一種人源程序性死亡受體hPD‑1單克隆抗體的製作方法
2023-06-14 04:03:01 2
本發明屬於抗體的製備方法技術領域，具體涉及一種人源程序性死亡受體PD-1單克隆抗體的製備方法。
背景技術：
眾所周知，初始T細胞活化離不開抗原肽-MHC分子複合物與T細胞表面受體（TCR）的相互作用，但同時需要抗原呈遞細胞表面（APC）的共刺激分子與其表面的相應受體結合來提供第二刺激信號。B7家族作為唯一能從APC單向傳送信號至T細胞的共刺激分子，可以調控免疫信號的強度、持續時間和過程。人源程序性死亡分子1（hPD-1）是B7家族的一員，是重要的免疫抑制分子，與其配體PD-Ls結合後，可激活細胞內的抑制信號，誘導T細胞凋亡，抑制T細胞的活化和增殖以及IL-2和IFN-γ等細胞因子的分泌，從而抑制免疫應答反應，參與調節免疫耐受，導致微生物感染和腫瘤細胞的免疫逃逸。hPD-1可表達在激活的T細胞、B細胞和骨髓細胞等免疫細胞上，屬於免疫球蛋白家族。因此，hPD-1作為腫瘤發生、發展、轉移以及腫瘤預後的重要指標，需要準確和高靈敏的免疫組化技術對其檢測。
免疫組化技術是20世紀70年代初Sterb Berger在酶標法的基礎上以免疫學的抗原抗體反應為理論基礎發展起來的技術，可對組織和細胞內的特定抗原或抗體(多肽和蛋白質)進行定位、定性或定量檢測。目前，免疫組化技術在臨床檢測的應用包括良性和惡性腫瘤的診斷與鑑定、腫瘤分期、腫瘤來源的鑑定、區分組織器官交界處腫瘤、發現微小轉移灶和指導腫瘤的治療。因此，有必要製備高純度、高特異性的hPD-1單克隆抗體，利用免疫組化技術指導腫瘤的診斷和治療。
技術實現要素：
為了解決上述問題，本發明提供一種人源程序性死亡受體PD-1單克隆抗體的製備方法。
為此採用如下的技術方案：
一種人源程序性死亡受體hPD-1單克隆抗體，所述抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，所述的重鏈可變區鹼基序列和胺基酸序列分別如SEQ ID NO.1-2所示，輕鏈可變區的鹼基序列和胺基酸序列分別如SEQ ID NO.3-4所示。
所述抗體為如下1）或2）所示的蛋白質：
1）重鏈與輕鏈可變區由SEQ ID NO.1-4所示的鹼基序列或胺基酸序列組成的蛋白質；
2）將SEQ ID NO.1-4所示的輕鏈和/或重鏈可變區的鹼基序列或胺基酸序列經過一個或幾個鹼基/胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白質的輕鏈和/或重鏈可變區。
所述抗體的輕鏈和/或重鏈可變區編碼DNA分子，所述編碼DNA分子為如下1）-3）中任一所述的DNA分子：
1）其輕鏈可變區和重鏈可變區的核苷酸序列所示；
2）與SEQ ID NO.1-4中序列限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1-2中任一所述抗體的DNA分子；
3）與1）的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼權利要求1-2中任一所述的抗體的DNA分子。
所述的單克隆抗體的重組表達載體或表達盒或轉基因細胞系或重組菌。
任一所述的抗體在如下a）-c）中任一種中的應用：
a）製備特異性結合人源程序性死亡受體PD-1的產品；
b)製備利用免疫組化技術檢測腫瘤組織中PD-1的產品；
c)製備作為治療腫瘤的藥物。
一種人源程序性死亡受體hPD-1單克隆抗體的製備方法，採用如下步驟：
1）利用分子克隆的方法構建hPD-1胞外段的重組質粒，轉化至宿主菌BL21（DE3）中進行蛋白表達，純化後，獲得高純度、構象均一的hPD-1蛋白；
2）將製備好的hPD-1抗原注射至Balb/c小鼠體內；
3）重複步驟2）再將強免疫2次後，採血，利用ELISA技術檢測血清中抗體效價；
4）取效價達到要求（高於100,000）的Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，製備雜交瘤細胞；
5）對分泌hPD-1單克隆抗體的雜交瘤細胞進行2~3次的克隆化培養；
6）將步驟5）獲得的克隆化培養的雜交瘤細胞接種於Balb/c小鼠腹腔內，獲得hPD-1蛋白單克隆抗體濃度很高的腹水單抗；
7）利用Protein A親和層析柱對腹水單抗進行純化；
8）特異性檢測：利用免疫組化技術對獲得的抗體的特異性進行檢測；
9）利用PCR技術對製備的單克隆抗體的重鏈可變區進行基因測序。
具體為：
1）獲取抗原hPD-1蛋白：人源程序性死亡受體hPD-1是由PDCD-1基因編碼的共刺激分子，選取hPD-1蛋白的胞外結構域作為抗原，其鹼基數約400 bp，蛋白分子量18 kDa左右。利用軟體Primer premier 5.0設計hPD-1蛋白的胞外結構域的上遊引物和下遊引物，利用聚合酶鏈式反應（PCR）技術擴增獲得hPD-1蛋白的胞外結構域的基因，分別對該目的基因與表達載體pET-22b進行雙酶切，然後利用T4-DNA連接酶進行酶連，獲得重組質粒pET-22b-hPD-1。將重組質粒pET-22b-hPD-1轉化至宿主菌BL21（DE3）中，進行蛋白表達。根據聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）的結果，hPD-1蛋白的胞外結構域以包涵體的形式表達。將hPD-1蛋白的包涵體溶於含有8 M尿素的PBS緩衝液中，進行Ni柱純化，然後利用復性緩衝液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，400 mM L-Arghydrochloride，2 mM EDTA，5 mM Cystamine，0.5 mM Cysteamine），進行hPD-1蛋白的復性，獲得空間摺疊正確、構象均一的抗原。最後再利用AKTA 蛋白純化系統進一步純化hPD-1蛋白，獲得高純度，高構象均一性的抗原蛋白。
2）用生理鹽水將步驟1）獲得的hPD-1蛋白稀釋至1 mg/mL，然後與等體積的完全弗氏佐劑（IFC）混合，利用乳化器將混合物乳化至滴水不化後，對Balb/c小鼠進行免疫，每隻小鼠注射劑量為：100 μg。
3）重複步驟2）所述，加強免疫兩次：第15天，每隻小鼠注射劑量為：50 μg；第29天，每隻小鼠注射劑量為：50 μg。
4）利用ELISA檢測Balb/c小鼠血清中的抗體效價，取效價達到要求（高於100,000）的Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，製備雜交瘤細胞。
5）融合2周左右，利用ELISA法對雜交瘤細胞進行篩選，獲得分泌hPD-1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞。
6）對於5）步驟獲得的雜交瘤細胞進行2~3次的克隆化培養，直至100%孔分泌hPD-1蛋白單克隆抗體，建系保存該雜交瘤細胞株。
7）將步驟6）克隆化培養、篩選獲得的雜交瘤細胞接種於Balb/c小鼠腹腔內，獲得hPD-1蛋白單克隆抗體濃度很高的腹水單抗。
8）將2 g左右的Protein A填料與10 mL pH 7.0的Tris緩衝液混合，倒入層析柱，靜置5-10 min，使得填料自然沉降，得到無氣泡的Protein A填料柱；加入10倍柱體積的pH 7.0的Tris緩衝液，並以合適的流速衝洗柱子；將步驟7）獲得高濃度單抗與pH 7.0的Tris緩衝液按照體積比1:2混合後，用0.45 μm濾膜過濾後，加入層析柱中進行親和層析，然後利用洗脫液（pH 4.5 0.1 M檸檬酸溶液加pH 8.0的中和液）洗脫抗體，將洗脫液利用PBS透析三次，最後利用超濾濃縮管濃縮抗體溶液，獲得高純度、高濃度的hPD-1單克隆抗體。
9）利用PCR技術對製備的單克隆抗體的重鏈可變區進行基因測序。
本發明的優點在於：本抗體是完全人源性抗體，具有高特異性、高親和力和高靈敏度，且抗體具有很好的膜定位；本發明純化抗體的方法是利用Protein A填料來純化，得到的單克隆抗體純度更高。本發明所採用的人源PD-1蛋白製備的單克隆抗體能夠為腫瘤的診斷與治療提供一定的科學指導。
附圖說明
圖1：hPD-1蛋白胞外結構域基因克隆的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖2：hPD-1蛋白胞外結構域蛋白表達鑑定的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。
圖3：hPD-1單抗的免疫組化特異性檢測圖。
圖4：hPD-1單抗檢測PD-1蛋白的WB結果圖。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的具體實施方式進行詳細的描述，但應當理解本發明的保護範圍並不受具體實施方式的限制。
除非另有其他明確表示，否則在整個說明書和權利要求書中，術語「包括」或其變換如「包含」或「包括有」等等將被理解為包括所陳述的元件或組成部分，而並非排除其他元件或其他組成部分。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
實施例1
具體採用如下步驟：
1）首先獲取抗原hPD-1蛋白：本發明選取hPD-1蛋白的胞外結構域作為抗原，其鹼基數約為400 bp，蛋白分子量約為18 kDa。利用引物設計軟體Primer premier 5.0設計hPD-1蛋白的胞外結構域的上遊引物：5』 TGAATTCCATATGCCCCCCACCTTCTCCCCAG3』 （酶切位點，Nde I）和下遊引物：5』 GTACTCGAG TTCTGCCCTTCTCTCTGTCACC3』（酶切位點，Xho I），利用聚合酶鏈式反應（PCR）技術擴增獲得大量hPD-1蛋白的胞外結構域的基因，分別對該目的基因與載體pET-22b進行雙酶切，然後利用T4-DNA連接酶進行連接，獲得重組質粒pET-22b-hPD-1，送至基因測序。將測序正確的重組質粒pET-22b-hPD-1轉化至宿主菌BL21（DE3）中，挑取陽性單克隆菌落，接種於35 mg/L氨苄抗性LB培養基的10 mL試管中，37 ℃，220 rpm/min 培養過夜；將10 mL過夜培養物接種於含有35 mg/L氨苄抗性的1 L LB培養基的三角瓶中，37℃，230rpm/min 培養至菌液OD值達到0.8-1.0，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.5 mM，37 ℃，190 rpm/min 培養16 h，進行蛋白表達。收集菌體，重懸於50 mL PBS中（含1mM EDTA，0.1mM PMSF），超聲破碎，進行聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑑定，結果表明： hPD-1蛋白的胞外結構域以包涵體的形式表達。將hPD-1蛋白的包涵體溶於含有8M尿素的PBS緩衝液中，進行Ni柱純化。將含有高純度的hPD-1蛋白的Ni柱洗脫液利用復性緩衝液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，400 mM L-Arghydrochloride，2 mM EDTA，5 mM Cystamine，0.5 mM Cysteamine）進行復性，獲得空間摺疊正確、構象均一的抗原。最後再利用AKTA純化系統的G75柱進一步對hPD-1蛋白進行純化，獲得高純度，構象均一性的抗原蛋白。
2）用生理鹽水將步驟1）獲得的hPD-1蛋白稀釋至1 mg/mL，然後與等體積的完全弗氏佐劑（IFC）混合，利用乳化器將混合物乳化至滴水不化；選取6~8周齡的Balb/c小鼠進行腹部多點注射免疫，每隻小鼠注射劑量為：100 μg。
3）重複步驟2）所述，加強免疫兩次：第15天，每隻小鼠注射劑量為：50 μg；第29天，每隻小鼠注射劑量為：50 μg。
4）第三次注射2周後，尾部取血並測定血清效價；利用ELISA檢測Balb/c小鼠血清中的抗體效價，以空白對照組血清為陰性對照，PBS為空白對照；效價高於100,000時，表明抗體具有足夠的抗體滴度和親和力，取該Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，製備雜交瘤細胞。
5）融合2周左右，利用ELISA法對雜交瘤細胞的抗體進行檢測和篩選，以骨髓瘤細胞培養上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性對照，包被抗原為hPD-1蛋白；最終獲得分泌hPD-1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞。
6）對於5）步驟獲得的雜交瘤細胞進行2~3次的克隆化篩選和培養；每次克隆化培養約7-10天，在倒置顯微鏡下觀察細胞，標出肉眼可見的只有單個克隆生長的孔，進行抗體檢測；將檢測結果為陽性細胞再次擴大培養，直至100%孔分泌hPD-1單克隆抗體，建系保存該雜交瘤細胞株。
7）小鼠腹水法製備單抗：首先每隻F1小鼠腹腔注射0.3 mL弗氏不完全佐劑；7天後每隻F1小鼠腹腔注射1×106/0.2 mL的細胞量的PBS稀釋的步驟6）克隆化培養、篩選獲得的雜交瘤細胞；7天後開始觀察F1小鼠，若觀察到小鼠腹部明顯膨大，則可採集其腹水；先將腹水低速離心以除去細胞等雜質，收集上清後再採用高速離心以除去細小顆粒。
8）將2g左右的Protein A填料與10 mL pH 7.0的Tris緩衝液混合，倒入層析柱，靜置5-10 min，使得填料自然沉降，得到無氣泡的Protein A填料柱；加入10倍柱體積的pH 7.0的Tris緩衝液，並以合適的流速衝洗柱子；將步驟7）獲得的高濃度hPD-1單抗與pH 7.0的Tris緩衝液按照體積比1:2混合後，用0.45 μm濾膜過濾後，倒入層析柱中進行親和層析純化，利用10倍柱體積的pH 7.0的Tris緩衝液進行洗脫非特異性吸附的雜質，然後利用洗脫液（pH 4.5 0.1 M檸檬酸溶液加pH 8.0的中和液）洗脫hPD-1單體，用PBS將洗脫液透析三次，最後利用超濾濃縮管濃縮抗體溶液，獲得高純度、高濃度的hPD-1單克隆抗體。
9）hPD-1單克隆抗體的特異性檢測：利用免疫組化技術進行檢測，選取hPD-1的陽性組織切片進行脫蠟和水化處理，之後封閉內源性過氧化物酶和非特異性抗原。接著加一抗、二抗，最後DAB顯色和核染。本發明所述的hPD-1單克隆抗體具有很好的膜定位、特異性很強、能夠很好的檢測hPD-1陽性組織（如圖3）。
10）hPD-1單克隆抗體亞型測定：利用鼠源單克隆抗體亞型鑑定試劑盒採用ELISA檢測法對Balb/c小鼠和F1小鼠腹水純化的hPD-1單克隆抗體進行亞型鑑定，結果表明：hPD-1單克隆抗體屬於IgG2a亞類，其輕鏈為K鏈。
11）利用PCR技術對製備的單克隆抗體的重鏈可變區進行基因測序。
表1 ELISA檢測Balb/c小鼠血清中的抗體效價表
注釋：1111：>1.5; 1111:0.95-1.5
取效價達到要求的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，融合後兩周，進行ELISA檢測，ELISA步驟和結果如下圖：
（1）包被：用包被緩衝液將本發明製備的PD-1蛋白稀釋至1 μg/mL，然後包被聚苯乙烯板的反應孔，100 μL/孔，4 ℃過夜。
（2）洗滌：棄去孔內的包被液，用洗滌緩衝液孔洗滌3次反應孔，3×3 min（以下簡稱洗滌）。
（3）封閉：每孔加入200 μL的封閉液，37 ℃封閉2 h；儘量棄盡封閉液。
（4）加一抗：每孔加入稀釋5倍細胞培養上清，37 ℃下孵育1 h；孵育完畢後棄盡一抗，充分洗滌後甩幹。
（5）加二抗：每孔加入100 μL用稀釋液稀釋至一定濃度的HRP-羊抗小鼠IgG二抗，37 ℃下孵育30 min；孵育完畢後棄盡酶標二抗，洗滌，甩幹。
（6）顯色：每孔加入100 μL底物TMB，37 ℃避光反應15 min；每孔加入100 mL的終止液以終止顯色反應。測定450 nm的吸光度值（A450）。
實驗結果分析：從ELISA結果中可以看出陰性的結果（NC）只有0.0738，陽性結果（PC）為OVER。表中標記的是抗體效價較高的融合細胞株，分別是：A9、B4、C3、D6、H10;這5株細胞株是對PD-1特異性較強、產生抗PD-1抗體較多的細胞株。將這5株細胞株進行進一步的克隆化培養，直至獲得特異性更強、100%分泌單克隆抗體的融合細胞株。
表2 hPD-1單抗亞型的ELISA結果
實驗結果分析：從抗體亞型鑑定的ELISA結果表中可以看出IgG2A的結果全為OVER，所以本次發明的抗體重鏈為IgG2A；輕鏈結果κ鏈的結果明顯高於λ鏈，而且據文獻描述95%的老鼠抗體均為κ鏈，所以可以判定本次發明的抗體輕鏈為λ鏈。
實施例2
利用Western-Blot技術檢測PD-1蛋白，具體操作步驟如下：
1）對含有PD-1蛋白的生物樣品，利用15%的聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行分離，電泳結束後取下PAGE膠，與PVDF膜做成「三明治」形狀，用溼轉法進行轉膜。
2）電轉完畢，取下PVDF膜，加入5% BSA-TBST(蛋白面朝下），於37 ˚C 搖床搖蕩（65 rpm）封閉1 h ，以消除非特異性背景。
3）封閉結束後用TBST洗掉5% BSA-TBST，加入一抗：本發明製備的hPD-1的單克隆抗體，於脫色搖床搖蕩孵育（60 rpm）1 h或者4 ˚C 孵育過夜（12-16 h），使一抗與特異蛋白結合。
4）回收一抗，用TBST在搖床中洗4次（60 rpm），洗脫時間分別為5 min、10 min、15 min、20 min。
5）加入二抗，於脫色搖床孵育（60 rpm）1 h，使二抗與一抗充分結合。
6）回收二抗，用TBST在搖床中洗4次（60 rpm），洗脫時間分別為5 min、10 min、15 min、20 min。
7）用ECL顯色試劑盒（200 μl試劑A/張+200 μl試劑B/張）孵育3 min。去掉反應液，轉移到保鮮膜上，壓片顯影定影。定影后自然乾燥，佳能相機拍照，記錄實驗結果（如附圖4）。
以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明作的進一步詳細說明、不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明、對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說、在不脫離本發明構思的前提下、還可以做出若干簡單推演或替換、都應當視為屬於本發明所提交的權利要求書確定的保護範圍。
SEQUENCE LISTING
福州大學
一種人源程序性死亡受體hPD-1單克隆抗體
6
6
PatentIn version 3.3
1
261
DNA
重鏈可變區鹼基序列
1
ctctcctgtg cagcctctgg attcactttc agtagctatg ccatgtcttg ggttcgccag 60
actccggaaa agaggctgga gtgggtcgca accattggta gtggtggtgg ttacacctac 120
tatccagaca ctgtgaaggg tcgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg 180
tacctgcaaa tgagcagtct gaggtctgag gacacggcca tgtattattg tgtaagacag 240
tgggattacg acgggggtta c 261
2
79
PRT
重鏈可變區胺基酸序列
2
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10 15
Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile
20 25 30
Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg
35 40 45
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
50 55 60
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
65 70 75
3
267
DNA
輕鏈可變區鹼基序列
3
agtcgtctgg agtcagcctc catctcttgc agatctagtc agagcattgt acatagtgat 60
ggaaacacct atttagaatg gtacctgcag aaaccaggcc agtctccaaa gctcctgatc 120
tacaaagttt ccaatcgatt ttctggggtc ccagacaggc tcagtggcag tggatcaggg 180
acagatttca cactcaagat cagcagagtg gaggctgagg atctgggagt ttattactgc 240
tttcaaggtt cacatgttcc tccgacg 267
4
88
PRT
輕鏈可變區胺基酸序列
4
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
1 5 10 15
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
20 25 30
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
35 40 45
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
50 55 60
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
65 70 75 80
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro
85
5
32
DNA
人工序列
5
tgaattccat atgcccccca ccttctcccc ag 32
6
31
DNA
人工序列
6
gtactcgagt tctgcccttc tctctgtcac c 31