產五種稻曲病菌毒素的稻綠核菌及其獲取方法與流程
2023-06-06 13:46:36
本發明涉及一種稻綠核菌，尤其是一種產五種稻曲病菌毒素的稻綠核菌及其獲取方法。
背景技術：
稻曲病是一種水稻真菌病害，由綠核菌屬綠核菌ustilaginodeavirens(cooke)takahashi侵染水稻穗部引起。稻曲病發生較為普遍，在中國、日本、美國、印度、菲律賓等多個國家均有出現，屬於世界性水稻病害(fuetal，2015；ashizawaetal，2010；hamedetal，2014)。20世紀80年代前，稻曲病僅零星分布於中晚稻田，為水稻次要病害；但隨著水稻品種、耕作方式、施肥用量及氣候環境等因素改變，近年來，稻曲病已由過去的零星分布轉變成為水稻生產中的主要病害之一(王文斌等，2014)。稻曲病不但在水稻穗部形成稻曲球，嚴重影響穀粒的生長，降低水稻的產量與品質，而且其病原真菌一一稻綠核菌ustilaginodeavirens(cooke)takahashi所產生的稻曲病菌毒素對人畜具有毒害作用(楊麗敏等，2012；範允卿等，2012)。目前，已逐漸引起了專家學者對稻曲病產生菌以及所產稻曲病菌毒素的廣泛關注(王偉剛等，2009)。
稻曲病菌屬於一種寄生性較強腐生性較弱的真菌，稻曲球營養豐富，而且又暴露於自然環境中，常伴生大量的腐生細菌和真菌及其它病原菌，再加上稻綠核菌生長非常緩慢，故在培養的過程中極易受到其他病原菌的汙染，因此，相對其他真菌來說，稻綠核菌的分離成功率很低。然而在實際的分離過程中，研究人員普遍發現採用稻曲球內層組織分離法可以成功分離到稻曲病菌，但其培養時間較長，分離速度較慢，比較耗時。但該方法由於選用的是內部菌絲，雜菌較少，成功分離的機率較高。厚垣孢子懸液法，稻曲球經無菌水衝洗即可配製成厚垣孢子懸浮液，由於稻曲球表層伴有大量其他病原菌，它們的生長速度快於稻曲病菌的生長速度，極易汙染稻曲病菌，而且生長速度過快的雜菌覆蓋於少量饅頭狀的稻曲病菌單菌落上，加大分離純化的難度。稻曲球法的缺點是多種病原菌伴生於稻曲球，在培養過程中亦可迅速生長而汙染目標菌。菌核萌發法較易成功，有研究證明菌核是稻曲病菌高效分離的首選材料，但菌核形成受環境條件限制，不易收集獲取菌核；而且南方稻區少見，採用此法分離南方稻曲病菌效果並不理想。孢子振落法，由於稻曲表面不作消毒處理，稻曲表面大量的雜菌易在培養基表面快速生長，影響厚垣孢子萌發、生長及菌落的純化，同厚垣孢子懸浮液法一樣易受其他病菌汙染，不易成功獲得稻曲病菌株。
因此，在傳統的稻綠核菌只能得到一種毒素。
技術實現要素：
本發明的目的在於，提供一種可以產五種稻曲病菌毒素的產五種稻曲病菌毒素的稻綠核菌及其獲取方法。
本發明解決技術問題的技術方案為：一種產五種稻曲病菌毒素的稻綠核菌，保藏號為cctccno：m2016230，通過如下方法獲得：將採集的稻曲球病粒先用75％酒精浸泡10秒鐘，然後放於酒精燈上自燃5秒鐘，用無菌濾紙吸乾表面的水分，將表層的組織在無菌操作狀態下清理乾淨，然後用無菌手術刀將稻曲球切開，夾取中間層，接種到含終濃度為0.05g/l氯黴素的無菌psa平板培養基上，每皿接種3個點，每一樣品設3個重複，接種後的培養皿於28℃恆溫培養箱培養，待菌落長出後(3-5d)，用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落或者挑取邊緣的菌絲移至新鮮配製且已滅菌的psa平板培養基中，進行反覆純化；將純化後的菌株接種到新鮮配製的無菌psa平板上進行活化，活化後的菌株接種於50mlps的250ml三角瓶種，置於150r/min、28℃恆溫搖床中培養7-10天，即得到菌絲孢子混合液；將此混合液經四層紗布過濾後所得濾液，即為薄壁分生孢子液；採用250ml錐形瓶裝有50ml馬鈴薯蔗糖培養基，將培養的孢子接入其中，調節孢子數量為1×106個/瓶，置於150r/min、28℃恆溫搖床中培養15d，每組設3個重複，將培養15d的ps培養液混勻後離心收集上清液，取10ml上清液加入等體積二氯甲烷充分振搖，於7000r/min下離心15min，使其分層，再次收集上清液，將其配成2ml5％甲酸樣品粗提液作為待淨化液，採用pcx小柱進行淨化，優化得到以含5％甲酸為最佳上柱環境和5％氨水甲醇溶液為洗脫劑的淨化條件，根據液體培養液中毒素的含量篩選出產毒素最高的一株稻綠核菌菌株。
採用上述方法獲得的稻綠核菌可以產五種毒素，該稻曲病菌(稻綠核菌)zzy-2(ustilaginoideavirens(cke.)tak.zzy-2)已於2016年4月26日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保存中心(cctcc)保藏，其保藏號為cctccno：m2016230。
附圖說明
圖1為5種稻曲病菌所產毒素含量的測定結果。
具體實施方式
本發明一種產五種稻曲病菌毒素的稻綠核菌，保藏號為cctccno：m2016230，通過如下方法獲得：將採集的稻曲球病粒先用75％酒精浸泡10秒鐘，然後放於酒精燈上自燃5秒鐘，用無菌濾紙吸乾表面的水分，將表層的組織在無菌操作狀態下清理乾淨，然後用無菌手術刀將稻曲球切開，夾取中間層，接種到含終濃度為0.05g/l氯黴素的無菌psa平板培養基上，每皿接種3個點，每一樣品設3個重複，接種後的培養皿於28℃恆溫培養箱培養，待菌落長出後(3-5d)，用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落或者挑取邊緣的菌絲移至新鮮配製且已滅菌的psa平板培養基中，進行反覆純化；將純化後的菌株接種到新鮮配製的無菌psa平板上進行活化，活化後的菌株接種於50mlps的250ml三角瓶種，置於150r/min、28℃恆溫搖床中培養7-10天，即得到菌絲孢子混合液；將此混合液經四層紗布過濾後所得濾液，即為薄壁分生孢子液；採用250ml錐形瓶裝有50ml馬鈴薯蔗糖培養基，將培養的孢子接入其中，調節孢子數量為1×106個/瓶，置於150r/min、28℃恆溫搖床中培養15d，每組設3個重複，將培養15d的ps培養液混勻後離心收集上清液，取10ml上清液加入等體積二氯甲烷充分振搖，於7000r/min下離心15min，使其分層，再次收集上清液，將其配成2ml5％甲酸樣品粗提液作為待淨化液，採用pcx小柱進行淨化，優化得到以含5％甲酸為最佳上柱環境和5％氨水甲醇溶液為洗脫劑的淨化條件，根據液體培養液中毒素的含量篩選出產毒素最高的一株稻綠核菌菌株。
菌株鑑定：
從psa分離平板上挑取純化後的菌株接種於ps液體培養基中，於150r/min、28℃條件中培養7d後，用離心管收集菌絲後，採用報導的ctab法提取菌絲總dna，利用真菌18s引物(its1：5』-tccgtaggtgaacctgcgg-3』；ns8its4：5』-tcctccgcttattgatatgc-3』)進行pcr擴增，pcr擴增的體系為：10×taq緩衝液5μl、10pmol的its1引物和its4引物各1μl、真菌dna提取液2μl、1utaqdna聚合酶1μl、2.5mmmgcl22μl、2mmol/ldntps3μl，無菌水補足至50μl；擴增條件為：95℃變性3min，95℃1min，59℃1min，72℃延伸1min，循環35次，72℃延伸10min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，再利用pcr回收試劑盒回收純化得到目的片段，然後將擴增產物送於生工生物工程股份有限公司進行序列分析，返回的測序結果提交到genbank資料庫，獲得相應登錄號。將測序結果在ncbi資料庫利用blast軟體進行比對分析。根據篩選到的菌株序列與稻曲病菌屬菌株序列的同源性判斷篩選到的菌株是否為稻曲病菌。結果為：分離到的菌株編號為zzy-2，genbank資料庫登錄號為no.ku306368，同源性比對結果顯示，該菌株與稻綠核菌的同源性為99.9％，結合形態觀察結果，確定分離到的菌株為稻曲病菌——稻綠核菌。
毒素鑑定：
5種毒素的檢測：取培養15d的大米培養基，按米粉∶水＝1∶5的比例進行提取毒素，提取淨化後的毒素利用tsqquantumaccessmax三重四極杆質譜儀進行檢測。檢測結果如圖1。
由圖1可以看出，大米培養基中水分含量對稻曲病菌產毒效果的影響很大，其中，效果最好的2號培養基，即30g米粉中加入15ml無菌水，5種毒素(a-d，f)均有檢出，且不管是單一毒素含量還是5種毒素總含量均遠高於其他兩種培養基配比，總含量為7301.2ng/g，分離到的菌株經本實驗室分離純化的標樣進行上機檢測，該菌株在大米培養基上能夠產生5種稻曲病菌毒素，且含量很高。
本發明為稻曲病毒素的提取提供了新的不受採摘時間、發病程度限制而且雜質較少的提取源。從稻曲病菌高產毒菌株中同時獲得5種毒素純品且各種毒素及總其含量均較高的情況，目前國內未見報導。
顯然，上述實施例僅僅是為了清楚的說明所做的舉例，而並非對實施方式的限定。對於所屬領域的技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明的保護範圍內。