一種具有產氫特性的光合細菌菌株的培養方法
2023-06-06 15:31:06 2
專利名稱：一種具有產氫特性的光合細菌菌株的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種具有產氫特性的光合細菌菌株的培養方法，屬於生物能源領域，具體涉及以環境中有機廢棄物為營養物質，培養一種具有產氫行為的光合細菌菌株的方法。
背景技術：
目前世界上氫的年產量在3600萬噸以上，主要來自化石燃料、生物質和水，主要是採用傳統的物理化學方法如水電解、天然氣催化重整和熱裂解、煤炭氣化、石油腦的部分氧化等製取氫氣，傳統的制氫方法實質上是以消耗大量化石能源為代價換取氫能，淨增能值低，經濟適用性不強，同時對環境產生汙染。運用光電技術和電解技術結合的方法也可以製取氫氣，用太陽能光伏電池或太陽能熱收集器能產生較高的轉化效率，但由於地球表面太陽能輻射率僅為1kW·m-2，因此需要建造巨大的面積以收集足夠多的能量，這明顯限制了其商業運用，同時這種方法的最不利條件是需要非常高的投資成本和高技術要求，從而在技術方面阻礙了其在欠發達國家和地區對太陽光的運用。而利用微生物法製取氫氣具有許多優點使用豐富的可再生資源微生物和水為原料，直接或間接利用地球上最經濟和最清潔的能源太陽光，能治理環境汙染，保護環境，經濟適用性強，生產安全，設備簡單，操作方便，不需消耗大量的能量，成本低、投資省，光合產氫微生物種類繁多，利用前景廣闊，易於普遍推廣應用。因此利用微生物法製取氫氣已成為可再生能源利用和開發領域的研究熱點。
目前利用太陽能制氫的方法有太陽能熱分解水制氫、太陽能發電電解水制氫、陽光催化光解水制氫、太陽能生物制氫等等，其中以太陽能生物制氫具有最廣闊的前景。
在太陽能光生物制氫技術中光合細菌因能分解有機物質，轉化和利用太陽光能為氫能而具有獨特的優勢，即在光能的驅動下以有機物為原料，分解有機物獲得氫氣，屬於光能異養型。在微生物產氫系統中，光合細菌制氫被認為是最有前途的微生物產氫方法，這是由於(1)光合細菌制氫具有高的理論光氫轉化量；(2)不產生O2，避免了O2造成的微生物失活問題；(3)光能利用中的光譜範圍寬；(4)具有消耗廢水處理過程中排放的有機底物的能力，實現了有機廢物的綜合利用和環境保護的目的，因此這對可再生能源的開發和可持續發展戰略的實現將是很有前途的處理技術。國外文獻報導光合細菌產氫速率一般為0.058016-17.696ml·h-1·l-1，這類光合細菌產氫效率仍然較低。
目前沒有專門培養產氫光合細菌方法的文獻報導，同時在光合細菌篩選方面更多的文獻資料集中於光合細菌的增殖培養及富集培養，得到的是含有雜菌的光合細菌培養液，其篩選光合細菌的目的僅僅用於飼料或蛋白質的生產或汙水處理，沒有將有機廢棄物處理與能源化緊密聯繫起來，部分資料報導對光合細菌的篩選是採用厭氧培養箱，但這種方法僅僅提供厭氧條件，而沒有同時提供光能，因此不能保證獲得的光合細菌具有較高的產氫能力。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種具有產氫特性的沼澤紅假單胞菌菌株的培養方法。
本發明的目的之二是提供一種具有產氫特性的膠狀紅長命菌菌株的培養方法。
本發明的技術方案一是一種具有產氫特性的沼澤紅假單胞菌菌株的培養方法，採用如下步驟(1)採集菌源採集農田、汙水溝等的上表層淤泥為菌源，過濾或靜置樣品，收集濾液或上清液；(2)沼澤紅假單胞菌菌株的增殖培養取上述濾液或上清液放入無菌的培養瓶中，同時按與之1比7～7比7的比例加入新鮮滅菌的培養基到培養瓶中，並充入氬氣排除空氣，進行靜置厭氧培養，菌種培養中以日光燈為光源，光照度為2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培養溫度為25℃～35℃，培養6天～12天，直到培養液顏色逐漸變紫紅，在培養瓶壁上有紅色菌吸附生長時止；(3)沼澤紅假單胞菌菌株的富集培養取上述紅色培養液的中下層液體加入滅菌的乾淨培養瓶中，按與之1比7～7比7的比例加入已滅菌的新鮮培養基，充入氬氣創造厭氧環境，將培養瓶置於恆溫培養箱中，以日光燈或發紅光的LED燈為光源，光照度為2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培養溫度為25℃～35℃，再次光照靜置轉化培養3天～10天，進一步淘汰非光合細菌，增強光合細菌的生長和適應能力，再取中下層的紅色培養液重複本步驟2次以上，直到光學顯微鏡下觀察到大量的優勢菌種為杆形或橢圓形細菌為止；(4)沼澤紅假單胞菌菌株富集培養液的梯度稀釋液的製備取步驟(3)得到的光合細菌菌株的富集培養液用滅菌的蒸餾水按10-1-10-9級數進行稀釋，分別得到稀釋倍數為10-1、10-2、……10-10的梯度稀釋液；(5)沼澤紅假單胞菌菌株的分離純化採用梯度稀釋平板菌落分離法，利用雙層平板固體培養基為菌種的生長繁殖提供厭氧環境；首先在無菌的培養皿中製作下層基礎營養固體平板培養基，待下層基礎營養固體平板培養基冷卻後分別在各固體平板培養基上接種步驟(4)得到的沼澤紅假單胞菌菌株富集培養液的10-3-10-10梯度稀釋液，將固體平板培養基表面放置5分鐘~20分鐘，倒入35℃～45℃的僅含瓊脂且含量為1.5％-2.0％的上層覆蓋液，蓋上培養皿皿蓋，放置冷卻至上層瓊脂覆蓋液完全凝固，再將培養皿置於25℃～35℃，光照度為2000lx～7000lx的光照恆溫培養箱中光照培養4天～10天；待長出菌落後，挑選生長快，菌落形態單一且顏色為紫紅色，細胞形態分別為橢圓形者為目的菌種；(6)挑取步驟(5)得到的目的菌種，按步驟(4)的方法進行稀釋，再按步驟(5)的方法進行培養基的製備和接種，重複進行3次以上的分離純化，直到觀察到生長的菌落形態一致，菌落顏色為紫紅色且光學顯微鏡下觀察到細胞形態分別為橢圓形即判定得到相應的純菌種。
所述培養基的組成如下K2HPO4·3H2O0.786g/l-1.5g/l；MgSO4·7H2O0.03g/l-0.6g/l；KH2PO40.272g/l-0.836g/l；FeSO4·7H2O0.01g/l-0.09g/l；C6H12O6·H2O2.012g/l-8.048g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0001g/l-0.0008g/l；NaCl1g/l-2g/l；CaCl20.005g/l-0.03g/l；NH4Cl0.8g/l-2.6g/l；生長因子溶液3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0001g/l-0.004g/l。
本發明的技術方案二是一種具有產氫特性的膠狀紅長命菌菌株的培養方法，採用如下步驟(1)採集菌源採集農田、汙水溝等的上表層淤泥為菌源，過濾或靜置樣品，收集濾液或上清液；(2)膠狀紅長命菌菌株的增殖培養取上述濾液或上清液放入無菌的培養瓶中，同時按與之1比7～7比7的比例加入新鮮滅菌的培養基到培養瓶中，並充入氬氣排除空氣，進行靜置厭氧培養，菌種培養中以日光燈為光源，光照度為2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培養溫度為25～35℃，培養6～12天，直到培養液顏色逐漸變紫紅，在培養瓶壁上有紅色菌吸附生長時止；(3)膠狀紅長命菌菌株的富集培養取上述紅色培養液的中下層液體加入滅菌的乾淨培養瓶中，按與之1比7～7比7的比例加入已滅菌的新鮮培養基，充入氬氣創造厭氧環境，將培養瓶置於恆溫培養箱中，以日光燈或紅色的LED燈為光源，光照度為2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培養溫度為25℃～35℃，再次光照靜置轉化培養3天～10天，進一步淘汰非光合細菌，增強光合細菌的生長和適應能力，再取中下層的紅色培養液重複本步驟2次以上，直到光學顯微鏡下觀察到大量的優勢菌種為杆形或橢圓形細菌為止；(4)膠狀紅長命菌菌株富集培養液的梯度稀釋液的製備取步驟(3)得到的光合細菌菌株的富集培養液用滅菌的蒸餾水按10-1-10-9級數進行稀釋，分別得到稀釋倍數為10-1、10-2、……10-10的梯度稀釋液；(5)膠狀紅長命菌菌株的分離純化採用梯度稀釋平板菌落分離法，利用雙層平板固體培養基為菌種的生長繁殖提供厭氧環境；首先在無菌的培養皿中製作下層基礎營養固體平板培養基，待下層基礎營養固體平板培養基冷卻後分別在各固體平板培養基上接種步驟(4)得到的膠狀紅長命菌菌株富集培養液的10-3-10-10梯度稀釋液，將固體平板培養基表面放置5分鐘-20分鐘，倒入35℃～45℃的僅含瓊脂且含量為1.5％-2.0％的上層覆蓋液，蓋上培養皿皿蓋，放置冷卻至上層瓊脂覆蓋液完全凝固，再將培養皿置於25℃～35℃，日光燈光照度為2000lx～7000lx的光照恆溫培養箱中光照培養4天～10天；待長出菌落後，挑選生長快，菌落形態單一且顏色為橙黃色，細胞形態分別為短杆形者為目的菌種；(6)挑取步驟(5)得到的目的菌種，按步驟(4)的方法進行稀釋，再按步驟(5)的方法進行培養基的製備和接種，重複進行3次以上的分離純化，直到觀察到生長的菌落形態一致，菌落顏色為橙黃色且光學顯微鏡下觀察到細胞形態分別為短杆形即判定得到相應的純菌種。
所述培養基的組成如下K2HPO4·3H2O0.786g/l-1.5g/l；MgSO4·7H2O0.03g/l-0.6g/l；KH2PO40.272g/l-0.836g/l；FeSO4·7H2O0.01g/l-0.09g/l；C6H12O6·H2O2.012g/l-8.048g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0001g/l-0.0008g/l；NaCl1g/l-2g/l；CaCl20.005g/l-0.03g/l；NH4Cl0.8g/l-2.6g/l；生長因子溶液3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0001g/l-0.004g/l。
本發明所述技術方案得到的沼澤紅假單胞菌和膠狀紅長命菌菌株具有如下特性(1)所述菌種無毒性，產氫能力高，能吸收和轉化太陽光能，有效分解和利用各種有機物質；(2)本發明得到的菌種為兼性厭氧生活方式，但在好氧條件下不產生氫氣，在厭氧光照條件下能分解各種有機物質產生氫氣。
(3)本發明所述菌株對底物的利用類型廣泛，能有效分解和利用葡萄糖、酒石酸鈉、乙酸鈉、丙酸鈉等有機物質，表明該菌株利用和代謝這類有機物質的能力較強，其中特別嗜好利用葡萄糖和多種有機酸，這有利於在環境汙染治理中的應用。
(4)由於本發明得到的菌株是以有機底物為碳源、同時提供氮源、無機鹽及生長因子等而培養獲得，除在產生氫能方面具有獨特的優勢外，同時能分解有機物，降低有機廢水的COD值，該菌種對有機物質的分解和利用率最高可達到98％以上，因此本菌種在轉化和利用有機底物方面具有很大的優勢，同時本菌種特別適合分解和利用厭氧發酵後的有機廢水，能進一步降低廢液中的有機物含量，取得良好的淨化性能，充分利用了生物質能，實現了化害為寶，保護環境的目的。因此在環境保護和實現資源的可持續利用方面具有廣闊的應用前景和社會價值。
本發明所述的技術方案與現有技術相比，由於採用雙層固體平板培養基能為沼澤紅假單胞菌和膠狀紅長命菌的生長繁殖提供厭氧環境，同時由於固體培養基是透光的，能保證沼澤紅假單胞菌和膠狀紅長命菌生長和產氫代謝過程中對光能的需求，保證了獲得的沼澤紅假單胞菌和膠狀紅長命菌菌種具有較高產氫能力，能吸收和轉化太陽光能，有效分解和利用各種有機物質。
具體實施例方式
實施例1(1)採集菌源採集農田、汙水溝等的上表層淤泥為菌源，靜置5小時，收集上清液；顯微鏡下初步鏡檢微生物的種類和數量分布，發現有大量的其它雜菌，如念珠藻菌、綠藻等，光合細菌數量很少；(2)沼澤紅假單胞菌菌株的增殖培養取上述上清液70ml倒入250ml的三角瓶中，同時加入30ml滅菌的新鮮培養基於瓶中，將上清液和新鮮培養基搖勻，並充入氬氣排除空氣，進行靜置厭氧培養，菌種培養中以日光燈為光源，光照度為3000勒克斯(lx)，培養溫度為30℃，培養10天，培養液顏色逐漸變紫紅，在培養瓶壁上有紅色菌吸附生長；(3)沼澤紅假單胞菌菌株的富集培養取上述培養液的中下層液體40ml於滅菌的乾淨培養瓶中，再加入40ml的已滅菌的新鮮培養基，將培養液和新鮮培養基搖勻，充入氬氣創造厭氧環境，將培養瓶置於恆溫培養箱中，以日光燈為光源，光照度為3000勒克斯，培養溫度為30℃，再次光照靜置轉化培養，培養1天後觀察到培養瓶中溶液變渾濁，培養3天後顯微鏡觀察到活菌鹼性美藍染色後，進行顯微鏡鏡檢，發現念珠藻菌株消失，含大量的長杆形非運動性細菌(革蘭氏染色不明顯)和部分長絲狀的多細胞連接的細菌(革蘭氏染色陽性)，觀察到少量的運動性、細胞呈橢園形的細菌，還含有部分球形、細胞形態很小的細菌(革蘭氏染色為陰性)，還具有少量的能快速彎曲變形運動的細菌；在第7天後觀察到大量的具有運動性、細胞呈橢圓形，革蘭氏染色為陰性的細菌出現，其它菌的數量明顯減少。再取中下層的紅色培養液重複本步驟3次，光學顯微鏡下觀察到大量的優勢菌種為短杆形或紅色橢圓形細菌；(4)沼澤紅假單胞菌菌株富集培養液的梯度稀釋液的製備取步驟(3)得到的富集培養液用滅菌的蒸餾水按10-1-10-9級數進行稀釋，分別得到稀釋倍數為10-1、10-2、……10-10的梯度稀釋液；(5)沼澤紅假單胞菌菌株的分離純化採用梯度稀釋平板菌落分離法，利用雙層平板固體培養基為菌種的生長繁殖提供厭氧環境；首先在無菌的培養皿中製作下層基礎營養固體平板培養基，待下層基礎營養固體平板培養基冷卻後分別在各固體平板培養基上接種步驟(4)得到的富集培養液的10-3-10-10梯度稀釋液，將固體平板培養基表面放置15分鐘，倒入40℃左右的僅含瓊脂且含量為1.8％的上層覆蓋液，蓋上培養皿皿蓋，放置冷卻至上層瓊脂覆蓋液完全凝固，再將培養皿置於30℃，光照度為5000lx的光照恆溫培養箱中光照培養8天；長出菌落後，挑選生長快，菌落形態單一而大、菌落顏色為紅色者為目的菌種；(6)挑取步驟(5)得到的目的菌種，按步驟(4)的方法進行稀釋，再按步驟(5)的方法重複進行4次分離純化後，生長的菌落形態一致，菌落顏色為紫紅色，光學顯微鏡下觀察到細胞形態均為橢圓形，即判定得到純菌種；該菌種菌落表面溼潤，極易挑取，細胞易分散，且革蘭氏染色為陰性，細胞運動性強，電鏡下可見細胞表面分泌有大量的粘液；鞭毛多而長，周生，直徑為100-200μm，長約4.0μm左右，寬約2.5μm左右；該菌種經生理生化分析和16SrRNA比對，鑑定該菌種屬於紅螺菌目、紅螺菌科、紅假單胞菌屬、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，並命名為Rhodopseudomonas palustris CQK 01。
其中，培養基的組成如下K2HPO4·3H2O1.2g/l；MgSO4·7H2O0.5g/l；KH2PO40.6g/l；FeSO4·7H2O0.05g/l；C6H12O6·H2O6.012g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0005g/l；NaCl1.5g/l；CaCl20.015g/l；NH4Cl1.5g/l；生長因子溶液濃度3ml/l；ZnSO4·7H2O0.002g/l；實施例2(1)採集菌源採集農田、汙水溝等的上表層淤泥為菌源，靜置5小時，收集上清液；顯微鏡下初步鏡檢微生物的種類和數量分布，發現有大量的其它雜菌，如念珠藻菌、綠藻等，光合細菌數量很少；(2)沼澤紅假單胞菌菌株的增殖培養取上述上清液70ml倒入250ml的三角瓶中，同時加入60ml滅菌的新鮮培養基於瓶中，將上清液和新鮮培養基搖勻，並充入氬氣排除空氣，進行靜置厭氧培養，菌種培養中以日光燈為光源，光照度為5000勒克斯(lx)，培養溫度為35℃，培養10天，培養液顏色逐漸變紫紅，在培養瓶壁上有紅色菌吸附生長；(3)沼澤紅假單胞菌菌株的富集培養取上述培養液的中下層液體50ml於滅菌的乾淨培養瓶中，再加入30ml的已滅菌的新鮮培養基，將培養液和新鮮培養基搖勻，充入氬氣創造厭氧環境，將培養瓶置於恆溫培養箱中，以發紅光的LED燈為光源，光照度為5000勒克斯，培養溫度為30℃，再次光照靜置轉化培養，培養1天後觀察到培養瓶中溶液變渾濁，培養3天後顯微鏡觀察到活菌鹼性美藍染色後，進行顯微鏡鏡檢，發現念珠藻菌株消失，含大量的長杆形非運動性細菌(革蘭氏染色不明顯)和部分長絲狀的多細胞連接的細菌(革蘭氏染色陽性)，觀察到少量的運動性、細胞呈橢園形的細菌，還含有部分球形、細胞形態很小的細菌(革蘭氏染色為陰性)，還具有少量的能快速彎曲變形運動的細菌；在第7天後觀察到大量的具有運動性、細胞呈橢圓形，革蘭氏染色為陰性的細菌出現，其它菌的數量明顯減少。再取中下層的紅色培養液重複本步驟4次，光學顯微鏡下觀察到大量的優勢菌種為短杆形或紅色橢圓形細菌；(4)沼澤紅假單胞菌菌株富集培養液的梯度稀釋液的製備取步驟(3)得到的富集培養液用滅菌的蒸餾水按10-1-10-9級數進行稀釋，分別得到稀釋倍數為10-1、10-2、……10-10的梯度稀釋液；(5)沼澤紅假單胞菌菌株的分離純化採用梯度稀釋平板菌落分離法，利用雙層平板固體培養基為菌種的生長繁殖提供厭氧環境；首先在無菌的培養皿中製作下層基礎營養固體平板培養基，待下層基礎營養固體平板培養基冷卻後分別在各固體平板培養基上接種步驟(4)得到的富集培養液的10-3-10-10梯度稀釋液，將固體平板培養基表面放置15分鐘，倒入40℃左右的僅含瓊脂且含量為1.5％的上層覆蓋液，蓋上培養皿皿蓋，放置冷卻至上層瓊脂覆蓋液完全凝固，再將培養皿置於30℃，光照度為3000lx的光照恆溫培養箱中光照培養10天；長出菌落後，挑選生長快，菌落形態單一而大、菌落顏色為紅色者為目的菌種；(6)挑取步驟(5)得到的目的菌種，按步驟(4)的方法進行稀釋，再按步驟(5)的方法重複進行4次分離純化後，生長的菌落形態一致，菌落顏色為紫紅色，光學顯微鏡下觀察到細胞形態均為橢圓形，即判定得到純菌種；其中，培養基的組成如下K2HPO4·3H2O0.8g/l；MgSO4·7H2O0.1g/l；KH2PO40.3g/l；FeSO4·7H2O0.02g/l；C6H12O6·H2O3.012g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0002g/l；NaCl1.8g/l；CaCl20.025g/l；NH4Cl2.3g/l；生長因子溶液濃度3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0002g/l；按照實施例1和實施例2得到的光合細菌菌株已在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2007年3月1日，保藏號CGMCC No.1947；具體內容為沼澤紅假單胞菌CQK 01，Rhodoseudomonas palustris CQK 01，CGMCC No.1947。
實施例3(1)採集菌源採集農田、汙水溝等的上表層淤泥為菌源，靜置5小時，收集上清液；(2)膠狀紅長命菌菌株的增殖培養取上述濾液70ml倒入250ml的三角瓶中，同時加入30ml滅菌的新鮮培養基於瓶中，將濾液和新鮮培養基搖勻，並充入氬氣排除空氣，進行靜置厭氧培養，菌種培養中以日光燈為光源，光照度為3000勒克斯(lx)，培養溫度為30℃，培養10天，直到培養液顏色逐漸變紫紅，在培養瓶壁上有紅色菌吸附生長時止；(3)膠狀紅長命菌菌株的富集培養取上述培養液的中下層液體40ml於滅菌的乾淨培養瓶中，再加入40ml的已滅菌的新鮮培養基，將培養液和新鮮培養基搖勻，充入氬氣創造厭氧環境，將培養瓶置於恆溫培養箱中，以日光燈為光源，光照度為3000勒克斯(lx)，培養溫度為30℃，再次光照靜置轉化培養，培養1天後觀察到培養瓶中溶液變渾濁，培養3天後顯微鏡觀察到活菌鹼性美藍染色後，進行顯微鏡鏡檢，發現念珠藻菌株消失，含大量的長杆形非運動性細菌(革蘭氏染色不明顯)和部分長絲狀的多細胞連接的細菌(革蘭氏染色陽性)，觀察到少量的運動性、細胞呈短杆形的細菌，還含有部分球形、細胞形態很小的細菌(革蘭氏染色為陰性)，還具有少量的能快速彎曲變形運動的細菌；在第5天後觀察到大量的具有運動性、細胞呈短杆形，革蘭氏染色為陰性的細菌出現，其它菌的數量明顯減少。再取中下層的紅色培養液重複本步驟3次，直到光學顯微鏡下觀察到大量的優勢菌種為短杆形或紅色橢圓形細菌；(4)膠狀紅長命菌菌株富集培養液的梯度稀釋液的製備取步驟(3)得到的富集培養液用滅菌的蒸餾水按10-1-10-9級數進行稀釋，分別得到稀釋倍數為10-1、10-2、……10-10的梯度稀釋液；(5)膠狀紅長命菌的分離純化採用梯度稀釋平板菌落分離法，利用雙層平板固體培養基為菌種的生長繁殖提供厭氧環境；首先在無菌的培養皿中製作下層基礎營養固體平板培養基，待下層基礎營養固體平板培養基冷卻後分別在各固體平板培養基上接種步驟(4)得到的短杆形細菌富集培養液的10-3-10-10梯度稀釋液，將固體平板培養基表面放置15分鐘，倒入40℃左右的僅含瓊脂且含量為1.8％的上層覆蓋液，蓋上培養皿皿蓋，放置冷卻至上層瓊脂覆蓋液完全凝固，再將培養皿置於30℃，光照度為5000lx的光照恆溫培養箱中光照培養8天；長出菌落後，挑選菌落生長快，橙黃色菌落為目的菌種；(6)挑取步驟(5)得到的目的菌種，按步驟(4)的方法進行稀釋，再按步驟(5)的方法進行培養基的製備和接種，重複進行4次分離純化後，觀察到生長的菌落形態一致，菌落顏色為橙黃色，且光學顯微鏡下觀察到細胞形態均為長杆形，即判定得到純菌種；該菌種菌落表面溼潤，極易挑取，細胞不易分散，革蘭氏染色為陰性，細胞運動性強，可見以二等分裂方式繁殖，分裂後的許多細胞連接成長杆形；電鏡下可見細胞表面分泌有大量的粘液；鞭毛少而長，極生，長約2.1-1.2μm左右，寬約0.5-0.9μm左右；該菌種經生理生化分析和16SrRNA比對，鑑定該菌種屬於紅螺菌目、紅螺菌科、長命菌屬、膠狀紅長命菌(Rubrivivax gelatinosus)，並命名為Rubrivivax gelatinosus CJK 02。
其中，培養基的組成如下K2HPO4·3H2O1.2g/l；MgSO4·7H2O0.5g/l；KH2PO40.6g/l；FeSO4·7H2O0.05g/l；C6H12O6·H2O6.012g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0005g/l；NaCl1.5g/l；CaCl20.015g/l；NH4Cl1.5g/l；生長因子溶液濃度3ml/l；ZnSO4·7H2O0.002g/l；實施例4(1)採集菌源採集農田、汙水溝等的上表層淤泥為菌源，靜置5小時，收集上清液；(2)膠狀紅長命菌菌株的增殖培養取上述濾液70ml倒入250ml的三角瓶中，同時加入60ml滅菌的新鮮培養基於瓶中，將濾液和新鮮培養基搖勻，並充入氬氣排除空氣，進行靜置厭氧培養，菌種培養中以日光燈為光源，光照度為5000勒克斯(lx)，培養溫度為35℃，培養10天，直到培養液顏色逐漸變紫紅，在培養瓶壁上有紅色菌吸附生長時止；
(3)膠狀紅長命菌菌株的富集培養取上述培養液的中下層液體50ml於滅菌的乾淨培養瓶中，再加入30ml的已滅菌的新鮮培養基，將培養液和新鮮培養基搖勻，充入氬氣創造厭氧環境，將培養瓶置於恆溫培養箱中，以日光燈為光源，光照度為5000勒克斯(lx)，培養溫度為30℃，再次光照靜置轉化培養，培養1天後觀察到培養瓶中溶液變渾濁，培養3天後顯微鏡觀察到活菌鹼性美藍染色後，進行顯微鏡鏡檢，發現念珠藻菌株消失，含大量的長杆形非運動性細菌(革蘭氏染色不明顯)和部分長絲狀的多細胞連接的細菌(革蘭氏染色陽性)，觀察到少量的運動性、細胞呈短杆形的細菌，還含有部分球形、細胞形態很小的細菌(革蘭氏染色為陰性)，還具有少量的能快速彎曲變形運動的細菌；在第5天後觀察到大量的具有運動性、細胞呈短杆形，革蘭氏染色為陰性的細菌出現，其它菌的數量明顯減少。再取中下層的紅色培養液重複本步驟4次，直到光學顯微鏡下觀察到大量的優勢菌種為短杆形或紅色橢圓形細菌；(4)膠狀紅長命菌菌株富集培養液的梯度稀釋液的製備取步驟(3)得到的富集培養液用滅菌的蒸餾水按10-1-10-9級數進行稀釋，分別得到稀釋倍數為10-1、10-2、……10-10的梯度稀釋液；(5)膠狀紅長命菌的分離純化採用梯度稀釋平板菌落分離法，利用雙層平板固體培養基為菌種的生長繁殖提供厭氧環境；首先在無菌的培養皿中製作下層基礎營養固體平板培養基，待下層基礎營養固體平板培養基冷卻後分別在各固體平板培養基上接種步驟(4)得到的短杆形細菌富集培養液的10-3-10-10梯度稀釋液，將固體平板培養基表面放置15分鐘，倒入40℃左右的僅含瓊脂且含量為1.5％的上層覆蓋液，蓋上培養皿皿蓋，放置冷卻至上層瓊脂覆蓋液完全凝固，再將培養皿置於30℃，光照度為3000lx的光照恆溫培養箱中光照培養10天；長出菌落後，挑選菌落生長快，橙黃色菌落為目的菌種；(6)挑取步驟(5)得到的目的菌種，按步驟(4)的方法進行稀釋，再按步驟(5)的方法進行培養基的製備和接種，重複進行4次分離純化後，觀察到生長的菌落形態一致，菌落顏色為橙黃色，且光學顯微鏡下觀察到細胞形態均為長杆形，即判定得到純菌種；其中，培養基的組成如下K2HPO4·3H2O0.8g/l；MgSO4·7H2O0.1g/l；KH2PO40.3g/l；FeSO4·7H2O0.02g/l；C6H12O6·H2O3.012g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0002g/l；NaCl1.8g/l；CaCl20.025g/l；NH4Cl2.3g/l；生長因子溶液濃度3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0002g/l；按照實施例3和實施例4得到的光合細菌菌株已在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2007年3月1日，保藏號CGMCC No.1948；具體內容為膠狀紅長命菌CJK 02，Rubrivivax gelatinosus CJK 02，CGMCC No.1948。
實施例5將實施例1或實施例2得到的沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonaspalustris CQK 01株進行產氫試驗，具體實驗方法為將沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustris CQK 01株製作菌懸液，將菌懸液按10％的比例加入長方體型的透明材質製成的生物反應器中的培養基中，反應器體積為500ml，反應液體積為300ml，上部空間體積為200ml，充入氬氣獲得厭氧環境，以發紅光的LED燈為光源，光照度為3000lx，溫度為30℃，靜置恆溫培養，採用的培養基組合物成分如下培養基成分及含量葡萄糖19.8g/l；NH4Cl1.99g/l；K2HPO4·3H2O0.6g/l；KH2PO40.38g/l；CaCl20.1g/l；FeSO4·7H2O0.0834g/l；ZnSO4·7H2O0.0005g/l；MgSO4·7H2O0.05g/l；CuSO40.03g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.00075g/l；生長因子溶液2ml g/l；VB20.00002g/l；煙酸0.000015g/l；牛肉膏3g/l；水1000ml；pH值6.2將接種後的培養液按上述條件連續培養5天，期間定時檢測產氫狀況，發現在接種培養後第12h光合細菌開始產氫，產氫速率為0.5376ml·h-1·l-1，此時生物量(乾重)為0.037g·l-1，當培養至第23h時，產氫速率達最大，為14.0672ml·h-1·l-1，此時生物量為0.28g·l-1。此後至第64h產氫速率基本維持在10.976-14.224ml·h-1·l-1之間，之後產氫速率逐漸下降，當培養至第120h，產氫仍繼續為0.645ml·h-1·l-1，生物量略減少為0.12g·l-1。
實施例6將實施例3或實施例4得到的該菌株是膠狀紅長命菌(Rubrivivaxgelatinosus)CJK 02株，進行產氫試驗，具體實驗方法為
將膠狀紅長命菌(Rubrivivax gelatinosus)CJK 02株製作菌懸液，將菌懸液按10％的比例加入長方體型的透明材質製成的生物反應器中的培養基中，反應器體積為500ml，反應液體積為300ml，上部空間體積為200ml，充入氬氣獲得厭氧環境，以日光燈為光源，光照度為3000lx，溫度為30℃，靜置恆溫培養，採用的培養基組合物成分如下葡萄糖19.8g/l；；NaCl1.5g/l；NH4Cl1.99g/l；K2HPO4·3H2O0.6g/l；KH2PO40.3g/l；CaCl20.1g/l；FeSO4·7H2O0.0834g/l；ZnSO4·7H2O0.0005g/l；MgSO4·7H2O0.005g/l；CuSO40.03g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.00075g/l；VB20.00002g/l；煙酸0.000015g/l；牛肉膏2.5g/l；水1000ml；pH值6.5將接種後的培養液按上述條件連續培養5天，期間定時檢測產氫狀況，發現在接種培養後第12h光合細菌開始產氫，產氫速率為0.0103mg·h-1·l-1，此時生物量(乾重)為0.083g·l-1，當培養至第28h時，產氫速率達最大，為1.35mg·h-1·l-1，此時生物量為0.49g·l-1。此後至第72h產氫速率基本維持在0.98-1.07mg·h-1·l-1之間，之後產氫速率逐漸下降，當培養至第120h，產氫仍繼續為0.025mg·h-1·l-1，生物量略減少為0.37g·l-1。
通過實施例5和實施例6可以看出，用本發明技術方案培養獲得的光合細菌菌種與國內外同類光合細菌菌種比較，產氫能力處於前列。
權利要求
1.一種具有產氫特性的沼澤紅假單胞菌菌株的培養方法，其特徵在於採用如下步驟(1)採集菌源採集農田、汙水溝等的上表層淤泥為菌源，過濾或靜置樣品，收集濾液或上清液；(2)沼澤紅假單胞菌菌株的增殖培養取上述濾液或上清液放入無菌的培養瓶中，同時按與之1比7～7比7的比例加入新鮮滅菌的培養基到培養瓶中，並充入氬氣排除空氣，進行靜置厭氧培養，菌種培養中以日光燈為光源，光照度為2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培養溫度為25～35℃，培養6～12天，直到培養液顏色逐漸變紫紅，在培養瓶壁上有紅色菌吸附生長時止；(3)沼澤紅假單胞菌菌株的富集培養取上述紅色培養液的中下層液體加入滅菌的乾淨培養瓶中，按與之1比7～7比7比例加入已滅菌的新鮮培養基，充入氬氣獲得厭氧環境，將培養瓶置於恆溫培養箱中，以日光燈或發紅光的LED燈為光源，光照度為2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培養溫度為25～35℃，再次光照靜置轉化培養3～10天，進一步淘汰非光合細菌，增強光合細菌的生長和適應能力，再取中下層的紅色培養液重複本步驟2次以上，直到光學顯微鏡下觀察到大量的優勢菌種為杆形或橢圓形細菌為止；(4)沼澤紅假單胞菌菌株富集培養液的梯度稀釋液的製備取步驟(3)得到的沼澤紅假單胞菌富集培養液用滅菌的蒸餾水按10-1-10-9級數進行稀釋，分別得到稀釋倍數為10-1、10-2、……10-10的梯度稀釋液；(5)沼澤紅假單胞菌菌株的分離純化採用梯度稀釋平板菌落分離法，利用雙層平板固體培養基為菌種的生長繁殖提供厭氧環境；首先在無菌的培養皿中製作下層基礎營養固體平板培養基，待下層基礎營養固體平板培養基冷卻後分別在各固體平板培養基上接種步驟(4)得到的沼澤紅假單胞菌菌株富集培養液的10-3-10-10梯度稀釋液，將固體平板培養基表面放置5-20分鐘，倒入40～45℃的僅含瓊脂且含量為1.5％-2.0％的上層覆蓋液，蓋上培養皿皿蓋，放置冷卻至上層瓊脂覆蓋液完全凝固，再將培養皿置於25℃～35℃，光照度為2000lx～7000lx的光照恆溫培養箱中光照培養4～10天；待長出菌落後，挑選生長快，菌落形態單一，且菌落顏色為紅色，細胞形態為橢圓形者為目的菌種；(6)挑取步驟(5)得到的目的菌種，按步驟(4)的方法進行稀釋，再按步驟(5)的方法進行培養基的製備和接種，重複進行3次以上的分離純化，直到觀察到生長的菌落形態一致，菌落顏色為紫紅色且光學顯微鏡下觀察到細胞形態分別為橢圓形即判定得到相應的純菌種。
2.根據權利要求1所述的具有產氫特性的沼澤紅假單胞菌菌株的培養方法，所述培養基的組成如下K2HPO4·3H2O0.786g/l-1.5g/l；MgSO4·7H2O0.03g/l-0.6g/l；KH2PO40.272g/l-0.836g/l；FeSO4·7H2O0.01g/l-0.09g/l；C6H12O6·H2O2.012g/l-8.048g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0001g/l-0.0008g/l；NaCl1g/l-2g/l；CaCl20.005g/l-0.03g/l；NH4Cl0.8g/l-2.6g/l；生長因子溶液3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0001g/l-0.004g/l。
3.一種具有產氫特性的膠狀紅長命菌菌株的培養方法，其特徵在於採用如下步驟(1)採集菌源採集農田、汙水溝等的上表層淤泥為菌源，過濾或靜置樣品，收集濾液或上清液；(2)膠狀紅長命菌菌株的增殖培養取上述濾液或上清液放入無菌的培養瓶中，同時按與之1比7～7比7的比例加入新鮮滅菌的培養基到培養瓶中，並充入氬氣排除空氣，進行靜置厭氧培養，菌種培養中以日光燈或發紅光的LED燈為光源，光照度為2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培養溫度為25～35℃，培養6～12天，直到培養液顏色逐漸變紫紅，在培養瓶壁上有紅色菌吸附生長時止；(3)膠狀紅長命菌菌株的富集培養取上述紅色培養液的中下層液體加入滅菌的乾淨培養瓶中，按與之1比7～7比7比例加入已滅菌的新鮮培養基，充入氬氣創造厭氧環境，將培養瓶置於恆溫培養箱中，以日光燈或紅色的LED燈為光源，光照度為2000勒克斯～5000勒克斯(lx)，培養溫度為25～35℃，再次光照靜置轉化培養3～10天，進一步淘汰非光合細菌，增強光合細菌的生長和適應能力，再取中下層的紅色培養液重複本步驟2次以上，直到光學顯微鏡下觀察到大量的優勢菌種為杆形或橢圓形細菌為止；(4)膠狀紅長命菌菌株富集培養液的梯度稀釋液的製備取步驟(3)得到的膠狀紅長命菌富集培養液用滅菌的蒸餾水按10-1-10-9級數進行稀釋，分別得到稀釋倍數為10-1、10-2、……10-10的梯度稀釋液；(5)膠狀紅長命菌菌株的分離純化採用梯度稀釋平板菌落分離法，利用雙層平板固體培養基為菌種的生長繁殖提供厭氧環境；首先在無菌的培養皿中製作下層基礎營養固體平板培養基，待下層基礎營養固體平板培養基冷卻後分別在各固體平板培養基上接種步驟(4)得到的膠狀紅長命菌菌株富集培養液的10-3-10-10梯度稀釋液，將固體平板培養基表面放置5-20分鐘，倒入40～45℃的僅含瓊脂且含量為1.5％-2.0％的上層覆蓋液，蓋上培養皿皿蓋，放置冷卻至上層瓊脂覆蓋液完全凝固，再將培養皿置於25℃～35℃，日光燈光照度為2000lx～7000lx的光照恆溫培養箱中光照培養4～10天；待長出菌落後，挑選生長快，菌落形態單一，且菌落顏色為橙黃色，細胞形態為短杆形者為目的菌種；(6)挑取步驟(5)得到的目的菌種，按步驟(4)的方法進行稀釋，再按步驟(5)的方法進行培養基的製備和接種，重複進行3次以上的分離純化，直到觀察到生長的菌落形態一致，菌落顏色為橙黃色且光學顯微鏡下觀察到細胞形態為短杆形即判定得到相應的純菌種。
4.根據權利要求3所述的具有產氫特性的膠狀紅長命菌菌株的培養方法，所述培養基的組成如下K2HPO4·3H2O0.786g/l-1.5g/l；MgSO4·7H2O0.03g/l-0.6g/l；KH2PO40.272g/l-0.836g/l；FeSO4·7H2O0.01g/l-0.09g/l；C6H12O6·H2O2.012g/l-8.048g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0001g/l-0.0008g/l；NaCl1g/l-2g/l；CaCl20.005g/l-0.03g/l；NH4Cl0.8g/l-2.6g/l；生長因子溶液3ml/l；ZnSO4·7H2O0.0001g/l-0.004g/l。
全文摘要
一種具有產氫特性的沼澤紅假單胞菌菌株的培養方法，其特徵在於採用如下步驟(1)採集菌源採集農田、汙水溝等的上表層淤泥為菌源，過濾或靜置樣品，收集濾液或上清液；(2)沼澤紅假單胞菌菌株的增殖培養取上述濾液或上清液放入無菌的培養瓶中，同時按與之1比7～7比7的比例加入新鮮滅菌的培養基到培養瓶中，並充入氬氣排除空氣，進行靜置厭氧培養，菌種培養中以日光燈為光源，光照度為2000勒克斯～5000勒克斯，培養溫度為25℃～35℃，培養6～12天，直到培養液顏色逐漸變紫紅，在培養瓶壁上有紅色菌吸附生長時止；(3)沼澤紅假單胞菌菌株的富集培養取上述紅色培養液的中下層液體加入滅菌的乾淨培養瓶中。
文檔編號C12R1/38GK101063098SQ20071007840
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月20日 優先權日2007年4月20日
發明者廖強, 王永忠, 朱恂, 田鑫, 石泳, 丁玉棟 申請人:重慶大學