一種檢測土拉菌感染的免疫層析試紙及其製備方法
2023-06-14 11:41:01 1
專利名稱：一種檢測土拉菌感染的免疫層析試紙及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測土拉菌感染的試紙及其製備方法，特別涉及一種檢測土拉菌感染的免疫層析試紙及其製備方法。
背景技術：
土拉菌病(Tularaemia)是一種急性、感染性人獸共患疾病，其致病菌是土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)(簡稱土拉菌)，易感動物為嚙齒類動物，人通過破損的皮膚、結膜感染，吸入或食入極少量(10-50個)土拉菌便可發病，臨床表現為皮膚潰爛、淋巴腺腫大、肺部感染和傷寒樣症狀，病情嚴重者甚至死亡。
土拉菌病一般是根據流行病學資料、臨床表現和實驗室診斷的綜合結果作為診斷依據。其臨床表現為潛伏期約1周，突發性寒戰，發熱(38-39℃)，伴有頭痛、盜汗、食慾減退、肝脾腫大，感染部位出現淋巴結腫大、皮膚潰瘍，扁桃體壞死等病兆；經由呼吸道吸入感染者可出現咳嗽，胸痛，嚴重者可導致肺炎，如未及時治療，病死率高達60％。
流行病學所調查的資料為發病前1-2周是否去過森林草原、沼澤地、湖邊、河灘等可能存在土拉菌的疫源地，是否與野生動物，特別是與野兔等齧齒動物有過接觸史或蜱叮咬史，是否去過戰區或特殊(如生物恐怖襲擊)情況下的生物戰劑汙染區。
土拉菌病的實驗室診斷主要為病原學診斷和血清抗體檢測。病原學診斷方法是採集疑是土拉菌病患者或病畜皮膚或腺體潰瘍病灶分泌物、膿、血、痰樣品，接種葡萄糖半胱氨酸血瓊脂培養基，37℃ 5％CO2培養72h，挑取灰白色、圓形、邊緣整齊、表面光滑凸起、形態典型的菌落，製備玻片作革蘭氏染色，如為革蘭氏陰性球桿菌，則繼續進行生化鑑定和血清學試驗，必要時需動物測毒；由於土拉菌生長條件要求十分苛刻，一般臨床實驗室不容易分離成功。血清抗體檢測的原理為人、家畜和野生動物感染土拉菌後均可出現有診斷意義的血清抗體，初次特異抗體的出現一般是在感染後1周，4-6周抗體滴度可達最高，以後逐步下降，半年至1年後仍能檢測出特異性抗體。
土拉菌多糖抗原具有較好的特異性和免疫原性，文獻報導的土拉血清抗體檢測方法有試管凝集法、紅細胞凝集法和ELIAS等，所用抗原均為土拉菌多糖抗原。本發明的發明人曾用土拉菌多糖抗原致敏雞血球，製備間接血球凝集試劑，在疫源地流行病學調查中用於檢測人和動物土拉血清抗體(李俐、馮志鶴、趙忠利 新疆塔城地區土拉弗氏菌病初步調查 中華流行病學雜誌1985，6(1)20)。2000年俄羅斯報導用斑點免疫酶法檢測人和動物土拉血清抗體，血清樣品來自患土拉菌病或免疫土拉菌的人或動物，檢測所用抗原也是土拉菌多糖，結果表明具有較好的特異性，不與新殺手弗朗西斯菌、布魯氏菌、霍亂弧菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌等發生交叉反應(Aronova NV，Pavlovich NV.The use if Francisella tularensislipopolysaccharide in the dot solid phase enzyme immunoassay Zh MikrobiolEpidemiol Immunobiol 2000，(5)75-8)。
膠體金免疫層析技術(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)用於臨床疾病診斷近年來發展較快，其基本原理為將待檢物的配對物(抗原或抗體)包被在NC膜上用於捕捉，然後用免疫膠體金探針檢測，陽性樣品2分鐘後出現肉眼可見的沉澱線，該技術與其它方法比較，優勢在於其樣品處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓，非專業人員按照說明書即可操作，並可迅速觀察結果，很適合現場和基層使用。
發明創造內容本發明的目的是提供一種檢測土拉菌感染的免疫層析試紙(ICA試紙)。
本發明所提供的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙(ICA試紙)，包括吸水紙墊、緊密連接於所述吸水紙墊上面的硝酸纖維膜、緊密連接於所述硝酸纖維膜上面的含有金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠體金探針的金標墊和緊密連接於所述金標墊上面的樣品墊；所述硝酸纖維膜載有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線為土拉菌多糖抗原，所述質控線為可和金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體。
為了使用更加方便，所述吸水紙墊的下面還緊密連接有背板。背板的材料可以是多種多樣的，如塑料、樹脂等。
本發明的第二個目的是提供一種製備上述檢測土拉菌感染的免疫層析試紙的方法。
本發明所提供的製備上述檢測土拉菌感染的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)製備土拉菌多糖抗原；用0.01M pH7.2的PB將該抗原和可與金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體分別稀釋至2-2.5mg/l，然後分別噴於硝酸纖維膜上形成相互分離的檢測線和質控線，37℃乾燥4-12小時，然後將其粘貼在吸水紙墊上；2)製備金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠體金探針；將該探針溶於0.01M四硼酸鈉緩衝溶液，然後將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入上述探針溶液中，取出冷凍真空乾燥18-32小時後，得到金標墊，將其粘貼在步驟1)中得到的硝酸纖維膜上，上面噴有相互分離的檢測線和質控線；3)在步驟2)中的金標墊上面再粘貼樣品墊，得到檢測土拉菌感染的免疫層析試紙。
為了使用更加方便，所述吸水紙墊的下面還粘貼有背板。
本發明所提供的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙及其製備方法中，所述土拉菌多糖抗原可按下述方法製備將土拉弗朗西斯菌接種在葡萄糖半胱氨酸血瓊脂培養基中，37℃培養48-96h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，水浴中加熱至68℃，加入68℃的等體積90％酚溶液，繼續在68℃攪拌30-40min，取出冷卻至室溫，7000-8000rpm離心，吸出水層，PBS透析過夜，即得到土拉菌多糖抗原；所述金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)標記膠體金探針，可按下述方法製備用水溶解氯金酸使其終濃度為0.01％，煮沸後每100ml氯金酸溶液進行以下操作加入1％的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續煮沸10-20min，用純水恢復至100ml，冷卻至室溫後用K2CO3調pH至6-7，攪拌加入SPA0.7mg，15-20min後加入10％的聚乙二醇20000 2ml，繼續攪拌30-40min，15000-16000rpm離心30-35min，棄上清，沉澱即為SPA標記膠體金探針；所述金標墊的材料可為玻璃纖維膜或聚脂膜；所述與金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體可為羊、兔、豚鼠、豬、小鼠或猴等IgG。
其中，調節pH值的K2CO3的濃度可為0.15-0.25M，優選為0.2M。
在實際應用中，所述硝酸纖維膜的厚度可為2.5-3mm(孔徑2-200μm)；所述金標墊的厚度可為30-70mm；所述樣品墊的厚度可為0.1-0.2mm。
本發明的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙可用於檢測人和動物土拉血清抗體，從而診斷土拉菌病。與斑點免疫酶法檢測原理相同，檢測土拉菌感染的免疫層析試紙是將土拉菌多糖包被在NC膜上，用於捕捉樣品中土拉抗體，然後用標記了SPA(金黃色葡萄球菌蛋白A)的免疫膠體金探針檢測；陽性樣品中，土拉抗體(IgG和IgM)的Fc端與金顆粒上的SPA結合，Fab端與NC膜上的土拉多糖結合，層析2分鐘後出現肉眼可見的沉澱線。本發明的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙及其製備方法與現有的其他方法相比，特異性強，更簡便，更快速，更適於臨床和特殊情況下現場使用。
具體實施例方式
實施例1、檢測土拉菌感染的免疫層析試紙的製備材料氯金酸(HAuCl4·4H2O)，分析純，上海試劑一廠；檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)，分析純，北京化工廠；
碳酸鉀(K2CO3)，分析純，北京化工廠；硝酸纖維膜，購於美國Millipore公司，HF B 504；玻璃纖維膜，購於南京雙威實業公司；聚脂，購於上海良信公司；金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，購於Amersham Pharmacia Biotech公司；土拉菌株(由中國人民解放軍微生物流行病研究所菌種庫保藏，保藏號為410062)；羊抗人IgG(購於北京經科宏達生物技術有限公司)正常小鼠血清、正常豚鼠血清、正常兔血清和正常人血清均按常規方法分離保存；土拉免疫小鼠血清、土拉免疫豚鼠血清、土拉免疫兔血清和土拉免疫人血清均以土拉菌多糖為抗原，按常規方法製備保存。
1、土拉菌多糖抗原的製備土拉弗朗西斯菌接種葡萄糖半胱氨酸血瓊脂斜面，37℃培養72小時，無菌生理鹽水洗下菌苔，水浴中加熱至68℃，加入68℃等體積90％酚溶液，繼續在水浴中攪拌30分鐘，取出冷卻至室溫，7000rpm離心，小心吸出上層水層，PBS透析過夜，即為土拉菌多糖抗原，4℃保存。
2、金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)膠體金探針的製備用純水溶解氯金酸使其終濃度為0.01％，煮沸後每100ml氯金酸溶液進行以下操作加入1％的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續煮沸10分鐘，用純水恢復原體積(100ml)，冷卻至室溫後用0.2M K2CO3調pH至6，磁力攪拌下加入SPA0.7mg，15min後加入10％的聚乙二醇20000 2ml，繼續攪拌30min，15000rpm離心35min，棄上清，沉澱即為SPA標記膠體金探針，用0.01M四硼酸鈉保存液恢復至原體積的十分之一，即10ml，4C冰箱保存。
3、檢測土拉菌感染的免疫層析試紙的製備檢測土拉菌感染的免疫層析試紙由吸水紙墊、硝酸纖維膜、金標墊和玻璃纖維膜樣品墊四部分組成。
分別用0.01M pH7.2 PB稀釋步驟1中製備的土拉菌感染多糖抗原至2mg/ml和羊抗人IgG至2.5mg/ml，用BIODOT公司XYZ3000噴膜機分別噴於2.5mm厚硝酸纖維素膜上，形成相互分離的檢測線和質控線，37℃乾燥2.5h，然後將其用雙面膠粘貼在吸水紙墊上；將玻璃纖維膜或聚脂膜浸於步驟2中製備的SPA標記膠體金探針液中製備成金標墊，冷凍乾燥機抽乾後備用；將該金標墊用雙面膠粘貼在上述具有檢測線和質控線的硝酸纖維膜上，再在該金標墊上面用雙面膠粘貼硝酸纖維膜樣品墊，最後將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，即為檢測土拉菌感染的免疫層析試紙，加乾燥劑後密封保存。
實施例2、檢測臨床血清樣品將待檢人或動物血清樣品用生理鹽水按1∶100稀釋，取實施例1中製備的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙1條，浸入經上述稀釋的血清樣品中，2min後開始觀察結果，15min觀察終止。以血清效價1∶100以上為陽性診斷標準，出現1條紅色(對照)沉澱線，為土拉菌血清學診斷陰性，即無土拉菌感染；出現2條紅色(樣品和對照)沉澱線，為土拉菌血清學診斷陽性，即有土拉菌感染。
檢測土拉菌感染的免疫層析試紙檢測動物血清樣品結果如表1所示，表明該試紙的檢測結果與IHA一致，具有特異性。該試紙檢測人血清樣品結果如表2所示，表明檢測土拉菌感染的免疫層析試紙與IHA在檢測人血清樣品中也具有較好的一致性和特異性。
表1.檢測土拉菌感染的免疫層析試紙檢測動物血清樣品樣品(編號) IHA ICA 樣品(編號)IHA ICA免疫兔血清(1)++ 正常小鼠血清(1)--(2)++ (2)--(3)++正常兔血清(1)-- 免疫豚鼠血清(1)++(2)-- (2)++(3)++免疫小鼠血清(1) ++ 正常豚鼠血清(1)--(2) ++ (2)--(3) ++表2.檢測土拉菌感染的免疫層析試紙檢測人血清樣品樣品(編號) IHA ICA 樣品(編號)IHA ICA免疫人血清(1)++ 正常人血清(1) --(2)++ (2) --(3) --(4) --
權利要求
1.一種檢測土拉菌感染的免疫層析試紙，包括吸水紙墊、緊密連接於所述吸水紙墊上面的硝酸纖維膜、緊密連接於所述硝酸纖維膜上面的含有金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠體金探針的金標墊和緊密連接於所述金標墊上面的樣品墊；所述硝酸纖維膜載有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線為土拉菌多糖抗原，所述質控線為可和金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體。
2.根據權利要求1所述的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙，其特徵在於所述吸水紙墊的下面還緊密連接有背板。
3.根據權利要求1或2所述的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙，其特徵在於所述土拉菌多糖抗原可按下述方法製備將土拉弗朗西斯菌接種在葡萄糖半胱氨酸血瓊脂培養基中，37℃培養48-96h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，水浴中加熱至68℃，加入68℃的等體積90％酚溶液，繼續在68℃攪拌30-40min分鐘，取出冷卻至室溫，7000-8000rpm離心，吸出水層，PBS透析過夜，即得到土拉菌多糖抗原。
4.根據權利要求1或2所述的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙，其特徵在於所述金黃色金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠體金探針，可按下述方法製備用水溶解氯金酸使其終濃度為0.01％，煮沸後每100ml氯金酸溶液進行以下操作加入1％的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續煮沸10-20min，用純水恢復至100ml，冷卻至室溫後用K2CO3調pH至6-7，攪拌加入SPA 0.7mg，15-20min後加入10％的聚乙二醇20000 2ml，繼續攪拌30-40min，15000-16000rpm離心30-35min，棄上清，沉澱即為SPA標記膠體金探針。
5.根據權利要求1或2所述的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙，其特徵在於所述金標墊的材料為玻璃纖維膜或聚脂。
6.根據權利要求1或2所述的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙，其特徵在於所述可和金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體為羊、兔、豚鼠、豬、小鼠或猴IgG。
7.一種製備檢測土拉菌感染的免疫層析試紙的方法，包括以下步驟1)製備土拉菌多糖抗原；用0.01M pH7.2的PB將該抗原和可與金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體分別稀釋至2-2.5mg/l，然後分別噴於硝酸纖維膜上形成相互分離的檢測線和質控線，37℃乾燥2-4小時，然後將其粘貼在吸水紙墊上；2)製備金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠體金探針；將該探針溶於0.01M四硼酸鈉緩衝溶液，然後將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入上述探針溶液中，取出冷凍真空乾燥18-32小時後，得到金標墊，將其粘貼在步驟1)中得到的硝酸纖維膜上，上面噴有相互分離的檢測線和質控線；3)在步驟2)中的金標墊上面再粘貼樣品墊，得到檢測土拉菌感染的免疫層析試紙。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述吸水紙墊的下面還粘貼有背板。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述土拉菌多糖抗原可按下述方法製備將土拉弗朗西斯菌接種在葡萄糖半胱氨酸血瓊脂培養基中，37℃培養48-96h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，水浴中加熱至68℃，加入68℃的等體積90％酚溶液，繼續在68℃攪拌30-40分鐘，取出冷卻至室溫，7000-8000rpm離心，吸出水層，PBS透析過夜，即得到土拉菌多糖抗原；所述金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠體金探針，可按下述方法製備用水溶解氯金酸使其終濃度為0.01％，煮沸後每100ml氯金酸溶液進行以下操作加入1％的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續煮沸10-20分鐘，用純水恢復至100ml，冷卻至室溫後用K2CO3調pH至6-7，攪拌加入SPA 0.7mg，15-20min後加入10％的聚乙二醇20000 2ml，繼續攪拌30-40min，15000-16000rpm離心30-35min，棄上清，沉澱即為SPA標記膠體金探針。
10.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述金標墊的材料為玻璃纖維膜或聚脂；所述可和金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體為羊、兔、豚鼠、豬、小鼠或猴IgG。
全文摘要
本發明公開了一種檢測土拉菌感染的免疫層析試紙及其製備方法。本發明所提供的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙，包括吸水紙墊、緊密連接於所述吸水紙墊上面的硝酸纖維膜、緊密連接於所述硝酸纖維膜上面的含有金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠體金探針的金標墊和緊密連接於所述金標墊上面的樣品墊；所述硝酸纖維膜載有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線為土拉菌多糖抗原，所述質控線為可和金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體。本發明的檢測土拉菌感染的免疫層析試紙及其製備方法與現有的其他方法相比，特異性強，更簡便，更快速，更適於臨床和特殊情況下現場使用。
文檔編號G01N33/558GK1632586SQ20041006932
公開日2005年6月29日 申請日期2004年7月16日 優先權日2004年7月16日
發明者端青, 何君, 檀華, 左庭婷 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所