一種穀胱甘肽生產菌株及其構建方法

2023-06-18 05:03:11

專利名稱：一種穀胱甘肽生產菌株及其構建方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種穀胱甘肽生產菌株及其構建方法。
背景技術：
穀胱甘肽(GSH)是生物體內一種重要的非蛋白巰基化合物，由於其具有多種重要的 生理功能，不僅在醫學和化妝品等領域有著廣泛的應用，而且也廣泛運用於食品加工的 各個領域，如調味食品、乳製品、口服保健品等[Sies H. (1999) Free Rad Biol Med. 27, 916-921;鄭雲朗(1995)生物學通報30,22-24]。穀胱甘肽的工業生產主要為化學合成法， 酶法和生物發酵等法。化學法存在的旋光性、環境方面的問題。生物法合成GSH主要 有兩種途徑酶轉化法和發酵法。二者的共同特點是首先要有性能良好的微生物，然後 再利用細胞中的高活性酶系在較為溫和的條件下來實現GSH的合成；二者最主要的區 別在於酶法需要提供三種底物胺基酸和ATP，而發酵法只要供給微生物生長代謝所需的 營養物質(碳源、氮源和無機鹽等)即可實現GSH在胞內的積累。酶法有成本高等缺 點，使得發酵法合成依然具備替代其成為主要生產方法[李華鍾,林金萍，李寅等(2000)中 國醫藥工業雜誌31,236-239]。
國外發酵法生產穀胱甘肽的研究開展得比較早，早在七十年代開始就開始對生物法 合成GSH進行了大量研究，發表了大量文章和申請並公布了一系列相關專利[US Patent 6卯2912; US Patent 4598046; US Patent 4582801; JP19890032584; WO2004/003217 Al; EP1539982; US Patent 20050239164]。 一些大公司(如協和發酵)利用酵母發酵生產的 GSH更是早在1985年就取得了中國衛生部的原料藥進口許可文號，基本壟斷了中國市 場。我國對GSH的研究尚處於起步階段，雖然從八十年代末期至今，曾開展過利用釀 酒酵母、大腸桿菌等菌種生產GSH的研究，但由於生產菌株中GSH含量較低，成本過 不了關，故一直未能實現工業化生產。
目前國內外生物法合成GSH研究的菌種的改良主要集中在對釀酒酵母、大腸桿菌 等菌種的改良。改良方法由常規誘變育種方法選育高產菌株發展到利用基因重組技術代 謝育種。由於GSH合成與其兩個合成酶密切相關，因此在育種方面主要集中在利用基 因重組技術使微生物細胞增加相關基因GSH I和GSH II的酶活[KimuraA. (1986) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 33,1-51]。 Nanjo、 Tezuka、 Christine、王紹校和饒志明等人分 別對酵母的分子育種進行了研究，主要思路考將含編碼GSHI和(或)GSH II基因的重組 質粒轉化進入S.cerevisiae或Pichia pastoris從而提高了穀胱甘肽的胞內含量[Nanjo, H.，Yamashita, K"et"al (1986)公開特許公辨61-52299; Tezuka, H.， Otake， Y., Yabushi， et.,al (1987)公開特許公報62-275685; Christine, L., Ulf， S. (1989) Eur. Pat. Appl.EP 300168; 王紹校，(2005).中國學位論文全文資料庫；饒志明，艾麗靜等(2007).應用與環境生物 學報，13: 257-260;饒志明，艾麗靜，沈微等(2007).食品與發酵工業.33: 1-4]。但是 他們報導的工程菌產量與工業化要求相比仍然有所距離。Gushima等人構建了同時帶有 GSH I和GSH II基因的質粒轉化後的大腸桿菌細胞表現出較高的穀胱甘肽生產活性 [Gushima H, Miya T, Mutara K et al. (1983) J Appl Biochem,5: 43-52]。 Perone Gabriel G. 等人通過表達GSH I和GSH II基因和突變相關基因使得酵母菌發酵生產GSH分泌到細 胞外[WO2004/003217Al; EP1539982; US Patent 20050239164];李華鍾等人構建了帶 有GSH I和GSH II基因的質粒轉化後的大腸桿菌細胞，通過發酵處理使得生產GSH分 泌到細胞外，發酵產量高達7g/L[李華鍾，李寅，陳堅等(2001)微生物學報，41: 16-23]。 雖然他們構建的工程菌發酵生產GSH是目前報導最高的產量，但是GSH的發酵生產是 分泌到胞外，GSH在胞外容易被氧化，而且發酵過程還需要添加甲苯、肌醇等化合物， 不利於工業化。因此，如何提高細胞內GSH的量和在發酵時提髙菌的濃度對於GSH工 業化生產來說，仍然十分重要。
生物GSH的合成是與兩個合成酶gshl與gshll含量密切相關，而且它們的基因轉 錄與翻譯是受高度調節的，兩個相關合成酶的比例是協調的。但是， 一般基因工程或代 謝工程手段是加入外源基因或宿主自身基因， 一般改變了原來調控啟動子或仍使用原基 因的啟動子但改變了拷貝數，由於事先未深入研究GSH I與GSH II基因含量的比例關 系而無法有目的地調節細胞內GSHI與GSHII的表達量，其結果並不一定能達到GSHI、 GSHII高效、協調表達的目的[堯輝.魏東芝，周宇荀等(2002).華東理工大學學報， 28: 144-148]。 Wantanabe K等人在構建，到了具有很髙的穀胱甘肽合成能力生產菌， 但他們卻是經過大量研究才發現GSHI和GSH II基因拷貝數在1: 3的重組質粒 PGS501-13的基因工程大腸桿菌具有較高產量[Watanabe K， Yamata Y, MurataK. (1986), Appl Microbiol Biotechnol， 24: 375-378]。因此，通過基因工程或代謝工程手段來育種時， 如何使得構建的工程菌具有GSHI和GSH II基因合適的比例數和相應合適的拷貝數，使 得構建的工程菌能達到GSHI、 GSHII高效、協調表達的目的是非常必要的。
發酵生產GSH —般在發酵過程中添加三種胺基酸前體以提高產量。三種胺基酸前 體之一的半胱氨酸最為重要，它的供應與利用直接影響GSH的產量[CatalinoG.A., Akihisa K., Toru S. et al. (1991) Appl Microbiol Biotechnol.， 6: 538-540; Wen, S., T. Zhang and T. Tan(2004) Enzyme Microb. Technol. 35: 501-507]。半胱氨酸與甘氨酸、穀氨酸相比價格較貴。GSH的生產中增加細胞內的半胱氨酸含量、減少外源半胱氨酸添加量可以 大大降低生產成本。酵母菌擁有各種同化含硫化合物的酶系統，能利用多種含硫化合物 合成各種含硫胺基酸[Beffa，T.， (1989) In Proceeding of the 48th annual congress,Swiss Society of Microbiology，p71]。胱硫醚合酶(cystathione beta synthase, CBS)胱硫和胱硫醚 一Y-裂解酶(cystathione gamma lyase, CSE)是半胱氨酸合成代謝的關鍵酶，它們的活力 或表達量與半胱氨酸合成代謝密切相關[http:〃www. yeastgenome. orggi -bin/searchtextSearch* query=cysteine&type=pathway; Dong-yang Li， Xin-song Ji Zhong-yi Yuan,eta1(2001) Acta Biochimica e't Biophysica Sinica 33 ， 600-606]。增加胱硫醚 合酶和胱硫醚—Y-裂解酶的活力或量，在硫酸鹽含量豐富培養基中培養，可以使酵母菌 細胞內硫元素的同化代謝流流向半胱氨酸的合成，提高胞內半胱氨酸的含量，減少外源 半胱氨酸的供給量，降低GSH的合成生產成本[Bun-Ichiro Ono， Kazuhide Naito， Yoh-Ichi Shirahige et al. (1991) Yeast， 7， 843-848; Bun-Ichiro Ono, Toshiya Hazu, Sayaka Yoshida. etal. (1999) Yeast, 15， 1365-1375; Alexandra Lafaye， Christophe Junot， Yannick Pereira. et al. (2005) J. Biol. Chem.,280, 24723-24730; Jaspreet Kaur and Anand K. Bachhawat (2007)Genetics, 176， 877-890]。

發明內容
發明目的本發明的目的是提供一種高密度、低成本的發酵特點的胞內高產穀胱甘 肽的工程菌株。
本發明的另一目的是提供上述穀胱甘肽生產菌株的構建方法。 .技術方案本發明的穀胱甘肽生產菌株，導入了 GSH相關合成酶y-L-穀氨醯一L-半胱氨酸合成酶基因GSH I與穀胱甘肽合成酶基因GSH II，以及半胱氨酸相關合成酶胱 硫醚合成酶基因CYS3和胱硫醚一，裂解酶CYS4基因。
其中，所述菌株為甲醇利用型酵母，優選Hansenula、 Candida、 Pichia或Torulopsis 種屬的酵母，更優選Pichiapastoris種屬菌株。
其中，所述GSHI、 GSHII基因和CYS3、 CYS4基因源於酵母或人工合成的相關 酶的突變體。
本發明的穀胱甘肽生產菌株的構建方法，包括以下步驟
1、 構建重組半胱氨酸相關合成酶基因CYS3、 CYS4表達載體；
2、 構建重組GSH相關合成酶基因GSHI、 GSHII表達質粒集合；
3、 轉化步驟1得到的表達CYS3、 CYS4基因表達載體PCR產物到宿主菌株中，用 抗性平板篩選得到表達CYS3、 CYS4基因的菌株；4、 將步驟2得到的質粒集合經過限制性內切酶線性化後轉化到步驟3得到的菌株
中；5、 篩選步驟4得到的菌株，得到高產穀胱甘肽的菌株。
其中，步驟1所述的構建重組半胱氨酸相關合成酶基因CYS3、 CYS4表達載體包 括如下步驟
1、 G418抗性基因和宿主菌胱硫醚合酶CBS基因的克隆；
2、 CYS3、 CYS4基因的克隆；
3、 將步驟2得到的基因分別插入甲醇利用型酵母表達質粒中；
4、 將G418抗性基因和上述3帶有啟動子的CYS3、 CYS4基因片段連接並插入到 來源於宿主菌CBS基因序列中。
其中，步驟2所述的構建重組GSH相關合成酶基因GSH I、 GSH II表達質粒集合 包括如下步驟
1、 GSHI和GSHII基因的克隆；
2、 將GSH I和GSH II基因分別插入甲醇利用型酵母表達質粒中；
3、 將步驟2得到的質粒或步驟2GSHI、 GSHII基因PCR產物，採用相同限制性 內切酶或同尾酶，酶切分別得到帶有啟動子的GSHI的基因片段或帶有啟動子的GSHII 的基因片段；
4、 將帶有啟動子的GSHI的基因片段插入到與步驟3相同限制性內切酶酶切的GSH II表達載體之中，或者將帶有啟動子的GSH II的基因片段插入到與步驟3相同限制性 內切酶酶切的GSH I表達載體之中，得到GSH I與GSH II基因數的比例隨機的表達載 體的集合；
5、 以上述表達載體為模板，擴增獲得帶有啟動子的GSHI-GSHII片段；
6、 將GSH I-GSH II片段PCR產物和質粒pA0815去除表達框的PCR產物釆用相 同限制性內切酶或同尾酶酶切後再連接，得到GSH I、 GSH II基因數的比例隨機，且 GSH I-GSH II片段的拷貝數隨機的表達質粒集合。
上述的GSHI與GSHII基因、胱硫醚合酶CYS3和胱硫醚一Y-裂解酶CYS4基因是 分別被裝入表達載體中，而且它們分別都有連接可以在甲醇利用型酵母細胞內發生作用 的啟動子序列之後。啟動子可以是組成型pGAP啟動子，也可以是誘導型AOX啟動子 或其他可以在甲醇利用型酵母細胞內發揮作用的啟動子。
通過本發明的穀胱甘肽生產菌株的構建方法篩選出的穀胱甘肽高產菌株為甲醇利 用型酵母，它的種屬為Pichiapastoris，基因型為GS115 [(cys3、 cys4、 kan1)， his+，aoxl::(gshl、 gsh2)]，菌株保藏號為CCTCC M 207192,日期2007年12月6日；保藏 地點為武漢，中國典型培養物保藏中心。
在不少情況下，外源基因整合的高拷貝數蛋白表達量大於低拷貝或單拷貝的菌株 [Clare JJetal.， 1991) Gene， 105: 205-212]。因此甲醇利用型酵母中外源蛋白表達的優 化，常常包括分離多拷貝的工程菌株，如可以用G418或Zeocin抗性篩選。但本發明卻 不同，本發明是構建得到GSHI、 GSHII基因數的比例可以是隨機，GSHI-GSHII片段 的拷貝數也是隨機的表達質粒集合再來轉化甲醇利用型酵母，對上述的轉化整合的表達 菌株直接用產量為標準來篩選到高產本發明菌株。此菌株基因整合的拷貝數可能為高拷 貝或低拷貝或單拷貝。
在含有較高硫酸銨含量的BMGY培養基中培養工程菌(his-、 cbs::(cys3、 cys4、 kanf))，與對照菌相比表達外源CYS3、 CYS4基因，促進了細胞GSH的合成。在 含有一定量的L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-穀氨酸前體的BMGY培養基中培養工程菌 GS115 [cbs::(cys3、 cys4、 kanr)， his+， aoxl::(gshl、 gsh2)]，細胞在可以利用培養基中 L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-穀氨酸做底物，在，L-穀氨醯一L-半胱氨酸合成酶gshl和 穀胱甘肽合成酶gsh 2催化下，大量合成GSH。通過比對照菌株(沒有轉化表達外源 GSHI、 GSHII基因的甲醇利用型酵母)可以確證外源GSHI、 GSHII基因的表達促進 了細胞內GSH產量的提高
有益效果本發明克服了現有研究生產GSH的方法中，大腸桿菌或釀滴酵母工程 菌內GSH含量高但單位發酵體積中菌體含量低的缺點，利用甲醇利用型酵母具有培養 低成本、生物積累量高，大規模發酵可以得到極高的細胞密度和生物轉化率的特點，運 用在甲醇利用型酵母的細胞內表達來源於釀酒酵母的GSH合成酶的技術路線，通過將 其置於強的組成型啟動子的調控之下，使細胞內能夠產生大量GSH相關合成酶，從而 使細胞內合成大量GSH。本發明同時解決了如何使得構建的工程菌能達到GSHI、 GSH II高效、協調表達問題和達到了表達外源CYS3、 CYS4基因，增加半胱氨酸在細胞體 內合成量的途徑，以降低GSH的合成生產成本的目的。通過篩選我們得到GSHI和GSH II為一定比例的和GSHI-GSHII片段為一定拷貝數的轉化子，與野生型甲醇利用型酵母 相比其細胞的GSH含量也相應提高了 18倍。在搖瓶條件下，該菌的GSH產量達到 0.462g/L，達細胞乾重的3%以上(表2)。


生物材料保藏情況日期2007年12月6日，單位中國典型培養物保藏中心 CCTCC,地址武漢大學，編號M207192。圖l為重組表達pPICGlG2質粒的構建示意圖； 圖2為CYS3、 CYS4基因表達載體的構建示意圖； 圖3為重組菌的GSH生產曲線。
具體實施方式
本發明可以通過下述實施例進一步闡明。實驗材料和方法簡要說明1、 酶以及主要試劑菌株GS115、質粒pGAPZA、 pA0815、 pPIC3.5K， Saccharomyces cerevisiae strain S288c, E. coli toplO來自於本實驗室。所用的酶(內切酶、Taq、 Ex Taq、 Pyrobest以及 T4連接酶等)購自Takara公司。蛋白腖(Tryptone)、酵母抽提物(Yeast Extract)購自Oxoid 公司；HPLC使用試劑購於江蘇漢邦。2、 常規的分子生物學操作酵母和質粒DNA的提取、純化，PCR反應，DNA酶切、連接均參考《分子克隆實 驗指南》、《酵母遺傳學方法實驗指南》以及試劑盒產品說明書。實施例l:重組GSH相關合成酶表達pAOGlG2質粒的構建(示意圖1) 1、釀酒酵母基因組DNA的提取按照《酵母遺傳學方法實驗指南》提取釀酒酵母基因組DNA。接種釀酒酵母S288c 於4ml YPD培養基中(1%酵母膏、2%蛋白腖、2%葡萄糖)，28-30°C 16-18小時。取 培養液離心沉降細胞G000rpm， 10min)，然後以冷的、等體積的無菌蒸餾水洗滌再離 心，將細胞沉澱轉移到1.5ml離心管，在20(HU裂解緩衝液(2% (v/v) TritonX-100， 1% (v/v) SDS， 100mMNaCl， lOmMTris鹼(pH8.0)， lmMEDTA (pH8,0))中重懸 浮，然後加入約300pl酸洗的玻璃珠和20(Hil的1:1苯酚:氯仿混和液，漩渦搖勻l-2min ， 加入200^1的TE緩衝液(10mM Tris鹼(pH8.0)， ImM EDTA (pH8.0))，倒置混合6-10 次。在離心機中以13000rpm的速度離心樣品5min。將上層的水相轉移到乾淨的微量離 心管中，加入l體積(40(^1)氯仿並翻轉混合，13000rpm的速度離心5min。將上層的 水相轉移到新的微量離心管中加lml乙醇，翻轉混勻，13000rpm離心2min，棄上清液， 用lml的70。/。乙醇洗滌沉澱。完全棄去上清液，並將沉澱在室溫下乾燥。沉澱在400nl 含有最後濃度為2pg/ml的核糖核酸酶的TE緩衝液中重懸，37°C 10min後，力B lml乙 醇，翻轉混勻，13000rpm離心2min，棄上清液，用lml的70%乙醇洗滌沉澱。完全棄 去上清液，並將沉澱在室溫下乾燥，然後沉澱在5(HUTE中重懸。2、 GSHI和GSHII基因克隆根據釀酒酵母基因組資料庫中GSH1和GSH2基因(GneBankD90220.1和854108) 設計合成了引物GSHI上遊引物(5'sense primer) pgshl-l GAAGCTCGAGATGGGACTCTTAGCTTT GGGCACGCC、 下遊引物(3'anti-sense primer) gshl國2 TCCTCGGGGCCCAATGGTCACGGCGTCTGGCTACG 。GSH 1I上遊引物pgsh2-1 CCTACTCGAGATGGCACACTATCCACCTTCCAAGG、 下遊引物gsh2-2 GTACATGGGCCCTTAGTAAAGAATAATACTGTCCAAAC。以本實施例l方法提取Saccharomyces cerevisiae strain S288c染色體DNA為模板， 用Pyrobest聚合酶擴增獲得GSH I和GSH II基因。在設計GSHI、GSHII上遊引物和下遊引物分別都引入xho1和apal限制性內切酶。將引物對pgshl-l、 pgshl-2和pgsh2-l、pgsh2-l以提取獲得的釀酒酵母基因組DNA 為摸板擴增獲得的GSH I和GSHII。3、 重組GSH相關合成酶表達pA0GlG2質粒的構建將引物對pgshl-l、 pgshl-2和pgsh2-l、 pgsh2-l擴增獲得的GSH I和GSH II基因 用限制性內切酶xhol和apal酶切並連接到相同的酶處理的質粒pGAPZA上得pGAPGl 和pGAPG2 (示意圖1 )。將pGAPG2用BglII和BamHl酶切回收帶有GSH2基因片段 GAPG2。將pGAPGl用BglII酶切用並鹼性磷酸酶處理最終得到DNA片段GAPG1 。用 T4連接酶連接GAPG1和GAPG2得到質粒pGGlG2 (示意圖1)。根據質粒pGGlG2設計克隆GSH I-GSHII片段引物，在遠離GAP啟動子和AOXITT 的上下遊設計引物，上遊引物 (5'sense primer ) pGG-l : GATCGCGGCCGCGGGGTCTGACGCTCA GTGGAAC,下遊引物(3 'anti-sense primer) pGG-2: AGTGCGGCCGCGATGCGCGGA GTCCGAGAAAATCTG。上下遊引物都引入 Notl酶切位點。以質粒pGGlG2為模板，上述引物對pGG-l、 pGG-2為引物，用Pyrobest聚合酶 擴增獲得片段。根據質粒pA0815設計上下遊引物，上遊引物(5'sense primer) TTGTGCGGCCGCT AATGCGGTAGTTTATCACAG,下遊引物(3'anti-sense primer) TGTCAAGCGGCCGCA GTCGCAATTATGAAAGTAAG。上下遊引物都引入Notl酶切位點。以質粒pA0815為模板，上述引物對為引物，用Ex Taq聚合酶擴增獲得pA0815 (去除表達框)片段。用Notl酶切GSHI-GSHII和pA0815 PCR片段，質粒pA0815 (去除表達框)PCR 片段NotI酶切後再用鹼性磷酸酶處理防止自連接。用T4連接酶連接兩片段，得到一個 表達pAOGlG2質粒的集合(示意圖l)。實施例2: CYS3、 CYS4基因表達載體的構建 1 、宿主菌屍/cWfl/ flWon's GS7"基因組的提取方法同實施例1中釀酒酵母基因組DNA的提取。2、 GWS抗性基因和CBS基因的克隆根據質粒pPIC3.5K設計上下遊引物，上遊引物(5'sense primer) pkan-l TGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGC ，下遊引物(3'anti-sense primer ) pkan-2 GGGGTGTTATGAGCCATATTCAACG。以質粒pPIC3.5K為模板，上述引物對為引物，用Pyrobest聚合酶擴增獲得來源於 大腸桿菌轉座子GWS抗性基因Kan片段。根據GS115菌株基因組CBS基因(GenBankNo.AF367364)設計上下遊引物，上 遊引物(5'senseprimer) pCBS-1 AGAAATACATACTATGTCAGACAACAACC,下遊引 物(3'anti-sense primer) pCBS-2 AGATAGTGTATGCCTAGATGGTACGCAGGC。以GS115菌株基因組為模板，上述引物對為引物，用Pyrobest聚合酶擴增獲得CBS 基因片段。3、 釀酒酵母cys3、 cys4基因的克隆根據釀酒酵母基因組資料庫(www.yeastgenome.org) cys3、 cys4基因信息設計合成 了引物5'sense primer pcys3-l AGACTCGAGATGACTCTACAAGAATCTGATAAATTTGC， 3'sense primer CTTGGGCCCTTAGTTGGTGGCTTGTTTCAAGGCTTG ; 5'sense primer pcys4-l TCACTCGAGATGACTAAATCTGAGCAGCAAGCCG， 3'sense primer pcys4-2 CTTGGGCCCTTATGCTA AGTAGCTC AGTAAATCC ATC 。在設計CYS3和CYS4上遊引物和下遊引物分別都引入xho1和apal限制性內切酶。 將引物對pcys3-l、 pcys3-2和pcys4-l、 pcys4-2為引物，以提取獲得的釀酒酵母 基因組DNA為摸板擴增獲得的CYS3和CYS4。4、 CYS3、 CYS4基因表達載體的構建將擴增獲得的CYS3、CYS4基因用酶xhol和apal限制性內切酶酶切分別連接於相 同酶切的質粒pGAPZA中，得載體pGAPCYS3和pGAPCYS4。在pGAPCYS4的 pGAP上遊設計引物pGAP-l TGCATGAAGATCTTTT TTGTAGAAATG。以pGAP-l與pcys4-2為引物對，以pGAPCYS4為模板PCR得帶 pGAP啟動子的CYS4基因序列。以pGAPCYS3的pGAP上遊較遠處設計引物pGAP-2 CrC4CG7T^4GGG^r77TGGrC4。以pGAP-2與pcys3-2為引物對，以pGAPCYS3為 模板PCR得帶pGAP的CYS3基因序列。再設計CYS4上遊引物pcys4-3 CAAGCCTTGAAACAAGCCACCAACTAATG CATGAAGATCTTTTTTGTAG，其下劃線序列帶pGAP的CYS3基因3'部分序列。根 據以上述pcys4-3與pcys4-2為引物，pGAP的CYS4基因序列為模板擴增獲得帶CYS3 基因3'部分序列的CYS4基因pGAPCYS4-l。再以引物pGAP-2和pcys4-2為引物對， pGAPCYS4-l基因片段和帶pGAP的CYS3基因序列為模板擴增獲得帶pGAP啟動子的 串聯CYS3-CYS4基因序列(圖2)。根據CYS3-CYS4設計CYS4下遊引物pcvs4-4 GCTCTCATCAACCGTGGCTCCCT eATTATGCTAAGTAGCTCAGTAAATCCATC，其劃線序列與GWS抗性基因5'部分序 列同。以引物pGAP-2和pcys4-4為引物對，以CYS3- CYS4基因序列為模板擴增獲得 CYS3- CYS4-2;以GWS抗性基因、0丫33- CYS4-2 PCR產物為模板，以pGAP-2、pkan-2 為引物PCR擴增獲得pGAPCYS3- pGAPCYS4- Kan基因序列(圖2)。根據CBS基因片段，設計兩引物，pCBS-3: TGACCAAAATCCCTTAACGTGAGG AAGAGC TAGAATGGAACCATGAGGATCA， pCBS-4: CGTTGAATATGGCTCATAAC ACCCCGATGAAAGTGCTGTAGTTGTTGTCG。 pCBS-3 、 pCBS-4 5'端都分別帶有 pGAPCYS3 5'部分序列、G47S抗性基因3'端部分片段。以上述的CBS PCR產物為模板，以引物pCBS-l和pCBS-3、 pCBS-2與pCBS-4為 引物對擴增得5'和3'端CBS基因部分片段5'CBS和3'CBS。以5'CBS和pGAPCYS3-pGAPCYS4-Kan片段為模板，以引物pCBS-l和pkan-2為 引物對，PCR擴增得5'CBS-pGAPCYS3-pGAPCYS4-Kan基因序列片段；以3'CBS和 5'CBS-pGAPCYS3-pGAPCYS4-Kan片段為模板，以引物pCBS-l和pCBS-2為引物對， PCR擴增得5'CBS-pGAPCYS3- pGAPCYS4-Kan-3'CBS的CBS基因的整合表達載體 (示意圖2)。實施例3:表達外源胱硫醚合酶和胱硫醚一Y-裂解酶基因重組細胞的構建 1、電轉巴斯德畢赤酵母細胞準備將GS115菌株接種於2mlYPD培養基，30 。C培養12~20小時，以1:100比例接種於100mlYPD培養基中，30°C培養至OD6oo=1.3~1.5, 4°C， 1500g離心10min，沉澱 用預冷的無菌水懸浮洗滌2次，4°C， 1500g離心lOmin，再用預冷的lmol/LD-山梨醇 懸浮洗滌沉澱2次，4 °C， 1500 g離心10 min後，所得GS115重懸於0.3 ml預冷的lmol/L D-山梨醇中，冰上放置待用。2、表達外源胱硫醚合酶和胱硫醚一Y-裂解酶基因重組細胞的構建用PCR產物膠回收試劑盒抽提相當於34個小抽量的上示例4的上述5' CBS-pGAPCYS3-pGAPCYS4-Kan-3' CBS的CBS基因的整合表達載體PCR產物約lOug 以備轉化。每管取感受態GS115 80pl，分別加入5-20嗎DNA(於5-10nlTE中)，小心 混勻，加入電轉化杯(電極間距0.2cm)，冰浴5min後。電轉條件1.5kv， 25uF， 200Q， 5ms。電極化後的細胞加200nl預冷的lmol/LD-山梨醇，混勻後鋪YPD G418平板，30 。C倒置培養3 5天，得到GS"5 (hi" cbs::(cys3、 cys4、 kan"))菌株。實施例4:表達外源的GSHI和GSHII合成酶重組細胞的構建1、 電轉巴斯德畢赤酵母細胞準備將GS/" (his-， cbs::(cys3、 cys4、 kan1))菌株接種於2 ml YPD培養基，30。C培養 12~20小時，其餘同上實施例l。2、 重組表達質粒pA0GlG2電轉巴斯德畢赤酵母細胞用質粒抽提試劑盒抽提相當於3-4個小抽量的P paeon's表達質粒pA0GlG2約 10ug，限制性內切酶SacI酶切線性化後，2倍以上的無水乙醇沉澱，70%乙醇洗滌兩次， 晾乾後以lOplTE緩衝液溶解，以備轉化。每管取感受態GS7" (his'， cbs::(cys3、 cys4、 kan。) 80 |il，分別加入5-20嗎線性化的DNA(於5-10 pl TE中)，小心混勻，加入電轉 化杯，冰浴5min後。電轉條件1.5kv， 25uF， 200Q， 5ms。電極化後的細胞加200 pl 預冷的lmol/LD-山梨醇，混勻後鋪RDB平板，30 。C倒置培養3~5天。實施例5高產菌株的篩選挑選單克隆菌株，接入於3ml含0.05%半胱氨酸、0.05%穀氨酸和0.05%甘氨酸的 BMGY培養基中，30°C、 240r/m48小時，檢測胞內GSH含量。實施例6高效液相色譜測定GSH含量待測樣品的製備取一定量的培養液加入終體積的3.3%的高氯酸，4'C劇烈震蕩5 分鐘，12000g離心20分鐘後上清液過濾，過濾液待上樣。色譜條件色譜柱C18(4.6X250mm),磷酸鹽溶液(取磷酸二氫鉀6.8克，庚烷磺酸鈉2.2克，加水溶解使成 1000ml，用磷酸調節PH值至3.0)-甲醇(97: 3體積比)流速lml/min，檢測波長210nm。 進樣量為5微升，GSH在16分鐘左右出峰。實施例7搖瓶培養重組甲醇酵母挑取篩選的工程菌GS/" (his'， cbs::(cys3、 cys4、 kan》)單克隆於3mlYPD培養 基中，30。C培養20小時後，以1:100比例接種於50mlBMGY培養基中，30°C培養24 小時後，檢測GSH含量，與對照菌相比表達外源CYS3、 CYS4基因促進了細胞GSH的 合成(表l)。表l.野生型與重組菌0811產量的比較*P. pastoris X33GS115 (his隱,cbs::(cys3、 cys4、 kanr))GSH產量18.6mg/L31.2 mg/LGSH含量1.55 mg/gdry cell2.60 mg/g dry cell*:培養基為BMGY挑取篩選的工程菌GS115 [cbs::(cys3、 cys4、 kanr)， his+ , aoxl::(gshl、 gsh2)]單克 隆於3 ml YPD培養基中，30 °C培養20小時後，以1:100比例接種於50 ml BMGY培 養基中，30。C培養24小時後，每天補加0.05%添加半胱氨酸、0.05%穀氨酸0.05%甘氨 酸和1%甘油，再連續培養4天，第72小時後GSH產量達最高，達0.462g/L (見示意 圖3)，達細胞乾重的3.85%，與對照菌P. pastoris X33相比產量提高18倍(表2)。表2.野生型與重組菌GSH產量的比較*P. pastoris X33GS115 (cbs:《cys3、 cys4、 kanr)， his+ , aoxl::(gshl、 gsh2))GSH產量25.4mg/L462.0 mg/LGSH含量2.11 mg/g dry cell38.50 mg/g dry cell*:培養基為BMGY (0.05%半胱氨酸、0.05%穀氨酸0.05%甘氨酸)需要說明的是，本實施例的巴斯德畢赤酵母在發酵時是個高耗氧的過程，在搖瓶發 酵並沒有完全發揮其高生物積累量的優勢(其發酵罐中最高可超過130克幹細胞/升)，在 本實施例中，菌體搖瓶乾重最高達12.0克/升。因此將本發明的方法運用於工業生產中， 工程菌的GSH產量還會大大增加。
權利要求
1、一種穀胱甘肽生產菌株，其特徵在於所述菌株導入了GSH相關合成酶γ-L-穀氨醯-L-半胱氨酸合成酶基因GSH I與穀胱甘肽合成酶基因GSH II，以及半胱氨酸相關合成酶胱硫醚合成酶基因CYS3和胱硫醚-γ-裂解酶CYS4基因。
2、 根據權利要求1所述的穀胱甘肽生產菌株，其特徵在於所述菌株為甲醇利用型 酵母。
3、 根據權利要求2所述的穀胱甘肽生產菌株，其特徵在於所述菌株種屬為Pichia pastoriso
4、 根據權利要求l、 2或3所述的穀胱甘肽生產菌株的構建方法，其特徵在於所述 GSHI、 GSHII基因和CYS3、 CYS4基因源於酵母或人工合成的相關酶的突變體。
5、 權利要求1所述的穀胱甘肽生產菌株的構建方法，其特徵在於包括以下步驟(1) 構建重組半胱氨酸相關合成酶基因CYS3、 CYS4表達載體；(2) 構建重組GSH相關合成酶基因GSHI、 GSHII表達質粒集合；(3) 轉化步驟(1)得到的表達CYS3、 CYS4基因表達載體PCR產物到宿主菌株 中，用抗性平板篩選得到表達CYS3、 CYS4基因的菌株；(4) 將步驟(2)得到的質粒集合經過限制性內切酶線性化後轉化到步驟(3)得 到的菌株中；(5) 篩選步驟(4)得到的菌株，得到高產穀胱甘肽的菌株。
6、 根據權利要求5所述的穀胱甘肽生產菌株的構建方法，其特徵在於步驟(1)所 述的構建重組半胱氨酸相關合成酶基因CYS3、 CYS4表達載體包括如下步驟(1) 抗性基因和宿主菌胱硫醚合酶CBS基因的克隆；(2) CYS3、 CYS4基因的克隆；(3) 將步驟(2)得到的基因分別插入甲醇利用型酵母表達質粒中；(4) 將上述(1)的抗性基因和上述(3)帶有啟動子的CYS3、 CYS4基因片段連 接並插入到來源於宿主菌CBS基因序列中。
7、 根據權利要求5所述的穀胱甘肽生產菌株的構建方法，其特徵在於步驟(2)所 述的構建重組GSH相關合成酶基因GSHI、 GSHII表達質粒集合包括如下步驟(1) GSHI和GSHII基因的克隆；(2) 將GSH I和GSH II基因分別插入甲醇利用型酵母表達質粒中；(3) 將步驟(2)得到的質粒或步驟(2) GSHI、 GSHII基因PCR產物，採用相 同限制性內切酶或同尾酶，酶切分別得到帶有啟動子的GSHI的基因片段或帶有啟動子 的GSHII的基因片段；(4) 將帶有啟動子的GSHI的基因片段插入到與步驟(3)相同限制性內切酶酶切 的GSH II表達載體之中，或者將帶有啟動子的GSH II的基因片段插入到與步驟(3) 相同限制性內切酶酶切的GSH I表達載體之中，得到GSH I與GSH II基因數的比例隨 機的表達載體的集合；(5) 以上述表達載體為模板，擴增獲得帶有啟動子的GSHI-GSHII片段；(6) 將GSH I-GSHII片段PCR產物和帶有甲醇利用型酵母表達質粒pA0815去除 表達框的PCR產物採用相同限制性內切酶或同尾酶酶切後再連接，得到GSH I、 GSH II 基因數的比例隨機，且GSH I-GSH II片段的拷貝數隨機的表達質粒集合。
8、 根據權利要求5、 6或7所述的穀胱甘肽生產菌株的構建方法，其特徵在於構建 的所述菌株為甲醇利用型酵母。
9、 根據權利要求5、 6或7所述的穀胱甘肽生產菌株的構建方法，其特徵在於所述 GSHI、 GSHII基因和CYS3、 CYS4基因源於酵母或人工合成的相關酶的突變體。
10、 根據權利要求6或7所述的穀胱甘肽生產菌株的構建方法，其特徵在於所述的 啟動子為組成型pGAP啟動子或誘導型AOX啟動子。
全文摘要
本發明公開了一種穀胱甘肽生產菌株，導入了GSH相關合成酶γ-L-穀氨醯-L-半胱氨酸合成酶基因GSH I與穀胱甘肽合成酶基因GSH II，以及半胱氨酸相關合成酶胱硫醚合成酶基因CYS3和胱硫醚-γ-裂解酶CYS4基因。本發明的穀胱甘肽生產菌株具有高密度、低成本的優點。
文檔編號C12N1/19GK101220338SQ20071019234
公開日2008年7月16日 申請日期2007年12月24日 優先權日2007年12月24日
發明者蔡宇傑, 許善峰, 金大勇 申請人:南京華錦生物製品有限公司