檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接elisa方法以及試劑盒的製作方法
2023-06-17 14:08:31
專利名稱：檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接elisa方法以及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、動物細菌學與動物傳染病學檢測技術領域，特別涉及一 種檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法以及試劑盒。
背景技術：
副豬嗜血桿菌病是引起斷奶仔豬發病和死亡的重要病因之一。副豬嗜血桿菌 (Haemophilus parasuis,HPS)作為豬上呼吸道的一種常在菌，在特定條件下侵入機體可以 引起嚴重的全身性疾病(Glasser's disease)，以纖維素性多發性漿膜炎、關節炎和腦膜炎 為主要特徵。此病過去一直被認為是仔豬的一種散發性、應激性疾病。但是，近年來，隨著養 豬產業化的發展，越來越多的高健康豬群或SPF豬群的出現，如果這些豬處於一種未免疫 狀態，一旦HPS入侵，就會受到嚴重感染，甚至死亡，各種日齡的豬均可感染，且發病率可達 50 70%，死亡率可達10%以上。目前引起副豬嗜血桿菌感染的發病機制還不是很清楚， 一些研究認為副豬嗜血桿菌可以並發或繼發於藍耳病、偽狂犬病、細小病毒病、圓環病毒病 和豬瘟等疾病。近年來，副豬嗜血桿菌病已成為全球範圍內影響養豬業的主要細菌性疾病，危害 日漸嚴重，給養豬業帶來巨大損失。早期、準確地做出診斷並進行疫苗預防是控制該病的重 要手段，但副豬嗜血桿菌血清型眾多，而且流行的副豬嗜血桿菌血清型通常為毒力較強的 血清型，如血清5型、4型和13型等。目前國內外已報導的HPS的檢測方法有16SrRNA PCR,Southern雜交、補體結合試 驗(CF)、間接血凝試驗(IHA)和ELISA等。然而，基於檢測其DNA的PCR和Southern雜交 方法很難應用於實踐，而CF也有參與反應的成分多、影響因素複雜、操作步驟繁瑣等缺點， IHA和ELISA方法是目前國內外學者探索的主要HPS抗體檢測方法，所不同的是抗原的製備 方法，而馮小明(2009)、石碧(2007)等用超聲破碎抗原和莢膜多糖作為包被抗原的建立的 間接ELISA方法結果證明，ELISA的敏感性比IHA高。目前國內外常用脂多糖、LPS、滅活的 全菌體作為包被抗原進行ELISA，檢測結果不太穩定並且經常出現假陰性，或是還未驗證其 符合率和敏感性。因此，仍然需要建立一種快速、簡便以及特異性高的檢測副豬嗜血桿菌抗 體的方法。
發明內容
本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種檢測副豬嗜血桿菌 抗體的間接ELISA方法。該方法具有快速、簡便、檢出率高等優點。本發明另一目的在於提供實現上述間接ELISA方法的試劑盒。本發明的目的通過下述技術方案實現一種檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA 方法，是將副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)OMP P5蛋白作為包被抗原；所述副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白的胺基酸序列如下所示MKKSLIALAVSGLAVASVAQA APQANTFYVGAKAGWATFHNDINQIDSKYANDARYDATNLKYGISRNSVTYGVFGGYQIIDNLAVELGYDYFGRVRGNKQEFRAFKHSAHGTHLSLKPSYEVLNGLDVYGKVGAALVRNDYKRYSQTAGVQTQKAHNLKTSLVLGAGVEYAILP ELAFRVEYQWLSRVGNANKAAQKRGDTAMFGPGSTYSPDAHSVSAGISYRFGQGAAPVVAAPEVVTKNFAFSSDVLF DFGKANLKPAAAQTLDAVHTEIVNLGLANPAVQVNGYTDRIGKDAANLTLSQKRAETVANYIVSKGVNPANVTAVGY GEANPVTGNTCDAVKGRKALITCLAPDRRVEIQVQGSKEVSM所述的副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白優選通過基因工程方法得到，具體如下(1)將如下所示的副豬嗜血桿菌OMP P5核苷酸序列通過表達載體pET_32a(+)的 多克隆位點克隆至表達載體pET-32a(+)中，得到pET-32a(+)-0MP P5質粒；其中，該副豬嗜 血桿菌OMP P5核苷酸序列的5』端位於表達載體pET_32a(+)中的Trx Taq編碼序列的3』 端；(副豬嗜血桿菌OMP P5核苷酸序列atgaaaaaatctttaattgcattagcagtatcaggtttagcagttgcttctgtagctcaagctgctcca caagctaacactttctatgtaggtgctaaagctggttgggcaacattccacaatgatattaaccaaattgactctaa gtatgctaatgatgcacgttatgatgctactaatttaaaatatggcattagccgtaactctgtaacttacggtgtgt ttggtggttaccaaattattgacaacttagcagttgaattaggttacgattatttcggtcgtgttcgtggtaacaaa caagaattccgtgcattcaaacactctgcacacggtacacacttaagcttaaaaccaagctatgaagtattaaacgg tttagatgtttacggtaaagttggtgctgcattagttcgtaacgattacaaacgttatagccaaacagctggagtgc aaactcaaaaagctcataacttaaaaacctctttagtattaggtgcaggtgttgagtatgcaattcttccagaatta gcattccgtgttgagtaccaatggttaagccgtgtgggtaatgctaacaaagcagctcaaaaacgtggcgacacagc tatgtttggtccaggttctacatatagccctgatgcacactcagtatctgcaggtatttcataccgcttcggtcaag gtgcagcaccagttgtagcagcaccagaagttgtaactaaaaacttcgcgttcagctcagacgtattatttgacttc ggtaaagcaaacttaaaaccagctgcagcacaaacattagacgcagtacacactgagatcgtaaatttaggtttagc aaaccctgctgtacaagtaaacggttacacagaccgtat tggtaaagatgctgccaacttaactctttcacaaaaa cgtgcagaaacagtagcaaactacatcgtttctaaaggtgttaacccagctaacgtaacagcggtaggttacggtga agctaacccagtaactggtaacacatgtgacgcagttaaaggtcgtaaagcattaatcacttgcttagcaccagatc gccgtgttgaaatccaagttcaaggttcaaaagaagtttctatgtaa(2)根據表達載體pET_32a (+)的操作指南，將pET_32a (+) -OMP P5質粒轉化至表 達宿主中，進行表達、純化和復性，得到副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白；所述的步驟(2)更優選為將pET-32a-0MP P5質粒轉化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)，接著，挑取單個菌落在含有Amp的LB液體培養基(氨苄青黴素的終 濃度至少為50 μ g/mL)中37 °C振蕩培養，待0D600值達到0. 6時加入IPTG (終濃度為 0. 2mmol · L—1)進行誘導5 6小時，收集菌體，超聲裂解收集得到的菌體，用Novagen的 His · Tag融合蛋白純化試劑盒，按照試劑盒說明書進行包涵體的抽提與純化；純化後用尿 素進行透析復性，得到副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白。所述檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，優選為所述副豬嗜血桿菌OMP P5 蛋白的包被量為0. 02 0. 05 μ g ；所述檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，更優選為S/N ^ 2. 1 (S為待測血 清測定得到的OD45tl, N為標準陰性血清的OD45tl)，且OD45tl > 0. 375 ；實現所述檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的試劑盒，包含包被緩衝液、 封閉液、洗滌緩衝液、抗體稀釋液、底物顯色液和終止液，其中，包被抗原為副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果(1)通過特異性試驗、阻斷實驗、重複性試驗及臨床應用檢測，證明本發明所述的 檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法具有特異性好、敏感性高、重複性好及快速、簡 便、準確的特點，可用於副豬嗜血桿菌抗體的臨床大規模檢測和流行病學調查。(2)本發明所用的包被抗原，即副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白可通過基因工程方法獲 得，生物安全性高。目前國內外還沒有用此蛋白作為抗原建立HPS抗體間接ELISA檢測方 法的相關報導，具有廣闊的應用前景。
圖1是副豬嗜血桿菌OMP P5基因的PCR擴增圖；其中泳道M為DL2000DNA Marker ；泳道1為陽性對照；泳道11為陰性對照；泳道 2 10禾Π 12 17為PCR擴增產物。圖2是pET-32a(+)-0MP P5質粒的酶切鑑定圖；其中泳道M為寬範圍DNA Marker (100 6000bp)；泳道2和3分別為EcoRV酶 和BamH I酶進行雙酶切的產物；泳道1為PCR產物；泳道4為pET_32a(+)質粒單酶切。圖 3 是 HPS OMP P5 蛋白的 SDS-PAGE 圖；其中泳道M為高分子量蛋白Marker ；泳道1為空載體對照；泳道2為未誘導對 照；泳道3為培養基對照；泳道4和9為全菌體表達產物；泳道5、6和10為超聲破碎菌體 沉澱；泳道7、8和11為超聲破碎菌體上清。圖4為HPS OMP P5蛋白純化的SDS-PAGE圖；其中泳道1 3為穿過峰；泳道4 8為漂洗下組分；泳道M為高分子量蛋白 Marker ；泳道9 14為洗脫下組分。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 於此。實施例1一、副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白基因的克隆、表達和純化1、PCR引物設計與合成(1)根據HPS OMP P5基因序列(基因登錄號為CP001321)，用生物軟體Premier Primer5.0設計了 1對特異性引物，擴增HPS OMP P5的全基因。引物由上海生工生物 工程技術服務有限公司合成。上遊引物HPS P1的序列5 『 -GCCGATATCGCTCCACAAGCTA ACACT-3 『(下劃線部分為EcoRV酶切位點)；下遊引物HPS P2的序列5 『 -CGCGGATCC TTACATAGAAACTTCTTTTGAACCT-3 『(下劃線部分為 BamHI 酶切位點)。2、HPS OMP P5基因的克隆及表達載體構建以臨床分離菌株HPS菌液為模板，用設計好的特異性引物P1/P2進行擴增(95°C 預變性5min ；94°C變性45s，50°C退火45s，72°C延伸lmin，進行30個循環；最後72°C延伸 IOmin)(見圖 1)。擴增產物用 Omega 公司的 Bio—tek Ε. Ζ. N. A. GelExtraction Kit DNA 凝膠回收試劑盒回收目的片段(1116bp)。目的片段回收後，與PMD18-T載體連接，連接後(按 照分子克隆)轉化入大腸桿菌DH5ci (廣州合達生物科技有限公司)，塗布於含氨苄青黴素 (氨苄的濃度為10(^8/11^)1^固體培養基，371、230印111培養12 1611後，挑取生長出的 陽性克隆重組子接種於加有氨苄青黴素的LB培養液中進行增菌培養，然後用PCR方法從克 隆質粒pMD18-T-0MP P5中擴增出副豬嗜血桿菌OMP P5基因片段，用EcoR V和BamHI雙酶 切後，將基因亞克隆到原核表達載體pET-32a (+)中，構建重組表達載體，並進行PCR鑑定和 酶切鑑定(見圖2)。陽性質粒由上海英駿生物技術有限公司進行序列測定(如下所示)， 陽性質粒命名為pET-32a(+)-0MP P5。atgaaaaaatctttaattgcattagcagtatcaggtttagcagttgcttctgtagctcaagctgctcca caagctaacactttctatgtaggtgctaaagctggttgggcaacattccacaatgatattaaccaaattgactctaa gtatgctaatgatgcacgttatgatgctactaatttaaaatatggcattagccgtaactctgtaacttacggtgtgt ttggtggttaccaaattattgacaacttagcagttgaattaggttacgattatttcggtcgtgttcgtggtaacaaa caagaattccgtgcattcaaacactctgcacacggtacacacttaagcttaaaaccaagctatgaagtattaaacgg tttagatgtttacggtaaagttggtgctgcattagttcgtaacgattacaaacgttatagccaaacagctggagtgc aaactcaaaaagctcataacttaaaaacctctttagtattaggtgcaggtgttgagtatgcaattcttccagaatta gcattccgtgttgagtaccaatggttaagccgtgtgggtaatgctaacaaagcagctcaaaaacgtggcgacacagc tatgtttggtccaggttctacatatagccctgatgcacactcagtatctgcaggtatttcataccgcttcggtcaag gtgcagcaccagttgtagcagcaccagaagttgtaactaaaaacttcgcgttcagctcagacgtattatttgacttc ggtaaagcaaacttaaaaccagctgcagcacaaacattagacgcagtacacactgagatcgtaaatttaggtttagc aaaccctgctgtacaagtaaacggttacacagaccgtattggtaaagatgctgccaacttaactctttcacaaaaac gtgcagaaacagtagcaaactacatcgtttctaaaggtgttaacccagctaacgtaacagcggtaggttacggtgaa gctaacccagtaactggtaacacatgtgacgcagttaaaggtcgtaaagcattaatcacttgcttagcaccagatcg ccgtgttgaaatccaagttcaaggttcaaaagaagtttctatgtaa3、重組pET-32a-0MP P5融合蛋白的誘導表達、純化及檢測按照分子克隆方法，將陽性重組表達質粒pET-32a-0MP P5轉化大腸桿菌 BL21 (DE3)(廣州合達生物科技有限公司)，挑取單個菌落在含有Amp的LB液體培養基中 37°C振蕩培養。待0D600值達到0. 6時加入異丙基硫代-β -D-半乳糖核苷IPTG (終濃度為 0. 2mmol化―1)進行誘導。誘導表達6h後，離心收集菌液，然後用適量pH8. 0的裂解液(50mM NaH2P04，pH 8. 0,300mM NaCl，IOmM咪唑)重懸上述菌體沉澱，在細菌重懸液中加入溶菌酶 至終濃度為lmg/mL，並置於冰浴中孵育30min。冰浴超聲破碎細菌，工作方式400W功率， 超聲破碎時間2s，間隔時間5s，超聲20min，直至液體變透亮為止。超聲裂解後，4°C 9000r/ min離心30min，分別收集菌液上清與沉澱，用於純化(上樣前用0. 45 μ m的濾膜過濾)；上 清和沉澱分別留樣作SDS-PAGE檢測分析。SDS-PAGE電泳檢測結果表明(見圖3)，重組大 腸桿菌能夠特異性表達HPS OMP P5蛋白，且主要以包涵體形式進行表達。收集的蛋白用Novagen公司的Ni-NTA His · Bind融合蛋白親和純化柱，按照說 明書進行包涵體的抽提與純化。包涵體的抽提步驟如下l)9000rpm離心IOmin收集菌體， 棄上清，儘量去除培養基，按每IOOmL培養基所得菌體加入40mL IX結合緩衝液比例重懸 菌體，此步驟不加變性劑；2)按前述方法進行超聲，重懸菌液，剪切降解核酸；3)9000rpm離 心20分鐘，包涵體和細胞碎片位於沉澱中，其他可溶蛋白部分位於上清中；4)移去上清，每IOOml培養物的沉澱重懸於20mL 1 X結合緩衝液，重複第3步。可能需要超聲以徹底 重懸沉澱；5)移去上清，按每IOOmL培養物加5mL緩衝液比例，加入含6M尿素的IX結合 緩衝液重懸沉澱；6)冰浴孵育1小時，徹底溶解包涵體，9000rpm離心30分鐘去除不溶成 分，Ni-NTA His - Bind純化之前用0. 45 μ m濾膜過濾上清。純化步驟如下1)將Iml 50% Ni-NTA His-Bind樹脂懸液加到4ml細胞裂解液中，輕柔混勻(如旋轉混合器200rpm)，室 溫結合15-60min ；2)將裂解液與Ni-NTAHis · Bind樹脂的混合物小心加入下端封閉的空 色譜柱中；3)除去柱下端封閉蓋子，收集流出液(穿過峰)，保存用於SDS-PAGE電泳分析; 4)以4ml buffer C漂洗雜蛋白2次。保存漂洗組分用於SDS-PAGE電泳分析；5)以0. 5ml buffer D洗脫目的蛋白4次，再以0. 5ml buffer E洗4次，收集組分，用SDS-PAGE分析(如 圖4所示)；蛋白單體通常用buffer D即可洗脫，而多聚體、聚合物和含兩個His· Tag標 籤的蛋白通常由buffer E洗脫。目的蛋白洗脫後，用5mL的平衡緩衝液平衡柱子，然後再 灌滿20%乙醇，封閉，以備下次使用。純化蛋白加入終濃度為lmg/mL的還原型穀胱甘肽後分別用含有4m0l/L、3m0l/L、 2mol/L、lmOl/L、0mOl/L尿素的pH8. 5的PBS緩衝液，進行梯度透析復性，得到有活性的目的蛋白。二、副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白作為抗原的間接ELISA方法的鑑定1、副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白作為抗原的間接ELISA檢測方法相關試劑的配方包被緩衝液(0.05M 碳酸鹽緩衝液 ρΗ9· 6) 1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3 溶於 800mL雙蒸水中，調節pH值至9. 6，並定容至IOOOmL。封閉液1 °/0 BSA,即Ig牛血清白蛋白(BSA)加入IOOmL的包被液中，混勻，現配現用。洗滌緩衝液(pH7.4PBST) :0· 2g KH2P04，2.9g Na2HPO4 · 12H20，8. Og NaCl，0.2g KCl，0. 5mLTween-20 (0. 05% V/V)以上各物質準確稱量後，加雙蒸水完全溶解後，調pH值至 7. 4，定容至 IOOOmL0抗體稀釋液0. 5g BSA溶於IOOmLPBST (洗滌緩衝液)中。TMB (四甲基聯苯胺)底物顯色液取A液lmL+B液50mL(Α液和B液的比例為 1 50)。A 液5mg/mL TMB 50mg 溶於 IOmL DMSO 中 4°C避光保存。B 液磷酸-檸檬酸緩衝液(PH 5. 0)甲液0. 2Μ(71· 6g/L) Na2HPO4. 12H20 ；乙液 0. IM(19. 2/L)檸檬酸。配製方法51. 4mL甲液+48. 6mL乙液+IOOmL超純水，加入30% H202 112 μ L至於棕色瓶中4°C避光保存。終止液(2M H2SO4)雙蒸水178. 3mL，逐滴加入濃硫酸(98% ) 21. 7mL。2、HPS OMP P5蛋白作為抗原的間接ELlSA方法的操作程序用純化的pET-32a(+)-0MP P5蛋白作為抗原包被聚苯乙烯反應板，建立間接 ELISA方法，步驟如下(1)包被用包被液稀釋抗原液後，100 μ L/孔，加入96孔聚苯乙烯酶聯反應板， 4°C過夜。甩幹後洗滌，每孔加250 μ L洗滌液，每次3分鐘，甩幹，洗3次。(2)封閉每孔加封閉液100μ L，37°C作用封閉2h，甩幹，每孔加250 μ L洗滌液進 行洗滌，每次3分鐘，甩幹，洗3次。
(3)加樣用抗體稀釋液稀釋血清(1 160)後每孔加入100μ L，37°C作用lh，甩 幹。每孔加250 μ L洗滌液進行洗滌、每次3分鐘，甩幹，洗3次。(4)加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔酶標二抗每孔加50 μ L最適稀釋倍數 (1 5000)的二抗，37°C作用30min，甩幹。每孔加250 μ L洗滌液進行洗滌，每次3分鐘， 甩幹，洗3次。(5)加顯色液每孔加入新配製的顯色液50 μ L，室溫避光顯色IOmin。(6)加入終止液每孔加入100 μ L終止液終止反應。(7)測OD值自動酶聯檢測儀測定各孔0D450nm值。3、HPS OMP P5蛋白作為抗原的間接ELlSA方法的特異性試驗利用初步建立的ELISA檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(App)陽性血清、豬鏈球 菌(SS)陽性血清、豬多殺巴氏桿菌(PM)陽性血清、豬大腸桿菌(E.coli)陽性血清、豬偽 狂犬病毒(ADV)陽性血清、豬圓環病毒2型(PCV2)陽性血清和豬繁殖與呼吸障礙症候群 (PRRSV)陽性血清進行檢測，並設HPS陰、陽性血清作為對照，以檢測其特異性；觀察上述各 血清與HPS OMP P5蛋白的交叉反應。結果見表1。表1特異性試驗結果
權利要求
一種檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特徵在於該方法是將副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)OMP P5蛋白作為包被抗原；而且判斷標準如下待測血清的OD450值＞0.375，且待測血清的OD450值/標準陰性血清的OD450值≥2.1。
2.根據權利要求1所述檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特徵在於所述 的副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根據權利要求2所述檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特徵在於所述 的副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白通過基因工程方法得到，具體如下(1)將核苷酸序列如SEQID NO. 2所示的的副豬嗜血桿菌OMP P5核苷酸序列通過表 達載體pET-32a(+)的多克隆位點克隆至表達載體pET-32a(+)中，得到pET_32a(+)-OMP P5 質粒；其中，該副豬嗜血桿菌OMP P5核苷酸序列的5』端位於表達載體pET-32a(+)中的Trx Taq編碼序列的3』端；(2)根據表達載體pET-32a(+)的操作指南，將pET_32a(+)-OMP P5質粒轉化至表達宿 主中，進行表達、純化和復性，得到副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白。
4.根據權利要求3所述檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特徵在於所述 的步驟(2)為將pET-32a-0MP P5質粒轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21 (DE3)，接著， 挑取單個菌落在含有Amp的LB液體培養基中於37°C振蕩培養，待0D600值達到0. 6時加 入IPTG進行誘導，收集菌體，超聲裂解收集得到的菌體，用Novagen的His · Tag融合蛋白 純化試劑盒，按照試劑盒說明書進行包涵體的抽提與純化；純化後用尿素進行透析復性，得 到副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白。
5.根據權利要求1所述檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，其特徵在於所述 副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白的包被量為0. 02 0. 05 μ g。
6.實現權利要求1 5任一項所述檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法的試劑 盒，包含包被緩衝液、封閉液、洗滌緩衝液、抗體稀釋液、底物顯色液和終止液，其特徵在於 所用的包被抗原為副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法以及試劑盒。該間接ELISA方法是將副豬嗜血桿菌OMP P5蛋白作為包被抗原；而且判斷標準如下待測血清的OD450值＞0.375，且待測血清的OD450值/標準陰性血清的OD450值≥2.1。實現該方法的試劑盒，包含包被緩衝液、封閉液、洗滌緩衝液、抗體稀釋液、底物顯色液和終止液，其中，所用的包被抗原為副豬嗜血桿菌OMPP5蛋白。通過特異性試驗、阻斷實驗、重複性試驗及臨床應用檢測，證明本發明具有特異性好、敏感性高、重複性好及快速、簡便、準確的特點，可用於副豬嗜血桿菌抗體的臨床大規模檢測和流行病學調查。
文檔編號C07K14/195GK101968490SQ201010264499
公開日2011年2月9日 申請日期2010年8月26日 優先權日2010年8月26日
發明者宋帥, 李春玲, 王貴平, 賈愛卿, 陳善真 申請人:廣東省農業科學院獸醫研究所