一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法
2023-06-18 09:35:21
專利名稱：一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法
技術領域：
本發明涉及一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法，屬生物醫用材料 技術領域。
背景技術：
組織工程學是一門利用工程學和生命科學的原理研究和開發具有生物活性 的人工替代物以維持恢復或提高人體受損組織的功能的交叉學科。組織工程的 基本原理和方法是通過生物過程將自體或異體的活細胞誘導分化增殖後種植到 體外構建的細胞外基質模擬物(可生物降解支架)中，經體外培養形成細胞/支 架複合物，然後將該細胞/支架複合物移入患者體內受損的組織或器官部位，通 過植入細胞的增殖分化與周圍組織整合，重建器官組織的缺損部位；同時，在 此過程中，可生物降解支架材料逐漸降解排出體外，最終完成受損器官組織的 再生。
組織工程包括"種子細胞"，"支架材料"，"細胞/支架複合物"三方面的內 容。其中，支架材料作為體外人工構建的細胞外基質模擬物是最為重要的內容。 它不僅為所種植細胞的黏附生長提供空間結構支撐，而且要引導細胞構建特定 功能的組織或器官。理想的組織工程支架通常必須具備的性能包括(1)具有良 好的生物相容性；(2)具有與特定組織生長相適應的微結構(織態結構、孔徑、 孔隙率等)；(3)具有與特定組織生長相適應的降解與吸收速率；(4)加工性能 良好，有適宜的力學強度以滿足體內外操作並適應再生的組織。
有研究表明，納米與微米共存的空間結構可以為組織生長提供一種綜合的 結構空間，是一種更為理想的亞微觀結構形態。
聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸共聚物是良好的生物支架材料之一，生物相容性好， 能在體內完全降解。但作為支架材料，其降解較快，尤其是聚乳酸在體內的降 解產物乳酸易造成局部無痛炎症且強度較弱等缺點。研究表明聚乳酸、聚乳酸/ 乙醇酸共聚物與羥基磷灰石複合而成的多孔支架材料不僅可以提高多孔支架的 壓縮強度，而且可以中和聚乳酸降解所產生的酸性，延緩聚乳酸的降解速度。
殼聚糖是一種鹼性多糖，其結構和性質與細胞外基質的主要成分氨基葡聚 糖非常類似。它不僅具有天然材料良好的生物相容性和可降解性，而且殼聚糖 分子鏈上富含氨基，具備抗菌功能，且氨基和羥基基團可接枝改性，賦予其衍 生物獨特的生物和材料方面的性能。所以殼聚糖作為一種新型的組織工程支架材料越來越受到人們的重視。Madihally等於1999年製備了膜狀，片狀，管狀， 球狀的殼聚糖支架，平均孔徑在l-250Mm，但是強度較差。研究表明用共混方法 製備的聚乳酸/殼聚糖多孔複合支架材料，具有良好的微結構、機械性能和降解 性能，其炎症反應遠遠低於純聚乳酸材料，並且具備良好的抗菌性，可以用作 細胞支架材料植入體內。但是，共混的一個典型缺點是降低聚乳酸的玻璃轉化 溫度，而且對於力學性能無明顯改善；另外該方法也無法控制支架的結構。
我國專利CN1394654公開了組織工程用聚乳酸多孔支架的製備方 法。CN1418904公開了殼聚糖-聚乳酸接枝共聚物的製備方法。CN1316464公 開了聚乳酸/甲殼素類多孔支架材料的製備方法，包括聚乳酸/甲殼素類熔融多 孔支架材料、聚乳酸/甲殼素溶液多孔支架、聚乳酸/殼聚糖類接枝共聚多孔支 架材料的製備方法，製得的材料具有更好的生物相容性，消除了傳統材料存在的 細菌性和無菌性反應。CN1895684採用納米蜘蛛絲纖維、天然納米蠶絲纖維、天 然納米纖維素纖維、天然納米甲殼素纖維以及天然納米膠原纖維基製備了組織 工程支架，製備出的天然納米纖維基組織工程細胞支架有著很好的承載強度、 可調控的支架孔隙率、很好的生物相容性與細胞親和性。CN1919352公布了採 用靜電紡絲法製備的殼聚糖纖維支架，可應用於仿生細胞外基質、傷口敷料、 酶、基因和藥物的載體和仿生細胞外基質。
Song等(美國專利6699287)採用殼聚糖及其衍生物製備的支架可用於皮 膚的再修復，特別是皮膚燒傷。Ma等(美國專利6673285)採用聚乳酸、聚乙 醇酸等用粒子致孔法製備的多孔纖維狀支架，支架具備良好的貫穿型孔結構， 易於細胞生長和分化，並具備良好的機械強度。Ma等(美國專利6146892)也 公布了採用熱致相分離的方法製備的聚乳酸、聚乙醇酸支架，支架具備良好的 三維多孔結構，可用於器官移植，肌腱修復等組織工程領域。Mikos等(美國 專利5512600)採用醋酸乙烯或甲基丙烯酸纖維填充聚乳酸、聚乙醇酸支架， 所製得的支架具備良好的生物相容性和強度。
上述方法都未釆用殼聚糖纖維增強，而且製得的三維支架都不是納米微米 共存結構的。
發明內容
本發明的目的在於通過聚乳酸或聚乳酸/乙醇酸共聚物和殼聚糖纖維的復 合雜化以製備出聚合物基納米複合增強組織工程支架材料。本發明方法製得的 支架可以解決以下主要問題
(1)組織工程支架材料的微觀結構和材料強度的矛盾問題細胞的生長過 程需要首先在支架上附著、然後逐漸增殖、生長。在此過程中，需要不斷吸收營養物質和排出代謝物。因此要求支架材料具有有利於粘附附著的表面(親水 性較高和較高的比表面積)、足夠大、足夠多的孔(細胞生長需要數百微米)並 且內部三維相通(有利於營養物質的輸入和代謝物的排出，也有利於血管和神 經的長入)。就支架材料的韌性以及細胞的粘附、增長而言，支架材料骨架部分
的微觀尺寸越小越好；這是因為，骨架部分尺寸越小，同種材料製備的支架材 料的韌性越好，越有利於組織在動態條件下的生長；骨架部分尺寸越小，相同 密度條件下材料的比表面積越大，各結構單元間存在相互作用，導致帶電能級 間歇加大和表面能大大增加，使之能有效地增強細胞黏附、誘導細胞生長，並 有利於組織再生。所以通過熱致相分離法製備的骨架部分為納米尺度的支架材 料是理想的。但是納米尺度支架材料的力學強度不足，甚至個別局部無法承受 細胞移動造成的載荷，是納米支架材料在應用中的最大瓶頸之一。採用殼聚糖 纖維複合增強則可以解決支架材料強度不足的問題。
(2) 聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸共聚物支架降解過程中的酸性問題釆用鹼性 多糖殼聚糖的複合雜化可以中和支架降解過程中的酸性產物從而解決酸性問 題。
(3) 支架在細胞增長過程中支架材料的強度降低速率與細胞增長速率相適應 問題採用殼聚糖纖維複合雜化不僅可以增強支架，降低酸性，而且殼聚糖纖 維的降解速率小，可以控制支架材料的強度降低速率與細胞的增長速率相適應。
為了實現上述發明目的，本發明的殼聚糖短纖維增強的納米支架的製備方 法如下
第一步對殼聚糖短纖維進行接枝改性。
(1) 配製聚乳酸類聚合物/二氯甲烷CH2Cl2溶液。
(2) 加入殼聚糖短纖維和接枝改性劑，冰浴中磁力攪拌3小時至縮合反應 完全。所使用的殼聚糖短纖維是直徑在5—80ym，脫乙醯度為50—95%的殼聚 糖纖維。接枝改性劑為含有活性反應基團的矽烷類化合物(如乙烯基三乙氧基 矽垸等)或有機胺類化合物(如N ， N' - 二環己基碳二亞胺DCC等)。
(3) 取出改性殼聚糖纖維，濾紙吸乾，用CH2Cl2流液衝洗交聯物表面3遍 後吸乾；空氣中乾燥至少1天至恆重後置於乾燥器中保存備用。
第二步納米支架的製備。
(1)在60。C恆溫水浴中，將濃度為10 — 100g/L的聚乳酸類聚合物溶解於 溶劑中。溶劑為四氫呋喃、四氫呋喃/水、二噁烷/水。(2) 在均相溶液中加入接枝改性殼聚糖短纖維，長度約1毫米，聚合物與 改性殼聚糖短纖維的質量比為100: 10 — 100: 60 。超聲混合均勻後，放入預冷 的成型玻璃容器中。
(3) 在一18。C條件下，將溶液冷凍至少2小時，製得聚合物和殼聚糖短纖 維的複合凝膠。
(4) 在4X:條件下，在50倍體積以上的去離子水中，將凝膠進行水置換， 時間為2天，中間每8小時換水一次。
(5) 將水置換後的凝膠取出，再次在一18。C條件下冷凍至少2小時。
(6) 將冷凍物在冷凍乾燥機中冷凍乾燥至少3天，即製得殼聚糖短纖維增 強的納米支架。
本發明所使用的聚乳酸類聚合物包括左旋聚乳酸、消旋聚乳酸、聚乳酸/ 乙醇酸共聚物等。
本發明方法製得的納米支架呈白色，多孔狀。孔隙率大於90%，所製得的 三維網絡狀支架具有納米級聚乳酸類聚合物骨架、微米級殼聚糖纖維支撐和微 米級孔共存結構，而且相互貫通。從結構上特別適合細胞的粘附、生長、分化 和營養液的輸運。由於加入殼聚糖短纖維，不僅大幅度提高了支架材料的力學 強度，而且大幅度減緩了支架材料降解過程中的pH值的下降，使細胞增長過程
中支架材料的強度降低速率與細胞增長速率相適應。本發明方法簡單可行，可 根據需要任意控制支架材料外形及尺寸，所製備的支架能廣泛應用於組織工程 領域。
圖1為殼聚糖短纖維增強的納米支架微觀結構圖。 圖2為殼聚糖短纖維增強的納米支架壓縮模量圖。 圖3為殼聚糖短纖維增強的納米支架體外降解pH變化圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明方法作進一步的說明。 實施例1:
第一步對殼聚糖短纖維進行接枝改性。
配製濃度為8g/100ml的聚乳酸類聚合物(左旋聚乳酸、消旋聚乳酸、聚乳 酸/乙醇酸共聚物)/二氯甲垸CH2Cl2溶液。加入直徑在5 — 80um，脫乙醯度為50_95%的殼聚糖纖維，接枝改性劑(乙烯基三乙氧基矽烷或N， N' - 二環己 基碳二亞胺DCC)，使殼聚糖纖維與接枝改性劑、聚乳酸類物質的質量比分別為
1: 2: 4;冰浴中磁力攪拌3小時至縮合反應完全。取出改性殼聚糖纖維，濾紙
吸乾，用CH2Cl2流液衝洗交聯物表面3遍後吸乾。空氣中乾燥至少1天至恆重後 置於乾燥器中保存備用。
第二步納米支架的製備。
在50ml溶劑(四氫呋喃、四氫呋喃/水、二噁烷/水)中加入2.5g聚乳酸 類物質(左旋聚乳酸、消旋聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸共聚物)，在60。C恆溫水浴 中溶解。在上述溶液中，加入0.25-1.5g接枝改性的殼聚糖短纖維，長度約1 毫米。超聲混合30min後，分裝入預冷的成型玻璃容器中。在一18"C條件下， 將溶液冷凍4小時。製得聚乳酸類物質和殼聚糖短纖維的複合凝膠。在4'C條件 下，在50倍體積以上的去離子水中，將凝膠進行水置換，時間為2天，中間每 8小時換水一次。將水置換後的凝膠取出，再次在一18"C條件下冷凍4小時。將 冷凍物在冷凍乾燥機中冷凍乾燥5天，製得殼聚糖短纖維增強的納米聚乳酸類 物質支架。
所製得的三維網絡狀納米複合支架材料中殼聚糖短纖維分散均勻，界面結 合牢固，納米聚乳酸類物質骨架、微米殼聚糖纖維支撐與微米級孔共存且相互 貫通依存，其微觀形貌如圖1所示(放大倍數為2000倍)，孔隙率93—96%; 強度隨聚合物和殼聚糖纖維濃度的不同而變化(如圖2所示，橫坐標為聚乳酸 與殼聚糖短纖維的質量比，縱坐標為壓縮模量，單位MPa)。採用殼聚糖短纖維 增強後，不僅力學強度大幅提高，而且減緩了支架降解過程中pH值的下降速率 (如圖3所示，橫坐標為降解天數，縱坐標為pH值)，從而使細胞增長過程中 支架材料的強度降低速率與細胞增長速率相適應。與同樣熱致相分離法製備的 純聚乳酸類物質支架材料相比，複合納米支架壓縮強度提高100—200%，體外 降解速率降低數倍，具有重要的應用價值。
權利要求
1、一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法，其特徵在於按照如下步驟操作第一步，利用接枝改性劑對殼聚糖短纖維進行接枝改性；第二步，在60℃恆溫水浴中，將濃度為10—100g/L的聚乳酸類聚合物溶解，加入接枝改性殼聚糖短纖維，聚乳酸類聚合物與改性殼聚糖短纖維的質量比為10010—10060，混勻後，放入預冷的成型玻璃容器中；在—18℃下，將溶液冷凍至少2小時，製得聚合物和殼聚糖短纖維的複合凝膠；在4℃下，將凝膠用至少50倍體積的去離子水進行水置換；取出凝膠，再次在—18℃下冷凍至少2小時；將冷凍物在冷凍乾燥機中冷凍乾燥至少3天，即製得殼聚糖短纖維增強的納米支架。
2、 根據權利要求1所述的一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法，其 特徵在於對殼聚糖短纖維進行接枝改性的操作步驟如下配製聚乳酸類聚合物/ 二氯甲烷溶液；加入殼聚糖短纖維和接枝改性劑，冰浴中攪拌至縮合反應完全； 取出改性殼聚糖纖維，濾紙吸乾，用CH2Cl2流液衝洗交聯物表面後吸乾；空氣中 乾燥至恆重。
3、 根據權利要求1所述的一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法，其 特徵在於所使用的殼聚糖短纖維是直徑在5—80um，脫乙醯度為50_95%的殼聚糖纖維。
4、 根據權利要求1所述的一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法，其 特徵在於接枝改性劑為含有活性反應基團的矽垸類化合物或有機胺類化合物。
5、 根據權利要求1所述的一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法，其 特徵在於聚乳酸類聚合物是左旋聚乳酸、消旋聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸共聚物。
6、 根據權利要求1所述的一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法，其 特徵在於第二步中溶解聚乳酸類聚合物所用的溶劑是四氫呋喃、四氫呋喃/水、 二噁烷/水。
7、 根據權利要求1所述的一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法，其 特徵在於本發明方法製得的納米支架呈白色，孔隙率大於90%，具有納米級聚 乳酸類聚合物骨架、微米級殼聚糖纖維支撐和微米級孔共存結構，而且相互貫 通。
全文摘要
本發明涉及一種殼聚糖短纖維增強的納米支架製備方法。利用接枝改性劑對殼聚糖短纖維進行接枝改性；將聚乳酸類聚合物溶解，加入接枝改性殼聚糖短纖維，在-18℃下，將溶液冷凍，製得聚合物和殼聚糖短纖維的複合凝膠；4℃下，將凝膠用去離子水進行水置換；取出凝膠，再次在-18℃下冷凍後乾燥即製得殼聚糖短纖維增強的納米支架。製得的三維網絡狀支架具有納米級聚乳酸類聚合物骨架、微米級殼聚糖纖維支撐和微米級孔共存結構，且相互貫通。由於加入殼聚糖短纖維，不僅大幅提高了支架材料的力學強度，而且大大減緩了支架材料降解過程中的pH值下降速率。本方法簡單可行，可根據需要任意控制支架材料外形及尺寸，可廣泛應用於組織工程領域。
文檔編號A61L31/04GK101411900SQ20081016001
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月7日 優先權日2008年11月7日
發明者宋國君, 濤 樓, 汪學軍 申請人:青島大學