核酸定量的產品和方法

2023-06-06 16:25:21

專利名稱：核酸定量的產品和方法
技術領域：
本技術部分涉及可用於核酸定量的產品和方法。
背景技術：
核酸測序已經成為現代分子生物學的一種主要分析技術。用於測序的可靠方法的發展推動了對於遺傳信息組織的理解，並使遺傳材料的操作(即基因工程)成為可能。 有多種方法用於核酸分子測序。歷史上，最常用的方法是基於化學(MG測序(Maxam and Gilbert sequencing))或酶(Sanger雙脫氧測序和基於外切核酸酶的測序)反應，所述反應形成特定的截短核酸分子，然後通過電泳技術分離所述截短核酸分子以確定它們的相對長度。近來，已經開發出潛在的高通量技術，包括焦磷酸測序(pyro-sequencing)、納米孔測序(nanopore sequencing)技術、基於雜交的測序技術、和基於非放射性技術在測序結果觀察中的應用。還提出可將掃描隧道顯微術用於直接觀察核酸分子的序列。此外，採用多種核酸檢測技術，包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、基於核酸序列的擴增、鏈置換擴增、Q複製酶擴增和多種雜交技術檢測來自各種來源的不同豐度核酸的存在。一些策略將核酸檢測技術與核酸測序方法相結合。發明概述本發明提供生物樣品中目標核酸含量的定量方法，包括(a)在目標與其對應物雜交的條件下，通過將⑴生物樣品的多種目標核酸(目標)與(ii)已知量的各目標的對應核酸(對應物)接觸來製備混合物，其中各對應物包含(i)與其目標基本相同的核苷酸序列和(ii)區分各對應物與其目標的特徵；(b)壓縮目標在混合物中的動態範圍；(C)測定各目標和/或對應物的含量；以及(d)通過(C)中的含量定量分析各目標的含量。本發明還提供鑑定生物樣品中目標核酸的方法，包括(a)在目標與其對應物雜交的條件下，通過將⑴生物樣品的多種目標核酸(目標)與(ii)已知量的各目標的對應核酸(對應物)接觸來製備混合物，其中各對應物包含(i)與其目標基本相同的核苷酸序列和(ii)區分各對應物與其目標的特徵；(b)壓縮目標在混合物中的動態範圍；以及(C) 鑑定各目標和/或對應物。本發明還提供壓縮生物樣品中目標核酸的動態範圍的方法，包括(a)在目標與其對應物雜交的條件下，通過將⑴生物樣品中的多種目標核酸(目標)與(ii)已知量的各目標的對應物核酸(對應物)來接觸製備混合物，其中各對應物包含(i)與其目標基本相同的核苷酸序列和(ii)區分各對應物與其目標的特徵；(b)將混合物與一組捕獲核酸接觸，其中(i)該組中的各捕獲核酸與一種目標和對應物特異性雜交，(ii)該組中的各捕獲核酸與其特異性雜交的目標和對應物的雜交強度基本相同，且(iii)各捕獲核酸的量低於生物樣品中目標的最高含量；從而目標的動態範圍得到壓縮。上述方法中，在某些實施方式中在步驟(b)之前擴增目標及對應物，或在一些實施方式中在步驟(b)之後擴增目標及對應物。在某些實施方式中，對應物的特徵是，在基本與目標相同的序列中存在單個核苷酸取代。在一些實施方式中，對應物的特徵是，在基本與目標相同的序列上附加一個或多個額外核苷酸。在某些實施方式中，各目標的量與其對應物的量的比例在約1 10到約10 1之間。在一些實施方式中，步驟(b)包括將混合物與一組捕獲劑接觸，其中各捕獲劑特異性地捕獲各目標及其對應物，且各捕獲劑的含量在能夠壓縮混合物中目標的動態範圍的範圍內。在具體的實施方式中，捕獲劑的陣列位於固相載體上。在一些實施方式中，捕獲劑以基本相同的親和力與目標和對應物相互作用。在某些實施方式中，各捕獲劑是包含與目標的核苷酸序列互補的多核苷酸序列的捕獲核酸。在一些實施方式中，目標-捕獲劑的解鏈溫度(Tm)與對應物-捕獲劑的Tm的差異低於或等於1攝氏度。在某些實施方式中，陣列的任何兩種捕獲劑的含量間相差低於或等於50%。在一些實施方式中，隨後確定目標的序列。在某些實施方式中，目標的序列通過單分子測序技術(例如用納米孔裝置分析目標)來確定。在一些實施方式中，對應物在步驟 (b)之後與目標分離。在具體的實施方式中，對應物或目標包含與捕獲劑結合的捕獲部分。所述技術的某些方面在以下附圖、發明詳述和權利要求中作進一步描述。附圖簡要說明

圖1顯示所述技術的非限制性實施方式。向含有目標核酸物質的組合物中加入對應物核酸，其中各對應物物質與特定的目標核酸物質雜交。在該具體實施方式
中，向以1到 100單位的動態範圍存在的目標加入10單位的各對應物。隨後通過將目標-對應物混合物捕獲到含有與目標物質或對應物物質特異性雜交的捕獲寡核苷酸的陣列的地址來壓縮樣品中目標的動態範圍。在該具體實施方式
中，陣列上的各個地址能結合最多10單位的各目標或對應物物質，這一結合減少了樣品中目標核酸的動態範圍。隨後確定各對應物物質的存在和含量，並可確定該實施方式中各目標物質的含量。發明詳述本文方法可用於確定樣品中核酸物質的豐度(如相對豐度)。本文方法還可用於確定樣品中核酸物質(如低拷貝數物質)的核苷酸序列和/或存在、不存在或含量。在某些核酸樣品中，核酸物質可以一定範圍的拷貝數存在，其中可存在最常見的核酸物質和最稀少的核酸物質。換言之，在樣品中，某些核酸物質可大量存在，而一些核酸物質可以較小的量存在，且較稀少的核酸物質的核苷酸序列和含量可利用本文提供的方法確定。本文將樣品中豐富物質和稀少物質的含量的範圍稱為核酸物質含量的「動態範圍」。在某些實施方式中，方法包括針對樣品中各感興趣的目標核酸的不同對應物核酸的應用，並減小樣品中核酸物質的動態範圍。因此，本文的方法具有檢測核酸序列的混合群體(其中一些序列是豐富的)中低豐度、稀少或獨特核酸序列的能力。本文的方法消除或降低了對於重複分析相同核苷酸序
5列的要求(如有時在評估較稀少核酸時的情況)，並因此減少了試劑、時間和其它資源的消 檢測和鑑定核酸的能力對許多領域中的診斷分析有重要作用，這些領域包括但不限於醫學、農業、軍事、以及法醫學應用。本文提供的核酸檢測技術可用作診斷工具、疾病監控工具、以及作為例如確定某些疾病或症狀的易感性的預示工具。在一些實施方式中，可以利用本文的核酸檢測技術檢測多種疾病狀況下病毒或細菌病原體的存在或不存在。在某些實施方式中，還可以利用本文提供的核酸檢測技術檢測與某些癌症類型相關的特定基因的存在、不存在或含量。本文的方法還能用於監控例如食品加工廠或農業環境中土壤、水和作物的細菌汙染。早期檢測能夠從生產線上除去受汙染的食品，或者如果檢測技術足夠靈敏，在農業用的土壤或水中潛在病原體含量還很低的時候就能將其鑑定出，那麼甚至可以避免汙染。類似地，例如，這些同樣的高靈敏度方法可用於軍事或防禦應用(即監控潛在的生物武器)或法醫學應用(即檢測非宿主核酸的存在以鑑定死亡的致病性原因的存在)。目標核酸本文使用的術語「目標核酸」是指待分析、檢測、定量或測序的一種或多種核酸 (也稱為「樣品核酸」)。目標核酸可以包含一個或多個感興趣的區域。本文所用的術語「感興趣的區域」和「感興趣的核苷酸序列」是指本文所述方法所確定(如鑑別、定量、分析)的核酸序列或物質。感興趣的區域的例子包括但不限於突變、單核苷酸多態性、一個或多個毗連核苷酸的取代、一個或多個核苷酸的缺失、一個或多個核苷酸的插入、微衛星、重複核苷酸區域、雜合等位基因、純合等位基因、基因序列或亞序列、非編碼序列或亞序列等。目標核酸可來自任何來源或組合物，如DNA(例如互補DNA(cDNA)、基因組 DNA (gDNA)等)、RNA (例如信使 RNA (mRNA)、短抑制性 RNA (siRNA)、核糖體 RNA (rRNA)、tRNA 等)、和/或DNA或RNA類似物(例如，包含鹼基類似物、糖類似物和/或非天然骨架等)。核酸可以是可用於進行本文所述方法的任何形式(例如線性、環狀、超螺旋、單鏈、雙鏈等)。 在某些實施方式中，核酸可以是，或者可來自，質粒、噬菌體、自主複製序列(ARS)、著絲粒、 人工染色體、染色體或能夠在體外或者在宿主細胞、細胞、細胞的細胞核或細胞質中複製或被複製的其它核酸。在一些實施方式中，目標核酸來自單個染色體(例如核酸樣品可來自二倍體生物樣品的一個染色體)。在需要時，可按本領域已知方法改變目標核酸，使密碼子編碼不同於正常的胺基酸，包括非常規或非天然胺基酸(包括可檢測的標記胺基酸)。目標核酸可包含可按照核酸所需用途選擇的某些元件。目標核酸中可包括或排除任何以下元件。例如，目標核酸可包括一種或多種或所有以下核苷酸元件一個或多個啟動子元件、一個或多個5』非翻譯區(5』 UTR)、一個或多個可插入目標核苷酸序列的區域 (「插入元件」)、一個或多個目標核苷酸序列、一個或多個3』非翻譯區(3』 UTR)和選擇元件。目標核酸可提供有一種或多種此類元件。在一些實施方式中，所提供的目標核酸包含操作性連接的啟動子、5』 UTR、任選的3』 UTR和供目標核苷酸序列插入(即克隆)模板中的插入元件。在某些實施方式中，所提供的目標核酸包含操作性連接的啟動子、插入元件和任選的3』肌1 ，且5』^^/目標核苷酸序列與任選的3』 UTR—起插入。各元件可以適用於目標蛋白生產的任何順序排列，且在一些實施方式中，目標核酸從5』到3』方向包含操作性連接的以下元件(1)啟動子元件、5』 UTR和插入元件；(2)啟動子元件、5』 UTR和目標核苷酸序列；(3)啟動子元件、5』 UTR、插入元件和3』 UTR ；以及(4)啟動子元件、5』 UTR、目標核苷酸序列和3』UTR。本文所用的術語「操作性連接」是指兩個或兩個以上核酸元件(啟動子、 5』 UTR,3' UTR、插入元件等)相互連接而使各元件能發揮所需功能，元件之間的距離不計。 也就是說，相互間操作性或功能性連接的核酸元件可以相互鄰接或者遠離，並發生功能性相互作用。目標核酸內可包括啟動子元件。啟動子通常與RNA聚合酶相互作用，該酶利用預先存在的核酸催化核酸的合成。當模板是DNA模板時，在合成蛋白之前轉錄出RNA分子。某些可用的啟動子來自病毒。某些啟動子具有組織特異性，僅在特定組織內驅動目標序列的表達。本領域技術人員可例如通過檢索一個或多個公共或私有資料庫很容易地獲得這些序列，且可很容易地改變這些序列使其適用於本文所述的目標核酸。相對於目標核酸骨架或目標序列，5』 UTR可包含一種或多種內源性元件並可包括一種或多種外源性元件。5』UTR可來自例如任何合適的生物(如病毒、細菌、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物)的任何合適的核酸，如基因組DNA、質粒DNA、RNA或mRNA，。本領域技術人員可根據所用的轉錄和/或翻譯系統選擇合適的5』 UTR元件。5』 UTR有時可包含一種或多種本領域技術人員已知的以下元件翻譯增強子序列、轉錄起始位點、轉錄因子結合位點、轉錄因子結合位點、翻譯調節位點、翻譯起始位點、翻譯因子結合位點、核糖體結合位點、複製子、增強子元件、內部核糖體進入位點(IREQ和沉默子元件。相對於目標核酸骨架或目標序列，3』 UTR可包含一種或多種內源性元件並可包括一種或多宗外源性元件。3』UTR可來自例如任何合適的生物(如病毒、細菌、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物)的任何合適的核酸，如基因組DNA、質粒DNA、RNA或mRNA。本領域技術人員可根據所用的轉錄和/或翻譯系統選擇合適的3』UTR元件。3』UTR有時可包含一種或多種本領域技術人員已知的以下元件轉錄調節位點、轉錄起始位點、轉錄終止位點、轉錄因子結合位點、翻譯調節位點、翻譯終止位點、翻譯起始位點、翻譯因子結合位點、核糖體結合位點、複製子、增強子元件、沉默子元件和多聚腺苷尾。3』UTR通常包括多聚腺苷尾，有時不包括，且若存在多聚腺苷尾，那麼該尾上可添加或去除一個或多個腺苷部分(例如可添加或減去約5個、約10個、約15個、約20個、約25個、約30個、約35個、約40個、約45 個或約50個腺苷部分)。目標(或樣品)核酸可來自一種或多種來源。包含目標核酸的來源可包含一種或多種目標核酸。本文所述的多種目標核酸是指至少兩種目標核酸，且包括可相同或不同的核酸序列。也就是說，目標核酸可都代表相同的核酸序列，或可代表兩種或兩種以上不同的核酸序列(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、1000 或更多的序列)。例如，樣品可採自生物、礦物或地質地點(例如土壤、巖石、礦藏、角鬥場(combat theater))、法醫學地點(例如罪案現場、走私品或疑似走私品)、或古生物學或考古學地點 (如化石或骨頭)。樣品可以是「生物樣品」，該術語是指獲自活體或曾經為活體的來源，例如動物如人或其它哺乳動物、植物、細菌、真菌、原生生物或病毒的任何材料。生物樣品可採用任何形式，包括但不限於，固體材料如組織、細胞、細胞團塊、細胞提取物、或活檢樣品， 或者生物液體如尿液、血液、唾液、羊水、感染或炎症區域的滲出液、或含有口腔細胞的漱口水、尿液、腦脊液和關節液，以及器官。可首先從樣品來源(如細胞、土壤等)中用本領域已知方法分離出目標核酸。細胞裂解過程和試劑是本領域眾所周知的，且一般可通過化學、物理或電解的裂解方法進行。 例如，化學方法一般採用裂解劑來破壞細胞並從細胞中提取核酸，隨後用離液鹽處理。也可利用物理方法如凍/融後進行研磨、使用細胞壓碎器等。高鹽裂解過程也是常用的。例如，可採用鹼性裂解過程。後者的過程通常包括使用苯酚-氯仿溶液，或可採用替代的包括三種溶液的無苯酚-氯仿過程。在後一種過程中，溶液1可包含15mM Tris, pH 8.0; IOmM EDTA和100ug/ml Rnase A ；溶液2可包含0. 2N NaOH和1 % SDS ；以及溶液3可包含 3M KOAc, pH 5.5。這些過程可參見紐約約翰韋利森公司(John Wiley & Sons, Inc.，New York)的《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology)的 6. 3. 1-6. 3. 6 (1989)，其全文納入本文。樣品還可以在與另一樣品不同的時間點分離得到，其中各樣品來自相同或不同的來源。目標核酸可來自核酸文庫，如cDNA或RNA文庫。目標核酸可以是樣品中核酸純化或分離和/或核酸分子擴增的產物。為本文所述方法提供的目標核酸可包含來自一個樣品或來自兩個或更多個樣品的核酸(例如來自1個或1個以上、2個或2個以上、3個或3個以上、4個或4個以上、5個或5個以上、6個或6個以上、7個或7個以上、8個或8個以上、9個或9個以上、10個或10個以上、11個或11個以上、12個或12個以上、13個或13個以上、 14個或14個以上、15個或15個以上、16個或16個以上、17個或17個以上、18個或18個以上、19個或19個以上、20個或20個以上的樣品)。目標核酸可包含適於本技術的方法使用的任何類型核酸，或基本由其組成。例如， 目標核酸通常採用可與捕獲核酸雜交的形式。本文所用術語「對應物核酸」是指包含的核苷酸序列與目標核酸基本相同，但具有區分對應物與其目標的特徵的核酸。對應物核酸中的核苷酸序列與目標核苷酸序列或其部分相同或基本相同，這使得對應物核酸能與捕獲核酸雜交的親和力和目標核酸與捕獲核酸雜交的親和力基本相同。本文使用的術語「捕獲核酸」是指包含的核苷酸序列與對應物和目標核酸的核苷酸序列互補或基本互補的核酸。在某些實施方式中，捕獲核酸可用來捕獲目標和對應物核酸用於動態範圍壓縮。在一些實施方式中，捕獲核酸可用來分離目標和對應物，用於進一步的測序分析如核苷酸測序或雜交分析。與目標和對應物核酸的核苷酸序列互補或基本互補的捕獲核酸的核苷酸序列可鄰接感興趣的核苷酸序列，或可位於或部分位於感興趣的核苷酸序列內。一些實施方式提供與固相載體上結合的捕獲分子。一些實施方式提供在溶液中使用捕獲核酸(例如，捕獲核酸不與固相載體連接)，有時捕獲核酸可以游離於溶液中，與目標和對應物核酸相互作用，然後與固相載體連接。在某些實施方式中，含核酸樣品可不經處理提供目標核酸用於進行本文所述方法。在一些實施方式中，可在處理含核酸的樣品後提供目標核酸用於進行本文所述方法。 例如，可從樣品中提取、分離、純化和/或擴增目標核酸。本文所用術語「分離」是指將核酸從其原始環境中取出(例如，天然發生的核酸的天然環境或外源表達的核酸的宿主細胞)， 因此核酸從其原始環境「通過人工」而被改變。與來源樣品中的組分含量相比，分離的核酸一般帶有較少的非核酸組分(例如，蛋白質、脂質)。包含分離目標核酸的組合物可以是基本分離的(例如，約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於 99% 不含非核酸組分)。本文所用術語「純化」是指提供的目標核酸與其所衍生自的樣品來源相比包含更少的核酸種類。包含目標核酸的組合物可以是基本純化的(例如，約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%不含其它核酸種類)。本文所用術語「擴增」是指對樣品中的核酸進行處理，線性或指數形式的產生與樣品中核酸的核苷酸序列或其部分序列相同或基本相同的核苷酸序列的核酸擴增子。在某些實施方式中，在提供目標核酸用於本文所述方法之前，還可通過將核酸用於產生核酸片段的方法來處理目標核酸。在一些實施方式中，經過片段化或切割的目標核酸，可具有約5到約10，000個鹼基對、約100到約1，00個鹼基對、約100到約500個鹼基對、或約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、 500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000 或 10000 個鹼基對的標稱平均長度。片段可通過本領域已知的任何合適方法產生，且核酸片段的平均或標稱長度可由普通技術人員通過選擇適當的片段產生過程而加以控制。在某些實施方式中，較短長度的目標核酸可用來分析含有很少序列變化和/或含有較大量的已知核苷酸序列信息的序列。在一些實施方式中，具有較長長度的目標核酸可用來分析含有更多序列變化和/或含有較少量的未知核苷酸序列信息的序列。目標核酸片段可含有重疊的核苷酸序列，這樣的重疊序列可促進構建此前未片段化的目標核酸或其部分的核苷酸序列。例如，一個片段可具有亞序列χ和y，而另一個片段可具有亞序列y和z，其中x、y和ζ是核苷酸序列，其長度可以是5個核苷酸或更長。重疊序列ι可用來促進構建樣品中核酸的χ-y-z核苷酸序列。在某些實施方式中，目標核酸可以是部分片段化的(例如來自未完全或中止的特異性切割反應)或完全片段化的。目標核酸的片段化可以通過本領域普通技術人員已知的各種方法進行，所述方法包括但不限於物理法、化學法和酶法。美國專利申請公開第20050112590號 (2005年5月沈日公開，題為「用於檢測和發現序列變化的基於片段化的方法和系統 (Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery)」，發明人為Van Den Boom等)中描述了這些方法的例子。本領域普通技術人員可選擇某些方法來產生非特異性切割的片段或特異性切割的片段。可產生非特異性切割片段目標核酸的方法的例子包括但不限於將目標核酸和使核酸暴露於剪切力的設備接觸 (例如使核酸通過注射器針頭；使用法式壓制器)；將目標核酸暴露於輻射(例如Y射線、 χ射線、紫外輻射；可以通過輻射強度控制片段的大小)；在水中煮沸核酸(例如產生約500 鹼基對的片段)和將核酸暴露於酸性和鹼性水解過程。可通過使目標核酸與一種或多種特異性切割劑接觸來特異性切割所述核酸。本文所用術語「特異性切割劑」有時是指可在一個或多個特異性位點處切割核酸的化學品或酶。 特異性切割劑通常能根據特定位點的特定核苷酸序列進行特異性切割。特異性酶切割劑的例子包括但不限於內切核酸酶(例如，DNase (例如DNase I、 II) ；RNase (例如 RNase E、F、H、P) ；Cleavase 酶；Taq DNA 聚合酶；E. coli DNA 聚合酶 I 和真核結構特異性內切核酸酶；小鼠FEN-I內切核酸酶；I、II或III型限制性內切核酸酶如 Acc I、Afl III、Alu I、Alw44I、Apa I、Asn I、Ava I、Ava II、BamH I、Ban II、Bcl I、 Bgl I.Bgl II、Bin I、Bsm I、BssH II、BstE II、Cfo I、CIa I、Dde I、Dpn I、Dra I、EcIX I、EcoR I、EcoR I、EcoR II、EcoR V、Hae II、Hae II、Hind II、Hind III、Hpa I、Hpa II、 Kpn I、Ksp I、Mlu I、MIuN I、Msp I、Nci I、Nco I、Nde I、Nde II、Nhe I、Not I、Nru I、 Nsi I、Pst I、Pvu I、Pvu II、Rsa I、Sac I、Sal I、Sau3A I、Sca I、ScrF I、Sfi I、Sma I、Spe I, Sph I, Ssp I,Stu I, Sty I, Swa I、Taq I,Xba I,Xho I。)；糖基化酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶11、嘧啶水合DNA糖基化酶、FaPy-DNA糖基化酶、胸腺嘧啶錯配DNA糖基化酶、次黃嘌呤-DNA糖基化酶、5-羥甲基尿嘧啶DNA糖基化酶(HmUDG)、5_羥甲基胞嘧啶DNA糖基化酶、或1，N6_亞乙烯基-腺嘌呤DNA糖基化酶)；外切核酸酶(例如外切核酸酶III)；核酶和DNA酶。可用化學試劑處理目標核酸，可切割修飾的核酸。在非限制性的例子中，可採用以下試劑處理目標核酸(i)烷基化劑如甲基亞硝基脲，其產生若干烷基化的鹼基，包括可被烷基嘌呤DNA糖基化酶識別並切割的N3-甲基腺嘌呤和N3-甲基鳥嘌呤；(ii)亞硫酸氫鈉，其可造成DNA中的胞嘧啶殘基脫氨形成可被尿嘧啶N-糖基化酶切割的尿嘧啶殘基；以及(iii)將鳥嘌呤轉化成其氧化形式8-羥基鳥嘌呤的化學試劑，8-羥基鳥嘌呤可被甲醯胺基嘧啶DNA N-糖基化酶切割。化學切割方法的例子包括但不限於烷基化(例如硫代磷酸酯修飾核酸的烷基化)；含P3' -N5'-磷醯胺酯核酸的酸不穩定性切割；以及核酸的四氧化鋨與哌啶處理。本文所用的術語「互補切割反應」是指用不同切割試劑或者通過改變相同切割試劑的切割特異性在相同目標核酸上進行的切割反應，從而產生相同目標或參比核酸或蛋白質改變的切割模式。在某些實施方式中，目標核酸可以用一種或多種特異性切割劑(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種特異性切割劑)在一個或多個反應容器中處理(例如目標核酸用各種特異性切割劑在單獨的容器內處理)。在將目標核酸用於本文所述方法之前，目標核酸還可經過修飾核酸中某些核苷酸的處理。可對目標核酸施用根據核酸中核苷酸的甲基化狀態選擇性修飾核酸的方法。本文所用術語「甲基化狀態」是指多核苷酸序列中的特定核苷酸為甲基化或未甲基化。按照反映目標核酸分子的甲基化模式的方式修飾目標核酸分子的方法是本領域已知的，其示例參見美國專利第5，786，146號以及美國專利公開第20030180779和200300擬600號。例如，核酸中未甲基化的胞嘧啶核苷酸可通過亞硫酸氫鹽處理轉化成尿嘧啶，這一處理不改變甲基化的胞嘧啶。可修飾核酸的核苷酸序列的試劑的非限制性例子包括甲基甲烷磺酸、乙基甲烷磺酸、硫酸二乙酯、亞硝基胍(N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍)、亞硝酸、二 O-氯乙基) 硫醚、二(2-氯乙基)甲胺、2-氨基嘌呤、t-溴尿嘧啶、羥胺、亞硫酸氫鈉、胼、甲酸、亞硝酸鈉、5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶。此外，高溫、紫外輻射、χ-射線輻射等條件可誘導核酸分子序列中的變化。目標核酸可以任何可用於進行本文所述的序列分析或製備方法的形式提供，如固體或液體形式。在某些實施方式中，可以可任選地包含一種或多種其它組分，包括但不限於本領域普通技術人員選擇的一種或多種緩衝液或鹽的液體形式提供目標核酸。對應物核酸對應物核酸是樣品群體中各感興趣的目標的代表。也就是說，樣品群體中各感興趣的目標核酸種類都有相應的對應物核酸，該對應物核酸至少部分與其目標基本相同並包含區分對應物與其目標的特徵。如上文就目標核酸而言，對應物核酸可以是任何類型的核酸，可以是天然產生或合成的，可來自任何來源或組合物，可採取任何形式。對應物核酸的存在、不存在或含量可通過檢測一種或多種區分對應物和目標核酸的特徵的存在、不存在或含量來確定。在一些實施方式中，區分對應物及其目標的特徵是相對於目標發生一個或多個核苷酸的取代，這樣的取代可通過例如序列測定方法來檢測。在一些實施方式中，區分對應物及其目標的特徵是相對於目標發生一個或多個核苷酸的添加或缺失。在一些實施方式中，區分對應物及其目標的特徵是互補序列(例如目標核酸或捕獲核酸)中核苷酸的取代、缺失或添加。在一些實施方式中，區分對應物及其目標的特徵是與互補序列相鄰(例如在目標或捕獲核酸中直接相連或由間隔序列隔開)的序列中核苷酸的存在、不存在或取代。在一些實施方式中，對應物核酸還可以包括一種或多種捕獲劑。可用於本文所述方法的捕獲劑的非限制性例子包括但不限於結合對的任何成員，其中結合對中的成員之一與固相相連，而結合對的另一成員與對應物核酸相連。在一些實施方式中，目標核酸可包含捕獲劑，有時對應物核酸包括一個類型的捕獲劑而目標核酸包含另一類型的捕獲劑(例如以便捕獲到不同的固相上)。可使用任何合適的結合對來實現非共價相互作用，包括但不限於抗體/抗原、抗體/抗體、抗體/抗體片段、抗體/抗體受體、抗體/蛋白質A或蛋白質 G、半抗原/抗半抗原、生物素/親和素、生物素/鏈黴親和素、葉酸/葉酸結合蛋白、維生素 812/特性因子、或核酸/互補核酸(如0嫩丄織1嫩)。可以使用任何合適的結合對來實現共價連接，包括但不限於化學反應基團/互補化學反應基團(例如巰基/馬來醯亞胺、巰基/滷化乙醯衍生物、胺/異硫氰酸、胺/琥珀醯亞胺酯、和胺/磺醯滷化物)。將這些結合對連接到試劑上以及實現結合的方法是已知的。本文所用術語「固相載體」或「固相」是指包括固體、半固體、凝膠、薄膜、膜、網、 氈、複合材料、顆粒等本領域技術人員常用來隔離分子的各種材料。該固相可以是無孔的或多孔的。合適的固相包括在固相結合試驗中開發或用作固相的那些材料。參見例如， E. P. Diamandis 和 T. K. Christopoulos 編著的《免疫測定(Immunoassay)))(紐約學術出版社，(Academic Press =New York) 1996)第9章，其通過引用納入本文。合適的固相的例子包括膜過濾器、基於纖維素的紙張、珠粒(包括聚合物的、膠乳的、和順磁的顆粒)、玻璃、矽晶片、微粒、納米顆粒、TentaGel凝膠、AgroGel凝膠、PEGA凝膠、SPOCC凝膠和多孔板。參見例如，Leon 等，Bioorg. Med. Chem. Lett. 8 :2997(1998) ；Kessler 等，Agnew. Chem. Int. Ed. 40 165 (2001) ；Smith 等，J. Comb. Med. 1 326 (1999) ；Orain 等，Tetrahedron Lett. 42 515 (2001) ；Papanikos 等，J. Am. Chem. Soc. 123 :2176 (2001) ；Gottschling 等，Bioorg. And Medicinal Chem. Lett. 11 :2997 (2001)。在一些實施方式中，固相載體可以固相載體的集合的形式提供。固相載體的集合包含兩種或兩種以上不同的固相載體種類。本文所用術語「固相載體種類」是指與一種特定的固相核酸種類或者不同的固相核酸種類的特定組合物相結合的固相載體。在某些實施方式中，固相載體的集合包含2到10，000種固相載體種類、10 到 1，000 種固相載體種類或者約 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、 5000、6000、7000、8000、9000或10000種獨特的固相載體種類。固相載體集合中的固相載體(例如珠粒)可以是均一的(例如均為王氏樹脂珠)或非均一的(例如一些為王氏樹脂珠，一些為磁珠)。例如，對應物核酸可來自核酸文庫，例如cDNA或RNA文庫，或可含有發現於核酸文庫如cDNA或RNA文庫的序列的代表序列。目標核酸可以是樣品中核酸純化或分離和/或核酸分子擴增的產物。為本文所述序列分析方法提供的對應物核酸可包含來自一個樣品或來自兩個或更多樣品的核酸(例如，來自1個或1個以上、2個或2個以上、3個或3個以上、4 個或4個以上、5個或5個以上、6個或6個以上、7個或7個以上、8個或8個以上、9個或9
11個以上、10個或10個以上、11個或11個以上、12個或12個以上、13個或13個以上、14個或14個以上、15個或15個以上、16個或16個以上、17個或17個以上、18個或18個以上、 19個或19個以上、20個或20個以上的樣品)。在一些實施方式中，對應物核酸是合成的。合成的對應物核酸可通過本領域已知的任何方法製備，這些方法生成的核酸可用於本文所述實施方式。例如，對應物核酸可按固相亞磷醯胺三酯法，如Needham-VanDevanter等所述用自動合成儀化學合成(Nucleic Acids Res. 12 :6159-6168,1984)，該方法首先由 Beaucage 禾口 Caruthers 在 Tetrahedron Letts. 22 :1859-1862(1981)中描述。例如，如 Pearson 和 Reanier 在 J. Chrom. 255 137-149(1983)中所述，寡核苷酸的純化可通過天然丙烯醯胺凝膠電泳或通過陰離子交換高效液相色譜(HPLC)實現。對應物核酸，不論是天然產生的或是合成的，可利用任何本領域已知的任何合適方法來定量，例如在合成和純化之後、在PCR擴增之後、或在本文所述方法的任何步驟中。 例如，將DNA溶液在^Onm和^Onm波長下的吸光強度測定作為DNA純度的一種度量。DNA 吸收260和^Onm的紫外(UV)光，而芳族蛋白質吸收^Onm的UV光；純DNA樣品的沈0々80 吸光比值為1.8並相對不含蛋白質汙染。被蛋白質汙染的DNA製品的沈0/觀0比值將會低於1.8。本領域已知定量PCR(Q-PCR)方法用來測定樣品中特定DNA序列的含量。同樣， 可通過限制性酶切、使產物在瓊脂糖凝膠中電泳、用溴乙啶或不同染料染色並將DNA的強度和已知濃度的DNA標記物相比較來定量DNA。核酸也可通過利用二苯胺(DPA)指示劑在 600nm進行比色檢測，並利用已知核酸濃度的標準曲線進行定量。合成的對應物核酸可根據目標種類的核酸序列來設計。對應物核酸的部分或全部，不論是天然產生或合成的，可與其代表的目標核酸基本相同。在一些實施方式中，對應物核酸的部分或全部，不論是天然產生或合成的，可含有與捕獲核酸基本互補的區域。本文所述涉及序列的「基本相同」是指相互例如對應物核酸和目標核酸之間享有一定量的序列相同性的核苷酸序列。包括對應物、目標和捕獲核苷酸序列之間具有55%或更高的、56或更高的、57%或更高的、58%或更高的、59%或更高的、60%或更高的、61%或更高的、62% 或更高的、63%或更高的、64%或更高的、65%或更高的、66%或更高的、67%或更高的、 68%或更高的、69%或更高的、70%或更高的、71%或更高的、72%或更高的、73%或更高的、74%或更高的、75%或更高的、76%或更高的、77%或更高的、78%或更高的、79%或更高的、80%或更高的、81%或更高的、82%或更高的、83%或更高的、84%或更高的、85%或更高的、86%或更高的、87%或更高的、88%或更高的、89%或更高的、90%或更高的、91% 或更高的、92%或更高的、93%或更高的、94%或更高的、95%或更高的、96%或更高的、 97%或更高的、98%或更高的、或者99%或更高的相同性。確定兩個核苷酸序列之間是否基本相同的一種測試是測定共享的相同核苷酸序列的百分比。本文所述涉及序列的「基本互補」是指能夠相互雜交的核苷酸序列。可改變雜交條件的嚴謹性以容許不同量的序列錯配。包括對應物、目標和捕獲核苷酸序列的區域之間具有55%或更高的、56或更高的、57%或更高的、58%或更高的、59%或更高的、60%或更高的、61%或更高的、62%或更高的、63%或更高的、64%或更高的、65%或更高的、66%或更高的、67%或更高的、68%或更高的、69%或更高的、70%或更高的、71%或更高的、72% 或更高的、73%或更高的、74%或更高的、75%或更高的、76%或更高的、77%或更高的、78%或更高的、79%或更高的、80%或更高的、81%或更高的、82%或更高的、83%或更高的、84%或更高的、85%或更高的、86%或更高的、87%或更高的、88%或更高的、89%或更高的、90%或更高的、91%或更高的、92%或更高的、93%或更高的、94%或更高的、95%或更高的、96%或更高的、97%或更高的、98%或更高的、或者99%或更高的互補性。序列相同性的計算可如下進行。為最優比較目的進行序列比對(例如，為最優比對，可在第一和第二核酸序列的一個或兩個中引入缺口，且為比較目的可不考慮非同源序列)。用於比較目的的參比序列中比對的長度有時是參比序列長度的30%或更長、40%或更長、50%或更長、常為60%或更長、更常為70%或更長、80%或更長、90%或更長、或者 100%。隨後分別在兩個序列之間比較相應位置的核苷酸。當第一序列中的某個位置被與第二序列中相應位置上相同的核苷酸殘基佔據時，則認為這個位置上的核苷酸相同。兩個序列間的相同性百分數是序列間共享的相同位置數量的函數，並考慮到為兩個序列的最優比對而引入的缺口數量和各缺口的長度。可採用數學算法在兩個序列間進行序列比較並確定相同性百分數。可採用已納入ALIGN程序版)的Meyers和Miller的算法(CABI0S 4 :11-17(1989)),利用PAM120權重殘基表，缺口長度罰分為12，缺口罰分為4，來確定兩個核苷酸序列之間的百分比相同性。可採用GCG軟體包(可從網址URL gcg.com上獲得)內的GAP程序，利用NWSgapdna. CMP矩陣和缺口權重40、50、60、70或80以及長度權重1、2、3、 4、5或6，來確定兩個核苷酸序列之間的相同性百分數。常用的一組參數是Blossum 62計分矩陣，其中缺口開放罰分為12、缺口延伸罰分為4、框架移動缺口罰分為5。確定兩個核酸是否基本相同的另一種方式是評估在嚴謹條件下與一種核酸同源的多核苷酸是否能與另一種核酸雜交。嚴謹條件下的雜交也可以用來確定兩個核酸是否彼此基本相同。本文所用術語「嚴謹條件」是指雜交和洗滌的條件。嚴謹條件是本領域技術人員已知的，可參見紐約約翰韋利森公司(John Wiley & Sons，N. Y.)的《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology)中 6. 3. 1-6. 3. 6 部分(1989)。該文獻中所述的水性和非水性方法均可採用。嚴謹雜交條件的一個例子是約45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然後在50°C下用0.2X SSC、0. 1% SDS洗滌一次或多次。嚴謹雜交條件的另一個例子是約45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然後在55°C 下用0. 2X SSC、0. 1% SDS洗滌一次或多次。嚴謹雜交條件的又一個例子是約45°C下在 6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然後在60°C下用0. 2X SSC、0. 1% SDS洗滌一次或多次。嚴謹雜交條件有時是約45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然後在65°C下用0. 2X SSC、0. SDS洗滌一次或多次。通常，嚴謹條件是在65°C下用0.5M磷酸鈉、7% SDS處理，然後在65°C下用0.2X SSC、1 % SDS洗滌一次或多次。嚴謹雜交溫度也可通過添加某些有機溶劑(例如甲醯胺)來改變(即降低)。有機溶劑如甲醯胺降低雙鏈多核苷酸的熱穩定性，使得雜交可在較低的溫度下進行而仍能保持嚴謹條件並延長可能不耐熱的核酸的使用壽命。在一些實施方式中，對應物核酸還可被修飾或製備成衍生物、由核苷酸類似物製得的RNA或DNA的變體和類似物、單鏈(正義或反義)和雙鏈多核苷酸。應理解，術語「核酸」並非表示或暗示特定長度的多核苷酸鏈，因此也包括核苷酸、多核苷酸、和寡核苷酸。對應物核酸可以包含適於在本技術的方法中使用的任何類型的核酸，如可與目標核酸或捕獲核酸雜交的對應物核酸，或基本由其組成。
在一些實施方式中，對應物核酸可包括可檢測標記。在一些實施方式中，目標核酸可包括可檢測標記，且有時目標核酸包括一種可檢測標記而對應物核酸包括顯著不同的可檢測標記。在需要時，可利用本領域技術人員已知的任何方法修飾核酸以包括可檢測標記。 可將標記作為合成的部分加入，或在將對應物用於本文所述的任何方法之前加入。標記的加入可在液相或者固相中進行。在一些實施方式中，可檢測標記可用於檢測目標。在一些實施方式中，可檢測標記可用於結合或未結合核酸(例如雜交或未雜交的對應物)的定量。 在一些實施方式中，可用一個以上的可檢測標記來標記對應物或目標。採用一個以上可檢測標記(例如不同種類的標記)可促進檢測和定量分析已結合的或溶液中的目標和對應物核酸。本領域技術人員可適當選擇並利用適用於檢測系統中的相互作用或者生物活性的任何可檢測標記。可檢測標記的例子有螢光標記如螢光素、羅丹明及其它(例如，Anantha 等，Biochemistry (1998) 37 :2709 2714 ；和 Qu 和 Chaires，Methods Enzymo 1. (2000)321 353369)；放射性同位素(例如，125I、131I、35S、31P、32P、33P、14C、3H、7Be、28Mg、57Co、 65Zn,67Cu,68Ge,82Sr,83Rb,95Tc,96TcU03PdU09Cd ^P 127Xe)；光散射標記(例如，美國專利號6，214，560以及加州吉尼康科學公司(Genicon Sciences Corporation)的市售產品)；化學發光標記和酶底物(例如二氧雜環丁烷和吖啶酯)；酶或蛋白質標記(例如，綠色螢光蛋白(GFP)或其顏色變體、螢光素酶、過氧化物酶)；其它生色標記或染料(例如菁) 和其它輔因子或生物分子如地高辛、鏈黴親和素、生物素等。在將對應物核酸用於本文所述方法之前，對應物核酸還可進行對核酸中某些核苷酸修飾的過程。在某些實施方式中，可將根據核酸中核苷酸的甲基化狀態選擇性修飾核酸的方法施用於對應物核酸。在此參考圖1對本發明的方法進行概述，並將在下文中進行更詳細的描述。如圖1 步驟1所示，對應物核酸(也稱為對應物)與含有感興趣的目標核酸(也稱為目標)的核酸樣品接觸。如圖1步驟2所示，對應物與樣品的組合物與捕獲核酸接觸。捕獲核酸可如圖1步驟2所示結合於固相載體上，或也可懸浮在溶液中。使對應物和目標與捕獲核酸相互作用，隨後進行分析，可例如如圖1步驟3所示確定各目標的含量。任選地，目標還可通過測序或雜交研究進一步分析。對應物和目標(樣品)可採用本領域已知的任何合適方法進行接觸。例如，對於小的樣品組，本領域技術人員可使用單道或多道移液器人工混合目標和對應物。對於較大的樣品組或利用DNA晶片或陣列的高通量應用，本文所述方法與高通量DNA分析中常用的機械化裝置兼容。用於高通量分析並且和本文所述實施方式兼容的自動化或者機械化裝置的一個非限制性例子是稱為Oasis LM(美國加利福尼亞州薩尼維爾的泰利卡姆國際公司 (Telechem International, Inc. Sunnyvale California 94089))的裝置。該計算機驅動的生物工作站可設置有最多達4個具有進行1、8、96、384或1536個樣品移液能力的獨立移液器頭。通常向系統中引入已知的或者預定量的對應物核酸以進行本文所述的方法。如圖 1所示，在一些實施方式中，加入反應中的各對應物的單位(例如，含量(例如，重量/重量、 重量/體積、克)；濃度)可保持為常數。反應中各對應物的單位數可保持為常數以使得能確定感興趣的目標的相對豐度，還能壓縮樣品中核酸物質的動態範圍(以下進一步討論)。 在一些實施方式中，可改變(即反應中各目標的單位數不保持為常數)加入的各對應物的量。本領域技術人員可通過使用不同量的對應物核酸進行分析來獲得補充信息。為圖1的說明目的加入的對應物的量為每個目標10單位。圖1所示的例子有3個具有感興趣區域的核酸種類，目標A、B、和C。為了說明的目的，所述3種目標的豐度範圍在約1單位到約 100單位之間。在實踐中，樣品可包含更多感興趣的核酸，且其豐度也可顯著變化。樣品中目標的豐度範圍可在約1單位到約10單位之間、約1單位到約50單位之間、約1單位到約 100單位之間、約1單位到約500單位之間、約1單位到約1，000單位之間、約1單位到約 5，000單位之間、約1單位到約10，000單位之間、約1單位到約50，000單位之間、約1單位到約100，000單位之間、約1單位到約500，000單位之間、約1單位到約1，000，000單位之間。本文所用的涉及目標的單位是指一種功能性標識，並可由本領域技術人員設定為任何實際的物理量。單位可以標識為序列的1個拷貝，或序列的10個拷貝。例如，單位可定義為含有低到ι毫微微克(fg)的核酸或者多達1毫克(mg)的核酸，或任何兩者之間的量。 更具體地，單位可以包含約Ifg、約2fg、約5fg、約IOfg、約IOOfg、約500fg、約1納克(ng)、 約 2ng、約 5ng、約 10ng、約 lOOng、約 500ng、約 1 微克(μ g)、約 2 μ g、約 5 μ g、約 10μ g、約 100μ g、約500 μ g或約1毫克等。在核酸種類間單位的類型可保持一致，或各核酸種類可具有各自的單位類型。圖1的表中還顯示了加入各反應中的目標和對應物的比例以及核酸的總單位數的非限制性例子。例如，圖1中表格所示的目標單位與對應物單位的比例在10 1到1 10 之間。在某些實施方式中，可使用約1 10到約10 1之間的任何便利的目標與對應物比例。也就是說，進行本文所述方法所採用的目標與對應物的比例可以是約1 10、約1 9、 約 1 8、約 1 7、約 1 6、約 1 5、約 1 4、約 1 3、約 1 2、約 1 1、約 2 9、 約 2 7、約 2 5、約 2 3、約 2 1、約 3 10、約 3 8、約 3 7、約 3 5、約 3 4、 約 3 2、約 3 1、約 4 9、約 4 7、約 4 5、約 4 3、約 4 1、約 5 9、約 5 8、 約 5 7、約 5 6、約 5 4、約 5 3、約 5 2、約 5 1、約 6 7、約 6 5、約 6 1、約
7 10、約 7 9、約 7 8、約 7 6、約 7 5、約 7 4、約 7 3、約 7 2、約 7 1、約
8 9、約 8 7、約 8 5、約 8 3、約 8 1、約 9 10、約 9 8、約 9 7、約 9 5、約
9 4、約9 2、約9 1、約10 9、約10 7、約10 3、和約10 1。超出上述範圍的目標與對應物的比例也可證明可用於定量分析目標種類的相對豐度或壓縮混合群體中極為稀少或極為豐富的核酸的動態範圍。如上所述，並如圖1所示，在一些實施方式中，可添加相同量的各對應物種類。在一些實施方式中，可確定目標種類的含量(例如大致含量)，並可加入與目標含量相應量的對應物。也就是說，如圖1所示，可在步驟1加入針對計算所得(或大致確定)的目標的量所調整的量的對應物，且對應物種類的量各不相同。在一些實施方式中，各捕獲核酸的量低於生物樣品中目標的最高含量。在一些實施方式中，目標可在與對應物接觸前通過例如PCR擴增。在一些實施方式中，目標和對應物可在相互接觸之後擴增。在一些實施方式中，目標和對應物可在動態範圍壓縮後擴增。也就是說，目標和對應物可在目標和對應物與捕獲核酸，例如以能夠實現動態範圍壓縮的量存在於陣列上的捕獲核酸接觸後擴增。動態範圍壓縮從樣品來源分離得到的混合核酸樣品中，某些核酸種類可大量存在，一些核酸種類可以較小的量存在，較稀少的核酸種類的核苷酸序列及其存在可能難以確定。本文將樣品中豐富的種類和稀少的種類的含量的範圍稱為核酸物質含量的「動態範圍」。本文所稱的動態範圍壓縮是指降低具有最高豐度的核酸種類的拷貝數。在某些實施方式中，最高豐度核酸種類的拷貝數的降低比照具有較低或者最低豐度的核酸種類的拷貝數進行，而一些實施方式中，則保持是群體中各感興趣的核酸種類的代表性樣品。換言之，後一類實施方式中的動態範圍壓縮降低了一些實施方式中高豐度核酸種類與低豐度核酸種類之間的比例 (高豐度低豐度)。在某些實施方式中，最高數量的種類與最低數量的種類之間的比例在動態範圍壓縮後保持不變，但各種類的相對含量降低。通常選擇條件以保持各感興趣的核酸種類的至少一個拷貝。在某些實施方式中，動態範圍壓縮還可用於降低中等豐度核酸種類相對於低豐度序列的比例。動態範圍壓縮的行為通常導致用於後續分析的樣品中的總核酸減少。利用動態範圍壓縮的方法能夠減少核酸分析和測序相關的時間和成本，因為分配用於曾是大量表示的核酸種類的分析和測序的資源較少。使用本文所述實施方式實現的壓縮量可根據手頭的應用來調整。在一些實施方式中，在對核酸群體的了解有一定程度的確定性時，把所有序列壓縮到最稀少序列的水平左右可實現快速序列分析，減少或者無需重複分析。在一些核酸群體未知的實施方式中，可將最高豐度核酸種類的比例降低至較低水平，任選地可確定樣品中是否存在一些目標核酸 (例如法醫學應用)。因此，可將動態範圍壓縮的程度調整至本領域技術人員可要求的任何範圍，以實現優化時間和試劑成本之間的平衡並滿足任務的需要。在一些實施方式中，動態範圍壓縮的程度可用動態範圍比例的降低倍數來表示。 動態範圍比例(RJ可用⑴最高豐度序列的拷貝數(H)，除以(ii)組合物中較低、或最低拷貝數核酸的拷貝數(L)計算得到Rdr = H/L.動態範圍壓縮程度可通過使比例Rd,乘以約1χ10_9到0. 999之間的乘數來表達。因此，本領域技術人員可捕獲幾乎所有(例如數值高達約0. 999)或顯著更少(例如數值為約 IxlO-6)的特定目標/對應物混合物。乘數的例子包括但不限於，乘數為約1χ10_7、約1χ10_6、 約 5xl(T5、約 lxl(T5、約 5xl(T4、約 lxl(T4、約 5xl(T3、約 lxl(T3、約 5xl(T2'、約 lxl(T2、約 5x10— 和約IxKT1。在一些實施方式中，上述壓縮因子不等於歸一化，因為並非各獨立目標都相對於特定種類進行壓縮。在某些實施方式中，當所有種類都相對於單一種類壓縮時，壓縮可相當於歸一化。在一些實施方式中，動態範圍的壓縮可利用連接在固相上的捕獲核酸實現，所述捕獲核酸包括但不限於核酸陣列或DNA晶片。在一些實施方式中，核酸動態範圍的壓縮可在溶液中進行。例如，當如圖1步驟1所示的目標-對應物混合物與如圖1步驟2所示的捕獲核苷酸或核酸接觸時，發生動態範圍的壓縮。捕獲核酸可與固相載體相互作用。在一些實施方式中，捕獲核酸可與固相載體以可逆方式相互作用，從而能夠(例如在捕獲後)分離目標和對應物用於另外的分析。在一些實施方式中，捕獲核酸以有限的含量存在，例如在溶液中或者與陣列結合。 在一些實施方式中，捕獲核酸以飽和含量存在，例如在溶液中或者與陣列結合時。在通過陣列實現動態範圍壓縮的實施方式中，捕獲可位於陣列上含有與目標種類和對應物種類特異性雜交的捕獲寡核苷酸種類的特定地址。捕獲核酸可以相對於目標核酸和對應物核酸的飽和量、或不飽和量存在(例如在溶液中或者在固相上)。在某些實施方式中，飽和度可以用比例(Rs)表示，其中捕獲核酸單位的量(Cap)除以目標核酸單位和對應物核酸單位的量(T+Cpt)Rs = Cap/T+Cpt。在一些實施方式中，當Rs大於1、通常當Rs大於10時，對應物核酸處於飽和。因此，在一些實施方式中，Rs可以在1.001到約10之間(例如，部分飽和條件；RS為約2、3、 4、5、6、7、8或9)，還可以在約10到約1,000,000之間(例如Rs為約100、200、300、400、 500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、50000、 100000,500000)。在一些實施方式中，當Rs小於1、通常當Rs等於或小於0. 1時，對應物核酸為不飽和。因此，在一些實施方式中，Rs可以在0.999到10_6之間(例如，Rs為約0.1、 0. 05,0. 001、5xl0-4、lxl0-4、5xl0-5、IxlO-5和5xl(T6)。捕獲劑的飽和量有時包括能夠捕獲 75%或更多、76%或更多、77%或更多、78%或更多、79%或更多、80%或更多、81%或更多、 82%或更多、83%或更多、84%或更多、85%或更多、86%或更多、87%或更多、88%或更多、 89%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、 96 %或更多、97 %或更多、98 %或更多、或者99 %或更多可被捕獲的目標和/或對應物的捕獲劑的量。在一些實施方式中，不飽和量的捕獲劑可結合在陣列上。捕獲劑的不飽和量通常產生動態範圍的壓縮，因為捕獲劑僅捕獲了部分目標或複合物。動態範圍壓縮通常取決於捕獲核酸的有效量。本文所用術語「有效量」是指目標和對應物核酸接觸到的捕獲核酸的有效量。捕獲核酸的有效量通常低於目標核酸種類及其對應物種類的總量，其中目標核酸種類是指樣品中最高豐度的種類。捕獲核酸的有效量可根據目標和對應物核酸在雜交條件下接觸捕獲核酸的時間量來調整。例如，在一些實施方式中，當雜交時間較長(例如M到48小時)時，捕獲核酸的有效量可大約是陣列上特定地址處核酸的總量。例如，在一些實施方式中，當雜交時間較短(例如1分鐘)時，捕獲核酸的有效量可低於陣列上特定地址處核酸的總量。因此，當捕獲核酸以飽和或不飽和量存在時，
可通過選擇時間量和條件壓縮動態範圍，在所選的條件下捕獲核酸與目標和對應物核酸雜 、-父。因此，可以控制雜交時間範圍以優化動態範圍壓縮。在一些實施方式中，有時當捕獲核酸處於飽和時，可以使用較短的雜交時間(例如，約0. 5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、 50、60分鐘)。在一些實施方式中，有時當飽和核酸處於不飽和時，可進行較長時間的雜交 (例如，約 1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 小時或更長)。當進行雜交的種類濃度高且不造成限速瓶頸時，雜交可以基本線性的速度進行。隨時間推移，隨著雜交夥伴中的其一或兩者的濃度降至閾值水平以下，雜交速度下降並接近開/關平衡反應。利用雜交速度，可調節雜交時間的長度來選擇性地消除高豐度種類，可容易地通過時程來優化雜交時間。捕獲核酸被用來與目標和對應物二者相互作用，並且在一些實施方式中，與捕獲核酸雜交的對應物和目標種類的序列是相同的。採用相同序列造成與捕獲寡核苷酸的基本相等的相互作用親和力。本文所用的術語「基本相等的親和力」涉及不同核苷酸種類與共同的捕獲核酸的結合，是指各目標和對應物與捕獲核酸以基本相同的頻率相互作用的結合反應和條件。在圖1步驟2所示的具體實施方式
中，陣列上的各地址能結合最多10單位的各目標或對應物種類，這一結合減小了樣品中目標核酸的動態範圍。隨後，確定各對應物種類的存在及其含量，並可確定各目標種類的含量。根據相互雜交的捕獲和目標核苷酸序列間的相同性百分數(％相同性)，可通過例如雜交條件優化捕獲寡核苷酸與特定目標種類的特異性雜交。如本文所述，相同性百分數(％ )是兩種或兩種以上核苷酸序列在最優比對和比較時相同鹼基數量的一種度量。已描述確定序列相同性的方法。由捕獲和目標核酸之間充分的百分數(％ )序列相同性引起的序列的特異性雜交有時包括序列相同性為55%或更高、56%或更高、57%或更高、58%或更高、59%或更高、60%或更高、61%或更高、62%或更高、63%或更高、64%或更高、65%或更高、66%或更高、67%或更高、68%或更高、69%或更高、70%或更高、71%或更高、72%或更高、73%或更高、74%或更高、75%或更高、76%或更高、77%或更高、78%或更高、79%或更高、80%或更高、81%或更高、82%或更高、83%或更高、84%或更高、85%或更高、86%或更高、87%或更高、88%或更高、89%或更高、90%或更高、91%或更高、92%或更高、93%或更高、94%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、或者99%或更高的核苷酸序列，只要組合中的各捕獲核酸能以基本相同的強度、親和力或雜交效率與其特異性雜交的目標和對應物進行雜交。雜交強度取決於可供雜交的序列和進行雜交的條件。最優雜交條件可取決於感興趣的核酸的長度和序列，並可容易地選擇(例如本文所述的某些雜交條件)。在一些實施方式中，動態範圍壓縮可至少部分或者完全在溶液中進行。在一些實施方式中，目標和對應物核酸接觸後，可將連接結合夥伴的有限有效量的捕獲核酸加入到混合物中。雜交後，與目標和對應物核酸雜交的捕獲核酸可與固相接觸，該固相與結合夥伴的其它成員連接。在一些實施方式中，目標核酸包括感興趣的區域(如上所討論)。在一些實施方式中，與目標核酸雜交的捕獲核酸的核苷酸序列可鄰接感興趣區域的末端，在某些實施方式中，可包含感興趣的區域或其部分。本文所用術語「鄰接」是指兩個序列末端之間的距離為 0個核苷酸。本文所用術語「鄰接」和「基本鄰接」是指兩個序列的末端之間的距離是1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10 個核苷酸。在一些實施方式中，捕獲核酸與目標-對應物混合物相互作用後，可用除去未雜交核酸的試劑處理核酸。在某些實施方式中，利用外切核酸酶，該酶可消化未與捕獲核酸雜交的核酸分子。在某些實施方式中，若複合物未被捕獲(例如通過與固相陣列的直接相互作用)，那麼可通過固相捕獲劑分離目標-捕獲或對應物-捕獲核酸複合物。雜交條件包括但不限於目標-捕獲複合物和對應物-捕獲複合物的解鏈溫度 (Tm)，是優化動態範圍壓縮的考慮因素。此外，具有區分密切相關種類能力的捕獲劑設計通過控制雜交條件和溫度，賦予本領域技術人員以具有重要意義的能力和機動性來進行動態範圍壓縮、序列捕獲、鑑定和分析。在一些實施方式中，目標-捕獲劑的Tm與對應物-捕獲劑的Tm的差異低於或等於1攝氏度。可用來區分目標和對應物種類的目標-捕獲劑與對應物-捕獲劑複合物之間的解鏈溫度差異有時包括相差1攝氏度或更低、0. 9攝氏度或更低、 0. 8攝氏度或更低、0. 7攝氏度或更低、0. 6攝氏度或更低、0. 5攝氏度或更低、0. 4攝氏度或更低、0.3攝氏度或更低、0.2攝氏度或更低、或0. 1攝氏度或更低。該雜交效率差異使能根
18據目標-捕獲劑和對應物-捕獲劑複合物的Tm進行特定核酸種類的選擇性結合及後續的捕獲或動態範圍壓縮。參考圖1，對於涉及將目標和對應物捕獲到陣列的實施方式，與在固相載體的整個表面和捕獲劑相互作用形成對比，捕獲劑可以與固相在離散的位置上相互作用。用與陣列上特定離散位置連接的捕獲劑製得的陣列如圖1步驟2所示。與特定、離散的位置相互作用的捕獲劑可稱為具有特定地址，且各位置的地址可以用行和列的位置定義。以這一方式製備固相使本領域技術人員能在相同的陣列上進行多個不同的範圍壓縮或目標和/或對應物的捕獲，同時仍能鑑定各單獨地址從而可保留並確定與特定地址相關的參數。在一些實施方式中，系統中與目標和對應物核酸的親和力基本相同的任何兩種捕獲核酸的量可不同。在某些實施方式中，陣列上捕獲核酸的量相差50%或更低、49%或更低、48 %或更低、47 %或更低、46 %或更低、45 %或更低、44 %或更低、43 %或更低、42 %或更低、41 %或更低、40 %或更低、39 %或更低、38 %或更低、37 %或更低、36 %或更低、35 %或更低、34%或更低、33%或更低、32%或更低、31%或更低、30%或更低、四％或更低、觀％或更低、27%或更低、沈％或更低、25%或更低、對％或更低、23%或更低、22%或更低、21%或更低、20%或更低、19%或更低、18%或更低、17%或更低、16%或更低、15%或更低、14%或更低、13%或更低、12%或更低、11%或更低、10%或更低、9%或更低、8%或更低、7%或更低、 6%或更低、5%或更低、4%或更低、3%或更低、2%或更低、或者或更低。在某些實施方式中，捕獲目標和對應物之後，可將各地址上的對應物核酸與目標分離，且僅進一步處理目標或對應物，例如以便進行檢測和/或測序。在一些實施方式中， 目標或對應物可用通過目標或對應物上的捕獲劑連接固相的捕獲劑夥伴而捕獲。這一方法的優勢在於，鑑定和分析低豐度核酸目標所需的測序或檢測事件較少，由於高豐度序列上浪費的測序反應較少而節約了時間和資源。核酸序列的長度可影響目標/捕獲複合物和對應物/捕獲複合物的形成。根據天然序列長度和分離和製備過程中的核酸斷裂/切割，從樣品中分離並含有感興趣區域的核酸可能含有不同長度的序列。通常，增加互補核苷酸序列長度可提高雜交的特異性。在一些實施方式中，各感興趣的目標序列還可具有獨特的或更適於雜交的亞區域。目標核酸的長度可根據序列組成和條件選擇。在某些實施方式中，目標核酸的長度可以是約5個鹼基對(bp)、IObp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、IOObp、200bp、300bp、400bp、 500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、IOOObp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、 7000bp、8000bp、9000bp 或 10，OOObp0類似地，對應物核酸的長度可根據序列組成和條件選擇。在某些實施方式中，對應物核酸的長度可以是約 5 個鹼基對(bp)、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、 90bp、IOObp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、 3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp 或 10，OOObp0在某些實施方式中，捕獲核酸具有足夠的長度以包括與目標核酸和對應物核酸互補的核苷酸序列，並能進行捕獲/目標和捕獲/對應物複合物的固相捕獲。在某些實施方式中，捕獲核酸的長度可以是約5個鹼基對(bp)、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、 70bp>80bp>90bpU00bp>200bp>300bp>400bp>500bp>600bp>700bp>800bp>900bp>1000bp> 2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp 或 10，000bp。捕獲/目標和捕獲/對應物複合物可不包含重疊區域，在一些實施方式中，可包括一個或兩個重疊區域。在某些實施方式中，重疊區域的長度可以是約5個鹼基對(bp)、10bp、20bp、 30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、1OObp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、 800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp 或 10，000bp。重疊區域可以是顯著重疊(例如超過95或者甚至99%的重疊)、到部分重疊 (在約10%到約90%之間的重疊)、到最低限度的重疊。目標核酸種類的檢測和定量捕獲目標和對應物後，可進一步分析目標核酸和對應物核酸，包括但不限於檢測、測序、雜交和定量。在一些實施方式中，目標核酸和/或對應物核酸種類可用直接結合在目標上或目標內或者通過雜交的捕獲劑與目標組合的標記來檢測。 在一些實施方式中，可在進一步分析之前將目標核酸與對應物核酸分離。在某些實施方式中，當雜交在陣列位置上的目標核酸的量較大而對應物核酸的量較小時，可以用更少的試劑和更低的成本確定對應物核酸的量。本領域技術人員可適當選擇並利用適用於檢測系統中的相互作用或生物活性的任何可檢測標記(例如本文所述的某些可檢測標記)。在一些實施方式中，已知量的標記與目標核酸或對應物核酸連接(例如，標記有時是化學計量的)。例如，與對應物核酸連接的可檢測標記的量可在陣列的某個位置上確定，並且對應物核酸的量可以根據檢測到的標記
量確定。在一些實施方式中，目標核酸種類可用核苷酸測序進一步分析。可使用任何合適的測序方法。在一些實施方式中，可通過單核苷酸測序方法和過程進行核苷酸測序。單核苷酸測序方法包括將樣品核酸與固相載體在能使單個樣品核酸分子與單個固相載體分子雜交的條件下接觸。所述條件可包括在「微反應器」中提供固相載體分子和單個樣品核酸分子。所述條件還可以包括提供使樣品核酸分子可在固相載體上與固相核酸雜交的混合物。 可用於本文所述實施方式的單核苷酸測序方法見2009年1月15日遞交，2009年7月23日以
發明者C·R·坎託 申請人:塞昆納姆股份有限公司