一組檢測ctg重複序列的引物及其檢測試劑盒的製作方法
2023-06-18 04:16:01
一組檢測ctg重複序列的引物及其檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及基因診斷【技術領域】，具體涉及一組檢測CTG重複序列的引物及其檢測試劑盒。一組檢測CTG重複序列的引物，所述引物為一組寡核苷酸引物，其核苷酸序列分別為：SEQID?NO.1，SEQID?NO.2，SEQID?NO.3和SEQID?NO.4所示。本發明所示引物組及其試劑盒能對高拷貝CTG重複序列進行精確定量分析，是DM1分子診斷中目前最簡單、快速、準確的檢測方法。只需要一次PCR實驗就可以檢測出DM1患者CTG重複數的變異情況；從DNA樣本開始8小時就可以出結果；檢測技術流程簡單，容易實現標準化。
【專利說明】—組檢測CTG重複序列的引物及其檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因診斷【技術領域】，具體涉及一組檢測CTG重複序列的引物及其檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]20世紀80年代後期，James和Wis等發現了微衛星DNA序列，又稱短串連重複序列(Short Tandem Repeats, STR)或者簡單重複序列(Simple Sequence Repeats, SSR),其每一單兀長度在 l_6bp 之間[E R Moxon, C Wills.DNA microsatellites:Agents ofevolution Sci A m, 1999，280，94-100]。若這些短串連重複序列在基因組中過量表達，極有可能影響正常基因的表達。例如三核苷酸重複序列，主要有(CGG) n、(CCG) n、(CTG) n、(CAG)η等，它們幹擾正常基因的表達從而引發一些遺傳性神經紊亂疾病。
[0003]強直性肌營養不良I型(Myotonic Dystrophy Typel, DM),它是一種常染色體顯性遺傳疾病[M ffojciechowska, A Bacolla, J E Larson et al.J.Biol.Chem.，2005, 280, 941-965]。其主要臨床症狀有肌肉直、肌肉萎縮、心臟傳導異常、前額早禿、胰島素抵抗、面部形態改變、頭頸部皮膚出現上皮瘤、先天性智力低下以及馬蹄內翻足等。患者間的病情和症狀變化較大，發病年齡跨度也很大。根據臨床表現和發病年齡將DMl分為三種類型:最嚴重的形式為先天性(CDM)，病人出生時出現肌張力低，呼吸窘迫，吸吮差和畸形的容貌，運動和智力發育遲緩，嬰兒期死亡率高；最輕的形式見於中老年，以白內障，額部禿髮為主要症狀，少數有肌肉受累表現；成人型為最典型的病例，一般發病年齡在10-30歲，有高度可變的表現，可有上述任何症狀和特徵性面容。位於19ql3.3區的強直性肌營養不良蛋白激酶(DMPK)基因3』非翻譯區(3' -UTR)CTG重複數的異常擴增是DMl的分子遺傳學病因，這種CTG重複數的異常擴增也稱之為「動態突變」。DMPK基因3' -UTR的CTG重複數在正常人群中一般為3~35，且遵循孟德爾遺傳規律，在世代傳遞中很少發生序列變化。而當重複數目在50~80時，就會在世代交替中出現頻繁的擴增現象，CTG重複數大量擴增，甚至達到數千。假如重複數超過80時，這一序列的不穩定性明顯增加，導致更高頻率的跳躍式擴增，擴增後的重複數達到120~1250左右。
[0004]目前，DMl的基因檢測方法主要有以下幾種:基因組DNA Southern blot方法、PCR結合Southern blot方法、TP-PCR、SP-PCR、RNA-FISH,上述這些檢測方法均存在缺點，如基因組DNA Southern blot方法操作繁瑣，DNA需要量大，一般實驗室難於實現；TP-PCR對於較大重複數不能進行精確定量分析，只能得出半定量結果；SP-PCR和RNA-FISH方法操作難度大、過程繁瑣，不適合常規基因診斷。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是解決現有DMl的基因檢測方法的缺陷，設計出一種檢測CTG重複序列的引物及其檢測試劑盒，能夠用一次PCR反應快速準確的完成DMl的基因檢測。[0006]為解決的上述技術問題，本發明一組檢測CTG重複序列的引物，所述引物為一組寡核苷酸引物，其核苷酸序列分別為=SEQID N0.1，SEQID N0.2，SEQIDN0.3和SEQID N0.4所示。
[0007]在一些實施例中，所述一組寡核苷酸引物中至少一個引物是經標記的引物。
[0008]在一些實施例中，所述標記為螢光標記，所示螢光標記為螢光素FL、N，N, N，N，-四甲基-6-羧基羅丹明、5-羧基螢光素、2，7- 二甲氧基-4，5- 二氯-6-羧基螢光素、6-羧基-X-羅丹明、CY3?、CY5?、四氯-螢光素、六氯-螢光素、NED?、6-FAM?、VIC?、PET?或LIZ?。
[0009]另一方面，本申請還公開了一種CTG重複序列的檢測試劑盒，其包含一組寡核苷酸引物，其核苷酸序列分別為:SEQID N0.1，SEQID N0.2，SEQID N0.3和SEQID N0.4所示。
[0010]在一些實施例中，所述一組寡核苷酸引物中至少一個引物是經標記的引物。
[0011]在一些實施例中，所述標記為螢光標記，所示螢光標記為螢光素FL、N，N，N，N，-四甲基-6-羧基羅丹明、5-羧基螢光素、2，7- 二甲氧基-4，5- 二氯-6-羧基螢光素、6-羧基-X-羅丹明、CY3?、CY5?、四氯-螢光素、六氯-螢光素、NED?、6-FAM?、VIC?、PET?或LIZ?。
[0012]在一些實施例中，所述檢測試劑盒包含正常人DNA對照品和DM症人DNA陽性對照品O
[0013]另一方面，本申請還公開了一種DMl的基因檢測診斷方法，提取待檢測個體的DNA樣品；採用本發明所述檢測試劑盒進行檢測；計算待檢測個體的CTG重複重複數。
[0014]本發明所示引物組及其試劑盒能對於高拷貝CTG重複序列進行精確定量分析，是DMl分子診斷中目前最簡單、快速、準確的檢測方法。只需要一次PCR實驗就可以檢測出DMl患者CTG重複數的變異情況；從DNA樣本開始8小時就可以出結果；檢測技術流程簡單，容易實現標準化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1 一步TP-PCR檢測方法示意圖。
[0016]圖2 —步TP-PCR檢測正常人的毛細電泳結果。
[0017]圖3 —步TP-PCR檢測DMl患者與正常人毛細電泳比較結果。
[0018]圖4檢測結果驗證的凝膠電泳和測序結果。
【具體實施方式】
[0019]在本說明書中所使用的多數詞語具有本領域技術人員所理解的這些詞的含義。在本說明書中明確定義的詞語具有在本發明上下文中作為整體所提供的、並且如本領域技術人員所一般理解的含義。在詞語或短語的本領域所理解的定義與該詞語或短語的在本說明書中明確發明的定義有矛盾時，以說明書為準。本文所使用的標題僅僅為了方便，並且不理解為以任何方式限制。
[0020] 如本文所使用的「DNA」指如本領域所理解的以其各種形式的脫氧核糖核酸，諸如基因組DNA、cDNA、分離的核酸分子、載體DNA以及染色體DNA。「核酸」是指任何形式的DNA或RNA (核糖核酸)。如本文所使用的術語「分離的核酸分子」是指已從其自然環境中移去的核酸分子(DNA或RNA)。分尚的核酸分子的一些實例是在載體中含有的重組DNA分子、維持在異源宿主細胞中的重組DNA分子、部分或基本上純化的核酸分子以及合成的DNA分子。「分離的」核酸可以沒有這樣的序列，即所述序列在該核酸衍生自其中的生物體的基因組DNA中天然地位於該核酸的側翼(即，位於該核酸5』和3』端的序列)。此外，當通過重組技術產生時，「分離的」核酸分子(諸如cDNA分子)可以基本上沒有其它細胞材料或培養基，或當化學合成時其基本上沒有化學前體或其它化學物質。
[0021]「短串聯重複」或「STR」基因座指含有短、重複序列元件的基因組DNA區域。所述重複的序列元件不限於但一般地為3至7個鹼基對長度。每一序列元件在STR中至少重複一次，並且在本文中稱為「重複單位」。術語STR還包括這樣的基因組DNA區域，即其中超過一個重複單位串聯地或具有中間鹼基地重複，條件是至少一個序列串聯地重複至少兩次。
[0022]「多態性短串聯重複基因座」指這樣的STR基因座，其中在基因組DNA特定區域的重複序列元件數目(以及序列淨長度)在等位基因間、以及在個體與個體之間不同。
[0023]如本文所使用的「等位基因階梯」是指由擴增的來自基因座的等位基因組成的標準大小標記物。「等位基因」是指與DNA區段相關的遺傳變異，即佔據相同基因座的DNA序列的兩個或多個備選形式之一。
[0024]「生物化學命名法」是指如在本文所使用的標準生物化學命名法，其中核苷酸鹼基命名為腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。相應的核苷酸例如為脫氧鳥苷-5，-三磷酸(dGTP)。
[0025]"DNA多態性」是指其中DNA序列中的兩種或更多種不同核苷酸序列共存於同一雜種繁殖的群體中的情況。
[0026]「基因座」或「遺 傳基因座」是指染色體上的特定物理位置。基因座的等位基因位於同源染色體上的相同位置。
[0027]「基因座特異性引物」是指與所指明的基因座的部分或其互補鏈特異性雜交的引物，其至少用於該基因座的一個等位基因，並且在用於該擴增方法的條件下不與其它DNA序列有效地雜交。
[0028]「聚合酶鏈式反應」或「PCR」是指其中使用變性、與引物退火、以及用DNA聚合酶延伸的重複循環來約106倍或更多地擴增靶DNA序列拷貝數的技術。用於擴增核酸的PCR方法由美國專利號4，683，195和4，683，202所覆蓋，其在此通過引用將其全文地併入本文，用於描述該方法。用於任意PCR的反應條件包括反應的化學成分以及它們的濃度、在反應循環中使用的溫度、反應的循環數以及反應循環階段的持續時間。
[0029]本文所使用的「擴增」是指用酶增加特定核苷酸序列量的方法。這一擴增不限於但一般通過PCR完成。如本文所使用的，「變性」是指將兩條互補核苷酸鏈從退火狀態分開。可通過許多因素，諸如例如破壞鹼基配對相互作用的緩衝液的離子強度、溫度或化學物質來誘導變性。
[0030]如本文所使用的，「退火」是指核苷酸鏈之間的特定相互作用，其中所述鏈基本上基於如通過Watson-Crick鹼基配對所確定的鏈之間的互補性彼此結合。對於發生退火，不需要100%的互補性。如本文所使用的，「延伸」是指在引物寡核苷酸與靶核酸退火之後的擴增循環，其中聚合酶應用靶核酸作為複製模板實現引物延伸為適當大小的片段。
[0031]「引物」是指單鏈寡核苷酸或DNA片段，其與基因座的DNA鏈以此種方式雜交從而使得該引物的3』端可作為應用DNA聚合酶聚合併延伸的位點。「引物對」是指兩條引物，其包含在待擴增的DNA序列的一端與單鏈雜交的引物I，以及與該待擴增的DNA序列的互補鏈的另一端雜交的引物2。「引物位點」是指引物與之雜交的靶DNA的區域。本文所用的術語「擴增引物」和「寡核苷酸引物」可互換使用
[0032]「遺傳標記」一般是具有用於分析(諸如DNA分型)的目的性狀的基因組DNA等位基因，其中個體基於它們DNA中的變異而區別。多數DNA分型方法被設計以檢測和分析群體中已知以至少兩種不同形式或等位基因出現的一個或更多個DNA標記區域的長度和/或序列差異。此類變異稱為「多態性」，並且其中發生了此類變異的DNA的任何區域稱為「多態性基因座」。進行DNA分型的一種可能方法包括結合PCR擴增技術(KB Mullis，美國專利號4，683，202)和長度變異多態性的分析。傳統上PCR僅能可靠地用於擴增相對小的DNA片段，即僅能擴增3000個鹼基長度以下的DNA片段(M.Ponce和L.Micol (1992)，NAR20 (3):623 ；R.Decorte 等(1990)，DNA CELL BIOL.9(6):461469)。短串聯重複(STR)、微衛星和可變數目串聯重複(VNTR)是長度變異多態性的一些實例。含有微衛星或VNTR的DNA片段通常太長而不能通過PCR可靠地擴增。相反，含有約3至7個核苷酸的重複單位的STR足夠短以在PCR應用中用作遺傳標記，因為可以設計擴增方案以產生比可能來自DNA的其它可變長度區域更小的產物。
[0033]寡核苷酸引物可包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶，以及尿嘧啶、核苷類似物(例如，但不限於次黃嘌呤核苷、鎖定核酸(LNA)、非核苷酸連接子、肽核酸(PNA)和phosporamidites以及含有或與化學部分綴合的核苷,其中所述化學部分諸如放射性核素(例如，32P和35S)、螢光分子、小溝結合物(MGB)、或本領域公知的任何其它核苷綴合物。
[0034]一般地，可化學合成寡核苷酸引物。在PCR優化中引物設計和選擇是常規步驟。本領域普通技術人員可容易地設計用於擴增目的靶基因座的特異引物，或從本文列出的參考文獻中獲得引物集。所有的這些引物都在本發明公開的範圍之內。
[0035]弓丨物濃度的優 化可在確定最終引物序列之前或之後進行，但是最經常在引物選擇之後進行。一般地，增加任何特定基因座的引物的濃度會增加為該基因座產生的產物量。然而，引物濃度優化也是反覆的過程。總之，特定引物集濃度的線性增加並不必然地等於相應基因座擴增產物產量的線性增加。有關基因座特異性引物更詳細的描述，參見MJ Simons美國專利號5192，659，其通過引用而全文併入本文。
[0036]在多重反應中基因座擴增產物平衡還可能受到擴增方案的許多參數的影響，例如，諸如模板(樣品DNA)輸入量、所使用的擴增循環數、熱循環方案的退火溫度以及在循環步驟的的末尾包括或不包括額外的延伸步驟。在所有等位基因和基因座中擴增產物產量的絕對均勻平衡儘管在理論上是期望的，但一般無法在實踐中實現。
[0037]可使用與隨後的DNA擴增相容的任何樣品製備方法製備用於本發明公開的方法的基因組DNA樣品。許多此類方法是本領域技術人員公知的。一些實例是通過苯酚抽提的 DNA 純化(J.Sambrook 等(1989)，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp.9.14-9.19)、以及通過鹽沉澱(S.Miller 等(1988)，NUCL.ACIDS RES.16:1215)或 Chelex(PS Walsh等(1991)，B10TECHNIQUES10:506-513 ;C.T.Comey 等(1994)，J.FORENSIC Sc1.39:1254)的部分純化，以及應用未處理的血的材料(J.Burckhardt (1994)，PCRMETHODS ANDAPPLICAT10NS3:239-243 ；RBE McCabe(1991)， PCR METHODS AND APPLICAT10NS1:99-106 ；BY Nordvag(1992)，B10TECHNIQUES12:4pp:490-492)。[0038]當待應用本發明的方法進行分析的至少一個DNA樣品是人類基因組DNA時，可從組織樣品製備D NA,所述組織樣品例如,諸如是血液、精液、陰道細胞、毛髮、唾液、尿、骨、口腔樣品、含有胎盤細胞或胎兒細胞的羊膜水、絨膜絨毛、和/或任意這些的混合物或其它組織的一種或更多種。
[0039]任選地，可在用於本發明公開的方法之前使用本領域技術人員公知的DNA定量的任何標準方法測量DNA濃度。此類定量方法例如包括如由J.Sambrook等(1989)描述的分光光度測量；或應用諸如由C.F.Brunk等(1979)，ANAL.B10CHEM.92 =497-500描述的測量技術的螢光測定方法。可通過比較DNA標準品與諸如由J.S.Waye等(1991)中描述的人特異性探針的雜交量測量DNA濃度。在擴增反應中使用太多的模板DNA可能產生可能不代表真實等位基因的擴增假象。
[0040]一旦製備了基因組DNA樣品，可在本發明公開的多重擴增步驟中共擴增靶基因座。可以使用許多不同擴增方法中的任一種擴增該基因座，例如，諸如PCR (R.K.Saiki等(1985)，SCIENCE230:1350_1354)、基於轉錄的擴增(D.Y.Kwoh&T.J.Kwoh (1990), AMERICANB10TECHN0L0GY LABORATORY, 1990 年 10 月)以及鏈置換擴增(SDA) (GT Walker 等(1992)，PROC.NATL.ACAD.SC1.,US A.89:392-396)。
[0041]標準PCR的化學成分一般包括溶劑、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸(「dNTPs」)、寡核苷酸引物、二價金屬離子、以及預期含有PCR擴增靶的DNA樣品。一般可使用水作為PCR的溶劑，其一般包含緩衝劑和非緩衝鹽諸如KC1。緩衝劑可以是本領域公知的任意緩衝劑，諸如，但不限於Tri s-HCl，並且可通過常規實驗進行變化以最優化PCR結果。本領域普通技術人員能很容易地確定最佳的緩衝條件。可依賴於用於擴增的特定酶優化PCR緩衝液。
[0042]二價金屬離子通常對於允許聚合酶有效工作是有利的。例如，鎂離子是允許一些DNA聚合酶有效工作的一種離子。一般地，可將MgCl2或MgSO4加入到反應緩衝液中以提供最佳的鎂離子濃度。最佳PCR擴增所需的鎂離子濃度可能取決於所使用的特定引物集以及模板。通常經驗地確定為達到最佳擴增所添加的鎂鹽量，並且是本領域的常規實踐。一般地，對於最佳PCR的鎂離子濃度可以在約I至約IOmM之間變化。在PCR中鎂離子濃度的一般範圍可以是約1.0至約4.0mM，在約2.5mM的中點周圍變化。備選地，可使用二價離子錳，例如以二氧化錳(MnO2)的形式，滴定至適於最佳聚合酶活性的濃度，這可通過本領域技術人員使用標準實驗室方法而很容易地確定。
[0043]在擴增核酸分子中使用的構件模塊dNTP—般可以以例如約40-200 μ M的脫氧腺苷三磷酸(「dATP」)、脫氧鳥苷三磷酸(「dGTP」)、脫氧胞苷三磷酸(「dCTP」)和脫氧胸苷三磷酸(「dTTP」)的每一種的濃度在標準PCR中提供。還可以使用其它dNTP，諸如脫氧尿苷三磷酸(「dUTP」 )、dNTP類似物(例如，次黃嘌呤核苷)、以及綴合的dNTP，並且它們也由本文所使用的術語「dNTP」所包括。儘管使用約40-200 μ M濃度的每一種dNTP適於本發明公開的方法，但是超過約200 μ M每一 dNTP的濃度將是有利的。因此,在這些公開的方法的一些實施方案中，每一 dNTP的濃度一般至少約500 μ M並且可高達約2mM。在一些其它的實施方案中，每一 dNTP的濃度為約0.5mM至約ImM。用於任意多重擴增的特定dNTP濃度可依據條件而變化，並且可通過本領域技術人員應用標準實驗室方法經驗地確定。 [0044]在PCR中使核苷酸三磷酸聚合為擴增產物的酶可以是任意DNA聚合酶。DNA聚合酶可以是例如本領域公知的任何耐熱聚合酶。可用於本領域公開的一些聚合酶的實例是來自諸如源於水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風產液菌、閃爍古生球菌、熱堅芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養甲烷桿菌ΛΗ、詹氏甲烷球菌、熾熱甲焼嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavor1、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshi1、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus kodakaraensis K0D1、 Thermococcus litoralis、 Thermococcuspeptonophilus、90N_7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcus zilligi1、嗜酸熱原體、Thermusbrokianusλ Thermuscaldophilus GK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或它們的突變體通過幾種可能方法的任一種獲得該酶；例如從來源細菌分離、通過重組DNA技術產生或購自商業途徑。此類可商購的DNA聚合酶的一些實例包括AmpliTaq Gold ? DNA聚合酶；Amp IiTaq? DNA 聚合酶；AmpliTaq? DNA 聚合酶 Stoffel 片段；rTth DNA 聚合酶；以及rTth DNA聚合酶。
[0045]PCR的其它已知成分可在本教導的範圍內使用。此類組分的一些實例包括山梨醇、去垢劑(例如Triton X-100、Nonidet P-40 (NP-40)、Tween-20)和破壞核苷酸對錯配的試劑，例如，諸如二甲亞碸(DMSO)和氯化四甲銨(TMAC)以及尿嘧啶N-轉葡糖基酶，或預防PCR的擴增子汙染和/或在PCR步驟開始之前的PCR溫育或預備期間產生不想要的產物的其它試劑。
[0046]PCR循環溫度、循環數和它們的持續時間可以改變以優化特定的反應，這是常規實驗內容。本領域普通技術人員將認識到以下是作為確定PCR各種參數的指引，並且也將認識到一個或更多個條件的變化在本發明的範圍內。為PCR的三個階段確定了溫度和循環時間:變性、退火和延伸。一輪變性、退火和延伸稱為一個「循環」。通常在足夠高以允許DNA鏈分離、而又沒高到破壞聚合酶活性的溫度下進行變性。一般地，可在反應中使用耐熱性聚合酶，其在升高的溫度下不會變性而是保留了一定水平的活性。然而，如果在PCR的每一變性步驟之後補充它們的話，也可以使用熱不穩定聚合酶。一般地，可在高於約90°C並低於約100°C進行變性。在一些實施方案中，可在約94-95°C進行變性。DNA變性一般地可進行至少約I至約30秒。在一些實施方案中，變性可進行約I至約15秒。在其它實施方案中，變
性可進行達約I分鐘或更久。除了 DNA變性，對於某些聚合酶，諸如AmpliTaqGold?，在
變性溫度下溫育還可以活化該酶。因此，當使用這些聚合酶時，允許PCR的第一個變性步驟比隨後的變性步驟更長是有利的。
[0047]在退火期間，寡核苷酸引物與靶DNA在它們的互補區域退火，並且一旦DNA聚合酶與引物-模板雙鏈體結合，則通過DNA聚合酶大大地延伸。在常規PCR中，退火溫度一般地可在或低於最不穩定的引物-模板雙鏈體的解鏈點(Tm)，其中Tm可通過本領域技術人員公知的幾種理論方法的任一種估計。
[0048]一般，在標準PCR中，退火溫度可以是比最不穩定的引物-模板雙鏈體的估計Tm低約5-10°C。退火時間可以是約30秒至約2分鐘。退火期之後一般是延伸期。延伸可進行足夠的時間量以允許聚合酶完成引物延伸至合適大小的擴增產物。
[0049] PCR的循環數(一個循環包括變性、退火和延伸)決定擴增的程度和隨後的擴增產物量。PCR導致DNA分子的指數擴增。因此，理論上，在PCR的每一循環之後，產物的數量是前一個循環中存在的產物的兩倍，直到PCR試劑耗竭並達到了不再產生其它擴增產物的平臺期。一般地，可進行約20-30個循環的PCR，以達到這一平臺期。更一般地，可進行約25-30個循環，儘管循環數沒有特別地限制。
[0050]對於一些實施方案,在PCR最後一個循環的最後階段之後在某些溫度溫育該反應是有利的。在一些實施方案中，可選擇延長的延伸期。在其它實施方案中，可選擇在低溫(例如，約4°C )溫育。
[0051]可使用各種方法評估從多重反應中獲得的擴增產物混合物中擴增的STR基因座產物，包括例如,檢測螢光標記的產物、檢測放射性同位素標記的產物、擴增產物的銀染、或使用DNA插入劑染料(諸如溴化乙錠(EtBr)和SYBR綠花菁染料)以顯現雙鏈擴增產物。適於與用於本發明的引物附著的螢光標記有很多，可商業獲得，並且是本領域公知的。對於螢光分析，可以使用至少一個螢光標記的引物擴增每一基因座。
[0052]當在多重反應中使用引物的螢光標記時，通常可使用至少不同的標記來標記不同的引物。當使用標記物評估多重反應產物時，用於製備標記物的引物可以用與在該反應中擴增目的基因座的引物不同的標記來進行標記。由於自動螢光成像和分析的出現，可以達到多重擴增產物的更快的檢測和分析。
[0053]在本發明公開的一些實施方案中，可以使用螢光團來標記STR基因座擴增中的至少一種引物，例如，通過共價結合至引物，因此產生螢光標記的引物。在一些實施方案中，可以使用不同的螢光團標記多重中用於不同靶基因座的引物，每一螢光團產生取決於該螢光團的發射波長的不同的著色產物。可在同一多重反應中使用這些不同地標記的引物，並且隨後一起分析它們各自的擴增產物。可標記擴增特定基因座的引物對的正向或反向引物之一，儘管更通常標記正向引物。
[0054]以下是本領域公知的並且適於在本發明公開中使用的可能的螢光團的一些實例。該實例意在示例性並且不意味著是窮舉的。一些可能的螢光團包括:螢光素(FL)，其在492nm處最大吸收並且在520nm處最大地發射；N，N, N, N,-四甲基_6_羧基羅丹明(TAMRA?)，其在555nm處最大吸收並且在580nm處最大地發射；5_羧基螢光素(5-FAM?)，其在495nm處最大吸收並且在525nm處最大地發射；2，7- 二甲氧基_4，5- 二氯_6_羧基螢光素(J0E?)，其在525nm處最大吸收並且在555nm處最大地發射；6_羧基-X-羅丹明(R0X?)，其在585nm處最大吸收並且在605nm處最大地發射；CY3?，其在552nm處最大吸收並且在570nm處最大地發射；CY5?，其在643nm處最大吸收並且在667nm處最大地發射；四氯-螢光素(TET?)，其在521nm處最大吸收並且在536nm處最大地發射；以及六氯-螢光素(HEX?)，其在535nm處最大吸收並且在556nm處最大地發射；NED?，其在546nm處最大吸收並且在575nm處最大地發射；6-FAM?，其在約520nm處最大地發射；VIC?，其在約550nm處最大地發射；PET?其在約590nm處最大地發射；以及LIZ?，其在約650nm處最大地發射。參見 SRCoticone 等，美國專利號 6，780, 588 ； AMPFLSTR? IDENTMLER? PCR擴增試劑盒用戶手冊，PP.1-3，Applied Biosystems (2001)。注意到上面列舉的發射和/或吸收波長是典型的並且僅可用於一般地指引作用；對於不同的應用和在不同的條件下真實的峰波長可能不同。
[0055]在篩選或非 篩選介質上分析PCR產物。在本發明的一些實施方案中，例如，可通過電泳分析PCR產物;例如毛細管電泳，如在H.Wenz等(1998)，GENOME RES.8:69-80 ；(還參見E.Buel等(1998)，J.FORENSIC SC1.43:⑴，第164-170頁)中所描述的那樣；或平板凝膠電泳，如在 M.Christensen 等(1999)，SCAND.J.CLIN.LAB.1NVEST.59(3):167-177中所描述；或變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(例如，參見J.Sambrook等(1989)，MOLE⑶LARCLONING:ALAB0RAT0RY MANUAL,SE⑶ND EDITION,Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.,第 13.45-13.57 頁)。電泳中 DNA 片段的分離主要基於不同的片段大小。還可通過色譜法分析擴增產物，例如通過空間排阻色譜法(SEC)。
[0056]一旦分離了擴增的等位基因，則然後可顯現並分析例如在凝膠或毛細管中的這些等位基因以及其它DNA(例如，DNA大小標記物或等位基因階梯)。可應用本領域公知 的許多技術中的任一種完成DNA的顯現，例如諸如，銀染或通過應用報告物，諸如如本文描述的放射性同位素和螢光染料，或化學發光劑以及與可檢測底物聯合的酶。通常，多重基因座的檢測方法可通過螢光。例如參見JW Schumm等，PROCEEDINGS FROM THE EIGHTHINTERNAT10NALSYMP0SIUM ON HUMAN IDENTIFICATION, 1998Promega Corporation 出版，第78-84頁；E.Buel等(1998)，同上。當在多重反應中使用螢光標記的引物檢測每一基因座時，可在擴增之後應用螢光測定檢測儀檢測標記的產物。參見上面的螢光染料的描述。
[0057]可通過與電泳中的大小標準品(諸如已知大小的DNA標記物)相比較而確定DNA樣品中在每一基因座上存在的等位基因大小。用於評估含有兩個或更多個多態性STR基因座的多重擴增的標記物還可包含基因座特異性等位基因階梯或用於每一進行評估的基因座的等位基因階梯的組合。例如參見C.Puers等(1993) ,AM.J.HUM.GENET.53:953-958 ；C.Puers 等(1994)，GEN0MICS23: 260_264。還參見美國專利號 5，99，666 ;5，674，686 ；5，783，406，用於描述適於在檢測STR基因座中使用的一些等位基因階梯，以及其中公開的梯構建的一些方法。在構建了單個基因座的等位基因階梯後，可在與擴增產物相同的時間電泳該梯。每一等位基因階梯與來自相應基因座的等位基因共遷移。
[0058]還可使用內部泳道標準品來評估本發明的多重反應的產物，所述內部泳道標準品即配置以進行電泳的特定類型的大小標記物，例如作為擴增產物在相同的毛細管中。該內部泳道標準品可包含一系列的已知長度片段。還可用螢光染料標記該內部泳道標準品，其中所述螢光染料可與在擴增反應中的其它染料相區分。該泳道標準品可與經擴增的樣品或大小標準品/等位基因階梯混合，並且與任一進行電泳以比較在凝膠電泳不同泳道中或在毛細管電泳不同毛細管中的遷移。內部泳道標準品遷移的不同可用於指示分離介質性能的不同。這一不同的定量以及與等位基因階梯的關聯可提供在不同泳道或毛細管中電泳的擴增產物的校準，並且校正未知樣品中等位基因的大小確定。
[0059]當使用螢光染料標記擴增產物時，可使用螢光檢測儀器分析經電泳並分離的產物，所述儀器例如諸如是ABI PRISM? 310或3130x1遺傳分析儀，或ABI PRISM? 377DNA
測序儀(Applied Biosystems, Foster City, Calif.) ;*Hitachi FMBI 0Π 突光掃描儀(Hitachi Software Engineering America, Ltd., South San Francisco, Calif)。在本發明的各實施方案中，可通過與諸如ABI PRISM" 3130x1遺傳分析儀(Applied Biosystems)的電泳設備聯合的毛細管凝膠電泳方案分析PCR產物，並且可進行經電泳的擴增產物的等位基因分析，例如使用來自 Applied Biosystems 的GeneMapper? ID Software ν3.2。在其它實施方案中，可在例如約4.5%，29: I的丙烯醯胺:雙丙烯醯胺，SM尿素凝膠中電泳分離擴增產物，其中所述凝膠如為ABI PR ISM li 377自動螢光DNA測序儀所製備的那樣。
[0060]本發明的發明還涉及使用上述方法的試劑盒。在一些實施方案中，基礎試劑盒可包括容器，其具有一個或更多個特異性引物。試劑盒還可任選地包含使用說明書。試劑盒還可包含其它任選的試劑盒成分，例如諸如以下中的一種或更多種:針對每一個特定基因座的等位基因階梯、用於擴增的足量的酶、促進擴增的擴增緩衝劑、促進酶活性的二價陽離子溶液、在擴增期間用於鏈延伸的dNTP、用於製備用於電泳的擴增材料的上樣溶液、作為模板對照的基因組DNA、保證材料如預期的那樣在分離介質中遷移的大小標記物、以及教導用戶以及限制使用中的誤差的方案和手冊。各試劑在試劑盒中的量也可以依據許多因素而不同，諸如該方法的最佳敏感性。提供用於手工應用的測試試劑盒或用自動化檢測儀或分析儀的測試試劑盒在這些發明的範圍之內。
[0061]以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。
[0062]實施例1、一步TP-PCR檢測方法的建立
[0063]1.樣本及方法
[0064]1.1樣本來源
[0065]本實驗中一步TP-PCR檢測方法的建立採用8個已知DMPK基因型的樣本，其中3個為DMl患者樣本，其餘5個為正常人樣本。並過對1124個正常中國人樣本和一個含有29個成員的DMl家系樣本的檢測對該方法進行了驗證。
[0066]1.2 一步 TP-PCR 實驗設計
[0067]1.2.1引物設計
[0068](I)引物設計方式見圖1A
[0069](2)引物序列:
[0070]DMPK-P4CAG(R):GGG CGT TCG TAA GGG TTG GC CAG CAG CAG CAG CAG
[0071]DMPK-PI (F):FAM-CGAACGGGGCTCGAAGGGTC
[0072]DMPK-P2(R):AGTTTGCCCATCCACGTCAGG
[0073]DMPK-P3R:GGG CGT TCG TAA GGG TTG GC
[0074] TP-PCR弓丨物篩選比較結果
[0075]
【權利要求】
1.一組檢測CTG重複序列的引物，所述引物為一組寡核苷酸引物，其核苷酸序列分別為=SEQID N0.1，SEQID N0.2，SEQID N0.3 和 SEQID N0.4 所示。
2.權利要求1所述引物，其特徵在於所述一組寡核苷酸引物中至少一個引物是經標記的引物。
3.權利要求2所述引物，其特徵在於所述標記為螢光標記。
4.如權利要求3所述引物，其特徵在於所示螢光標記為螢光素FL、N，N,N, N，-四甲基-6-羧基羅丹明、5-羧基螢光素、2，7- 二甲氧基-4，5- 二氯-6-羧基螢光素、6-羧基-X-羅丹明、CY3?、CY5?、四氯-螢光素、六氯-螢光素、NED?、6-FAM?、VIC?、PET?或LIZ?。
5.如權利要求2所述引物，其特徵在於所述經標記的引物，其核苷酸序列:SEQIDN0.2所示。
6.一種CTG重複序列的檢測試劑盒，其特徵在於其包含一組寡核苷酸引物，其核苷酸序列分別為:SEQID N0.1，SEQID N0.2，SEQID N0.3 和 SEQID N0.4 所示。
7.如權利要求6所述檢測試劑盒，其特徵在於所述一組寡核苷酸引物中至少一個引物是經標記的引物。
8.如權利要求7所述檢測試劑盒，其特徵在於所述標記為螢光標記。
9.如權利要求8所述檢測試劑盒，其特徵在於所示螢光標記為螢光素FL、N，N,N，N，-四甲基-6-羧基羅丹明、5-羧基螢光素、2，7- 二甲氧基-4，5- 二氯-6-羧基螢光素、6-羧基-X-羅丹明、CY3?、CY5?、四氯-螢光素、六氯-螢光素、NED?、6-FAM?、VIC?、PET?或LIZ?。
10.如權利要求6所述檢測試劑盒，其特徵在於所述檢測試劑盒包含正常人DNA對照品和DMl病人DNA陽性對照品。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966332SQ201410211499
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月19日 優先權日:2014年5月19日
【發明者】蘭小平, 安宇, 吳柏林 申請人:復旦大學