應用基因沉默技術提高大豆和花生種子的油酸含量的方法
2023-06-17 17:14:56 1
專利名稱:應用基因沉默技術提高大豆和花生種子的油酸含量的方法
技術領域:
本發明屬於植物育種領域,特別是大豆和花生品質改良的生物工程育種領域。應用雙鏈RNA基因沉默技術對大豆和花生的種子Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1進行改建,通過轉基因技術對大豆和花生種子的脂肪酸含量進行特異性遺傳改良,進而選育油酸含量高的大豆和花生材料。
背景技術:
雙鏈RNA基因沉默是指在生物體內有雙鏈RNA參與指導的,以外源和內源mRNA為降解目標的,致使特定基因不能表達的遺傳現象。雙鏈RNA基因沉默技術是目前控制基因表達最有效和先進的技術,廣泛的應用在植物基因工程的研究領域。Δ12脂肪酸脫氫酶是脂肪酸代謝中催化油酸形成亞油酸的關鍵酶,利用RNA反向重複序列引發的基因沉默原理對大豆和花生種子Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1進行基因改造,導致該基因沉默,使Δ12脂肪酸脫氫酶形成受阻和催化活性降低,從而減少亞油酸的合成,積累大量的油酸。一般的大豆種子油脂中油酸含量約為20%,花生為40-50%。油酸是一種單不飽和脂肪酸(18∶1),穩定性高,能夠降低人體中總膽固醇和血脂,降低有害的低密度脂蛋白膽固醇(LDC),但保持有益高密度脂蛋白膽固醇(HDL)的水平。由於油酸穩定而益於健康的特點,提高大豆和花生種子油酸的含量以改善其營養價值和氧化穩定性,已成為目前大豆和花生品質改良的重要內容。
雙鏈RNA基因沉默是指在生物體內有雙鏈RNA參與指導的,以外源和內源mRNA為降解目標的,致使特定基因不能表達或降低表達的遺傳現象。自從雙鏈RNA在基因沉默中的重要性被發現以來,世界上許多實驗室將雙鏈RNA基因技術用於植物基因功能研究和植物品質改良研究。這個技術是目前最有效的RNA水平上的基因表達抑制手段,其基因抑制效果遠高於傳統的反義antisense基因沉默技術。本發明所採用的發卡式雙鏈RNA(帶有部分內含子,hpRNA-intron)基因沉默結構是目前所研究的基因沉默類型中效率最高的,可達100%,而正義sense和反義antisense抑制的沉默效率為10%和15%,不帶有內含子的發卡式雙連RNA結構(hpRNA-loop)的沉默效率為69%,這些結果已經被很多實驗所證實(Smith et al.2001 Nature 407319)。
高油酸大豆美國的DUPOND公司的高油酸大豆品種(G94-1,G94-19,and G168),1996年申請專利,1997年獲得美國FDA批准可以通過商品化進入市場。他們所獲得的高油酸大豆材料的目的基因和來源為編碼Δ-12油酸脫氫酶的gmFad2-1基因的正義抑制(sense)。與我們所採用雙鏈RNA基因沉默的設計和構建來抑制大豆油酸脫氫酶(Δ-12油酸脫氫酶)gmFAD2-1的活性,進而合成和積累大量油酸的工作原理完全不同。
發明內容
本發明的目的在於應用雙鏈RNA引發的基因沉默技術,設計和構建大豆和花生種子Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1的特殊轉化載體,通過基因工程手段,導致該基因的沉默,促進種子中油酸的積累,獲得高油酸的大豆和花生材料。通過對大豆和花生種子Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1的克隆與改建,構建FAD2-1的反向重複序列結構,並應用FAD2-1種子特異表達的啟動子和終止子,其特殊的基因載體構建會導致FAD2-1基因沉默,進而達到合成大量油酸的目的。即本發明的目的是提供一種應用雙鏈RNA基因沉默技術提高大豆和花生種子油酸含量的方法。
1.應用PCR方法,從大豆和花生基因組中克隆種子特異的Δ12脂肪酸脫氫酶基因片段,並根據雙鏈RNA基因沉默原理將該基因片段構建成反向重複序列結構;2.將大豆和花生種子特異的Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1的反向重複序列基因片段構建到含有種子特異性表達的啟動子和終止子的載體中;3.通過農桿菌介導轉化方法進行基因轉移,組織培養和篩選工作,在其轉基因後代中篩選高油酸含量的株系;採用PCR和Southern blot方法檢測目的基因,用氣相色譜(GC)檢測油酸含量,通過系統選育,確立高油酸含量穩定的大豆和花生材料。
本發明可以縮短周期,提高效率,大幅度提高油酸含量,這將促進我國的大豆和花生品質改良育種的研究和發展。大豆和花生種子Δ12脂肪酸脫氫酶基因反向重複序列結構的設計與構建,可以提高目的基因的表達效率,通過建立的大豆和花生的遺傳轉化系統選育高油酸優異材料,為進一步選育高油酸大豆和花生品種提供基礎。
具體實施例方式
以應用基因沉默技術提高花生種子油酸的含量為例1.所用材料花生材料花生品種為豐花1號、禾花1號和8130。
菌株和質粒大腸桿菌E.coli-DH5α、農桿菌LBA4404;克隆載體pGEM-Teasy,pBI121和pGLe-10。
酶和化學試劑植物基因組提取試劑盒;質粒提取試劑盒,DNA限制性內切酶,T4DNA連接酶,T4DNA聚合酶,CIAP小牛腸鹼性磷酸化酶,pfu聚合酶和DNA ladder;抗生素(卡那黴素等)及其他生化試劑。
2.技術方法FAD2-1基因片斷的克隆和表達載體構建從花生材料中製備總DNA,以此為模板進行多聚酶鏈式反應(PCR)。參照GeneBank中的花生FAD2-1基因(AF272950)設計兩組PCR引物,引物由上海生工公司合成。
第1組引物序列為Primer1GAGCTGGAGGGCGTGTCACTAAGAT;Primer2CAAGTACAAGGGCCATCCTAGTGTG第2組引物序列為Primer1AGGGCGTGTCACTAAGATTGAAGCT;Primer2AATGGGTATGGAAGCTTGTGGAAATPCR反應體系包括10μl PCR buffer,10μl dNTP(each 2.5nmol/L),2μl Tag酶,2μl引物(each 20nmol/μl),2μl模板DNA,加滅菌雙蒸水至100μl。基因擴增儀為PerinElmer9600型,PCR時間程序為94℃預變性3min,94℃1min,59℃1min,72℃90s,共35個循環。
將這兩組PCR產物(片段1和片段2)分別連入pGEM-Teasy載體,然後進行DNA序列分析。測序結果與Genebank中序列進行同源性比較。
將片段2用EcoRI從pGEM-Teasy切下,用T4DNA聚合酶補平後反向連接到片段1所在的pGEM-Teasy的SacII位點上(平端連接法),形成了FAD2-1基因片段的反向重複序列(片段2的序列與片段1的起始序列完全相同)。
利用種子特異表達的大豆凝集素基因啟動子和終止子進行植物表達載體的構建。用載體pBI121和pGle-10重組產生的pLecSma(內含Smal酶切位點)作為卡那黴素抗性且帶有大豆種子特異表達的凝集素啟動子和終止子的雙元載體。將構建好的FAD2-1反向重複序列用Nco1和Pst1從pGEM-Teasy釋放出來,pfu聚合酶平端化,與用Smal線性化後並CIAP去磷酸化的載體pLecSma相連接,構建出表達載體pPNHO-1(見圖1)。
大豆FAD2-1基因片段的克隆和載體的構建方法與花生相同,構建的表達載體為pSBHO-1(見圖2)。
花生的轉化和植株再生花生轉化和組織培養參照Kiran SharmaVanamala Anjaiah(Plant Science 159(2000)7-19)方法進行。即通過三親雜交方法將雙元載體pPNHO-1導入根癌農桿菌LBA4404,用該農桿菌感染花生子葉外植體,光照下共培養三天,然後轉至含有250mg/L頭孢黴素的芽誘導培養基(20uMBA+10uM2,4-D+MS)上誘導叢生芽,兩周後將叢生芽轉至含有125mg/L卡那黴素和250mg/L頭孢黴素的芽誘導培養基(20uMBA+10uM2,4-D+MS)上進行篩選,兩周後再轉至含有125mg/L卡那黴素和250mg/L頭孢黴素的莖伸長培養基(2uMBA+MS)上,此過程約12周,待芽長至3-4釐米高時,轉入無任何抗生素的生根培養基(5uMNAA+MS),經過4周的培養,轉化植株生根並長成完整小植株,經過煉苗,移栽至土壤長大並開花結實。
轉基因花生的鑑定和油酸含量的測定PCR檢測提取再生植株總DNA,以此為模板,用以NPTII和大豆凝聚素基因5』和3』端部分序列設計引物進行PCR反應。
NPTII基因部分序列引物Primer15-TGAGAATATCACCGGAATTG-3;Primer25-GGAAGAACAGTATGTCGAGCTA-3;大豆凝聚素啟動子基因部分序列引物Primer15-CATGTGACAGATCGAAGGAA-3;Primer25-ATCTAATTATTCTATTCAGAC-3。
Southern雜交再生植株總DNA(10ug)經HindIII完全酶解後進行Southern雜交。DNA探針為大豆凝聚素啟動子基因的全部序列,按TaKaRa公司隨機引物標記試劑盒說明書進行標記。
T1和T2代種子油酸含量測定壓榨法提取種子總油脂,甲酯化後用氣相色譜法檢測油酸含量。由東北師範大學測試中心和澳大利亞CSIRO植物研究所檢測。
3.結果利用農桿菌介導的方法將ahFAD2-1基因的反向重複序列導入花生基因組,已在三個品種豐花1號、禾花1號和8130上獲得成功,得到了100多株轉化花生苗,具有良好的重複性,建立了高效的花生轉化體系。
轉基因花生的PCR檢測採用標記基因NPTII,目的基因啟動子(大豆凝聚素啟動子)基因序列設計引物進行PCR檢測。PCR檢測結果表明,在88株檢測植株中有65株為PCR陽性,擴增出了與標記基因和啟動子基因序列片段相同分子量的條帶,而對照植株未擴增出相應條帶。
轉基因花生的Southern雜交分析用目的基因啟動子一大豆凝聚素啟動子基因序列作為探針與轉基因再生植株的DNA雜交,在PCR陽性植株當中,大部分植株的轉基因真實性用Southern雜交分析所證實,含有一至多條雜交帶。
T1代種子油酸含量測定壓榨法提取種子總油脂,甲酯化後用氣相色譜、Megabore層析柱檢測油酸含量。2004年和2005年經東北師範大學分析測試中心和澳大利亞CSIRO植物研究所測定,轉基因花生T1代單株種子在總油脂含量不變的條件下,對照植株油酸含量平均為40%,轉基因花生東花4061(暫定名)平均為77%,其油酸含量平均比對照提高了37個百分點。
附圖1為用於轉化花生的載體模式圖附圖2為用於轉化大豆的載體模式圖附圖3為基因沉默類型效率示意圖
權利要求
1.一種應用基因沉默技術提高大豆和花生種子的油酸含量的方法,其特徵是(1).應用PCR方法,從大豆和花生基因組中克隆種子特異的Δ12脂肪酸脫氫酶基因片段,並根據雙鏈RNA基因沉默原理將該基因片段構建成反向重複序列結構;(2).將大豆和花生種子特異的Δ12脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1的反向重複序列基因片段構建到含有種子特異性表達的啟動子和終止子的載體中;(3).通過農桿菌介導轉化方法進行基因轉移,組織培養和篩選工作,在其轉基因後代中篩選高油酸含量的株系;(4).採用PCR和Southern blot方法檢測目的基因,檢測油酸含量,通過系統選育,確立高油酸含量穩定的大豆和花生材料。
2.按照權利要求1所述的應用基因沉默技術提高大豆和花生種子的油酸含量的方法,其特徵是FAD2-1基因片斷的克隆和表達載體構建從花生材料中製備總DNA,以此為模板進行多聚酶鏈式反應,參照GeneBank中的花生FAD2-1基因(AF272950)設計兩組PCR引物第1組引物序列為Primer1GAGCTGGAGGGCGTGTCACTAAGAT;Primer2CAAGTACAAGGGCCATCCTAGTGTG第2組引物序列為Primer1AGGGCGTGTCACTAAGATTGAAGCT;Primer2AATGGGTATGGAAGCTTGTGGAAATPCR反應體系包括10μl PCR buffer,10μl dNTP(each 2.5nmol/L),2μl Tag酶,2μl引物(each 20nmol/μl),2μl模板DNA,加滅菌雙蒸水至100μl。基因擴增儀為PerinElmer9600型,PCR時間程序為94℃預變性3min,94℃1min,59℃1min,72℃90s,共35個循環;將這兩組PCR產物片段1和片段2,分別連入pGEM-Teasy載體,然後進行DNA序列分析,測序結果與Genebank中序列進行同源性比較;將片段2用EcoRI從pGEM-Teasy切下,用T4DNA聚合酶補平後反向連接到片段1所在的pGEM-Teasy的SacII位點上,形成了FAD2-1基因片段的反向重複序列;利用種子特異表達的大豆凝集素基因啟動子和終止子進行植物表達載體的構建用載體pBI121和pGle-10重組產生的pLecSma作為卡那黴素抗性且帶有大豆種子特異表達的凝集素啟動子和終止子的雙元載體,將構建好的FAD2-1反向重複序列用Nco1和Pst1從pGEM-Teasy釋放出來,pfu聚合酶平端化,與用Sma1線性化後並CIAP去磷酸化的載體pLecSma相連接,構建出表達載體pPNHO-1;大豆FAD2-1基因片段的克隆和載體的構建方法與花生相同,構建的表達載體為pSBHO-1;花生的轉化和植株再生通過三親雜交方法將雙元載體pPNHO-1導入根癌農桿菌,用該農桿菌感染花生子葉外植體,光照下共培養約三天,然後轉至含有250mg/L頭孢黴素的芽誘導培養基上誘導叢生芽,兩周後將叢生芽轉至含有125mg/L卡那黴素和250mg/L頭孢黴素的芽誘導培養基上進行篩選,兩周後再轉至含有125mg/L卡那黴素和250mg/L頭孢黴素的莖伸長培養基上,此過程約12周,待芽長至3-4釐米高時,轉入無任何抗生素的生根培養基,經過約4周的培養,轉化植株生根並長成完整小植株,經過煉苗然後移栽至土壤。
3.按照權利要求2的應用基因沉默技術提高大豆和花生種子的油酸含量的方法,其特徵是所述的芽誘導培養基配方為20uMBA+10uM2,4-D+MS,莖伸長培養基為2uMBA+MS,生根培養基為5uMNAA+MS。
4 按照權利要求2的應用基因沉默技術提高大豆和花生種子的油酸含量的方法,其特徵是所述的花生品種為豐花1號、禾花1號和8130。
5 按照權利要求2的應用基因沉默技術提高大豆和花生種子的油酸含量的方法,其特徵是所述的根癌農桿菌菌種為LBA4404。
全文摘要
本發明屬於植物育種領域,特別是大豆和花生品質改良的生物工程育種領域。本發明應用PCR方法,從大豆和花生基因組中克隆種子特異的基因片段,並根據基因沉默原理將該基因片段構建成反向重複序列結構;將大豆和花生種子特異基因的反向重複序列基因片段構建到含有種子特異性表達的啟動子和終止子的載體中;通過農桿菌介導轉化方法進行基因轉移,組織培養和篩選;採用PCR和Southern blot方法檢測目的基因的表達,檢測油酸含量,通過系統選育,從而確立高油酸含量穩定的大豆和花生材料,改良大豆和花生品質。
文檔編號A01H4/00GK1724669SQ20051001663
公開日2006年1月25日 申請日期2005年3月17日 優先權日2005年3月17日
發明者許守民, 柳青, 劉立俠, 李桂民, 宋凱, 蔡一榮, 馮凱, 李望豐 申請人:東北師範大學