圓環病毒基因工程黏膜免疫亞單位疫苗的製備及其應用的製作方法

2023-06-18 03:52:56

專利名稱：圓環病毒基因工程黏膜免疫亞單位疫苗的製備及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明涉及用於黏膜免疫的融合蛋白，用於 預防豬圓環病毒，其由圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亞單位、大腸桿菌不耐 熱毒素B亞單位、T細胞抗原表位及純化標籤序列組成，及其製備方法及應用。
背景技術：
豬圓環病毒2型(PCV-2)是1991年加拿大的Harding J和Clark E等學者最早 發現。仔豬斷奶後多系統衰竭症候群(PMWS)的主要病原是PCV-2，此外，豬皮炎與腎炎綜 合徵、增生性壞死性肺炎、豬呼吸道症候群、繁殖障礙、先天性顫抖等疫病都與PCV-2相關 聯。PCV2及其相關的豬病死亡率10% 30%不等，較嚴重的豬場在暴發本病時死淘率高達 40%，給養豬業造成嚴重的經濟損失。豬對PCV2具有較強的易感性，感染豬可自鼻液、糞便 等廢物中排出病毒，經口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬。懷孕母豬感染PCV2後，可經胎 盤垂直傳播感染仔豬。公豬精液可能是另一種傳播途徑。用PCV2人工感染試驗豬後，其他 未接種豬的同居感染率是100%，這說明該病毒可水平傳播。豬在不同豬群間的移動是該病 毒的主要傳播途徑，也可通過被汙染的衣服和設備進行傳播。豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)為無囊膜的單股負鏈DNA病 毒，屬圓環病毒科(Circoviridae)成員。其基因組為單股環狀DNA。豬圓環病毒(Porcine circovirus, PCV)為圓環病毒科圓、環病毒屬成員，可分為不致病的圓環病毒1型(PCV-I) 和致病的圓環病毒2型(PCV-幻兩個血清型。國內目前的PCV2疫苗都是全病毒滅活疫苗，有很好的免疫原性。其他商品化的 PCV2滅活疫苗直至到2006年才正式獲得許可證。2006年在富道動物公司的PCV2疫苗 (Suvaxyn)在美國第1個獲得了完整的許可證。2007年9月，梅裡亞PCV2滅活疫苗首次在 歐洲獲得批准文號。全球一共有5家商品化的PCV2疫苗。其中梅裡亞研發的PCV2疫苗 (Circovace)為全病毒滅活苗，適用於母豬免疫；勃林格殷格翰動物保健公司的PCV2疫苗 (CircoFlex)和英特威/先靈葆雅動物保健公司的PCV2疫苗(Circumvent)屬於亞單位苗； 富道動物保健公司的PCV2疫苗(Suvaxyn)則屬於嵌合病毒滅活苗。另外還有一家韓國的公 司亦擁有該疫苗。國內新型疫苗的研製比國外稍慢一些。滅活疫苗在使用中都存在病毒重 組形成新毒株的可能，因此有一定的潛在危險；在亞單位疫苗方面，主要是將PCV2基因組 中編碼免疫原性蛋白的OR F2片段插入到昆蟲杆狀病毒中，通過培養昆蟲杆狀病毒即可快 速、大量獲得具備免疫原性的PCV2核衣殼蛋白，再將其製備成疫苗，大量田間試驗表明該 類疫苗可為仔豬提供良好的免疫保護(勃林格殷格翰動物保健公司的PCV2疫苗CircoFlex 和英特威/先靈葆雅動物保健公司的PCV2疫苗Circumvent):另一類是嵌合病毒滅活苗， 原理是用PCV-2的0RF2片段置換不致病的PCVl中的0RF2片段，即獲得了 PCV1-PCV2嵌合 病毒，具有與PCV-2類似的免疫原性(富道動物保健公司)，試驗中發現活苗中的嵌合病毒 易被母源抗體中和，遂將其滅活製得PCV-1-PCV-2嵌合滅活苗。迄今，多批試驗表明，嵌合 病毒滅活苗可為豬群提供較好的免疫保護，特別在抑制病毒、減少病毒血症方面具有顯著的優勢。近年興起的黏膜免疫，不僅可以產生很強的抗體應答，而且還能產生較好的細胞 免疫效果。黏膜免疫需要有黏膜佐劑分子，已經證實霍亂毒素B亞單位(本文簡稱為CTB)、 大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位(本文簡稱為LTB)均是良好的佐劑分子(Lycke N, European J. of Immunol, 1992 ；22 :2277-2281)。此外，Blanco的研究發現，含有T細胞表位的多肽 能增強Th細胞的活性，並協同誘導機體產生抗病毒抗體(Blanco E，J Virol. 2001 ；75(7) 3164-74)。目前，尚沒有見到針對PCV的黏膜免疫疫苗，為了有效預防圓環病毒，人們迫切需 要一種新型、高效的疫苗來預防圓環病毒。本發明提供了提供了一種新的能用於黏膜免疫 的融合蛋白及其疫苗組合物，其能預防圓環病毒的感染。

發明內容
本發明的目的在於提供了一種新的能用於黏膜免疫的融合蛋白及其疫苗組合物， 其能預防圓環病毒的感染。本發明還提供了含有所述融合蛋白的藥物組合物，如疫苗組合 物。此外，本發明還提供了編碼所述融合蛋白的多核苷酸以及製備該融合蛋白的方法等。在第一個方面，本發明提供了一種用於黏膜免疫的融合蛋白，其含有圓環病毒 PCV2主要膜蛋白capsid protein的亞單位、大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位(LTB)和T細胞 抗原表位。其中，所述圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亞單位指的是具有免 疫原性的圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亞單位中的主要多肽或其具有基本 相同免疫原性的功能等價物，優選是圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亞單位 SEQ ID No. 4。所述的LTB指的是大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位或其具有基本相同黏膜佐 劑功能的功能等價物，優選是如SEQ ID No. 6所示的胺基酸序列或其功能等價物。所述的 T細胞抗原表位指的是能夠能增強Th細胞活性的抗原表位，優選是如SEQ ID No. 8所示的 胺基酸序列或其功能等價物。本文中所用的術語「融合蛋白」是指多個蛋白質或多肽分子連接到一起所形成的 新的蛋白質或多肽或其藥學上可接受的鹽。連接可以通過公知的遺傳工程或化學合成方法 來進行，優選通過遺傳工程方法，即通過重組DNA技術來實現多個蛋白質或多肽分子的融 合。本發明的融合蛋白中亦可包括一些化學修飾部分，如水溶性聚合物。優選水溶性聚合 物要為藥學上可接受的聚合物，如聚乙二醇，葡萄糖，聚乙烯醇，乙二醇/丙二醇共聚物，丙 二醇同源共聚物，多聚胺基酸等。它們可以延長融合蛋白的體內代謝時間，加速生物體對融 合蛋白的吸收，增強融合蛋白的穩定性等。當用基因工程手段表達本發明的融合蛋白時，根 據生產中所使用的宿主細胞的不同，如原核(細菌細胞)或真核(酵母細胞、植物細胞、昆 蟲細胞、哺乳動物細胞、哺乳動物乳腺反應器)，本發明的融合蛋白可以是糖基化的、也可以 是非糖基化的。「藥學上可接受的鹽」指適於與人或動物的組織接觸，而無過多的毒性、刺激 或變態反應等的鹽。藥學上可接受的鹽是本領域熟知的。本文中所用的術語「功能等價物」指的是與原有多肽或蛋白質的活性基本相同的 變異體多肽。該變異體多肽是在原有多肽或蛋白質序列中變異一個或幾個胺基酸殘基而獲 得的多肽，優選是變異一個至五個胺基酸殘基而獲得的多肽，更優選是變異一個至三個氨 基酸殘基而獲得的多肽。變異可以通過缺失、插入和/或用其他胺基酸取代序列上的原氨
4基酸殘基來實施。本領域技術人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列並將其導入表 達載體，可以製備出取代、插入或添加了胺基酸殘基的多肽，這些方法廣泛記載於《分子克 隆實驗指南》(北京科學出版社，2002年)等本領域公知的文獻中。在變異的胺基酸殘基 中，優選變異為與原胺基酸殘基側鏈性質相似的其他胺基酸，從而更得以保持原有功能活 性。側鏈性質相似的胺基酸分別有疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸 (R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側鏈的胺基酸(G、A、V、L、I、P)、含羥基側鏈的胺基酸 (S、T、Y)、含硫原子側鏈的胺基酸(C、M)、含羧酸和醯胺側鏈的胺基酸(D、N、E、Q)、含鹼性基 團側鏈的胺基酸(R、K、H)、含芳香族側鏈的胺基酸(H、F、Y、W)。本文中所用的術語「基本相同」指的是功能等價物的活性相對於與原有多肽或蛋 白質的活性基本不減弱，優選活性可降低不到30%，更優選可降低不到10%，最優選不減 弱。目前已經存在大量檢驗諸如免疫原性、黏膜佐劑功能或增強Th細胞活性能力的實驗方 法，必要時也可根據本發明實施例所述的具體方法，通過諸如基因工程手段將原有多肽或 蛋白質部分替換為相應的功能等價物，由此來選出合適的功能等價物。優選在本發明第一方面的融合蛋白中，所述的圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亞單位的胺基酸序列選自SEQ ID No. 4，其中所述的大腸桿菌不耐熱毒素B亞單 位的胺基酸序列為SEQ ID No. 6;其中所述的T細胞抗原表位的胺基酸序列為SEQ ID No. 8。更優選，本發明第一方面的融合蛋白進一步含有純化標籤和/或接頭肽。純化標 籤(Tag)通常為特定的蛋白質或連續的幾個胺基酸序列，其可以與相應結合物質產生特異 性結合。因而當融合蛋白中含有純化標籤時，可以較容易地利用其結合性質來對融合蛋白 進行純化和鑑定。目前已經有很多純化標籤可以使用，有些已經商品化了，如His標籤、 FLAG標籤、Myc標籤、β-半乳糖苷酶標籤、蛋白A標籤、GST (穀胱甘肽硫轉移酶)標籤等。 本發明的純化標籤優選是His標籤，更優選是胺基酸序列為SEQ ID No. 10所示的胺基酸 序列。接頭肽(也稱「連接子」)是起連接融合蛋白中各活性成分的不超過20個胺基酸殘 基大小的肽，其本身並不具有融合蛋白中各活性成分的作用。優選接頭肽不超過10個氨基 酸殘基大小。本發明可使用接頭肽連接在本發明中的圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亞單位、大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位和純化標籤之間，也可以不使用連接肽而 讓上述活性成分直接。例如，本領域的技術人員所公知的接頭肽的序列有(1)、Α1ειη，η = 2-10(2)、Glyn, η = 2-10 ；(3)、Glyn-Ser, η = 2-10(4)、(Glyn-Ser)m, m = 2-3 ；η = 2-10(5)、Glyn-Ser-Glym, m = 0-10 ；η = 0-10(6)、Glyn-Pro-Glym, m = 0-10 ；η = 0-10(7)、(Ala-Gly) η, η = 1 10 ；(8)、(Gly-Ala) η, η = 1 10 ；(9)、Glyn-Ala-Glym, m = 0-10 ；η = 0-10(10)、Alan-Gly-Alam, m = 0-10 ；η = 0-10(11)、上述序列的任意組合形式。本發明第一方面的融合蛋白優選含有一個圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsidprotein的亞單位、一個T細胞抗原表位、1個大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位和1個 純化標籤，其中純化標籤連接在大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位的C端。本發明的融合蛋白 優選含有圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亞單位和一個T細胞抗原表位，本 發明的融合蛋白含有圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亞單位的一個具有廣泛 代表性的亞單位分子和一個T細胞抗原表位。融合蛋白中各活性成分的排列次序(其中， ORF代表圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsidprotein的抗原亞單位，T代表T細胞抗原表位， Tag代表純化標籤)可以是如下次序=ORF-T-LTB-Tag另外優選，本發明第一方面的融合蛋白的胺基酸序列a)如 SEQ ID No. 2 所示；或b)是對SEQ ID No. 2所示的序列插入、缺失或取代一個或幾個胺基酸殘基而得 的胺基酸序列。本領域技術人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列並將其導入表達載體， 可以製備出取代、缺失或插入了胺基酸殘基的多肽，這些方法廣泛記載於《分子克隆實驗指 南》(北京科學出版社，2002年)等本領域公知的文獻中。在第二個方面，本發明提供了一種核酸分子，其編碼本發明第一個方面所述的融 合蛋白。在本文中，「多核苷酸」、「核酸」、「核酸分子」、「核苷酸序列」可以相互替換使用，均 指一個含意。本發明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，優選DNA形式。DNA 形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是編碼鏈或模板鏈。通過常規技術，如PCR 方法、重組法或人工合成的方法，本領域技術人員可以很容易獲得本發明的編碼融合蛋白 的核苷酸序列或其片段。這些序列一旦獲得，就可以將其克隆入載體，再轉化或轉染入相應 的細胞，然後通過常規的宿主細胞進行增殖，從中分離得到大量的核苷酸序列。優選本發明 的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。在第三個方面，本發明提供了一種載體，其含有本發明第二個方面所述的核酸分 子。本文中的術語「重組表達載體」、「表達載體」，有時僅稱「載體」，在此可以交互替換使 用，是指本領域中常用的細菌質粒、粘粒、噬菌粒、酵母質粒、植物細胞病毒、動物病毒及其 它各種病毒載體。本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達用的載體(原核表達 載體)、在酵母中表達用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲細胞中表達的 杆狀病毒載體載體、在哺乳動物細胞中表達用的載體(痘苗病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺 病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達 用的各種載體。總之，只要能在宿主細胞中穩定複製，任何質粒和載體都可使用。優選表達 載體包含選擇標記基因，如細菌的氨苄青黴素抗性基因、四環素抗性基因、卡那黴素抗性基 因、鏈黴素抗性基因、氯黴素抗性基因；酵母菌的新黴素抗性基因、kocin抗性基因，酵母 菌的缺陷選擇標誌，如His，Leu，Trp等；真核細胞的新黴素抗性基因、Zeocin抗性基因、二 氫葉酸還原酶基因及螢光蛋白標記基因等。在一優選實施方式中，所述表達載體為大腸杆 菌表達載體。本領域技術人員可利用DNA重組技術等一系列技術，構建含本發明所述編碼 融合蛋白的DNA序列、合適的轉錄和翻譯調控序列、啟動子及選擇性標記基因等特定元件 的表達載體。上述載體可用來轉化、轉染合適的宿主細胞，以便獲得所需要的融合蛋白。在第四個方面，本發明提供了一種宿主細胞，其特徵在於，所述細胞已用本發明第 三個方面所述的核酸分子轉化或轉染。宿主細胞可以是原核細胞，也可以是真核細胞，如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。宿主細胞在轉化或轉染含本發 明所述編碼融合蛋白的基因序列後，即構成工程化細胞或細胞株，可用於生產所需融合蛋 白。本領域技術人員能夠恰當地選擇適當的載體、宿主細胞，並熟知如何將載體高效地轉化 或轉染入宿主細胞中，所用方法包括但不限於氯化鈣法、電穿孔法用於細菌細胞，電穿孔 法和原生質體融合法用於酵母細胞，脂質體包裹、磷酸鈣共沉澱、電融合法以及顯微注射法 用於哺乳動物細胞等真核細胞。在第五個方面，本發明提供了製備本發明第一個方面所述融合蛋白的方法，其包 括以下步驟用本發明第四個方面的宿主細胞表達本發明第一個方面所述的融合蛋白，並 分離所述的融合蛋白。獲得的工程細胞可以通過常規方法培養、誘導來表達所需要的融合 蛋白，包括發酵過程和純化工藝。上述表達的蛋白可在細胞內、細胞膜上或分泌到細胞周 質、細胞外。根據需要，可利用融合蛋白的物理的、化學的以及其它生物學特性，進行分離純 化。方法包括但不限於裂菌(超聲波裂菌、滲透壓裂菌)，離心，鹽析，分子篩色譜，離子交 換色譜，吸附色譜(親和層析、金屬鏊合層析)，反向色譜，高效液相色譜，毛細管電泳，製備 性等電聚焦以及常規的變性、復性處理等，這些方法均是本領域技術人員所熟知的。在第六個方面，本發明提供了一種用於黏膜免疫的藥物組合物，其包括本發明第 一個方面所述的融合蛋白以及藥學上可接受的載體，能預防圓環病毒的感染。對於本領域 普通技術人員來說，已經有很多公知的方法能將蛋白質或多肽活性成分與藥學上可接受的 載體製備成藥物組合物。本文中使用的藥學上可接受的載體指無毒的填充劑、稀釋劑、佐劑 或其他製劑輔料。根據本領域的公知技術，可以根據治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合 物製成各種劑型，優選該組合物為單位劑量形式，如片劑、膠囊、粉劑、乳液劑、注射劑、噴霧 劑型或作為飼料添加劑的劑型。優選該藥物組合物為注射劑型、噴霧劑型或作為飼料添加 劑的劑型。這些組合物包含不同緩衝液內容(如磷酸鹽緩衝液、Tris-HCl緩衝液)、相應的 離子強度和PH值，以及其它物質(如聚乳酸、甘露醇等)。也優選該藥物組合物為疫苗組合 物，優選進一步含有佐劑，如福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、CpG序列等。在第七個方面，本發明提供了本發明第一個方面所述的融合蛋白在製備預防圓環 病毒的藥物中的應用。在第八個方面，本發明提供了本發明第五個方面所述的藥物組合物 在製備預防圓環病毒的藥物中的應用。在本發明的一個優選實施方式中，通過對實驗動物 以特定劑量黏膜給藥，有效地保護了實驗動物。


下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的 本發明範圍。圖1為含有融合蛋白編碼基因的表達載體pPICBMDORFLTB的示意圖。圖2顯示了重組表達載體pPICBMDORFLTB用EcoRI+Xbal酶切後的電泳結果，其中 左邊為酶切產物，右邊為DNA分子量標準(從下到上依次對應200bp、400bp、750bp、lkb、 1. 5kb,2kb)。圖3顯示了融合蛋白編碼基因的表達產物的純化和分析鑑定結果，其中左邊第1 道為蛋白分子量標準，第2道為發酵培養液上清，第3道為用60 %飽和度硫酸銨沉澱純化後 的樣品，第4道為用金屬鏊合層析純化後的樣品；右邊第1道為用金屬鏊合層析純化後的樣品的Western印跡的結果，右邊第2道為配製成製劑後的樣品的Western印跡的結果。圖4A分別為血清㈧、肺衝洗物⑶和鼻衝洗物(C)的抗VPl-LTB的IgG抗體的 曲線，其中分三種不同的免疫途徑，具體圖例如下(■-■)為肌肉注射；(O——O ) 為鼻飼；(▲-----▲)為口服，該圖用於顯示活性測定/動物實驗分析的結果。圖4B分別血清㈧、肺衝洗物⑶和鼻衝洗物(C)中的抗ORF-LTB的IgA抗體曲 線，其中分三種不同的免疫途徑，具體圖例如下(■ -■)為肌肉注射；(O——O)為 鼻飼；(▲-----▲)為口服，該圖用於顯示活性測定/動物實驗分析的結果。本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容 均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重複敘述過一樣。為了便於理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指 出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制。依據本說明書的論 述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見了。
具體實施例方式以下所述實驗方法，沒有具體說明的，均按照《分子克隆實驗指南》，2002年，第三 版，科學出版社)所述方法進行。實施例一融合蛋白基因的來源整個融合蛋白的編碼基因按大腸桿菌偏好的密碼子人工設計，並分兩段(按編 碼蛋白從氨基端到羧基端的順序，分別命名為ORF片段(其具有序列為SEQ IDNo. 1中第 1-807位的核苷酸序列)、PLTB片段(其具有序列為SEQ ID No. 1中第802-1116位的核苷 酸序列)交由上海英俊生物技術公司合成，SEQ ID No. 1中1117-1185位的核苷酸序列是 由hvitrogen公司的載體pPIChlpha A的1277-1340位的核苷酸序列提供的。OFD片段 兩端分別設計了 EcoRI (5』端)和BamHI (3』端)限制性內切酶位點，PLTB片段兩端分別設 計了 BamHI (5』端)和)(baI(3』端)限制性內切酶位點。上海英俊生物技術公司把這四個 片段合成好後分別克隆到PMD18T載體上，轉化大腸桿菌，分別提取測序正確後，把這四個 含有分別命名為pMD18T-0RF、pMD18T-PLTB重組質粒的大腸桿菌寄給本公司。實施例二融合蛋白酵母表達載體的構建將含有命名為pMD18T-0RF、pMD18T_PLTB重組質粒的四個大腸桿菌菌株，接種到 含氨苄青黴素50mg/L的IOmlLB培養基中，將含有畢赤酵母分泌表達載體pPIChlpha A(購 自^witrogen公司)的大腸桿菌菌株，接種到含25mg/L kocin低鹽LB培養基中，37°C振 蕩培養過夜，次日按照Qiagen公司質粒提取試劑盒使用手冊，分別提取質粒。含融合片段 編碼基因的重組質粒分別用片段兩端對應的限制性內切酶進行處理，畢赤酵母分泌表達載 體pPIChlpha A用EcoRI和XbaI處理，具體處理條件10μ 1反應體系，體系內加入2 μ 1 質粒，各限制性內切酶分別使用5個活性單位(New England biolabs)，加入IOX緩衝液 Ιμ ，用去離子水補齊，37°C酶切2小時。酶切結束後，加Ιμ 200mM EDTA終止反應。在
瓊脂糖凝膠電泳中，電泳30分鐘。在紫外燈下，分別切下電泳凝膠中載體pPIChlphaA 對應的約3. 6kb條帶和ORF片段各自對應的約800bp條帶，以及PLTB各自對應的約300bp 條帶，按照Qiagen公司凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收。按照載體和片段1 1 3的 比例將4個片段和表達載體混合，反應體系15μ 1，由T4DNA連接酶進行連接，4°C或16°C連接過夜。按照常規方法(氯化鈣法)轉化大腸桿菌ToplOF』感受態細胞，鋪於含kocin 25mg/L的低鹽LB平板，37°C倒置過夜。低鹽LB的配製蛋白腖10g，酵母抽提物5g，氯化鈉5g，加水900ml溶解，用IN氫 氧化鈉調節PH值到7. 5，補水到1000ml，高壓滅菌；低鹽LB平板的配製蛋白腖10g，酵母抽提物5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，加水900ml 溶解，用IN氫氧化鈉調節pH值到7. 5，補水到1000ml，高壓滅菌，待冷卻至55 60°C時，加 入kocin至終濃度25mg/L，鋪平板，保存於4°C備用；挑取平板上的單克隆，接種於低鹽LB培養基中，過夜培養，按照常規方法提取質 粒，EcoRI和^CbaI進行雙酶切鑑定。酶切鑑定陽性的克隆(鑑定結果見圖2)，留存甘油菌 種，儲存於超低溫冰箱中。同時進行序列測定，以確保克隆正確無誤。篩選得到的酵母分泌 表達載體命名為pPICBMD0RFLTB(見圖1)。實施例三融合蛋白表達菌株的構建與篩選接種上述陽性克隆至50ml含25mg/L kocin低鹽LB培養基中，8-12小時後，轉接 於500-1000ml含25mg/L Zeocin低鹽LB培養基中，過夜培養，大量提取質粒，備用。線性化DNA的製備在100 μ 1反應體系中，加入20 μ g上述提取的DNAJnAftne I 20 U (New England biolabs)，去離子水補齊。37°C酶切3小時。取2μ1酶切產物，瓊 脂糖凝膠電泳，觀察酶切是否完全。確認線性化完全後，將餘下的酶切產物加入2 μ 1 200mM EDTA，終止反應。線性化DNA的純化在上述酶切體系中，加入100 μ 1去離子水，加入等體積酚/ 氯仿，劇烈振蕩混勻，13000rpm高速離心10分鐘，將上層轉入新管，加入1/10體積3M醋 酸鈉，再加入2. 5倍體積無水乙醇，混勻，-70°C冰箱中放置1小時，4°C離心，13000rpm, 15 分鐘，棄液體，以80%乙醇洗滌一次，空氣中晾乾，重新溶解在10 μ 1去離子水中，準備電融
合，酵母菌感受態細胞的準備在5ml YPD培養基中接種Pichia pastoris宿主菌(購 自hvitrogen公司)KM71H、GS115和X-33，30°C振蕩培養過夜，次日轉接入500ml新的YPD 培養基中，轉接量約0. 1 0. 5ml (根據酵母菌生長狀態)，30°C繼續培養，直至0D_達到 1. 3 1. 5為止。離心收菌，4°C條件下，1500rpm,離心8分鐘，棄上清，以預冷的500ml無菌 去離子水，重新懸浮，再次離心，條件同上，以250ml預冷的無菌去離子水，重新懸浮，離心， 再以20ml預冷的無菌去離子水，重新懸浮，離心，最後重新用Iml預冷的IM山梨醇懸浮，置 冰上，待用。酵母菌的電融合將80 μ 1上述感受態細胞與5 μ 1 (約10 μ g)線性化DNA混合均 勻，轉入預冷的0. 2cm電融合杯中，冰上放置5分鐘。電融合條件如下1500V，25 μ F，20 Ω。 電擊後，立即加入Iml預冷的IM山梨醇，混合，再轉入一個15ml培養管中，30°C孵育2小時。 取200 μ 1分別鋪於含不同濃度kocin的YPDS平板上(含kocin 200 μ g/ml, 500 μ g/ml, 1000 μ g/ml)，倒置，30°C培養 2 天。培養基和平板準備YPD培養基900ml水中溶解IOg酵母抽提物，20g蛋白腖(ρ印tone)，高壓滅菌，待 冷卻至55 60°C時，加入100ml 20%葡萄糖(Dexture)，儲存於4°C。YPDS平板(含kocin 100 μ g/ml為例)900ml水中溶解IOg酵母抽提物，20g蛋白腖(peptone), 182. 2g山梨醇，20g瓊脂，高壓滅菌，待冷卻至55 60°C時，加入IOOml 20%葡萄糖(Dexture)JnAlml 100mg/ml 的 kocin，鋪平板，儲存於 4°C。克隆篩選挑取各高濃度kocin平板上的克隆10個，接種於100ml BMGY培養基 中，30°C振蕩培養16 18小時，當OD600達到2 6之間時，離心收菌，3000g, 8分鐘，棄上 清，用20ml BMGY培養基重新懸浮，繼續培養，並加入100%甲醇0. Iml至終濃度0. 5%，每隔 M小時補加一次，每次0. Iml0在加入甲醇後的48小時、72小時和144小時，分別取樣&ι1， 離心，取上清50 μ 1，與等量的SDS-PAGEh載樣緩衝液混合，100°C煮沸10分鐘，13000rpm， 離心10分鐘，取15μ1，行10% SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色，觀察結果。挑取高表達克隆進 行表型鑑定。用PCV2陽性血清進行Western鑑定，用GM1-ELISA進行LTB部分結構和功能檢 測(見圖幻。最後篩選得到高效分泌表達融合蛋白疫苗的工程菌，命名為pPICBMD0RFLTB/ GS115。實施例四工程菌的發酵對高效分泌表達融合蛋白疫苗的工程菌pPICBMD0RFLTB/GS115的生長表達條件 進行了優化，確定了有利於工程菌生長和表達的培養基、補料培養基、碳源(0.5%甘油)、 培養基和補料培養基的碳氮比、Ρ Κ4 7，較佳的為5. 0)、誘導劑甲醇的最適濃度範圍 (0.5% )等。成功的建立了工程菌PPICBMD0RFLTB/GS115的溶氧反饋高密度發酵工藝，使 疫苗的理論分泌表答水平達到0. 8 1. 3克/升發酵液。實施例五融合蛋白的純化發酵上清中的重組疫苗蛋白在近中性環境中，用30 75%飽和度硫酸銨沉澱；沉 澱的蛋白用10 50mM pH7. 0 9. 0的Tris-HCl充分復溶；然後用金屬鏊合親和層析進行 進一步純化，分離介質一般選用Co2+、ai2+或Gu2+金屬鏊合親和分離介質，可以採用pH梯度 洗脫和咪唑梯度洗脫，一般選擇咪唑梯度洗脫；經過純化的目的蛋白再經過脫鹽柱或透析 處理進行脫鹽並將重組疫苗蛋白的緩衝液換成PBS ；再通過稀釋或濃縮將重組疫苗蛋白調 整到合適濃度後，進行製劑配製，再過濾除菌，最後分裝，或直接儲藏備用，或真空冷凍乾燥 後儲藏備用。具體實施中的純化工藝為發酵上清中的重組疫苗蛋白在近中性環境中，用60% 飽和度硫酸銨沉澱；沉澱的蛋白用20mM pH7. 0 9. 0的Tris-HCl充分復溶；然後用Zn2+金 屬鏊合親和分離介質，採用咪唑梯度洗脫，一般選擇咪唑梯度洗脫；經過純化的目的蛋白再 經過脫鹽柱脫鹽並將重組疫苗蛋白的緩衝液換成PBS ；再通過稀釋或濃縮將重組疫苗蛋白 調整到合適濃度後，進行製劑配製，再過濾除菌，最後分裝，或直接儲藏備用(純化結果見 圖3)。經過該工藝處理後的重組疫苗蛋白，蛋白純度大於95%，終產率在0. 6 0. 9克/ 升發酵液，終產品達到無菌無熱源，而且穩定性良好。後又通過PCV2陽性血清ELISA (檢 測抗原部分)和GM1-ELISA (檢測LTB部分)跟蹤檢測，確定的疫苗凍幹和穩定保護劑，建 立了凍幹工藝。實施例六重組黏膜疫苗免疫對SPF豬的免疫效力研究將8周齡SPF豬隨機分為組，10隻/組，第一組經口、鼻腔分兩等份接種200微 克(lmL，0. 2mg/mL)重組疫苗，第二組經頸部肌肉注射接種200微克(lmL，0. 2mg/mL)重組 疫苗，第3組為對照組，注射ImL PBS溶液。2周後，同等劑量同樣方法加強免疫一次，再過 2周，同等劑量再加強免疫一次。最後一次免疫7天後，採用肌肉注射和皮下注射，每隻豬
10分別用100倍的半數致死劑量的圓環強毒進行攻毒。觀察四肢是否出現症狀，連續觀察14天。將4周齡SPF級Balb/c雌性小鼠隨機分為組，20隻/組，採用鼻飼、口服和肌肉注 射3種不同的黏膜免疫途徑。對於鼻飼和口服免疫，每隻小鼠免疫2微克ΟΟμ L，0. lmg/ mL)重組黏膜疫苗免疫；對於肌肉免疫，每隻小鼠免疫2微克(100μ L，0. 02mg/mL)重組粘 膜疫苗。2周和4周後，同等劑量分別加強免疫一次。每次免疫後，隔14天採用眼睛或者 心臟採血，分離血清。用剪刀剪開鼻腔，用500 μ 1 PBS (含BSA)衝洗鼻腔，收集鼻衝洗 物。剖開胸腔，用眼科鑷子取出肺，用500 μ IPBS (含BSA)衝洗肺部，收集肺衝洗物；將 收集到的鼻衝洗物和肺衝洗物12000rpm離心5min，取上清_70°C保存備用。利用ELISA檢測小鼠血清、鼻衝洗物和肺衝洗物中的抗ORF-LTB IgG和IgA抗 體。用純化的ORF-GST (終濃度1 μ g/mL)，利用原核表達載體pGEX_6P_l表達)包被酶標 板(Nunc,Denmark)；用2. 5% Casein封閉後，加倍比稀釋的血清、鼻衝洗物和肺衝洗物。加 羊抗鼠IgG-HRP (辣根過氧化物每)(sigma) 二抗檢測IgG抗體，加羊抗鼠IgA-HRP (sigma) 二抗檢測IgA抗體。用OPD作為底物顯色。2M H2SO4終止反應，酶標儀490nm判讀。IgG和 IgA終點的判斷採用文獻(0' Dowd et al. 1999)報導的方法進行，即血清中IgG抗體終點 =免疫血清的最大稀釋度> 2(沒有免疫的正常小鼠血清)；鼻或者肺衝洗物中IgG抗體終 點=衝洗物最大稀釋度> 2(沒有免疫的正常小鼠鼻或者肺衝洗物)。保護率=[(攻毒對照組死亡率一疫苗免疫組死亡率)/攻毒對照組死亡率]X i00% ]。實驗結果顯示血清、鼻衝洗物和肺衝洗物中的抗ORF-LTB IgG抗體如圖4A所示。對肌肉免疫和 鼻飼免疫來說，血清和衝洗物中的抗體水平比口服免疫各組都要高。血清、鼻衝洗物和肺衝洗物中的抗ORF-LTB的IgA抗體如圖4B所示。對肌肉免疫 和鼻飼免疫來說，血清和衝洗物中的抗體水平比口服免疫各組都要高。其中鼻飼產生的IgA 抗體最高。採用肌肉注射、鼻飼、口服三種不同的免疫途徑分別免疫豬3次後，用100倍的半 數致死劑量的圓環病毒進行攻毒，保護率如表1所示。肌肉注射免疫效果最好，保護率即可 達到100%;鼻飼免疫保護率可達80%，而口服免疫最高保護率只有70%。對照組用PBS免 疫，攻毒後全部死亡。表1.重組VPl-LTB融合蛋白免疫後對受試動物(豬)的保護效應
權利要求
1.一種用於黏膜免疫的融合蛋白，其中包含圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsidprotein 的亞單位、大腸桿菌不耐熱病毒B亞單位、T細胞抗原表位及純化標籤。
2.權利要求1所述的融合蛋白，其中所述的圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsidprotein 的亞單位的胺基酸序列選自SEQ ID No. 4;其中所述的大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位的氨 基酸序列為SEQ ID No. 6 ；其中所述的T細胞抗原表位的胺基酸序列為SEQ ID No. 8。
3.權利要求1或2所述的融合蛋白，其進一步含有純化標籤和/或接頭肽。
4.如權利要求3所述的融合蛋白，其中所述的純化標籤的胺基酸序列為SEQIDNo. 10 所示的胺基酸序列。
5.如權利要求3所述的融合蛋白，其含有一個圓環病毒PCV2主要膜蛋白 capsidprotein的亞單位、一個T細胞抗原表位、1個大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位和1個 純化標籤，其中純化標籤連接在大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位的C端。
6.如權利要求3所述的融合蛋白，其胺基酸序列 a)如 SEQ ID No. 2 所示；或b)是對SEQ ID No. 2所示的序列插入、缺失或取代一個或幾個胺基酸殘基而得的胺基酸序列。
7.—種核酸分子，其編碼權利要求1-6之任一所述的融合蛋白。
8.權利要求7所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
9.一種載體，其含有權利要求7或8所述的核酸分子。
10.一種宿主細胞，其特徵在於，所述細胞含有權利要求9所述的載體，或者所述細胞 已用權利要求7或8所述的核酸分子轉化或轉染。
11.一種製備權利要求1所述融合蛋白的方法，其包括，用權利要求10的宿主細胞表達 權利要求1-6之任一所述的融合蛋白，並分離所述的融合蛋白。
12.一種用於黏膜免疫的藥物組合物，包括權利要求1-6之任一所述的融合蛋白以及 藥學上可接受的載體。
13.權利要求12所述的藥物組合物，其為注射劑型、噴霧劑型或作為飼料添加劑的劑型。
14.權利要求1-6之任一所述的融合蛋白在製備預防圓環病毒的藥物中的應用。
15.權利要求12所述的藥物組合物在製備預防圓環病毒的藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於涉及一種用於預防豬圓環病毒感染的融合蛋白以及該融合蛋白的製備方法及其應用。具體而言，本發明涉及一種融合蛋白，該融合蛋白包含圓環病毒PCV2主要膜蛋白capsid protein的亞單位、大腸桿菌不耐熱病毒B亞單位、T細胞抗原表位及純化標籤，本發明還涉及該融合蛋白的製備方法和藥學應用。
文檔編號C12N15/62GK102134278SQ201010100219
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月25日 優先權日2010年1月25日
發明者李殿明, 李毅, 田春輝, 蒲勤, 趙明, 顧富香, 齊春梅 申請人:青島寶麥德生物醫藥科技有限公司