用於成象的鎝-99m標記的肽的製作方法

2023-06-14 03:14:26 4

專利名稱：用於成象的鎝-99m標記的肽的製作方法
發明的背景1.發明的領域本發明涉及放射性診斷試劑和肽，以及標記的放射性診斷劑的製備方法。更具體地說，本發明涉及肽、肽的製備方法和用於製備這類肽的試劑盒、以及使用這類肽使哺乳動物體內的各部位成象的方法，所說的哺乳動物體使用鎝-99m(Tc-99m)通過放射性結合基團標記，所說的放射性鍵合基團與Tc-99m形成中性配合物。
2.現有技術的描述在核藥物領域中，有時需要通過檢測少量體內給藥的放射性標記示蹤化合物(稱之為放射性指示劑或放射性藥物)的分布來定位某些疾病症狀或評估疾病症狀的嚴重程度。用於檢測這些放射性藥物的方法通常被稱之為成象方法或放射性成象方法。
在放射性成象中，放射性標記是發射γ射線的放射性核素，其中使用檢測γ射線的照相機定位放射性指示劑(這種方法經常被稱之為閃爍照相法)。成象部位之所以可檢測是因為選擇使用了可在病變部位定位的放射性指示劑(稱為正反差法)或特定地選擇使用了不能在病變部位定位(稱為負反差法)的放射性指示劑。
必須考慮各種不同的因素以使人體放射性成象達到最佳化。為了使檢測的效率達到最高，優選使用發射γ射線的能量為100至200keV的放射性核素。為了使病人獲得最少量的放射性輻射，放射性核素的物理半衰期應短至僅能滿足成象過程之所需。為了能夠在每天及在每天的任何一個時間進行病理檢查，優選在診所地點始終有一個可獲得的放射性核素源。
各種已知的放射性核素包括67Ga、99mTc(Tc-99m)、111In、123I、125I和169Yb都可用於放射性成象。其中Tc-99m是優選的放射性核素，因為其發出能量為140keV的γ射線，且具有6小時的物理半衰期以及使用鉬-99/鎝-99m發生器易於當地獲得。
使用放射性標記肽的成象方法，其感光性要高於現有技術中使用其它已知放射性藥物進行放射性成象的感光性。因為，放射性肽的特異性結合使放射性信號集中在檢查所感興趣的區域。與靶向物特異性結合的小分子合成肽可以優選地用作放射性指示劑的基質。這是因為1.可用化學方法合成這類肽(不再要求其在生物系統中如細菌或哺乳動物細胞中製備，或者要求其從生物衍生的物質如蛋白質片段中分離)；2.它們是小分子，因而，可迅速地從體內除去那些與非靶向物結合的放射性指示劑，由此減少了背景(非靶向物)放射性和更好地確定靶向物；3.小分子的肽可以容易地經化學處理使其在特異性結合部位的親合力達到最大。
小分子易於合成的標記肽優選用作日常使用的放射性藥物。顯然，目前仍需要有能直接注入病人體內並通過在疾病部位的定位使疾病部位成象的小分子合成的標記肽。由於Tc-99m可用作成象用放射性核素的特性和特異性結合的小分子合成肽作為放射性指示劑分子的效用，Tc-99m標記的小分子合成肽作為γ射線閃爍照相法的放射性指示劑明顯具有許多優點。
現有技術中已經報導了放射性標記的肽。
Ege等人在美國專利4,832,940中教導了用於定位T-淋巴細胞成象的放射性標記的肽。
Olexa等人，於1982年，在歐洲專利申請823017009中公開了選自從交聯的血纖維蛋白分離得到的片段E1和從交聯的血纖維蛋白分離得到的片段E2的藥學上可接受的放射性標記的肽，和具有片段E1和片段E2之間的胺基酸序列中間體的肽。
Ranby等人，於1988年，在PCT/US88/02276中公開了檢測動物體內血纖維蛋白的方法，該方法包括將放射性標記的化合物共價結合到血纖維蛋白上。
Hadley等人，於1988年，在PCT/US88/03318中公開了包括如下步驟的檢測體內血纖維蛋白-血小板凝塊的方法(a)給病人施用標記的稀釋溶解血栓蛋白，其中標記選擇性地連接在血纖維蛋白結合區域之外的那部分溶解血栓蛋白上；(b)檢測病人體內標記的溶解血栓蛋白的分布狀況。
Lees等人，於1989年，在PCT/US89/01854中教導了用於動脈成象的標記肽。
Sobel，於1989年，在PCT/US89/02656中公開了使用標記的酶失活組織纖維蛋白溶酶原激活劑定位動物體內一個或多個血栓位置的方法。
Stuttle，於1990年，在PCT/GB90/00933中公開了含有3至10個包含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)序列的胺基酸並能結合到體內RGD結合部位上的放射性標記的肽。
Maraganore等人，於1991年，在PCT/US90/04642中公開了放射性標記的血栓抑制劑，其包含(a)抑制劑部分；(b)連接部分；和(c)陰離子結合位置部分。
Rodwell等人，於1991年，在PCT/US91/03116公開了「分子識別單元」與「效應物域」的共軛物。
Tubis等人，於1968年，在Int.J.Appl.Rad.Isot.19835-840中描述了用鎝-99m標記肽的方法。
Sundrehagen，於1983年.在Int.J.Appl.Rad.Isot.341003中描述了用鎝-99m標記多肽的方法。
在現有技術中，螯合劑在放射性標記多肽方法中的應用以及使用Tc-99m標記肽和多肽的方法都是已知的，並且公開在共同待審的美國專利申請07/653,012和07/807,062中，這兩篇專利申請在此引用作為參考文獻。
儘管Tc-99m最適宜用於放射性成象，但是，目前對於Tc-99m化學特性的研究還不象對其它元素化學特性的研究那樣全面。為此，至今尚未大量使用由Tc-99m標記的方法。Tc-99m通常是以Tc-99m的高鎝酸鹽(TcO-4，鎝為+7價氧化態)的形式獲得，一般從鉬-99/鎝-99m發生器中得到。但是，高鎝酸鹽不能良好地與其它化合物結合。因此，為了放射性標記肽，必需將Tc-99m的高鎝酸鹽轉化成其它的形式。由於鎝在水溶液中不能形成穩定的離子，所以必需將其以配位化合物的形式置於一種溶液中，所說的溶液具有足夠的穩定性以阻止其分解並最終使Tc-99m轉化成不溶的二氧化鎝或再轉化成高鎝酸鹽。
上述這類Tc-99m的配位化合物(以+1至+6價氧化態)是已知的。但是，許多這類配位化合物由於其分子形狀的原因而不適合用於放射性標記。為了進行放射性標記，特別有利的是將配位化合物製成螯合物，在該螯合物中通過單一的螯合配位體提供所有圍繞鎝離子的供電子團。由此，通過螯合劑和肽之間的單一連接體使螯合的Tc-99m共價結合到肽上。
這些配位體有時被稱為具有螯合部分和連接部分的雙功能螯合劑。這類化合物在現有技術中也是已知的。
Byme等人在美國專利4,434,151中描述了高半胱氨酸硫羥內酯(thiolactone)衍生的雙功能螯合劑，該螯合劑能夠使放射性核素偶合到含有氨基末端的化合物上，所說的含有氨基末端的化合物能夠在待成象的器官或組織中定位。
Fritzberg，在美國專利4,434,151中描述了一系列以2，3-二(巰基乙醯氨基)丙酸鹽為基質的鎝螯合劑。
Byme等人在美國專利4,571,430中描述了用於螯合放射性核素的新的高半胱氨酸硫羥內酯雙功能螯合劑，，該螯合劑能夠使放射性核素偶合到含有氨基末端的化合物上，所說的含有氨基末端的化合物能夠在待成象的器官或組織中定位。
Byme等人在美國專利4,575,556中描述了用於螯合放射性核素的新的高半胱氨酸t硫羥內酯雙功能螯合劑，該螯合劑能夠使放射性核素偶合到含有氨基末端的化合物上，所說的含有氨基末端的化合物能夠在待成象的器官或組織中定位。
Davison等人在美國專利4,673,562中描述了主要用作腎功能監視劑的二醯氨基-二硫代-配位體的鎝螯合物和其鹽。
Nicolotti等人在美國專利4,861,869中描述了用於與生物分子如抗體形成共軛物的雙功能偶合劑。
Fritzberg等人在美國專利4,965,392中描述了用於標記蛋白質的各種S-保護的以巰基乙醯基甘氨醯基甘氨酸為基質的螯合劑。
Fritzberg等人在歐洲專利申請86100360.6中描述了用於製備鎝標記的成象試劑的二巰基、二氨基、或二醯氨基羧酸或胺配合物。
Dean等人，於1989年，在PCT/US89/02634中描述了用於放射性標記蛋白質和肽的雙功能偶合劑。
Flanagan等人在歐洲專利申請90306428.5中公開了通過一組有機螯合分子用Tc-99m對合成肽片段進行標記的方法。
Albert等人在歐洲專利申請WO91/01144中公開了使用放射性標記的肽進行放射性成象的方法，所說的放射性標記的肽與生長因子、激素、幹擾素和細胞分裂素有關並含有共價連接在放射性核素螯合基團上的特異性識別肽。
Dean在共同待審的美國專利申請07/653,012中教導了用於製備肽的試劑和方法，所說的肽含有共價連接在用於體內放射性成象的特異性結合肽上的Tc-99m螯合基團，該美國專利申請在此作為參考文獻使用。
Baidoo Lever於1990年，在Bioconjugate Chem，1132-237中描述了使用提供陽離子鎝配合物的雙氨雙巰基基團標記生命分子的方法。
可以簡單地通過加入含巰基部分如半胱氨酸或巰基乙酸來標記肽。這類方法在現有技術中已有描述。
Schochat等人在美國專利5,061,641中公開了對含有至少一個「懸掛的」巰基的蛋白質進行直接放射性標記的方法。
Dean等人在共同待審的美國專利申請07/807,062中教導了通過含有游離巰基的連接基團來放射性標記肽的方法，該美國專利申請在此作為參考文獻使用。
Goedemans等人在PCT申請WO89/07456中描述了使用環硫醇化合物，特別是2-亞氨基硫醇和其衍生物放射性標記蛋白質的方法。
Thornback等人在歐洲專利申請90402206.8中描述了使用含有巰基的化合物，特別是2-亞氨基硫醇進行放射性標記的蛋白質的製備方法和應用。
Stuttle在PCT申請WO90/15818中描述了Tc-99m標記含有RGD的低聚肽的方法。
Burns等人，於1985年，在歐洲專利申請85104959.3中描述了用於製備少量中性Tc-99m腦成象劑的雙胺雙硫醇化合物。
Kung等人於1986年，在歐洲專利申請86105920.2中描述了用於製備少量中性Tc-99m成象劑的雙胺雙硫醇化合物。
Bergstein等人於1988年，在歐洲專利申請88102252.9中描述了用於製備少量中性Tc-99m腦成象劑的雙胺雙硫醇化合物。
Bryson等人於1988年，在Inorg.Chem.272154-2161中描述了對於過量配位體呈不穩定狀態的鎝-99的中性配合物。
Misra等人於1989年，在Tet.Let.301885-1888中描述了用於標記的雙胺雙硫醇化合物。
Bryson等人於1990年，在Inorg.Chem.292948-2951中描述了可以生成中性Tc-99m配合物的含有二個醯氨基、一個巰基和一個取代的吡啶基的螯合劑。
Taylor等人於1990年，在J.Nucl.Med.31885(摘要)中描述了用於腦成象的中性Tc-99m配合物。
使用螯合劑對肽進行放射性標記，和用Tc-99m標記肽的方法在現有技術中是已屬已知技術，並已公開在下面共同待審的美國專利申請中07/653,012、07/807,062、07/871,282、07/886,752、07/893,981、07/955,466、08/019,864、08/073,577、08/210,822、08/236,402和08/241,625。為使血栓成象而用作閃爍照相成象劑的標記肽在現有技術中也是已知的，並已公開在下面共同待審的美國專利申請中07/886,752、07/893,981和08/044,825；以及公開在國際專利申請PCT/US92/00757、PCT/US92/10716、PCT/US93/02320、PCT/US93/03687、PCT/US93/04794、PCT/US93/05372、PCT/US93/06029、PCT/US93/09387、PCT/US94/01894、PCT/US94/03878和PCT/US94/05895。上述每篇文獻以其整體在此被引用作為參考文獻。
發明的簡要說明本發明提供了放射性標記肽的閃爍照相成象劑。本發明的放射性標記肽含有與體內的靶向物特異性結合的肽並共價連接到放射性標記結合部分，其中放射性標記結合部分與放射性同位素相結合。本發明一個特有的優點就是放射性標記結合部分共價連接在含有肽的胺基酸殘基的側鏈上。
由於下述的多種原因，上述這種共價連接模式十分有利。第一、與肽的胺基酸組分的側鏈形成共價連接避免了共價連接的放射性標記結合部分對於特異性結合肽的特異性結合特性的幹擾。第二、這種連接方式可以使環肽(其定義是指端部不含有游離的氨基或羧基)與本申請公開的用作閃爍照相成象劑的放射性標記結合部分一起使用。第三、與胺基酸組分的側鏈形成的共價連接可以使照相檢查更為靈活地選取使用各種本發明的閃爍照相成象劑以最大限度地提高效率和降低抗原性等。與胺基酸側鏈的共軛作用使得放射性標記結合部分可以在肽的合成過程中以胺基酸共軛物的形式加入肽中，或在肽的合成結束之後加入肽中。最後，環肽公知是抗外蛋白酶消化的，由此而將體內的這種提高了穩定性的肽結合至本發明的閃爍照相成象劑中。
本發明的第一個方面是提供可用於哺乳動物體內各部位成象的放射性標記的肽。所說的肽包含具有胺基酸序列和與該肽共價連接的放射性標記結合部分的特異性結合的肽。另外，放射性標記結合部分共價連接在包含該肽的胺基酸的側鏈上。在優選的實施方案中，放射性標記結合部分共價連接在具有包含胺或硫醇的側鏈的胺基酸側鏈上，胺基酸最優選的是賴氨酸或高半胱氨酸。在另一個優選的實施方案中，放射性標記是鎝-99m。
本發明的第二個方面是提供一種用於製備哺乳動物體內各部位成象用的閃爍照相成象劑的試劑，所說的試劑包含特異性結合的肽，該特異性結合的肽中放射性標記結合部分通過肽的胺基酸的胺基酸側鏈共價連接在該肽上，所說的放射性結合部分具有下面的通式IC(pgp)s-(aa)-C(pgp)s其中(pgp)s是保護的半胱氨酸，(aa)是任何不含硫羥基的初級α-或β-胺基酸。在優選的實施方案中，胺基酸是甘氨酸。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種用於製備哺乳動物體內各部位成象用的閃爍照相成象劑的試劑，所說的試劑包含特異性結合的肽，其中放射性標記結合部分通過肽的胺基酸的胺基酸側鏈共價連接在該肽上，所說的放射性結合部分具有下面的通式IIA-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X其中A是H、HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC或R4；B是H、SH或-NHR3，-N(R2)-(胺基酸或肽)或R4；Z是H或R4；X是SH或-NHR3、-N(R3)-(胺基酸或肽)或R4；R1、R2、R3和R4分別為H或直鏈或支鏈低級烷基或低級環烷基；n是0、1或2；其中(肽)是2至約10個胺基酸的肽；和；(1)當B為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)時，X是SH和n是1或2；(2)其中當X為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)時，B是SH和n是1或2；(3)當B為H或R4時，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC，X是SH和n是0或1；(4)當A為H或R4，而其中的B為SH時，X是-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)和當X是SH時，B是-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)；(5)當X為H或R4時，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC和B是SH；(6)當Z為甲基時，X是甲基，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC和B是SH和n是0；和(7)當B為SH和X為SH時，n不為0；以及其中硫羥基部分為還原形式和其中(胺基酸)是任何不含硫羥基的初級α-或β-胺基酸。
在本發明這一方面的具體實施方案中，放射性標記結合的部分具有下面的通式IIa.-(胺基酸)1-(胺基酸)2-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}IIb.-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(胺基酸)1-(胺基酸)2IIc.-(伯α，ω-或β，ω-二胺基酸)-(胺基酸)1-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}或IId.-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(胺基酸)1-(初級α，β-或β，γ-二胺基酸)其中(胺基酸)1和(胺基酸)2分別為任何天然生成的、修飾的、取代的或改變的不含硫醇基的α-或β-胺基酸；A是H、HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC或R4；B是H、SH或-NHR3、-N(R2)-(胺基酸或肽)或R4；Z是H或R4；X是SH或-NHR3、-N(R3)-(胺基酸或肽)或R4；R1、R2、R3和R4分別為H或直鏈或支鏈低級烷基或低級環烷基；n是0、1或2；(肽)是2至約10個胺基酸的肽；和(1)當B為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)時，X是SH和n是1或2；(2)當X為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)時，B是SH和n是1或2；(3)當B為H或R4時，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC，X是SH和n是0或1；(4)當A為H或R4，而B為SH時，X是-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)和當X是SH時，B是-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)；(5)當X為H或R4時，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC和B是SH；(6)當Z為甲基時，X是甲基，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC和B是SH和n是0；和(7)當B為SH和X為SH時，n不為0；以及其中硫羥基部分為還原形式。
在另一個實施方案中，本發明提供了用於哺乳動物體內各部位成象的放射性標記的肽，所說的肽包含特異性結合的肽，該特異性結合的肽中放射性標記結合部分通過肽的胺基酸的胺基酸側鏈共價連接在肽上，所說的放射性結合部分具有下面的通式
{為了本發明的目的，具有這種結構的放射性標記結合部分將被稱之為吡啶甲酸(Pic)為基礎的部分}或
{為了本發明的目的，具有這種結構的放射性標記結合部分將被稱之為吡啶甲基胺(Pica)為基礎的部分}其中X為H或保護基團；(胺基酸)是任何胺基酸；放射性標記結合部分共價連接至肽上，放射性標記結合部分和放射性標記的配合物呈電中性。在優選的實施方案中，胺基酸是甘氨酸及X為乙醯氨基甲基保護基。在另一優選的實施方案中，肽通過胺基酸共價連接到放射性標記結合部分上，最優選的是胺基酸為甘氨酸和放射性標記為鎝-99m。
在本發明的另一實施方案中，提供了一種用於哺乳動物體內各部位成象的放射性標記的肽，所說的肽包含特異性結合的肽和通過肽的胺基酸側鏈共價連接到肽上的雙氨基雙巰基放射性標記結合部分。在本發明的這一實施方案中的雙氨基雙巰基放射性標記結合部分具有選自下面通式組的通式
其中每個R分別為H、CH3、或C2H5；每個(pgp)s分別為硫羥基保護基或H；m、n和p分別為2或3；A為直鏈或環狀的低級烷基、芳基、雜環基、它們的組合或取代的衍生物；和X為肽；以及
其中每個R分別為H、CH3、或C2H5；m、n和p分別為2或3；A是直鏈或環狀的低級烷基、芳基、雜環基、它們的組合或取代的衍生物；V為H或CO-肽；R』為H或肽；其前提條件是當V為H時，R』是肽，而當R』為H時，則V為肽。{為了本發明的目的，具有這些結構的放射性標記結合部分將被稱之為「BAT」部分}。在優選的實施方案中，肽通過胺基酸共價連接到放射性標記結合部分，最優選的是胺基酸為甘氨酸，放射性標記為鎝-99m。
在本發明上述這些方面的優選實施方案中，特異性結合化合物是包含3至100個胺基酸的肽。最優選的放射性標記是鎝-99m。
本發明提供的特異性結合肽包括(但並不僅限於這些)具有下述序列的肽甲醯-MLF(VGVAPG)3醯胺(VPGVG)4醯胺RALVDTLKFVTQAEGAK醯胺RALVDTEFKVKQEAGAK醯胺PLARITLPDFRLPELAIP醯胺GQQHHLGGAKAGDVPLYKKIIKKLLESLRALVDTLK醯胺GGGLRALVDTLK醯胺GGGLRALVDTLKFVTQAEGAK醯胺GGGRALVDTLKALVDTL醯胺GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYRPSPSPIHPAHHKRDRRQ醯胺GGGFD.Cpa.YWDKTFT醯胺
{SYNRGDSTC}3-TSEAGGGLRALVDTLK醯胺GCGGGLRALVDTLK醯胺GCYRALVDTLKFVTQAEGAK醯胺GC(VGVAPG)3醯胺本發明的試劑可以形成為其中特異性結合化合物或放射性標記結合部分均共價連接在多價連接部分上。本發明的多價連接部分包含至少2個相同的能夠共價結合到特異性結合化合物或放射標記結合部分上的連接體官能基團。優選的連接體官能基團是伯胺或仲胺、羥基、羧酸基團或巰基反應基團。在優選的實施方案中，多價連接部分包含雙琥珀醯亞氨基甲基醚(BSME)、4-(2，2-二甲基乙醯基)苯甲酸(DMAB)、三(琥珀醯亞氨基乙基)胺(TSEA)、N{2-N』，N』-二(2-琥珀醯亞氨基乙基)氨基乙基〕}-N6，N9-二(2-甲基-2-巰基丙基)-6，9-二氮壬醯胺(BAT-BS)、二-(乙醯亞氨基乙基)醚、三(乙醯亞氨基乙基)胺、二-(乙醯亞氨基乙基)醚、二-(乙醯亞氨基甲基)醚、α，ε-二乙醯基賴氨酸、賴氨酸和1，8-二乙醯亞氨基-3，6-二氧雜辛烷。
本發明還包括本發明的肽和Tc-99m形成的配合物以及用Tc-99m放射性標記本發明肽的方法。本發明提供的放射性標記配合物是在還原劑存在下，由本發明的肽與Tc-99m反應而製得。優選的還原劑包括(但不僅限於這些)連二亞硫酸鹽離子、亞錫離子和亞鐵離子。本發明的配合物還可以通過本發明提供的預還原的Tc-99m配合物的配位體交換用Tc-99m標記本發明的肽而製得。
本發明還提供了用於製備由Tc-99m標記的本發明肽的試劑盒。用於由Tc-99m標記本發明肽的試劑盒包括一個含有預定量本發明的肽和足夠量用於由Tc-99m標記肽的還原劑的封閉的小瓶。
本發明提供了通過體內的化學合成製備本發明肽的方法。在優選的實施方案中，肽通過固相肽合成方法來合成。
本發明提供了Tc-99m標記的肽通過在體內獲得γ射線閃爍照相法成象而使哺乳動物體內各部位成象的使用方法。這些方法包括施用診斷有效量的本發明的Tc-99m放射性標記肽和檢測在哺乳動物體內的檢查部位定位的Tc-99m發射的γ射線。
本發明特別優選的實施方案會通過下面一些優選實施方案和權利要求的更為詳細的說明變得十分明顯。
附圖的簡要說明

圖1表示患有腫瘤大鼠體內的99mTc-P587的成象。
發明的詳細說明本發明提供了用於在哺乳動物體內各靶向部位成象的Tc-99m標記的肽，所說的肽包含通過胺基酸側鏈共價連接在放射性標記結合部分上的胺基酸序列，其中放射性標記結合部分與放射性同位素相結合。
使用Tc-99m進行標記是本發明的一個優點，因為這種同位素的核特性和放射特性使其成為一種理想的閃爍照相成象劑。這種同位素具有140keV的單一光子能和約6小時的放射性半衰期，並且易於從99Mo，99mTc發生器中獲得。在現有技術中已知的其它放射性核素則具有太長的有效半衰期(例如111In的半衰期為67.4小時)或者具有毒性(例如125I)。
在放射性標記結合部分和與該部分共價連接的肽中(所說的放射性標記結合部分含有共價連接在本發明提供的硫羥基保護基[(pgp)5]上的硫羥基)，硫羥基保護基可以相同或不同並可以是(但並不僅限於這些)-CH2-芳基(芳基是苯基或烷基或烷氧基取代的苯基)；-CH-(芳基)2，(芳基是苯基或烷基或烷氧基取代的苯基)；-C-(芳基)3，(芳基是苯基或烷基或烷氧基取代的苯基)；-CH2-(4-甲氧基苯基)；-CH-(4-吡啶基〕(苯基)2；-C(CH3)3-9-苯基芴基；-CH2NHCOR(R是未取代的或取代的烷基或芳基)；-CH2-NHCOOR(R是未取代的或取代的烷基或芳基)；-CONHR(R是未取代的或取代的烷基或芳基)；-CH2-S-CH2-苯基優選的保護基具有通式-CH2-NHCOR，其中R是具有1至8個碳原子的低級烷基、苯基或有低級烷基、羥基、低級烷氧基、羧基或低級烷氧基羰基取代的苯基。最優選的保護基是乙醯氨基甲基。
本發明的每個含有特異性結合肽的實施方案都包含胺基酸序列。本發明中所用的術語胺基酸是指天然生成或非天然生成的所有L-或D-胺基酸。
本發明的肽可以在體內化學合成。通常，本發明的肽優選在胺基酸合成器中製備。本發明的肽也可以這樣來合成，即其中使用本領域內的普通技術人員熟知的技術，使放射性標記結合部分在體外化學合成過程中共價連接到肽上。由於可以確定共價連接的具體部位，因此，這種在合成中共價連接到放射性標記結合部分上的肽是優選的。
本發明中特別優選將放射性標記結合部分通過靶向特異性結合肽的胺基酸側鏈共價連接到肽上。上述的共價連接可以通過與特定的胺基酸側鏈形成共價鍵而將放射性標記結合部分偶合到肽上來完成，或者也可以通過結合在肽合成中與放射性標記結合部分共軛的胺基酸來完成。
在前一種情況下，例如，在pH8-10的條件下，將放射性標記結合部分CLCH2CO.Gly-Gly-Cys-Lys醯胺(特別是，在合成過程中，通過半胱氨酸殘基中巰基的三苯甲基化來保護)偶合到生長激素釋放的抑制因子受體結合的肽cyclo.(N-CH2).Phc-Tyc-(p-Trp)-Lys-Val-Hcy上生成肽cyclo.(N-CH2).phc-Tyc-(p-Trp)-Lys-Val-Hcy.(CH2CO).Gly-Gly-Cys-Lys醯胺(接著脫去保護)。在上述該通式中，應該認識到放射性標記結合部分是共價連接在高半胱氨酸的側鏈硫原子上。
在另一種情況下，通過使用在肽合成過程中製得的賴氨酸衍生物，Na(Fmoc)-Nε(N9-(叔丁氧基羰基)-N6，N9-二(2-甲基-2-三苯基甲基硫代丙基)-6，9-二氮壬醯基)賴氨酸將放射性標記結合部分BAT(N6，N9-二(2-巰基-2-甲基丙基)-6，9-二氮壬酸)結合到白細胞結合肽，甲醯基.Met-Leu-Phe-Lys.醯胺上。
本發明其它的放射性標記結合部分可以在肽合成中引入靶向特異肽上。可以將含有吡啶甲酸的放射性標記結合部分共價連接到賴氨酸的ε-氨基上得到，例如，αN(Fmoc)-Lys-εN[Pic-Gly-Cys(保護基)]，其可以結合到肽鏈的任何位置上。該序列特別優選，因為其提供了易於結合到靶向物結合肽的模式。
在放射性鎝和本發明肽的配合物的製備方法中，在還原劑存在下，鎝配合物，優選為Tc-99m的高鎝酸鹽，與本發明的肽進行反應。優選的還原劑是二亞硫酸鹽離子、亞錫離子和亞鐵離子。最優選的還原劑是二氯化錫。在其它的優選實施方案中，還原劑是固相還原劑。配合物和製備這類配合物的方法通常是以一個試劑盒的形式提供，所說的試劑盒包含一個含有預定量待標記的本發明的肽和足夠量用於由Tc-99m標記肽的還原劑的封閉小瓶。另外，所說的配合物也可以通過本發明的肽與預選製得的鎝和另一種作為轉移配位體的已知化合物形成的易變配位化合物的反應而生成。該方法是被稱之為配位體交換的已知方法並已為本領域內的普通技術人員所熟知。易變配位化合物可以使用象酒石酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽或甘露糖醇這樣的轉移配位體來製備。本發明使用的Tc-99m的高鎝酸鹽包括鹼金屬鹽如鈉鹽、或銨鹽或低級烷基銨鹽。
在本發明優選的實施方案中，提供了用於製備鎝標記的肽的試劑盒。本發明的肽可以使用本領域內的普通技術人員所熟知的和下述的方法和手段化學合成。由此製得的肽包含3-100個胺基酸殘基，並且這種肽共價連接在放射性標記結合部分上，所說的放射性標記結合部分與放射性同位素相結合。肽是以足以能滿足用Tc-99m標記肽的量被引入到含有還原劑如二氯化錫或固相還原劑的小瓶中。該小瓶中還包含了如上所述的轉移配位體(如酒石酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽或甘露糖醇)。本發明的鎝標記的肽可以通過將適量的Tc-99m或Tc-99m配合物加入到小瓶中並在下述實施例3中所述的條件下進行反應來製備。
本發明提供的放射性標記的肽具有適量的放射性。在Tc-99m放射性配合物的製備中，通常，優選製得在含放射性濃度為每毫升約0.01毫居裡(mCi)至100mCi的溶液中的放射性配合物。
本發明提供的放射性標記的肽可以用於使哺乳動物體內各部位顯象。根據本發明，將鎝標記的肽以一個單位的可注射劑量給藥。任何本領域內的普通技術人員所熟知的常用載體，如無菌鹽水溶液或血漿都可以在放射性標記之後，用於製備可注射的溶液。所說的可注射溶液根據本發明的方法使各器官、腫瘤等診斷成象。通常，給藥的單位劑量具有的放射性為約0.01mCi至100mCi，優選1至20mCi。以單位劑量注射的溶液為約0.01毫升至約10毫升。在靜脈注射給藥之後，可以在幾分鐘後使體內的器官或腫瘤成象。但是，如果需要，也可在放射性標記肽注射入病人體內數小時或更長的時間之後成象。在大多數情況下，在0.1小時內，給藥劑量中有足夠量的放射性標記肽在待成象的區域積累以進行閃爍照相。任何診斷用的常用閃爍照相成象方法都可用於本發明。
可以將本發明提供的鎝標記的肽和配合物置於任何靜脈注射常用的介質如鹽酸水溶液介質或血漿介質中並通過靜脈注射給藥。上述這種介質還可含有常用的藥物添加劑物質如用於調節滲透壓的藥學上可接受的鹽、緩衝劑、防腐劑及類似物質。優選的介質是常用的鹽水和血漿。
下面將用實施例更為全面地說明製備和標記這些化合物的方法。這些實施例說明了上述方法的一些方面和有利的效果。它們只是用於說明本發明，而並不是用來限定本發明。
實施例1固相肽合成使用Applied Biosystems Model 431A肽合成反應器和使用二環己基碳化二亞胺/羥基苯並三唑或2-(1H-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/羥基苯並三唑(HBTU/HOBT)與9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)偶合的氨基末端保護和使用用於羧基末端酸的對羥基甲基苯氧基甲基聚苯乙烯(HMP)樹脂或用於羧基末端醯胺的Rink醯胺樹脂，以0.25毫摩爾(mmole)的規模，進行固相肽合成(SPPS)。在室溫下，使用含有三乙酸、水、苯硫基甲烷、乙二硫醇和三乙基矽烷(含量比為100∶5∶5∶2.5)的溶液將樹脂結合產物裂解1.5-3小時。
在適當的情況下，通過下述步驟以引入αN-甲醯基，即用在98％甲酸中的過量乙酸酐處理裂解和去保護後的肽，並攪拌約18小時，然後使用HPLC提純。在適當情況下，通過用20％(體積/體積)在NMP(N-甲基吡咯烷酮)中的乙酸酐對結合在樹脂上的游離N-氨基末端肽處理30分鐘以引入N-乙醯基末端。通過使用作為SPPS中待偶合的最後殘基的2-滷代乙酸或者通過用2-滷代乙酸/二異丙基碳化二亞胺/在2-滷代乙酸酐的NMP中的N-羥基琥珀醯亞胺/在NMP中的二異丙基乙胺處理與樹脂結合的游離N-末端氨基肽以引入2-氯乙醯基和2-溴乙醯基。在適當的情況下，通過下述方法使用HPLC提純的2-滷代乙醯化的肽環化，所述的方法包括將在含或不含0.5-1.0毫摩爾EDTA的碳酸氫鈉或氨水緩衝液(pH8)中的0.1-1.0毫克/毫升溶液攪拌1-48小時，然後用乙酸酸化，冷凍乾燥和使用HPLC提純。在適當的情況下，通過用0.006摩爾K3Fe(CN)6的等分試樣處理以0.1毫克/毫升的濃度處於pH7緩衝溶液中的前體半胱氨酸-游離巰基肽直至其保持穩定的黃色以使Cys-Cys二硫醚鍵發生環化。用過量的半胱氨酸還原過量的氧化劑，冷凍乾燥混合物，然後用HPLC提純。
在適當的情況下，通過使用二異丙基碳化二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺使吡啶甲胺共軛到前體肽上以引入「Pica」基團。通過使用作為SPPS中待偶合的最後殘基的BAT酸或用BAT酸/二異丙基碳化二亞胺/在NMP中的N-羥基琥珀醯亞胺處理結合在樹脂上的N-末端游離氨基肽以引入BAT配位體。通過下述方法使[BAM]共軛到肽上，所述方法包括，首先使用在DMF、NMP或CH2CL2中的二異丙基碳化二亞胺/N-羥基琥珀醯亞胺或HBTU/HOBt的混合物活化肽羧酸酯，然後，在二異丙基乙胺存在下，使其偶合；偶合後，按照上述的方法使所得的共軛物去保護。
在適當情況下，在室溫下，通過含單一巰基的肽(濃度為5-50毫克/毫升，在50毫摩爾磷酸鈉緩衝液中的溶液，PH8)與預先溶解在乙腈中的0.5摩爾當量BMME(二馬來醯亞氨基甲基醚)反應約1-18小時製備BSME加成物。將反應所得溶液濃縮並用HPLC提純濃縮得到的產物。
在適當情況下，在室溫下，通過含單一巰基的肽(濃度為10-100毫克/毫升，在DMF中的肽溶液或濃度為5-50毫克/升，在毫克磷酸鈉(PH8)/乙腈或THF中的肽溶液)與預先溶解在乙腈中或DMF中的含或不含1摩爾當量三乙醇胺的0.33摩爾當量的TMEA(三(2-馬來醯亞氨基乙基)胺(其公開在美國專利申請08/044,825中，該申請在此引用作為參考文獻))反應約1-18小時製備TSEA加成物。將含有加成物的反應混合物濃縮，然後再用HPLC提純該加成物。
在適當情況下，在室溫下，通過通過含有單一巰基的肽(濃度為2-50毫克/毫升，在50磷酸鈉(PH8)/乙腈或THF中的肽溶液)與預先溶解在乙腈或THF中的0.5摩爾當量的BAT-BM(N-[2-(N』，N』-二(馬來醯氨基甲基硫代丙基)氨基乙基)]-N9-(叔丁氧基羰基)-N6，N9-二(2-甲基-2-三苯基甲基硫代丙基)-6，9-二氮壬醯胺)(其公開在美國專利申請08/044,825，該申請在此引用引用作為參考文獻)反應約1-18小時製備BAT-BS加成物。將反應所得溶液蒸發至幹並通過用10毫升TFA和0.2毫三乙基矽烷處理1小時使[BAT-BS]-肽共軛物去保護。將溶液濃縮，用乙醚使產物加成物沉澱，然後再用HPLC濃縮。
通過製備性高壓液相色譜(HPLC)分離提純粗產物肽，其中使用WatersDdlta Pak C18柱和使用0.1％三氟乙酸在由乙腈改性的水中的溶液進行梯度洗脫。在乙腈從洗脫餾份中蒸除之後，將該洗脫餾份冷凍乾燥。由快速原子爆炸質譜(FABMS)確認每種產物都相同。
實施例2用Tc-99m進行放射性標記的一般方法將0.1毫克實施例2中製得的肽溶解在0.1毫升水或50毫升磷酸鉀緩衝液中(PH=5.6或7.4)。通過下述方法製備Tc-99m的葡庚糖酸鹽，該方法包括用含有至多200mCi的1.0毫升Tc-99m高鎝酸鈉再配製一個Glucoscan小瓶(E.I.DuPont de Nemours，Inc.)並將其在室溫下放置15分鐘。然後，將25微升Tc-99m的葡庚糖酸鹽加入到肽中，並使其在室溫下或100℃下反應15-30分鐘，通過0.2微米過濾器過濾。
通過使用下述條件的HPLC測定Tc-99m標記肽的純度用放射性標記肽裝載Waters DeltaPure RP-18，5μ，150毫米×3.9毫米分析柱；以1毫升/分鐘的溶劑流速洗脫肽。經20分鐘從10％溶劑A(0.1％CF3COOH/H2O)至40％溶劑B90(0.1％CF3COOH/90％CH3CN/H2O)進行梯度洗脫。
使用與積分記錄器相連的聯機放射性檢測器檢測放射性組分。在上述條件下，在1至4分鐘之間洗脫Tc-99m的葡庚糖酸鹽和Tc-99m高鎝酸鈉，而Tc-99m標記肽則在很長一段時間之後才洗脫。
下面的表格說明了用上述方法對實施例2製得的肽成功地進行了Tc-99m標記。
表I
表I(續)
*上標是指下面的標記條件1=室溫下，在10％HPCD中，2=在室溫下，在50/50乙醇/水中3=在100℃，在0.9％NaCl中HPLC方法(用RT後的上標表示)Waters-1柱，在10分鐘內100％溶液A→100％溶液B
表II
*下述是相應的肽使用的標記條件1.將肽溶解在50毫摩爾磷酸鉀緩衝液(PH7.4)中並在室溫下標記。
2.將肽溶解在50毫摩爾磷酸鉀緩衝液(PH7.4)中並在100℃下標記。
3.將肽溶解在水中並在室溫下標記。
4.將肽溶解在水中並在100℃下標記。
5.將肽溶解在50毫摩爾磷酸鉀緩衝液(PH6.0)中並在100℃下標記。
6.將肽溶解在50毫摩爾磷酸鉀緩衝液(PH5.0)中並在室溫下標記。
**HPLC方法一般方法 溶劑A ＝0.1％CF3COOH/H2O溶劑B70＝0.1％CF3COOH/70％CH3CN/H2O溶劑B90＝0.1％CF3COOH/90％CH3CN/H2O溶劑流速＝1毫升/分鐘Vydak柱＝帶有防護柱的Vydak218TP54RP-18，5μ×220毫米×4.6毫米分析柱Brownlee柱＝Brownlee Spheri-5 RP-18，5μ×220毫米×4.6毫米分析柱Waters柱＝Waters Delta-Pak C18，5μm，39毫米×150毫米方法1Brownlee柱10分鐘內從100％A至100％B70方法2Vydak柱 10分鐘內從100％A至100％B90方法3Vydak柱 10分鐘內從100％A至100％B70方法4Brownlee柱10分鐘內從100％A至100％B90方法5Waters柱 10分鐘內從100％A至100％B90用單一字母縮寫表示胺基酸可以在G.Zubay，Biochemistry(2d.ed.)，1988(MacMillenPublishingNew york)第33頁上找到；Ac＝乙醯基；Pic＝吡啶甲醯基(吡啶-2-羰基)＝6氨基己酸；Hly＝高賴氨酸(homolysine)；Acm＝乙醯亞氨基甲基；pGlu＝焦穀氨酸；Mob＝4-甲氧基苄基；Pica＝吡啶甲基胺(2-(氨基甲基)吡啶)；Apc＝L-[S-(3-氨基丙基)半胱酸；FD＝D-苯基丙氨酸；WD＝D色氨酸；YD＝D酪氨酸；Cpa＝L(4-氯苯基)丙氨酸；Thp＝4-氨基-四氫噻喃-4-羧酸；ma＝巰基乙酸；DNal＝D-2-萘基丙氨酸；Dpg＝-二丙基甘氨酸；Nle＝正亮氨酸；BAT＝N6，N9-二(2-巰基-2-甲基丙基)-6，9-二氮壬酸；BAT酸(保護的)＝N9-(叔丁氧基羰基)-N6，N9-二(2-甲基-2-三苯基甲基硫代丙基)-6，9-二氮壬酸；BAM＝N1，N4-二(2-巰基-2-甲基丙基)-1，4，10-三氮癸烷；BAM(保護的)＝N1-(叔丁氧基羰基)-N1，N4-二(2-甲基-2-三苯基甲基硫代丙基)-1，4，10-三氮癸烷；[BAT-BM]＝N-[2-(N』，N』-二(2-馬來醯亞氨基乙基)氨基乙基]-N9-(叔丁氧基羰基)-N6，N9-二(2-甲基-2-三苯基甲基硫代丙基)-6，9-二氮壬醯胺；[BAT-BS]＝N-[2-(N』，N』-二(2-琥珀醯亞氨基乙基)氨基乙基]-N6，N9-二(2-巰基-2-甲基丙基)-6，9-二氮壬醯胺；[BMME]＝二馬來醯亞氨基甲基醚；[BSME]＝二琥珀醯亞氨基甲基醚；[DTPA]＝二亞乙基三胺五乙酸；Amp＝4-脒基苯基丙氨酸。
實施例3在高膽固醇血症兔子模型中使用Tc-99m標記化合物P215使動脈粥樣硬化斑定位和體內成象將22個兩種性別體重為2-3公斤的紐西蘭白兔(NZW)分成兩組。將對照組的兔籠養並餵食商購的兔食(Purina)。從7周齡開始給HC組的兔餵食標準化的高膽固醇食物(混合了1％重量/重量濃度的膽固醇的兔食)直至兔長到28周齡。給所有的兔隨意喝水。
按照上述實施例1的方法製備Tc-99m標記的P215({BAT}.RA1VDTLKFVTQAEGAK醯胺)。用140-160mCi的Tc-99m標記約250-400微克的肽並將其製成在0.2毫升體積劑量中含7-8mCi(12.5-20.0微克/兔；6-7微克/公斤)的單位劑量。以慢速濃輸液的方式(約0.1毫升/分鐘)從兔耳外側的靜脈給成年兔靜脈給藥Tc-99m標記的肽。使用裝有針孔準直器(5毫米孔)和Tc-99m的能量視窗組並且程序設置為累計計數500,000次或掃描所需時間的γ射線照相機來獲得成象。在成象前的瞬間，使用克他命和甲苯噻嗪的混合物麻醉動物(5∶1，1毫升/公斤肌肉內給藥)。
在心臟正上方的40°-50°處(左斜前方取景區)收集γ射線照相成象以勾畫出主動脈弓並檢查下行的主動脈。在注射後的1小時和2小時得到成象，在注射後的3小時和5小時間或性地得到成象。在每次收集成象之前根據需要對動物進行補充麻醉。
在2.5小時(在2小時掃描之後)時，給動物施用靜脈劑量的戊巴比妥鈉以使其致死。根據驗屍，從中腹區的主動瓣膜中移出主動脈和切除分枝血管。使用平行孔準直器，再從軀體外使主動脈成象。然後，縱向打開主動脈並用蘇丹第四染色，由此使動脈粥樣硬化斑變成深磚紅色。脫脂的和未損傷的主動脈內皮仍保持其原樣，並且在這些條件下所說主動脈內皮的外觀呈現白桃紅色。在體內和體外的Tc-99m P215成象中的正反差和在HC-處理的兔主動脈中蘇丹IV的沉積圖案表明，本發明的閃爍照相成象劑能夠使動脈粥樣硬化斑成象。
實施例4在體內使用Tc-99m標記的化合物P357使犬模型的深靜脈栓塞成象肌肉注射給藥克他命和乙醯丙嗪的結合物使Mongrel狗鎮靜，然後，靜脈注射給藥戊巴比妥鈉使其麻醉。將18號口徑的血管導管(angiocath)從右側股骨靜脈的靠遠端的一半處插入靜脈並將由8毫米Dacron纏繞的不鏽鋼繞制線圈(Cook Co.，Bloomington 1N)置於每個動物接近股骨中部的股骨靜脈中。取出血管導管，縫合傷口並通過X光記錄線圈的移動。然後，使各動物過夜後甦醒。
在線圈移動一天後，將每個動物再次麻醉，在動物的每個前肢上經靜脈輸液生理鹽水並插膀胱導管收集尿樣。將動物仰臥置於低耗能狀態，且在裝有各種用途準直器的γ射線照相機下，使Tc-99m達到光峰。在NuclearMac計算機系統中獲得成象。
將Tc-99m標記的P357{(CH2CO-YD.Apc.GDCGGCAcmGCAcmGGC.醯胺)2-[BAT-BS]}{185-370mBq(5-10mCi)Tc-99m和0.2-0.4毫克P357}注射進入插入點處的一條前肢靜脈血管中。保持第二條前肢血管用於收集血樣。在注射後約10-20分鐘和在注射後約1，2，3，和4小時，獲取500,000次或20分鐘的(無論哪種方式，只選取更短時間的那種)腿部的腹面成象。通過心內注射或藥團靜脈注射給藥安樂死劑量的飽和氯化鉀溶液，然後用肝磷脂注射器通過心臟穿刺收集兩種血樣。將含有血栓的股骨靜脈和大腿肌肉試樣細心地剖開分離。然後，從血管中切割下血栓並置於預先稱重的試管中。稱重血栓試樣並用Tc-99m通道中的γ井式計數器計數。另外，還計數已知餾份的注射劑量。
測定新鮮的血栓重量、安樂死之前獲得的血栓和血液中的百分注射劑量(％ID)/克以及血栓/血液比和血栓/肌肉比。通過對在靶向區(ROI)中測得的計數/象素的分析來確定血栓/背景比率，所說的靶向區是根據儲存在計算機中的成象，在血栓和其相鄰肌肉區域上畫出的。
上述所得結果用來說明可以在體內迅速而有效地定位深靜脈血栓。
實施例5閃爍照相成象和Tc-99m標記的肽的生物分布為了說明上面給出的Tc-99m標記肽的作用，在紐西蘭白兔的左腓腸部上肌肉內注射大腸桿菌有效染劑。在肌肉內注射克他命和甲苯噻嗪使動物鎮靜24小時之後，給動物靜脈注射Tc-99m標記的肽(≤150微克，2-10mCi)。將動物以仰臥姿式置於γ射線照相機(LEAP準直器/Tc-99m達到光峰)的取景區中，並在注射1小時後開始成象，然後，在此後的3小時內每間隔約1小時進行成象。在獲取成象和根據需要再次使動物麻醉之間使動物甦醒。
在完成最後一次成象後，通過靜脈注射過量的苯巴比妥使每個動物致死，並解剖獲取血樣和感染組和對照組肌肉組織的試樣。稱重組織試樣，使用γ計數器計數組織試樣和注射劑量的標準量，並測定留在組織中的百分注射劑量(每克組織)。對於每種肽計算出每克感染組織的百分注射劑量，感染肌肉組織與非感染肌肉組織的比率，以及感染肌肉組織與血液的比率。下面的表中給出了使用具有下述通式的本發明Tc-99m標記試劑所獲得的這些結果甲醯基MLFK(BAT).醯胺表III
A＝％ID/克感染的肌肉B＝％ID/克對照組的肌肉C＝感染的肌肉與對照組的肌肉之比D＝％ID/克血液E＝感染的肌肉與血液之比實施例6用大鼠腫瘤表達的生長激素釋放抑制因子受體(SSTR)的定位和體內成象用基本上如Bakker等人(1991，Life Sciences491593-1601)所述的方法進行由大鼠腫瘤細胞表達的生長激素釋放抑制因子受體的體內成象。
將採樣並冷凍的腫瘤接髓質解凍後獲得的CA20948鼠的胰腫瘤細胞，以每個動物0.05-0.1.05-0.1毫升細胞懸浮液的劑量，通過肌肉注射植入6周齡Lewis鼠的右後腿。使腫瘤長至約0.5-2克，採樣，並將腫瘤接髓質植入第二個鼠，自然組Lewis鼠。重複這種轉種方式以生產患腫瘤動物的下一代。用於體內研究的患腫瘤動物通常是第三至第五代轉種的且長有0.2-2克腫瘤的鼠。
為了研究放射性試劑對於腫瘤的特異性，在注射放射性試劑之前30分鐘，給選擇的動物施用皮下SSTR阻斷劑量(4毫克/公斤)的奧曲肽(Bakker等人已對此發表了實驗報告，其結果是111In-[DTPA]奧曲肽腫瘤吸收下降了40％)。
將第三至第五代轉種的CA20948患有腫瘤的Lewis鼠禁錮並通過背側的尾靜脈注射，對應於0.2-0.4毫升中3-8微克肽，劑量為0.15-0.20mCi的99mTc-標記的肽。
在選定的時間，將動物頸部脫位而致死並對其進行選擇性驗屍。稱重採樣的組織試樣並在γ井式計數器中逐個計數注射劑量的可分量。
表1中給出了選擇的放射性標記肽的90分鐘生物分布。其中99mTc-P587、99mTc-P617、99mTc-P726、和99mTc-P736顯著地表明非常高的腫瘤吸收，腫瘤/血液比率表明了它們在靶向(腫瘤)組織中高的特異性吸收。
圖1表明了患腫瘤鼠中99mTc-P587的成象。在腿下部(箭頭所指部分)腫瘤中的高吸收清晰可見。
對於經預先注射奧曲肽處理或沒有經預先注射奧曲肽處理兩種情況，比較99mTc-P587在鼠腫瘤中的吸收，其中已經知曉生長激素釋放抑制因子結構類似物結合在體內的生長激素釋放抑制因子受體之上。在這些實驗中，通過在施用99mTc-P587之前施用奧曲肽而阻斷受體可使放射性標記肽的特異性腫瘤吸收下降76％。這些結果證實體內99mTc-P587的結合是SSTR特異性。
表IV
應該認識到上述公開的本發明的一些具體實施方案以及所有在此基礎上所做的改進或變化的等同物都在本申請權利要求中所述的本發明的精神和保護範圍之內。
權利要求
1.一種用於製備哺乳動物體內各部位成象所用的閃爍照相成象劑的試劑，其包括具有含3-100個胺基酸的胺基酸序列的特異性結合肽和與所說的肽共價連接的放射性標記結合部分，其中放射性結合部分共價連接在特異性結合肽的胺基酸殘基的側鏈上。
2.權利要求1的試劑，其中特異性結合肽和放射性標記結合部分通過賴氨酸殘基或高半胱氨酸殘基共價連接。
3.包含權利要求1試劑的閃爍照相成象劑，其中放射性標記配合部分與放射性標記相結合。
4.權利要求3的試劑，其中放射性標記是鎝-99m、銦-111、或鎵-68。
5.權利要求1的試劑，其中放射性標記結合部分具有選自下列的通式ICp(aa)Cp其中Cp是保護的半胱氨酸，(aa)是不含硫羥基的任何初級α-或β-胺基酸；和
其中X＝H或保護基；(胺基酸)＝不含硫羥基的任何初級α-或β-胺基酸；V
其中，每個R5分別為H、CH3或C2H5；每個(pgp)s分別為硫羥基保護基或H；m、n和p分別為2或3；A＝直鏈或環狀的低級烷基、芳基、雜環基、它們的組合或取代的衍生物；V＝H或-CO-特異性結合化合物；X＝特異性結合的化合物；
其中，每個R5分別為H、具有1至6個碳原子的低級烷基、苯基或有低級烷基或低級烷氧基取代的苯基；m、n和p分別為1或2；A＝直鏈或環狀的低級烷基、芳基、雜環基、它們的組合或取代的衍生物；V＝H或-CO-特異性結合化合物；X＝特異性結合的化合物；和其中當V＝H時，R6＝特異性結合化合物，當R6＝H時，V＝-CO-特異性結合化合物。
6.權利要求5的試劑，其中通式I的放射性標記配合部分中保護的半胱氨酸具有下面通式的保護基-CH2-NH-CO-R其中R是具有1至6個碳原子的低級烷基，2-、3-、4-吡啶基、苯基、或有低級烷基、羥基、低級烷氧基、羧基或低級烷氧基羰基取代的苯基。
7.權利要求5的試劑，其中通式為Cp(aa)Cp的放射性標記配合部分具有下面的通式
8.包含權利要求5試劑的閃爍照相成象試劑，其中放射性標記配合部分與放射性標記相結合。
9.權利要求8的試劑，其中放射性標記是鎝-99m、銦-111、或鎵-68。
10.權利要求1的試劑，其中放射性標記配合部分包含下面通式的含單一硫羥基的部分IIA-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X其中，A是H、HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC或R4；B是H、SH、-NHR3、-N(R2)-(胺基酸或肽)、或R4；X是H、SH、-NHR3、-N(R3)-(胺基酸或肽)或R4；Z是H或R4；R1、R2、R3和R4分別為H或直鏈或支鏈低級烷基或低級環烷基；n是0、1或2；(肽)是2至約10個胺基酸的肽；和當B為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)時，X是SH，和n是1或2；當X為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)時，B是SH，和n是1或2；當B為H或R4時，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或氨)-OOC，X是SH，和n是0或1；當A為H或R4，而其中的B為SH時，X是-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)和當X是SH時，B是-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)；當X為H或R4時，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或氨)-OOC和B是SH；當Z為甲基時，X是甲基，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC，B是SH和n是0；當B為SH和X為SH時，n不為0；和其中硫羥基部分為還原形式和其中(胺基酸)是任何不含硫羥基的初級α-或β-胺基酸。
11.權利要求10的試劑，其中放射性標記配合部分是選自具有下面通式的放射性標記部分IIa.-(胺基酸)1-(胺基酸)2-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}IIb.-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(胺基酸)1-(胺基酸)2IIc.-(伯α，ω-或β，ω-二胺基酸)-(胺基酸)1-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}或IId.-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(胺基酸)1-(初級α，β-或β，γ-二胺基酸)其中(胺基酸)1和(胺基酸)2分別為任何天然生成的、修飾的、取代的或改變的不含硫羥基的α-或β-胺基酸；A是H、HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC或R4；B是H、SH或-NHR3、-N(R3)-(胺基酸或肽)或R4；X是SH或-NHR3、-N(R3)-(胺基酸或肽)或R4；Z是H或R4；R1、R2、R3和R4分別為H或直鏈或支鏈低級烷基或低級環烷基；(肽)是2至約10個胺基酸的肽；n是0、1或2的整數；和當B為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)時，X是SH和n是1或2；當X為-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)時，B是SH和n是1或2；當B為H或R4時，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC，X是SH和n是0或1；當A為H或R4，而其中的B為SH時，X是-NHR3、-N(R3)-(胺基酸或肽)和當X是SH時，B是-NHR3或-N(R3)-(胺基酸或肽)；當X為H或R4時，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC和B是SH；當Z為甲基時，X是甲基，A是HOOC、H2NOC、(胺基酸或肽)-NHOC、(胺基酸或肽)-OOC和B是SH和n是0；當B為SH和X為SH時，n不為0；和其中硫羥基部分為還原形式。
12.包含權利要求10試劑的閃爍照相成象劑，其中放射性標記配合部分與放射性標記相結合。
13.權利要求12的試劑，其中放射性標記是是鎝-99m、銦-111、或鎵-68。
14.權利要求1的試劑，其中特異性結合的肽是選自具有下述胺基酸序列的肽甲醯基-MLF(VGVAPG)3醯胺(VPGVG)4醯胺RALVDTLKFVTQAEGAK醯胺RALVDTEFKVKQEAGAK醯胺PLARITLPDFRLPELAIP醯胺GQQHHLGGAKAGDVPLYKKIIKKLLESLRALVDTLK醯胺GGGLRALVDTLK醯胺GGGLRALVDTLKFVTQAEGAK醯胺GGGRALVDTLKALVDTL醯胺GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYRPSPSPHPAHHKRDRRQ醯胺GGGFD.Cpa.YWDKTFT醯胺
{SYNRGDSTC}3-TSEAGGGLRALVDTLK醯胺GCGGGLRALVDTLK醯胺GCYRALVDTLKFVTQAEGAK醯胺GC(VGVAPG)3醯胺
15.權利要求1的試劑，其中該試劑還進一步包括與許多特異性結合化合物共價連接並且也與許多放射性標記結合部分共價連接的多價連接部分，以製備多體的多價閃爍照相成象劑，其中多體的多價閃爍照相成象劑的分子量小於約20,000道爾頓。
16.權利要求15的試劑，其中多價連接部分是雙琥珀醯亞氨基甲基醚、4-(2，2-二甲基乙醯基)苯甲酸、三(琥珀醯亞氨基乙基)胺、N{2-N』，N』-二(2-琥珀醯亞氨基乙基)氨基乙基〕}-N6，N9-二(2-甲基-2-巰基丙基)-6，9-二氮壬醯胺(BAT-BS)、二-(乙醯亞氨基乙基)醚、三(乙醯亞氨基乙基)胺、二-(乙醯亞氨基乙基)醚、二-(乙醯亞氨基甲基)醚、αε-二乙醯基賴氨酸、賴氨酸和1，8-二乙醯亞氨基-3，6-二氧雜辛烷，或其衍生物。
17.由權利要求1的試劑與鎝-99m在還原劑存在下進行反應而製得的配合物。
18.權利要求17的配合物，其中還原劑選自連二亞硫酸鹽離子、亞錫離子和亞鐵離子。
19.通過用鎝-99m標記權利要求1的試劑生成的配合物，所說的標記是通過預先製備的鎝-99m配合物的配位體交換來進行。
20.用於製備放射性藥物製劑的試劑盒，所說的試劑盒包括含有預定量權利要求1的試劑和足夠量用於由Tc-99m標記肽的還原劑的封閉的小瓶。
21.權利要求1的試劑用於使哺乳動物體內各部位成象的用途，其中試劑用鎝-99m進行標記。
22.製備權利要求1試劑的方法，其中肽是在體外化學合成。
23.權利要求22製備肽的方法，其中肽是通過固相肽合成法來合成。
24.權利要求1的試劑，其中特異性結合肽是環肽。
全文摘要
本發明涉及放射性標記的肽和這類肽的製備方法。更具體地說，本發明涉及肽、肽的製備方法和用於製備這類肽的試劑盒、以及使用這類肽使哺乳動物體內的各部位成象的方法，所說的哺乳動物體使用鎝-99m(Tc-99m)通過放射性鍵合基團標記，所說的放射性鍵合基團通過肽的胺基酸側鏈共價連接在特異性結合的肽上。
文檔編號A61K51/08GK1154072SQ95194335
公開日1997年7月9日 申請日期1995年6月1日 優先權日1994年6月3日
發明者理察·T·迪安, 斯科特·巴特拉姆, 威廉·麥克布萊德, 約翰·利斯特-詹姆斯, 埃德加·R·西維特羅 申請人:迪亞太德公司