菌(例如莢膜多糖及其偶聯物、PsaA、PspA、鏈球菌溶血素、膽鹼結合蛋白)在內的鏈球菌屬細菌的抗原和蛋白抗原肺炎鏈球菌溶血素(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins等，Microbial Pathogenesis，25，337-342)及其變異的去毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其它優選細菌疫苗包含得自嗜血菌屬細菌(Haemophilus spp.)的抗原，包括B型流感嗜血菌(H.influenzae)(例如PRP及其偶聯物)、未定型(non typeable)流感嗜血菌，例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、蛋白D以及脂蛋白D和絲束蛋白以及絲束蛋白衍生的肽(US 5,843,464)或其多拷貝變異體或融合蛋白。
B型肝炎表面抗原的衍生物是本領域眾所周知的，特別包括歐洲專利申請EP-A-414 374、EP-A-0304 578和EP 198-474介紹的PreS1、PreS2 S抗原。在一個優選方面，本發明疫苗製劑包含HIV-1抗原、gp120，尤其是當用CHO細胞表達時。在另一個實施方案中，本發明疫苗製劑包含本文以上定義的gD2t。
在本發明的一個優選實施方案中，包含要求保護的佐劑的疫苗包含得自認為與生殖器疣有關的人乳頭瘤病毒(HPV)(HPV 6或HPV 11以及其它HPV病毒)和與宮頸癌有關的HPV病毒(HPV16、HPV18以及其它HPV病毒)的抗原。
特別優選形式的生殖器疣預防或治療疫苗包含L1顆粒或病毒殼粒和融合蛋白，該融合蛋白包含一種或多種選自HPV 6和HPV 11蛋白E6、E7、L1和L2的抗原。
最優選形式的融合蛋白為WO 96/26277公開的L2E7和GB9717953.5(PCT/EP98/05285)公開的蛋白D(1/3)-E7。
優選HPV宮頸感染或宮頸癌的預防或治療疫苗組合物可包含HPV 16或18抗原。例如L1或L2抗原單體、或以病毒樣顆粒(VLP)一起存在的L1或L2抗原或者只以VLP或殼粒結構存在的L1單一蛋白。這類抗原、病毒樣顆粒和殼粒本身是已知的。參見例如WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792和WO93/02184。
VLP可包含單一或為融合蛋白的其它早期蛋白，例如E7、E2或優選E5；這樣特別優選的實施方案包括含L1E7融合蛋白的VLP(WO96/11272)。
特別優選HPV 16抗原包含與蛋白D載體融合的早期蛋白E6或E7，以形成蛋白D-HPV 16的E6或E7融合，或其組合；或者E6或E7與L2的組合(WO 96/26277)。
另一方面，HPV 16或18早期蛋白E6和E7可以以一個分子、優選蛋白D-E6/E7融合蛋白存在。這種疫苗可任選包含HPV18的E6和E7之一或二者，該疫苗優選為蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白形式。
本發明疫苗還可包含其它HPV病毒株、優選病毒株HPV 31或33的抗原。
本發明疫苗還包含從引起瘧疾的寄生蟲獲得的抗原。例如惡性瘧原蟲(Plasmodia falciparum)的優選抗原包括RTS、S和TRAP。RTS是一種雜合蛋白，主要包含惡性瘧原蟲環子孢子蛋白(CS)的基本上所有C-末端部分，該部分通過B型肝炎表面抗原preS2部分的4個胺基酸與B型肝炎病毒表面抗原(S)連接。國際專利申請號PCT/EP92/02591公開了其完整結構，所述專利以公布號WO 93/10152公布，它要求英國專利申請第9124390.7號的優先權。當用酵母表達時，產生的RTS為脂蛋白顆粒，當它與HBV的S抗原共表達時，它產生稱為RTS，S的混合顆粒。以WO 90/01496公布的國際專利申請號PCT/GB89/00895介紹了TRAP抗原。本發明的一個優選實施方案是瘧疾疫苗，其中所述抗原製劑包含組合的RTS、S和TRAP抗原。其它可能候選為多階段瘧疾疫苗組分的瘧原蟲抗原有惡性瘧原蟲MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230及其瘧原蟲屬類似物。
所述製劑還可含有抗腫瘤抗原，並可用於免疫治療癌症。例如所述佐劑製劑可用於腫瘤排斥抗原，例如前列腺癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎臟癌症或黑素瘤抗原。典型抗原包括MAGE 1和MAGE3或其它MAGE抗原(用於治療黑素瘤)、PRAME、BAGE或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，Current Opinions in Immunology 8，第628-636頁；Van den Eynde等，International Journal of ClinicalLaboratory Research(1997年遞交)；Correale等(1997)，Journal of theNational Cancer Institute 89，第293頁)。實際上，這些抗原在種類繁多的腫瘤類型表達，例如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。其它腫瘤特異性抗原適用於本發明佐劑，包括但不限於腫瘤特異性神經節苷脂、前列腺特異性抗原(PSA)或Her-2/neu、KSA(GA733)、PAP、mammaglobin、MUC-1、癌胚抗原(CEA)。因此，在本發明的一個方面，提供包含本發明的佐劑組合物和腫瘤排斥抗原的疫苗。
本發明一個特別優選的方面是所述疫苗包含腫瘤抗原；這種疫苗令人驚奇地有效治療癌症，例如前列腺癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎臟癌、卵巢癌或黑素瘤。因此，所述製劑可含有腫瘤相關抗原以及支持腫瘤形成(例如血管形成、腫瘤侵襲)的相關抗原。另外，治療癌症疫苗特別相關的抗原還包括前列腺特異性膜抗原(PSMA)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、酪氨酸酶、survivin、NY-ESO1、prostase、PS108(WO 98/50567)、RAGE、LAGE、HAGE。此外，所述抗原可以是自身肽激素，例如全長促性腺激素釋放激素(GnRH，WO 95/20600)，該激素為10個胺基酸長的短肽，可用於治療許多癌症或免疫閹割。
預期本發明組合物可用於配製含得自疏螺旋體屬菌的抗原的疫苗。例如抗原可包括核酸、病原體衍生的抗原或抗原性製品、重組產生的蛋白或肽以及嵌合融合蛋白。所述抗原特別為OspA。OspA為藉助於宿主細胞(大腸桿菌)的脂質化型完全成熟蛋白，稱為Lipo-OspA，或者為非脂質化衍生物。該非脂質化衍生物包括非脂質化NS1-OspA融合蛋白，它含有流感病毒非結構蛋白(NS1)的前81個N-末端胺基酸和完整的OspA蛋白，非脂質化衍生物還包括另一種MDP-OspA，它為具有3個其它N-末端胺基酸的非脂質化OspA。
本發明疫苗可用於預防或治療變態反應。這種疫苗應該包含變應原特異性抗原(例如Der p1)和變應原非特異性抗原(例如人IgE產生的肽，包括但不限於stanworth十肽(decapeptide)(EP 0 477 231 B1))。
本發明疫苗還可用於預防或治療變態反應、癌症或感染性疾病以外的慢性病症。這類慢性病症為諸如動脈硬化和阿爾茨海默氏病的疾病。
預防和治療這類阿爾茨海默氏神經變性性疾病易感者或患者的相關抗原具體有澱粉樣前體蛋白的N末端39-43個胺基酸片段(Aβ)和小片段。該抗原公開於國際專利申請號WO 99/27944-(AthenaNeurosciences)。
根據在典型疫苗接受者誘導免疫保護性反應而沒有顯著副作用的劑量，選定每個疫苗劑量中的蛋白劑量。該劑量隨使用的具體免疫原和如何提呈免疫原而不同。一般來說，預期每個疫苗劑量包含1-1000μg蛋白、優選1-500μg、優選1-100μg、最優選1-50μg。應用標準研究可確定具體疫苗的最佳劑量，所述標準研究包括觀測接種疫苗者的合適免疫反應。初次免疫接種後，疫苗接受者可間隔適當時間後再接受1次或若干次加強免疫接種。在激發免疫接種或加強免疫接種方案中，該疫苗製劑可施用於哺乳動物黏膜表面；或者系統給予，例如通過透皮、皮下或肌肉途徑系統給予。
本發明佐劑或疫苗中的CpG或免疫刺激寡核苷酸含量一般較小，但是根據疫苗製劑可以為1-1000μg/劑、優選1-500μg/劑而更優選1-100μg/劑。
用於本發明佐劑的皂甙量可以為1-1000μg/劑、優選1-500μg/劑、更優選1-250μg/劑而最優選1-100μg/劑。所以，CpG∶皂甙(w/w)的比值為1∶1000至1000∶1，通常為1∶100至100∶1，優選1∶10至1∶1或1∶1至10∶1，最優選1∶1、4∶1或10∶1。
本發明製劑可用於預防和治療目的。因此，本發明提供組合的皂甙和CpG分子用於生產預防和治療病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、變態反應、癌症和其它非慢性病症的疫苗的用途。所以，本發明提供治療感染性疾病或癌症或變態反應或自身免疫性疾病易感或患病哺乳動物的方法。本發明的再一方面，提供包含皂甙和CpG的本文描述的疫苗組合或佐劑組合，以用作藥物。New Trends and Developments inVaccines，Voller等編著，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978全面介紹了疫苗製劑。
預期本發明組合物可用於配製含各種來源獲得的抗原的疫苗。例如，抗原可包括人類、細菌或病毒的核酸、病原體衍生的抗原或抗原性製品、腫瘤衍生抗原或抗原性製品、宿主衍生抗原(包括IgE產生的肽，例如IgE的釋放組織胺的十肽(稱為Stanworth十肽))、重組產生的蛋白或肽以及嵌合融合蛋白。
本發明提供包含抗原、皂甙和免疫刺激寡核苷酸的疫苗組合物。因此，本發明提供治療疾病易感或患病個體的方法，該方法為通過所述個體的系統途徑給予本文大致介紹的組合物。還提供防止個體罹患疾病的方法，該方法為通過所述個體的系統途徑給予本文大致介紹的組合物，所述疾病包括感染性細菌疾病和病毒疾病、寄生蟲病、前列腺癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎臟癌、卵巢癌或黑素瘤；非癌性慢性病症、變態反應、阿爾茨海默氏病、動脈硬化。
另一方面，本發明提供包含抗原和溶血性皂甙的黏膜疫苗組合物。因此，本發明提供通過將本文大致介紹的組合物給予到所述個體的黏膜表面而治療疾病易感個體或患病個體的方法。
此外，本發明介紹了誘導哺乳動物系統性抗原特異性免疫反應的方法，包括將包含抗原和溶血性皂甙的組合物給予到所述哺乳動物的黏膜表面上。進而本發明還提供生產疫苗或佐劑的方法，包括製備皂甙、製備CpG分子以及將它們與抗原混合。
用於本發明組合的合適的藥學上可接受的賦形劑實例包括水、磷酸緩衝鹽水、等滲緩衝溶液。


圖1鼻內加強免疫後14天的OspA特異性IgG滴度。
圖2鼻內加強免疫後14天的OspA特異性LA2滴度。
圖3鼻內加強免疫後14天的血清Flu病毒株特異性IgG滴度。
圖4鼻內加強免疫後14天的血清Flu病毒株特異性血清的血細胞凝集抑制(HAI)滴度。
圖5小鼠的OspA特異性LA2滴度。
圖6免疫小鼠脾細胞的gp120特異性淋巴細胞增殖活性。全部4個實驗組的抗原特異性活性以不同抗原濃度的SI表示。
圖7免疫小鼠脾細胞的HBsAg特異性CTL活性。通過檢測P815細胞(空心圓)或s-轉染P815細胞(實心圓)釋放的51Cr評價效應細胞活性。
圖8免疫小鼠的HBsAg特異性抗體反應。採用ELISA實驗測定特異性抗體滴度(以EU/ml表示)和同種型分布。合併血清的數字用表表示，而同種型分布仍用圖說明。
圖9免疫小鼠脾細胞的HBSAg和gp120特異性淋巴細胞增殖活性。全部4個實驗組的抗原特異性活性以不同抗原濃度的SI表示。
圖10免疫小鼠脾細胞的HBsAg和gp120特異性CTL活性。通過檢測對照P815細胞(空心三角)或呈現HBsAg或gp120CTL表位的P815細胞(實心三角)釋放的51Cr評價效應細胞活性。
圖11免疫小鼠的gp120特異性和HbsAg特異性抗體反應。採用ELISA實驗測定特異性抗體滴度(以μg/ml表示)(圖11A)和同種型分布。合併血清的數字用表表示，而同種型分布仍用圖說明。圖11B顯示gp120特異性抗體的同種型分布。
圖12每組10隻動物在不同時間的平均腫瘤生長情況。
本發明通過下列實施例闡明，但不限於下列實施例。
實施例1應用QS21和CpG鼻內加強系統性抗Lipo-OspA抗體我們用該實施例研究溶血性皂甙如QS21和免疫刺激劑如CpG是否能夠以協同方式增強小鼠對鼻內加強免疫的系統性免疫反應。用配製在明礬(50μg)上的lipo-OspA(1μg)肌肉注射免疫8周齡雌性Balb/c小鼠(每組5隻小鼠)。3個月後，用10μl含5μg lipo-OspA的APBS；B20μg CpG 1001(TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT，Krieg 1826)；C5μg QS 21(得自Cambridge Biotech，USA)；D20μg CpG 1001+5μgQS21的溶液鼻內(麻醉下)加強免疫小鼠，或者E肌肉注射1μg吸附在明礬(50μg)上的lipo-OspA加強免疫小鼠。圖1和2顯示鼻內加強免疫後14天的OspA特異性IgG滴度和LA2滴度。
方法用於測定小鼠OspA特異性血清IgG的ELISA用50μl/孔的1μg/ml用PBS稀釋的OspA(板的B至H行)或50μl的5μg/ml純化山羊抗小鼠Ig(Boerhinger)的PBS(A行)使MaxisorpNunc免疫板於4℃包被過夜。用飽和緩衝液含1％BSA的PBS、0.1％聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(吐溫20)和4％正常牛血清(NBS)封閉(1小時，37℃)各板的游離位點。然後使連續2倍稀釋的IgG同種型混合物和血清樣品(從100倍稀釋度開始，加入B至H行)於37℃溫育1.5小時，所述混合物用飽和緩衝液稀釋(50μl/孔)並加入各板中以製備標準曲線(小鼠單克隆抗體IgG1、IgG2a和IgG2b(Sigma)的混合物，從200ng/ml開始，加入A行)。再後用洗滌緩衝液(PBS，0.1％聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(吐溫20))洗滌(×3)各板。然後使用飽和緩衝液稀釋5000倍的生物素化山羊抗小鼠IgG(Amersham)於37℃溫育(50μl/孔)1.5小時。洗滌3次後加入鏈黴抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶綴合物(Amersham)，洗滌板5次，以50μl/孔顯色緩衝液(OPDA0.4mg/ml(Sigma)和0.03％H2O2的50mM pH 4.5檸檬酸緩衝液)使板於室溫下溫育20分鐘。加入50μl/孔2N硫酸終止顯色。用Biorad 3550免疫讀數器於492和630nm讀出光密度。採用SoftMaxPro軟體通過4參數數學方法計算抗體滴度。
用於測定血清抗lipo-OspA的LA2類(LA2-like)抗體滴度的抑制測定法就其LA2類特異性研究疫苗接受者的抗體滴度。LA2是識別細菌表面的OspA構象表位而且證實能夠體外殺傷B.burgdorferi以及保護小鼠免受實驗性培養的螺旋體攻擊的小鼠單克隆抗體(Schaible LUE等1990，Proc Natl Acad Sci USA 873768-3772)。而且證實LA-2mab與殺細菌抗體有關，關於人血清的研究也表明，總的抗OspA IgG滴度和LA-2滴度具有良好的相關性(根據ELISA測定)。
用50μl/孔的0.5μg/ml用PBS稀釋的lipo OspA使Maxisorp Nunc免疫板於4℃包被過夜。用飽和緩衝液於37℃封閉游離位點1小時(100μl/孔飽和緩衝液PBS/BSA 1％/吐溫200.1％/NBS 4％)。用飽和緩衝液(50μl/孔)從4μg/ml開始稀釋連續2倍稀釋的LA2單克隆抗體(mAb)，以製備標準曲線。另外加入得自疫苗接受者的稀釋血清樣品(從10倍稀釋度開始)，於37℃溫育板2小時。溫育後用PBS/吐溫20(0.1％)洗滌板3次。在每孔中(50μl/孔)加入用飽和緩衝液稀釋(10,000倍)的LA2mAb-過氧物酶綴合物，於37℃溫育1小時。洗滌板5次後，以50μl/孔顯色緩衝液(OPDA 0.4mg/ml和H2O20.03％的50mM pH 4.5檸檬酸緩衝液)使板於室溫下(避光)溫育20分鐘。用2N硫酸終止反應和顏色形成。用Biorad 3550免疫讀數器於492和630nm讀出光密度。採用SoftMaxPro軟體通過4參數數學方法計算LA2類抗體滴度。通過與標準曲線比較確定LA2類抗體滴度。
結果CPG和QS21顯著改善鼻內加強免疫的系統性抗Lipo-OspA抗體。而且當這兩種佐劑聯用時，明確證實對這些反應的協同作用，對於LA2抗體尤其如此。在QS21和CpG存在下激發的體液免疫反應顯著高於胃腸外加強免疫誘導的體液免疫反應。總之，這些結果明確證實聯用溶血性皂甙和免疫刺激劑的鼻內製劑的潛力。
實施例2用於增強鼻內加強免疫的系統性抗流感病毒抗體的QS21和CpG的協同組合我們用該實施例研究溶血性皂甙如QS21(見實例)和免疫刺激劑如CpG是否能夠以協同方式增強小鼠鼻內加強免疫的系統抗體，所述小鼠用滅活完整流感病毒鼻內激發免疫。
用β-丙酸內酯滅活的三價完整流感病毒(A/Beijing/262/95；A/Johannesburg/33/94；B/Panama/45/90；5μg HA/病毒株)鼻內激發免疫8周齡雌性Balb/c小鼠(每組10隻小鼠)，以模擬人類天然激發免疫。28天後，用20μl含1.5μgHA/病毒株的β-丙酸內酯滅活三價完整流感病毒(與激發免疫接種的病毒株相同)的APBS；B50μg CpG(TCGTCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT，Krieg 2006)；C4.5μg QS 21(得自Cambridge Biotech，USA)；D50μg CpG+4.5μg QS21的溶液(每個鼻孔10μl，用吸移管滴鼻給予)鼻內(麻醉下)加強免疫小鼠，或者E肌肉注射1.5μg HA/病毒株的三價分裂流感病毒(與激發免疫接種的病毒株相同)加強免疫小鼠。Flu抗原由SSD GmBH生產商(Dresden，Germany)供應。
圖3和4顯示鼻內加強免疫後14天的血清Flu病毒株特異性IgG滴度和血細胞凝集抑制(HAI)滴度。
方法用於測定小鼠抗流感病毒IgG滴度的ELISA用50μl/孔的1μg/ml用PBS稀釋的完整流感病毒抗原(板的B至H行)或50μl的5μg/ml純化山羊抗小鼠Ig(Boerhinger)的PBS(A行)使Maxisorp Nunc免疫板於4℃包被過夜。用飽和緩衝液含1％BSA的PBS、0.1％聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(吐溫20)和4％正常牛血清(NBS)封閉(1小時，37℃)各板的游離位點。然後使連續2倍稀釋的IgG同種型混合物和血清樣品(從100倍稀釋度開始，加入B至H行)於37℃溫育1.5小時，所述混合物用飽和緩衝液稀釋(50μl/孔)並加入各板中以製備標準曲線(小鼠單克隆抗體IgG1、IgG2a和IgG2b(Sigma)的混合物，從200ng/ml開始，加入A行)。再後用洗滌緩衝液(PBS，0.1％聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(吐溫20))洗滌(×3)各板。然後使用飽和緩衝液稀釋5000倍的生物素化山羊抗小鼠IgG(Amersham)於37℃溫育(50μl/孔)1.5小時。洗滌3次後加入鏈黴抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶綴合物(Amersham)，洗滌板5次，以50μl/孔顯色緩衝液(OPDA 0.4mg/ml(Sigma)和H2O20.03％的50mM pH 4.5檸檬酸緩衝液)使板於室溫下溫育20分鐘。加入50μl/孔2N硫酸終止顯色。用Biorad 3550免疫讀數器於492和630nm讀出光密度。採用SoftMaxPro軟體通過4參數數學方法計算抗體滴度。用於包被、用β-丙酸內酯(BPL)滅活的完整流感病毒(病毒株A/Beijing/262/95)由SSDGmBH生產商(Dresden，Germany)供應。
小鼠Flu特異性血清抗體的血細胞凝集抑制(HAI)活性首先用100μl 0.5M硼酸鹽緩衝液(pH 9)和125μl購自DadeBehring的高嶺土於室溫下(RT)處理血清(25μl)20分鐘。離心(30分鐘，3000RPM或860g)後，取100μl上清液(相當於10倍稀釋的血清)，於4℃與0.5％雞紅細胞溫育1小時。於3200RPM(970g)離心10分鐘後收集上清液。進行2次操作以消除血清中含有的天然血細胞凝集因子。然後，在96孔Greiner板中用25μlPBS(從20倍稀釋度開始連續2倍稀釋)稀釋25μl處理血清。以4個血細胞凝集單位濃度(即低於激發紅細胞凝集的最後稀釋度4倍的稀釋度)加入(25μl孔)BPL滅活的完整病毒，振蕩下於RT處理30分鐘。然後在RT下加入雞紅細胞(250μl/孔)處理1小時。最後板於4℃保持過夜後變紅。HAI滴度相當於抑制病毒誘導的血細胞凝集的最後血清稀釋度。
結果CPG和QS21沒有提高鼻內加強免疫的抗Flu病毒株的IgG或HAI抗體。然而，當這兩種佐劑聯用時，明確證實對這些反應的協同作用。在QS21和CpG存在下激發的HAI反應非常類似胃腸外加強免疫誘導的反應。這些結果證實了聯用溶血性皂甙和免疫刺激劑的鼻內製劑的潛力。它們還表明，數個CpG序列在這種條件下均是有效的(本實施例中的Krieg 2006以及實施例3和5中的Krieg 1826)。
實施例3用於增強鼻內加強免疫的系統性抗Lipo-OspA抗體的β-七葉素和CpG的協同組合我們用該實施例評價用其它溶血性皂甙(見實例)如β-七葉素是否能夠獲得類似於QS21和CpG觀測到的協同作用。還測試了非溶血性皂甙，即甘草酸。
用配製在明礬(50μg)上的lipo-OspA(1μg)肌肉注射激發免疫8周齡雌性Balb/c小鼠(每組6隻小鼠)。3個月後，用10μl含5μg lipo-OspA的APBS；B50μg CpG 1001(TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT，Krieg 1826)；C5μg β-七葉素(購自Sigma)；D50μg CpG 1001+5μgβ-七葉素；E5μg甘草酸(購自Sigma)；F50μg CpG 1001+5μg甘草酸的溶液(每個鼻孔5μl，用吸移管滴鼻給予)鼻內(麻醉下)加強免疫小鼠，或者G肌肉注射1μg吸附在明礬(50μg)上的lipo-OspA加強免疫小鼠。圖5顯示鼻內加強免疫後14天的OspA特異性LA2滴度。
方法該方法與實施例1詳細介紹的方法相同。
結果β-七葉素與CpG協同作用增強鼻內加強免疫的系統性LA2抗體。這種組合比胃腸外加強免疫增強激發的抗體反應的作用更強。相反，聯用CpG和甘草酸不能獲得這種協同作用。
這些結果和本專利前面的結果一起證實，CpG和不同溶血性皂甙能夠以協同方式輔助增強免疫反應。
實施例4利用以CpG和/或DQS21配製的惡性瘧原蟲RTS，S和HIV-1gp120研究免疫原性1.實驗概述進行2隻小鼠的免疫原性研究，以評價CpG寡核苷酸(CpG)和QS21的潛在累加或協同作用。單獨或聯合用CpG和QS21配製的RTS，S和gp120免疫各組小鼠。還在載體氫氧化鋁或水包油(o/w)乳液存在下測試了這些佐劑組合。
2次胃腸外免疫後測定所述製劑的免疫原性。分析血清中存在的抗原特異性抗體和抗體同種型分布。用脾細胞評價細胞介導的免疫反應。測試這些細胞中存在的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和淋巴細胞增殖的細胞。
表1實驗1的各組小鼠

表2實驗2的各組小鼠

2.製劑2.1.實驗1配製方法每次注射前3天製備製劑。必要時，使RTS，S(10μg)和gp 120(10μg)吸附在100μg氫氧化鋁上。必要時，加入MPL(5μg)並溫育30分鐘，然後加入10倍濃縮的PBS pH 7.4和水的混合物的緩衝液，例外的是沒有DQ的實驗組，緩衝液為PO4，NaCl 10/150pH 6.8。30分鐘後，需要的話，在所述製劑中加入以QS21/膽固醇1/5重量比與脂質體混合的QS21(稱為DQ)(5μg)。30分鐘後，如果用所述寡核苷酸配製，則在加入100μg CpG 30分鐘後，加入50μg/ml作為防腐劑的硫柳汞。

所有溫育均在室溫下振蕩進行。
2.2.實驗2配製方法同時配製兩種注射劑。每隻小鼠的注射體積為100μl。加入50μg/ml用作防腐劑的硫柳汞。
第1組用水和PBS pH 6.8等滲性稀釋RTS，S(10μg)和gp120(10μg)。5分鐘後所述製劑吸附在CpG 1856(100μg)上。
第2組用水和PBS pH 7.4等滲性稀釋RTS，S(10μg)和gp120(10μg)。30分鐘後RTS，S和gp120吸附在DQ(5μg)上。吸附30分鐘後，所述製劑吸附在CpG 1856(100μg)上。
第3組用水和PBS pH 6.8等滲性稀釋RTS，S(10μg)和gp120(10μg)。5分鐘後所述製劑吸附在o/w乳液上。吸附5分鐘後，所述製劑吸附在QS21(5μg)上後，加入CpG(100μg)。
3.免疫方法每組9隻(Balb/C×C57B1/6)F1小鼠，在小鼠的後足墊注射2×50μl疫苗，間隔2周注射2次。2周後取血清測定抗體反應，收穫脾細胞測定細胞介導的免疫反應。
對於淋巴細胞增殖分析，將細胞以2×106/ml濃度一式四份接種在96孔圓底微量滴定板中。在不同濃度RTS，S或gp120抗原存在下，用添加抗生素、穀氨醯胺和1％(v/v)正常小鼠血清的RPMI-1640培養細胞72或96小時。對照細胞的培養不含抗原。然後以1μCi/孔[3H]-胸苷脈衝處理所述細胞過夜，收穫細胞，用β計數器測定摻入的放射性。結果以平均計數/分鐘(cpm)表示。
對於CTL分析，在10μg/ml相當於HBsAg CTL表位的合成肽pCMI003(IPQSLDSWWTSL)(Schirmbeck等，1995)或代表gp 120 CTL表位的合成肽pCMI007(GIHIGPGRAFYAARK)(Casement等，1995)存在下，在6孔板中培養細胞7天。結束培養後，採用對照細胞和S-轉染P815細胞以標準[51Cr]-釋放測定法一式二份測定效應細胞的HBsAg特異性細胞溶解活性。用留置未處理的P815靶細胞或用肽pCMI007脈衝處理1小時的P815靶細胞測定gp120特異性細胞毒性。分別用沒有效應細胞的靶細胞和加入3％(v/v)Triton X-100的靶細胞測定最小釋放和最大釋放。結果以[51Cr]釋放百分率(實驗培養物cpm-自然釋放cpm/最大釋放cpm-自然釋放cpm)表示。
採用以HbsAg包被的板以標準酶聯免疫吸附測定法(ELISA)方式對合併血清進行滴定和同種型分型。從400倍稀釋度開始，用PBS/BSA稀釋血清。用Ig或同種型IgG1、IgG2a和IgG2b特異性生物素化二抗，接著用辣根過氧化物酶-鏈黴抗生物素蛋白綴合物檢測結合抗體。根據SoftmaxPro的參考值計算ELISA滴度，以ELISA單位(EU/ml)表示。用gp120蛋白包被的板以標準ELISA測定gp120特異性抗體滴度。從100倍稀釋度開始，以PBS/吐溫20/BSA稀釋血清。用Ig或同種型IgG1、IgG2a和IgG2b特異性生物素化二抗，接著用辣根過氧化物酶-鏈黴抗生物素蛋白綴合物檢測結合抗體。相對於標準小鼠Ig計算滴度，以μg/ml表示。
4.結果實驗1淋巴細胞增殖反應分析顯示，各組間對RTS，S的反應性沒有任何顯著性差異。相反，同時含有CpG和DQS21的第1組和第3組顯示，gp120特異性淋巴細胞增殖反應比只含CpG或DQS21的各組更好(圖6)。
在本實驗中，只檢測了HBsAg特異性CTL。接受CpG和DQS21組合的第1和3組與只接受兩種佐劑組分之一免疫的第2和4組之間在誘導CTL作用方面沒有顯著性差異，而觀測到在氫氧化鋁存在下聯合用CpG和DQS21的第1組CTL活性降低(圖7)。但是存在這樣的趨勢CpG和DQS21比單獨的DQS21更好，在氫氧化鋁存在下CpG和DQS21組合誘導CTL比單獨的CpG誘導CTL的作用更強(圖7)。
對小鼠的體液免疫反應只檢測了HBsAg特異性抗體的存在。所有各組的滴度相似，例外的是，第3組顯示滴度增加約3倍，證實在氫氧化鋁存在下，DQS21和CpG組合比單獨的CpG的免疫原性更好(圖8)。含氫氧化鋁的第3和4組的同種型分布相似，而缺乏氫氧化鋁時，CpG和DQS21組合誘導的TH1-類同種型分布比單獨的DQS21更強(圖8)。
實驗2在本實驗中，RTS，S和gp120特異性淋巴細胞增殖反應非常相似。數據表明，加入DQS21(單獨加入或用o/w乳液加入)增強兩種抗原的淋巴細胞增殖反應(圖9)。
同時用HBsAg和gp120CTL表位肽檢測了CTL反應。在兩種情況下，單獨用CpG免疫第1組後均能夠檢測到CTL(圖10)。但是，加入DQS21使兩種抗原的CTL顯著增強(圖10)。存在o/w乳液或者中和DQS21(gp120)的正性作用或者增強體外測定的本底(HBsAg)。
在CpG佐劑中加入DQS21增強抗HBsAg和gp120的抗體反應(圖11A)。當所述製劑中包含o/w乳液時觀測到其作用進一步增強(圖11A)。在CpG中加入DQS21使gp120同種型分布向更顯著的TH1偏移(圖11B)，而在本實驗中對HBsAg同種型分布的影響較弱。
5.結論以組合的CpG和DQS21配製的RTS，S和gp120免疫增強抗原特異性免疫反應。與單一組分相比，佐劑組分CpG和DQS21組合-增強淋巴細胞增殖反應-增強CTL活性-提高抗體滴度和TH1同種型分布。
實施例5.CpG和/或DQS21製劑在TC1腫瘤模型中的治療潛力1.實驗設計4組C57b1/6小鼠(每組10隻)在第0天於脅腹皮下注射接受10e6(200μl)TC1細胞(表達E7的腫瘤細胞)。
然後在腫瘤攻擊後14天和21天，用5μg配製的PD1/3E7HPV16通過足墊注射免疫小鼠2次。每周分別測定腫瘤生長兩次。
小鼠分組1.無疫苗組2.PD1/3E7+CPG(10μg ODN 2006)3.PD1/3E7+DQS21(0.5μg)4.PD1/3E7+CPG+DQS21通過每周2次測量各腫瘤監測腫瘤生長情況。
2.製劑在注射當天進行配製。每隻小鼠的注射體積為100μl。需要的話，用水和PBS pH 7.4等滲性稀釋PD1/3E7(5μg)。5分鐘後，如果需要的話，在所述製劑中加入以QS21/膽固醇1/5重量比與脂質體混合的QS21(稱為DQ)(0.5μg)。30分鐘後，對於含有所述寡核苷酸的製劑，加入10μg CpG(ODN 2006)，30分鐘後加入1μg/ml用作防腐劑的硫柳汞。

3.結果各組小鼠(每組10隻)在不同時間的平均腫瘤生長情況見圖12。100％接受10e6TC1細胞的腫瘤攻擊小鼠的腫瘤生長呈進行性發展。
70％-80％沒有免疫的小鼠或沒有用E7蛋白的DQS21免疫小鼠在35天內死亡。
用DQS21配製的E7蛋白免疫2次對腫瘤生長几乎沒有作用。相反，IFP(第14、21天)5μg ProtD 1/3 E7 HPV16的CPG佐劑免疫2次使這些預建立的腫瘤消退，保護小鼠免於死亡70-80％小鼠在第35天仍然存活。證實2種免疫刺激劑CPG和DQS21組合的有益作用略微優於單獨使用CpG。
序列表110Friede，MartinGarcon，NathalieHermand Philippe120佐劑製劑130B451811605170FastSEQ for Windows Version 3.0210121120212DNA213人4001tccatgacgt tcctgacgtt 20210221118212DNA213人4002tctcccagcg tgcgccat18210321130212DNA213人4003accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30210421124212DNA213人4004tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24210521120212DNA213人4005tccatgacgt tcctgatgct 20100393.0權利要求
1.一種疫苗組合物，其包含腫瘤抗原和佐劑組合物，所述佐劑組合物包含皂甙和免疫刺激寡核苷酸，其中所述免疫刺激寡核苷酸包含嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶序列。
2.權利要求1的疫苗組合物，其中所述抗原衍生自MAGE、BAGE、GAGE、MUC-1、Her-2neu、CEA、PSA、KSA或PRAME。
3.權利要求1的疫苗組合物，其中所述抗原衍生自腫瘤相關抗原PSMA、PSCA、酪氨酸酶、survivin、NY-ESO1、prostase、PS108、RAGE、LAGE或HAGE。
4.權利要求1-3任一項的疫苗組合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸選自TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO1)；TCTCCC AGC GTG CGC CAT(SEQ ID NO2)；ACC GAT GAC GTC GCCGGT GAC GGC ACC ACG(SEQ ID NO3)；TCG TCG TTT TGT CGTTTT GTC GTT(SEQ ID NO4)；TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(SEQ ID NO5)。
5.權利要求1-3任一項的疫苗組合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸包含被3個核苷酸分隔開的2個未甲基化CG重複基元。
6.權利要求5的疫苗組合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸包含被6個核苷酸分隔開的2個未甲基化CG重複基元。
7.權利要求1-6任一項的疫苗組合物，其中所述皂甙衍生自QuilA。
8.權利要求7要求保護的疫苗組合物，其中所述QuilA衍生物是QS21。
9.權利要求1-8任一項的疫苗組合物，其還包含3D-MPL。
10.權利要求1-9任一項的疫苗組合物，它還包含載體。
11.權利要求10的疫苗組合物，其中所述皂甙為脂質體形式。
12.權利要求10的疫苗組合物，其中所述皂甙為水包油乳液形式。
13.權利要求10的疫苗組合物，其中所述皂甙與金屬鹽顆粒結合。
14.權利要求13的疫苗組合物，其中所述金屬鹽顆粒為氫氧化鋁或磷酸鋁。
15.權利要求1-14任一項的疫苗組合物，其中所述佐劑組合物中的皂甙是溶血性皂甙。
16.腫瘤抗原、皂甙和CpG分子的組合在製備用於預防和治療癌症的疫苗中的用途，其中所述CpG分子包含嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶序列。
17.權利要求1-15任一項的疫苗組合物的製備方法，包括將皂甙、免疫刺激寡核苷酸和腫瘤抗原混合，其中所述免疫刺激寡核苷酸包含嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶序列。
18.權利要求17的疫苗製備方法，包括將下述組分混合(a)皂甙，(b)免疫刺激寡核苷酸，和(c)腫瘤抗原，其中所述皂甙為脂質體形式，且所述寡核苷酸含有未甲基化CpG二核苷酸。
19.權利要求17的疫苗製備方法，包括將下述組分混合(a)皂甙，(b)免疫刺激寡核苷酸，和(c)腫瘤抗原，其中所述皂甙為水包油乳液形式，且所述寡核苷酸含有未甲基化CpG二核苷酸。
全文摘要
本發明涉及適合用於疫苗的佐劑組合物。具體來說，本發明佐劑組合物包含皂甙和免疫刺激寡核苷酸以及任選包含載體。本發明還提供包含本發明佐劑和抗原的疫苗。還提供生產本發明佐劑和疫苗的方法及其用作藥物的用途。還提供通過給予本發明疫苗治療疾病易感個體或患病個體的方法。
文檔編號A61P37/00GK1911443SQ20061010022
公開日2007年2月14日 申請日期2000年4月4日 優先權日1999年4月19日
發明者M·弗裡德, N·加康, P·赫爾曼德 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司