一種內生枯草芽孢桿菌正突變株、製備方法和製備的生防菌劑及其防治石榴幹腐病的應用的製作方法

2023-06-06 15:39:56 5

一種內生枯草芽孢桿菌正突變株、製備方法和製備的生防菌劑及其防治石榴幹腐病的應用的製作方法
【專利摘要】一種內生枯草芽孢桿菌正突變株、製備方法和製備的生防菌劑及其防治石榴幹腐病的應用，包括：(1)Bacillussubtilis（枯草芽孢桿菌）野生型菌株NS04的篩選，正突變生防菌株NS04307的紫外線誘變和選育；(2)正突變株NS04307的抑菌穩定性；(3)正突變株NS04307生防菌劑的製備方法；（4）正突變株NS04307防治植物病害的應用。該生防菌劑具有殺菌譜廣、效果好、病害不易產生抗藥性、對人、畜、農作物安全和環境友好等特點，特別對石榴幹腐病的田間防治具有較好的效果。另外對芝麻白絹病（Sclerotiumrolfsii）、蘋果黴心病（Trichotheciumroseum）、香蕉葉斑病菌喙突臍蠕孢（Exserohilumrostratum）、芝麻枯萎病（Fusariumoxysporum）、山茱萸褐斑病（Alternariaalternate）等15種不同病原菌的生長有顯著的抑制活性。
【專利說明】—種內生枯草芽孢桿菌正突變株、製備方法和製備的生防菌劑及其防治石榴幹腐病的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物農藥【技術領域】，具體涉及一種具有高抗石榴幹腐病菌活性的內生枯草芽孢桿菌正突變株NS04307及其製備以及防治石榴幹腐病的應用。
【背景技術】
[0002]石榴幹腐病是影響石榴產業的重要病害，其病原菌為石榴墊殼孢
granati (Sacc.)Petr.&Syd)異名 'Zythia versoniana Sacc.,屬於半知菌亞門iDeuteromycotina )、球殼孢目(Sphaeropsidales、。主要侵染果實和樹幹，也可以侵染石榴花器、果枝和新梢。病原菌的菌絲或分生孢子能夠在病果、病枝、病果臺上越冬，致使病果皮、病枝等成為初侵染源。當夏季雨水多時，石榴幹腐病發病情況尤其嚴重，輕者石榴產量受影響，重者石榴樹整枝或整株枯死。據統計，一般年份病果率達10%~40%，嚴重時病果率達到60%~80%，減產一般2~3成，高者達5成以上。此外，若貯藏期間溼度不適宜，造成大量爛果。可見，石榴幹腐病嚴重影響了石榴的經濟價值和觀賞價值。
[0003]目前，國內外對石榴幹腐病一般採取以農業防治技術為基礎，化學防治技術為主導的綜合防 治措施。農業防治多採用清園、套袋、加強栽培管理等。化學防治主要噴施化學農藥，常使用的農藥有甲基託布津(Thiophanate-Methyl),加瑞農可溼性粉劑(Kasumin+Bordeaux)、代森猛鋒(Mancozeb)、多菌靈(Carbendazim)、福美砷(Carbendazim)、石硫合劑(Lime sulfur)等。
[0004]化學防治在短期內的確有效，但是化學農藥造成的環境汙染問題、病原菌抗藥性問題和對人類健康的潛在威脅十分嚴重。我國耕地面積居世界第4位，但每年農藥用量高達80~100萬t，居世界之首。化學農藥對環境的影響和破壞，尤其是對地下水和食品的汙染問題已到了令人觸目驚心的地步；由於化學農藥的不合理使用，導致病原微生物產生抗藥性，致使人們更頻繁的噴施更多、更毒的農藥，產生惡性循環，極大的破壞了生態平衡和生物的多樣性。消費者對無公害農產品、綠色食品和有機食品的強烈需求，開發高效、低毒、無殘留的生物農藥已成為迫切希望。生物農藥是指利用生物產生的生物活性物質或生物活體作為農藥，以及人工合成的與天然化合物結構相同的農藥，是不汙染環境的綠色農藥，可望成為解決化學農藥殘留汙染的有效途徑之一。
[0005]但是在微生物防治植物病害的相關研究中，活體微生物農藥的有效性受到了田間環境的限制，很難在祀標部位定殖，影響殺菌效果。植物內生菌(Plant endophyte)作為生防菌株發展迅速並已成為當前微生物學研究領域的熱點，其獨具優勢的特性使其成為植物病害生物防治的一類極具應用潛能的新型資源菌。現有研究發現植物內生細菌具有穩定的生存空間，它們與宿主植物之間的關係比宿主與土壤微生物及其附生菌更加密切。一些微生物能夠分泌拮抗物質作用於病原菌的細胞膜、細胞壁、能量代謝系統及蛋白質合成系統，從而抑制或殺死病原菌。此外，內生細菌在植物體內佔據了一定的生態位點從而阻止了病原菌的入侵和定殖；內生細菌還可以與病原菌競爭養分，使病原菌得不到營養供給而死亡。目前，關於大豆、水稻、小麥、棉花、香蕉、蘋果、番茄、辣椒等作物的內生細菌研究的較多。但從植物組織內部篩選的內生菌一般抑菌效果較低，誘變育種是工業微生物育種的重要方向，而其中又以物理誘變方法中的紫外線輻射誘變使用最為普遍，其他物理誘變因子則受設備條件的限制，難以普及，因此，可以使用紫外誘變的方法選育高抗活性的正突變株，使內生生防菌在防治植物病害上有更大的應用潛力。目前有關石榴幹腐病內生菌細菌的研究在國內外還屬於空白。
[0006]綜上所述，篩選有效的內生細菌，開發新型、安全有效的微生物殺菌劑，控制石榴幹腐病的發生，是提高石榴產量，減少貯藏期石榴的損失，促進石榴產業經濟可持續發展的迫切需要。

【發明內容】

[0007]本發明需要解決的問題是利用植物內生細菌資源開發一種可用於防治石榴幹腐病及其它植物病害的廣譜、高效、可產業化生產的內生枯草芽孢桿菌正突變株生防菌劑，提供由內生菌feci77心subtilis NS04菌株為出發菌株選育的正突變菌株NS04307的方法，提供由正突變菌株NS04307製備的生防菌劑及其防治石榴幹腐病的應用方法。
[0008]為實現上述目的，本發明採用的技術方案為:
一種內生枯草芽孢桿菌正突變株，其特徵是，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisNS04307菌株，是一種防治石榴幹腐病的生防菌，其特徵在於該菌株為一株植物內生細菌正突變株，由分離自石榴葉片內部組織NS04菌株(已於2014年2月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8812)經紫外線誘變選育得到，編號為:NS04307，已於2014年2月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8813。
[0009][XI] 一種內生枯草芽孢桿菌正突變株的製備方法，其特徵是:包括以下步驟:
(一)野生型內生菌株NS04的篩選
(1)內生菌株的分離和純化
採集健康的石榴葉片稱取3.0 g，自來水洗乾淨，用無菌水衝洗3次，無菌剪刀剪成4-5mm見方的小塊後，在超淨工作檯上，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，無菌水漂洗3次，然後加30 mL無菌水在無菌研缽中研磨；研磨後靜止分層，上清液作為浸出液備用，其濃度為0.1 g/mL，取上清液I mL進行梯度稀釋至10_5，從10_3、10_4、10_5稀釋懸液中各取0.2 mL塗布平板，以最後一次漂洗液0.2 mL塗布平板進行無菌檢驗，每處理3個重複。在37°C恆溫培養箱中倒置培養24~48h，挑取單菌落在牛肉膏蛋白腖平板培養基上採用平板劃線法進行純化；純化後的菌株接種於牛肉膏蛋白腖斜面培養基，37°C培養24 h，4°C冰箱保存備用；
(2)內生生防菌株的篩選
採用平板對峙法測定內生細菌對石槽幹腐病菌{ Zythia Versoniana Sacc.)的抑制作用。首先將石榴幹腐病菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上28 °C培養至產生孢子，用接種環挑取少量的病原菌孢子點接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，在距平板中央3 cm的兩條對稱直線處劃線接種已分離的內生細菌，以只接石榴幹腐病菌為對照，每處理3個重複，28 V恆溫培養箱中培養，待對照皿中病原菌菌絲即將鋪滿全皿時，計算抑制率的大小；抑制率(％)=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/對照菌落直徑]X100 %，菌落直徑單位:釐米(cm)；
通過石榴葉片內生菌的分離純化和篩選，獲得了一株對石榴幹腐病菌有較好抑菌活性的內生菌菌株，抑制率為55.6%，編號為NS04 ；
(二)正突變菌株NS04307的製備 (4.1)野生型菌株NS04生長曲線的測定
將活化後的出發菌株配成濃度為IX 108cfu/ml的菌懸液，取20 μ I接入裝有10 ml牛肉膏蛋白腖液體培養基的試管中，共接18支，置於37 °C, 150 r/min搖床震蕩培養，從2 h後開始，每隔2 h取出一支試管放進4 1:冰箱保存，等全部取完後，用分光光度計在625 nm波長下分別測其OD值，以不接菌的牛肉膏蛋白腖液體培養基為對照，每個處理3個重複。以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪製菌株生長曲線，確定其對數生長期。研究結果表明，NS04菌株的生長曲線呈S型，0-14 h為延滯期，對數生長期為16~24 h，26 h後進入穩定期，30 h後則進入衰亡期。故選擇培養20 h對數期的NS04菌懸液進行誘變處理；
(4.2)致死率曲線的測定及野生型菌株的誘變 將NS04菌株接種於100 mL的牛肉膏蛋白腖液體培養基中，37°C培養20 h，4 000 r/min離心10 min去上清，菌體用無菌生理鹽水和0.1 mo I/L的磷酸鹽緩衝液(pH 5.8)各洗滌一次後，調節菌液濃度約IX IO8 cfu/mL。取33個培養皿，每皿加入5 mL上述菌懸液，每3個為I組，共11組。選用20 W (照射距離30 cm)的紫外燈，預熱30 min使波長穩定後，分別照射 O s、20 s、40 s、60 s、80s、100 s、120 s、140 s、160 s、180 s、200 s，然後每皿吸取 0.I mL塗平板，37 1:恆溫培養24 h，待平板上長出菌落後計數。以不經紫外線誘變的平板為對照，依據下列公式計算出每個處理的致死率，以照射時間為橫坐標、致死率為縱坐標，繪製致死率曲線。
[0010]致死率(%)=[(對照組菌落數一紫外照射後菌落數)/對照組菌落數]X 100%採用紫外照射對細菌NS04進行誘變處理，在紫外燈功率和照射距離(保持30 Cm)不變時，致死率僅與照射時間有關，且照射時間越長，誘變致死率越高。近年來研究認為，致死率在70%~80%時誘變效果較好。從致死率突變曲線可知，NS04菌株的誘變時間為260 s時致死率為75.87 %，因此選擇260 s為NS04菌株最適誘變時間；
(4.3)突變菌株的篩選
採用瓊脂塊培養法進行突變株的篩選，採用平板對峙法檢測突變株對石榴幹腐病病原菌的抑菌活性。當石榴幹腐病病原菌長滿平皿時，用無菌接種環挑取石榴幹腐病病原菌孢子，接在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，在其兩側3 cm處劃線接種誘變菌株。在同樣條件下接種出發菌株和只接石榴幹腐病菌為對照，每處理3個重複，28 °C培養7 d後測病原菌菌落直徑，觀察平板抑制作用，並計算突變菌株與出發菌株對病原菌的生長抑制率；
抑制率(％)=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/對照菌落直徑]X 100 %，菌落直徑單位:釐米(cm)；
經過篩選得到了正突變菌株NS04307，對石榴幹腐病菌的平板抑制作用明顯增強，其抑制率為80%，與出發菌株相比，抑制率提高了 30.5% ；
(4.4)正突變菌株NS04307的抑菌穩定性測定
將NS04307菌株在牛肉膏蛋白腖斜面培養基上傳代，共傳10次，並在相同條件下對每一代的菌株做平板對峙實驗，NS04307的抑菌率在71.95%~80.00%，該菌株對石榴幹腐病的抑制率保持穩定，說明NS04307突變菌株對石榴幹腐病菌的抑制作用能穩定遺傳。
[0011]一種內生枯草芽孢桿菌正突變株在防治其他真菌病害中的應用，其特徵是:所述的內生枯草芽孢桿菌突變株NS04307在防治芝麻白絹病iSclerotium ro7/^ii)、蘋果黴心病(Trichothecium roseum)、香蕉葉斑病菌_突胳螺抱(MxserohiIum rostraturn)、芝麻枯萎病{Fusari um oxysporum )、山茱萸褐斑病(Alterrmria al terna )、香蕉褐緣灰斑病iPseudocercospora musae ) >玉蜀黍赤黴菌(JJibberella zeae ) >山茱萸葉枯病iPeyronellaea glomera ia )、大葉黃楊炭疽病(Cb77<9 ? o tri chum sp.)、山茱萸擬盤多毛葉斑病 iPestalotiopsis foedans)、甘鹿鳳梨病(?ielaviopsis paradoxa)、玉米穗腐病致病性木賊鐮刀菌iFusarium equise ii )、玉米穗腐病致病串珠鐮刀菌(6?bberellamoni Iiformis )、玉米穗腐病致病層出鐮刀菌(Mt sari um prolifera turn )中的應用。
[0012]根據所述內生枯草芽孢桿菌正突變株製備的生防菌劑，其特徵是，挑取活化的NS04307菌株，接種到IOmL馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)中，37 °C, 180 r/min搖床培養，24 h，作為種子液；根據測定結果將種子液按1% (v/v)的比例接種於含200 mL PDB培養基的IL三角瓶中；37 °C，180 r/min搖床培養，72 h，得到發酵液，將發酵液稀釋10倍，濃度為
1.3X108cfu/mL,再在發酵液中添加3% (W/V)表面活性劑0P-10，充分混勻後獲得NS04307菌株的生防菌劑。
[0013]根據所述的內生枯草芽孢桿菌正突變株及其生防菌劑在防治石榴幹腐病中的應
用。
[0014]根據所述的內生枯草芽孢桿菌正突變株及其生防菌劑在防治石榴幹腐病中的應用，其特徵是，包括以下兩個方面:
(I )NS04307菌株室內果實離體防效試驗:將NS04307生防菌於牛肉膏蛋白腖培養液37V, 180 r/min振蕩培養72 h, 4 000 r/min離心10 min,棄上清,菌體用無菌水稀釋至IO8個/mL後備用；培養好的病原菌孢子用無菌水稀釋至IO8個/mL ;將石榴果實表面用75 %酒精消毒處理並自然晾乾；用滅菌的5孔接種針在石榴果實腰部等距離地刺2處傷口，噴霧接種生防菌菌懸液及病原菌孢子懸液；該試驗設3個實驗組，每組3個處理，處理1:先接病原菌孢子懸液，24 h後再接生防菌菌懸液；處理2:先接生防菌菌懸液，24 h後再接病原菌孢子懸液；處理3:先接病原菌孢子懸液，待傷口晾乾後立即接生防菌菌懸液；每處理5個果實，重複4次，以只接病原菌的處理為對照組；待其自然晾乾後，將各處理的果實置於28 °C,RH 90%恆溫恆溼培養箱中貯存,待接種9 d後觀察並統計石榴幹腐病的發病情況，用十字交叉法測定病斑直徑，最後計算抑制率；結果表明:NS04307生防菌株各處理對石榴幹腐病都有很好的防治作用；處理I的抑制率為75.08 %，處理2和處理3對石榴幹腐病的抑制率差異不顯著，分別為53.80 %和58.82 %，說明NS04307菌株對石榴幹腐病有很好的治療作用和保護作用；
(2)NS04307生防菌劑大田防治石榴幹腐病試驗:於6月底7月初開始防治石榴幹腐病，在所選的石榴園將上述製備好的生防菌劑進行噴施。試驗採用隨機化完全區組設計進行，從田間東、南、西、北和中部五個點選各取9株石榴果樹，分為3組，每3棵樹為I組，其中I組噴施NS04307生防菌劑，I組噴施60%代森錳鋅可溼性粉劑，一組噴施清水作為對照。每隔10 d重複施藥，連續3次，最後一次施藥後第15d調查果實發病情況，對病害進行分級，計算病情指數和發病率。結果顯示:NS04307菌株生防菌劑在大田對石榴幹腐病的防效可達65.15%，極顯著優於果農田間目前使用的化學藥劑代森錳鋅6.17%。
[0015]本發明採用的細菌是以分離自植物石槽葉片組織的內生細菌subtil isNS04菌株為野生型菌株，按照常規方法以野生型NS04菌株為出發菌株，經紫外線誘變進行選育得到了高抗的正突變菌株，編號為NS04307。保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年I月26日，保藏號為CGMCC NO 8813。
[0016]本發明按照常規方法製備，以正突變株NS04307作為生產菌株，通過液體發酵和在發酵液中添加表面活性劑，製備NS04307菌株的生防菌劑；通過室內平板實驗，評價其對其它植物病原真菌菌絲生長的抑制作用；通過石榴果實離體防效試驗、大田試驗，評價其對石榴幹腐病的防效。
[0017]本產品發明的優點及效果:本發明具有穩定的、高活性的內生正突變細菌一Bacillus subti I is NS04307，該菌株培養方法簡單；NS04307菌株發酵過程所用原料主要為馬鈴薯和蔗糖，成本較低；由NS04307菌株發酵製備的生防菌劑方法簡單，完全沒有因化學農藥使用所帶來的一系列問題，因而有利於作物的無公害生產，對人畜無害、對農作物無藥害，綠色環保，且大田中對石榴幹腐病有顯著防效，對其它15種病原菌引起的植物病害也有較好的抑制作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為NS04菌株生長曲線。
[0019]圖2為NS04菌株的致死率曲線。
[0020]圖3為NS04307菌株對石榴幹腐病病菌的平板抑制作用。圖3中A:石榴幹腐病病原菌；B:野生型菌株NS04對石榴幹腐病的平板抑制作用；C:突變菌株NS04307對石榴幹腐病的平板抑制作用。
[0021]圖4 NS04307菌株的抑菌穩定性。
【具體實施方式】
[0022]本發明枯草芽孢桿菌subtil is NS04307菌株，是一種防治石榴幹腐病的生防菌，其特徵在於該菌株為一株植物內生細菌正突變株，由分離自石榴葉片內部組織NS04菌株(於2014年I月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8812)經紫外線誘變選育得到，編號為:NS04307，己於2014年I月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8813。
[0023]所述的NS04菌株作為野生型菌株，通過紫外線誘變選育得到該菌株的正突變株NS04307，該突變株的抗石榴幹腐病菌活性可達71.95%~80%，比野生型菌株的抗石榴幹腐病活性提聞了 30.5%。
[0024]所述的內生枯草芽孢桿菌的突變株NS04307的製備方法，其特點是先根據野生型菌株NS04的生長曲線，研究出該菌株的致死率曲線，得出最佳誘變條件，再通過紫外線誘變和產量型突變菌株的篩選方法得到突變菌株NS04307。
[0025]所述的內生枯草芽孢桿菌突變株NS04307抑菌性能的穩定性，其特點是該突變菌株對石榴幹腐病菌的抑菌性能穩定，連續移接培養10代，其抑菌活性沒有發生變化。
[0026]所述的內生枯草芽孢桿菌的突變株NS04307的生防菌劑的製備方法。
[0027]所述的生防菌劑在防治石榴幹腐病中的應用。
[0028]所述的內生枯草芽孢桿菌突變株NS04307在防治芝麻白絹病iSclerotiumrolfsi i)、蘋果黴心病(Tri cho theci um roseum )、香蕉葉斑病菌_突胳螺抱iExserohi Iumriosira乙應)、芝麻才古萎病(/7W1Sari應 oxysporum)、山茱萸褐斑病alternate、、香蕉褐緣灰斑病{Pseudocercospora musae)、玉蜀黍赤黴菌((?'bberella zeae)、山茱萸葉枯病QPeyronellaea glomera ia )、大葉黃楊炭疽病(Cb77<9 ? o tri chum sp.)、山茱萸擬盤多毛葉斑病 iPes talo ti opsi s foedans )、甘鹿鳳梨病(?i ela vi opsi s paradoxa )、玉米穗腐病致病性木賊鐮刀菌iFusarium equise ii )、玉米穗腐病致病串珠鐮刀菌(6?bberellamoni Iiformis )、玉米穗腐病致病層出鐮刀菌(Mt sari um prolifera turn )中的應用。
[0029]下面結合附圖和實施例來進一步講述本發明，但本發明的內容並不局限於此。
[0030]實施例1:野生型內生菌株NS04的篩選
1.內生菌株的分離和純化 採集健康的石榴葉片稱取3.0 g，自來水洗乾淨，用無菌水衝洗3次，無菌剪刀剪成4-5mm見方的小塊後，在超淨工作檯上，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，無菌水漂洗3次，然後加30 mL無菌水在無菌研缽中研磨；研磨後靜止分層，上清液作為浸出液備用，其濃度為0.1 g/mL，取上清液I mL進行梯度稀釋至10_5，從10_3、10_4、10_5稀釋懸液中各取0.2 mL塗布平板，以最後一次漂洗液0.2 mL塗布平板進行無菌檢驗，每處理3個重複。在37°C恆溫培養箱中倒置培養24~48h，挑取單菌落在牛肉膏蛋白腖平板培養基上採用平板劃線法進行純化；純化後的菌株接種於牛肉膏蛋白腖斜面培養基，37°C培養24 h，4°C冰箱保存備用。
[0031]2.內生生防菌株的篩選
採用平板對峙法測定內生細菌對石槽幹腐病菌{ Zythia Versoniana Sacc.)的抑制作用。首先將石榴幹腐病菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上28 °C培養至產生孢子，用接種環挑取少量的病原菌孢子點接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，在距平板中央3 cm的兩條對稱直線處劃線接種已分離的內生細菌，以只接石榴幹腐病菌為對照，每處理3個重複，28 V恆溫培養箱中培養，待對照皿中病原菌菌絲即將鋪滿全皿時，計算抑制率的大小。
[0032]抑制率(％ )=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/對照菌落直徑]X 100 %，菌落直徑單位:釐米(cm)。
[0033]通過石榴葉片內生菌的分離純化和篩選，獲得了一株對石榴幹腐病菌有較好抑菌活性的內生菌菌株，抑制率為55.6%，編號為NS04。
[0034]3.內生生防菌株NS04的鑑定
3.1 NS04菌株的形態學、生理生化特性
NS04菌株在NA平板培養基上菌落直徑約為0.76 cm,白色，不透明，不規則狀，隆起，邊緣裂葉狀，隨培養時間延長菌落表面出現褶皺。NS04單個細胞呈短杆狀，
0.63^0.87X 1.75^2.51 μ m，單生或對生，革蘭氏染色陽性，有橢圓形或柱狀芽孢。NS04菌株和枯草芽孢桿菌(ifeciBiAs的生理生化特性基本一致(表1)。
[0035]表1內生生防菌NS04菌株生理生化特徵
【權利要求】
1.一種內生枯草芽孢桿菌正突變株，其特徵是，枯草芽孢桿菌subtil isNS04307菌株，是一種防治石榴幹腐病的生防菌，其特徵在於該菌株為一株植物內生細菌正突變株，由分離自石榴葉片內部組織NS04菌株(已於2014年2月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8812)經紫外線誘變選育得到，編號為:NS04307，已於2014年2月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8813。
2.一種內生枯草芽孢桿菌正突變株的製備方法，其特徵是:包括以下步驟: (一)野生型內生菌株NS04的篩選 (1)內生菌株的分離和純化 採集健康的石榴葉片稱取3.0 g，自來水洗乾淨，用無菌水衝洗3次，無菌剪刀剪成4-5mm見方的小塊後，在超淨工作檯上，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，無菌水漂洗3次，然後加30 mL無菌水在無菌研缽中研磨；研磨後靜止分層，上清液作為浸出液備用，其濃度為0.1 g/mL，取上清液I mL進行梯度稀釋至10_5，從10_3、10_4、10_5稀釋懸液中各取0.2 mL塗布平板，以最後一次漂洗液0.2 mL塗布平板進行無菌檢驗，每處理3個重複；在37°〇恆溫培養箱中倒置培養24-48 h，挑取單菌落在牛肉膏蛋白腖平板培養基上採用平板劃線法進行純化；純化後的菌株接種於牛肉膏蛋白腖斜面培養基，37°C培養24 h，4°C冰箱保存備用； (2)內生生防菌株的篩選 採用平板對峙法測定內生細菌對石槽幹腐病菌{ Zythia Versoniana Sacc.)的抑制作用；首先將石榴幹腐病菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上28 °C培養至產生孢子，用接種環挑取少量的病原菌孢子點接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，在距平板中央3 cm的兩條對稱直線處劃線接種已分離的內生細菌，以只接石榴幹腐病菌為對照，每處理3個重複，28 V恆溫培養箱中培養，待對照皿中病原菌菌絲即將鋪滿全皿時，計算抑制率的大小； 抑制率(％)=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/對照菌落直徑]X 100 %，菌落直徑單位:釐米(cm)； 通過石榴葉片內生菌的分離純化和篩選，獲得了一株對石榴幹腐病菌有較好抑菌活性的內生菌菌株，抑制率為55.6%，編號為NS04 ； (二)正突變菌株NS04307的製備 (4.1)野生型菌株NS04生長曲線的測定 將活化後的出發菌株配成濃度為IX 108cfu/ml的菌懸液，取20 μ I接入裝有10 ml牛肉膏蛋白腖液體培養基的試管中，共接18支，置於37 °C, 150 r/min搖床震蕩培養，從2 h後開始，每隔2 h取出一支試管放進4 1:冰箱保存，等全部取完後，用分光光度計在625 nm波長下分別測其OD值，以不接菌的牛肉膏蛋白腖液體培養基為對照，每個處理3個重複；.以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪製菌株生長曲線，確定其對數生長期；結果表明，NS04菌株的生長曲線呈S型，0-14 h為延滯期，對數生長期為16~24 h，26 h後進入穩定期，30 h後則進入衰亡期；7.故選擇培養20 h對數期的NS04菌懸液進行誘變處理； (4.2)致死率曲線的測定及野生型菌株的誘變 將NS04菌株接種於100 mL的牛肉膏蛋白腖液體培養基中，37°C培養20 h，4 000 r/min離心10 min去上清，菌體用無菌生理鹽水和0.1 mo I/L的磷酸鹽緩衝液(pH 5.8)各洗滌一次後，調節菌液濃度約I X IO8 cfu/mL ;取33個培養皿，每皿加入5 mL上述菌懸液，每3個為I組，共11組；選用20W (照射距離30 cm)的紫外燈，預熱30 min使波長穩定後，分別照射O s、20 s、40 s、60 s、80s、100 s、120 s、140 s、160 s、180 s、200 s，然後每皿吸取 0.I mL 塗平板，37 1:恆溫培養24 h，待平板上長出菌落後計數；以不經紫外線誘變的平板為對照，依據下列公式計算出每個處理的致死率，以照射時間為橫坐標、致死率為縱坐標，繪製致死率曲線.致死率(%)=[(對照組菌落數一紫外照射後菌落數)/對照組菌落數]X100% 採用紫外照射對細菌NS04進行誘變處理，在紫外燈功率和照射距離(保持30 Cm)不變時，致死率僅與照射時間有關，且照射時間越長，誘變致死率越高；致死率在70%~80%時誘變效果較好；從致死率突變曲線可知，NS04菌株的誘變時間為260 s時致死率為75.87 %，選擇260 s為NS04菌株最適誘變時間； (4.3)突變菌株的篩選 採用瓊脂塊培養法進行突變株的篩選，採用平板對峙法檢測突變株對石榴幹腐病病原菌的抑菌活性；當石榴幹腐病病原菌長滿平皿時，用無菌接種環挑取石榴幹腐病病原菌孢子，接在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板中央，在其兩側3 cm處劃線接種誘變菌株；在同樣條件下接種出發菌株和只接石榴幹腐病菌為對照，每處理3個重複，28 °C培養7 d後測病原菌菌落直徑，觀察平板抑制作用，並計算突變菌株與出發菌株對病原菌的生長抑制率； 抑制率(％)=[(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/對照菌落直徑]X 100 %，菌落直徑單位:釐米(cm)； 經過篩選得到了正突變菌株NS04307，對石榴幹腐病菌的平板抑制作用明顯增強，其抑制率為80%，與出發菌株相比，抑制率提高了 30.5% ； (4.4)正突變菌株NS04307的抑菌穩定性測定 將NS04307菌株在牛肉膏蛋白腖斜面培養基上傳代，共傳10次，並在相同條件下對每一代的菌株做平板對峙實驗，NS04307的抑菌率在71.95%~80.00%，該菌株對石榴幹腐病的抑制率保持穩定，說明NS04307突變菌株對石榴幹腐病菌的抑制作用能穩定遺傳。
3.根據權利要求1所述的一種內生枯草芽孢桿菌正突變株在防治其他真菌病害中的應用，其特徵是:所述的內生枯草芽孢桿菌突變株NS04307在防治芝麻白絹病應rolfsii)、蘋果黴心病(Trichothecium roseum)、香蕉葉斑病菌_突胳螺抱iExserohiIumriosira乙應)、芝麻才古萎病(/7W1Sari應 oxysporum)、山茱萸褐斑病alternate、、香蕉褐緣灰斑病{Pseudocercospora musae)、玉蜀黍赤黴菌((?'bberella zeae)、山茱萸葉枯病QPeyronellaea glomera ia )、大葉黃楊炭疽病(Cb77<9?o trichum sp.)、山茱萸擬盤多毛葉斑病 iPestalotiopsis foedans)、甘鹿鳳梨病(?ielaviopsis paradoxa )、玉米穗腐病致病性木賊鐮刀菌iFusarium equise ii )、玉米穗腐病致病串珠鐮刀菌(6?bberellamoni Iiformis )、玉米穗腐病致病層出鐮刀菌(Mt sari um prolifera turn )中的應用。
4.根據權利要求1所述內生枯草芽孢桿菌正突變株製備的生防菌劑，其特徵是，挑取活化的NS04307菌株，接種到IOmL馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)中，37 °C, 180 r/min搖床培養，24 h，作為種子液；根據測定結果將種子液按1% (v/v)的比例接種於含200 mL PDB培養基的IL三角瓶中；37 °C，180 r/min搖床培養，72 h，得到發酵液，將發酵液稀釋10倍，濃度為1.3 X IO8 cfu/mL,再在發酵液中添加3% (W/V)表面活性劑0P-10，充分混勻後獲得NS04307菌株的生防菌劑。
5.根據權利要求1和4所述的內生枯草芽孢桿菌正突變株及其生防菌劑在防治石榴幹腐病中的應用。
6.根據權利要求5所述的內生枯草芽孢桿菌正突變株及其生防菌劑在防治石榴幹腐病中的應用，其特徵是，包括以下兩個方面: (I )NS04307菌株室內果實離體防效試驗:將NS04307生防菌於牛肉膏蛋白腖培養液37V, 180 r/min振蕩培養72 h, 4 000 r/min離心10 min,棄上清,菌體用無菌水稀釋至IO8個/mL後備用；培養好的病原菌孢子用無菌水稀釋至IO8個/mL ;將石榴果實表面用75 %酒精消毒處理並自然晾乾；用滅菌的5孔接種針在石榴果實腰部等距離地刺2處傷口，噴霧接種生防菌菌懸液及病原菌孢子懸液；該試驗設3個實驗組，每組3個處理，處理1:先接病原菌孢子懸液，24 h後再接生防菌菌懸液；處理2:先接生防菌菌懸液，24 h後再接病原菌孢子懸液；處理3:先接病原菌孢子懸液，待傷口晾乾後立即接生防菌菌懸液；每處理5個果實，重複4次，以只接病原菌的處理為對照組；待其自然晾乾後，將各處理的果實置於28 °C,RH 90%恆溫恆溼培養箱中貯存,待接種9 d後觀察並統計石榴幹腐病的發病情況，用十字交叉法測定病斑直徑，最後計算抑制率；結果表明:NS04307生防菌株各處理對石榴幹腐病都有很好的防治作用；處理I的抑制率為75.08 %，處理2和處理3對石榴幹腐病的抑制率差異不顯著，分別為53.80 %和58.82 %，說明NS04307菌株對石榴幹腐病有很好的治療作用和保護作用； (2) NS04307生防菌劑大田防治石榴幹腐病試驗:於6月底7月初開始防治石榴幹腐病，在所選的石榴園將上述製備好的生防菌劑進行噴施；試驗採用隨機化完全區組設計進行，從田間東、南、西、北和中部五個點選各取9株石榴果樹，分為3組，每3棵樹為I組，其中I組噴施NS04307生防菌劑，I組噴施60%代森錳鋅可溼性粉劑，一組噴施清水作為對照；每隔10 d重複施藥，連續3次，最後一次施藥後第15d調查果實發病情況，對病害進行分級，計算病情指數和發病率；結果顯示:NS04307菌株生防菌劑在大田對石榴幹腐病的防效可達65.15%，極顯著優於果農田間目前使用的化學藥劑代森錳鋅6.17%。
【文檔編號】C12N1/20GK104017749SQ201410144902
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年4月13日 優先權日:2014年4月13日
【發明者】譚小豔, 馬耀華, 黃思良, 劉晶, 張盼盼, 牛小瑞, 羅偉 申請人:棗莊學院