載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化矽納米粒的製備方法

2023-06-06 11:24:41

載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化矽納米粒的製備方法
【專利摘要】本發明涉及載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化矽納米粒的製備方法，所述方法包括：稱取氨基修飾介孔二氧化矽納米粒，分散到白藜蘆醇飽和乙醇溶液中，常溫下避光攪拌，每隔20～30min超聲處理3～5min，攪拌2～3h使H2N-MSN充分吸附RES飽和乙醇溶液，然後15000～20000r·min-1離心20～30min，將離心得到的白色固體35～45℃減壓乾燥，得到載藥粉末；重複上述分散、吸附、離心、乾燥操作7～8次，即得所述載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化矽納米粒。本發明改良的經典Stober法成功合成了NH2-MSN，通過反覆飽和溶液吸附法能夠有效提高載藥量，製備得到NH2-MSN-RES提高了RES的生物利用度，具有較好市場前景。
【專利說明】載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化矽納米粒的製備方法 (一）

【技術領域】
[0001] 本發明涉及載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化矽納米粒的製備方法。 (二）

【背景技術】
[0002] 白藜蘆醇（Resveratrol，RES)為蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.乾燥根莖及根中提取出來的一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物[1]。研究證明， RES不僅有抗炎、抗血栓等功效[2]，而且RES通過抗氧化、抗突變、抑制環加氧酶和氫過氧化 物酶的活性，抑制癌細胞的生長和增殖、誘導癌細胞的分化和凋亡，被喻為繼"紫杉醇"之後 又一新的綠色抗癌物質。但是，由於其理化性質不穩定、極難溶於水、半衰期短等特性，致口 服製劑的生物利用度較低、血藥濃度不穩定，嚴重限制其臨床應用。
[0003] 納米粒載體作為一種新型藥物傳遞系統，將藥物包載於納米粒中，一方面可以提 高藥物穩定性，具有緩控釋特性，另一方面可以增加生物膜透過性、改變藥物體內分布、提 高生物利用度等。其中，介孔二氧化娃（Mesoporous Silica Nanoparticles，MSN)作為一 種新型的介孔材料，其巨大的比表面積和比孔容可有效的提高載藥量，介孔結構和孔徑調 節藥物釋放特性，豐富的表面矽羥基極易修飾或改性，並且MSN具有良好的生物相容性，使 其在藥物載體領域具有優良的研究前景。 (三）


【發明內容】

[0004] 本發明提供一種氨基改性的介孔二氧化娃（Amino-modified Mesoporous Silica Particles，NH2-MSN)為載體材料，製備新型口服氨基改性介孔二氧化矽載白藜蘆醇納米粒 (NH 2-MSN-RES)的方法，為RES納米製劑的研究提供參考。
[0005] 本發明採用的技術方案是：
[0006] 載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化矽納米粒的製備方法，所述方法包括：（1)稱 取氨基修飾介孔二氧化矽納米粒（H 2N-MSN),分散到白藜蘆醇（RES)的飽和乙醇溶液中，氨 基修飾介孔二氧化矽納米粒與白藜蘆醇飽和乙醇溶液用量之比為IOOmg :20?25mL，常溫 下避光攪拌，每隔20?30min超聲處理3?5min，攪拌2?3h使H2N-MSN充分吸附RES飽 和乙醇溶液，然後15000?20000r · mirf1離心20?30min，將離心得到的白色固體35? 45°C減壓乾燥，得到載藥粉末；（2)重複步驟（1)操作8?9次，即得所述載白藜蘆醇的氨基 修飾介孔二氧化矽納米粒。本發明採用反覆飽和溶液吸附法來製備H 2N-MSN-RES,經實驗發 現，隨著吸附次數的增加，H2N-MSN載入RES的量不斷增加，吸附8次之後，載入藥量基本不 變，因此，本發明確定了反覆飽和溶液吸附法來製備H 2N-MSN-RES的吸附次數為8?9次。
[0007] 優選的，所述氨基修飾介孔二氧化矽納米粒按如下方法製備得到：將CTAB (十六 烷基三甲基溴化銨）溶解於超純水中，加入適量2M NaOH溶液，80?85 °C恆溫攪拌2? 3h，然後快速加入適量TEOS (正矽酸乙酯），30min後緩慢恆速滴入適量APTES (3-氨丙 基三乙氧基矽烷），控制5min內滴畢，恆溫繼續反應2?3h，反應結束後靜置熟化24h， 15000?20000r · mirf1離心20?30min得到白色固體，將離心得到的白色固體分散於濃 度為IOmg .mr1的NH4NO3乙醇溶液中80°C回流4?5h，經過6次反覆操作去除CTAB後，再 經離心、真空乾燥，得到白色粉末，即為所述氨基修飾介孔二氧化矽納米粒。本發明在經典 Stober法製備MSN基礎上，改良了經典Stober法，進行一步合成H2N-MSN,製得H2N-MSN氨 基成功修飾，呈圓整球形，分布均一，粒徑為98. 4±2. 8nm，Zeta電位13. 2±L 8mv，在0? 20ug · ml/1範圍內，對Cac〇-2細胞無明顯的毒性。
[0008] 具體的，所述CTAB :水：2M NaOH溶液：TEOS :APTES用量之比為L Og :400? 500mL :3 ?5mL :2 ?4mL :1 ?3mL〇
[0009] 本發明的有益效果主要體現在：本發明改良的經典Stober法成功合成了 NH2-MSN,通過反覆飽和溶液吸附法能夠有效提高載藥量，製備得到的NH2-MSN-RES提高了 RES的生物利用度，具有較好市場前景。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1為H2N-MSN的TEM圖；A為除模板劑之前，B為除模板劑之後；正常觀察為放大 12k倍，觀察介孔結構為放大40k倍；
[0011] 圖 2 為粒徑分布圖；A :MSN，B :H2N-MSN ;
[0012] 圖 3 為 Zeta 電位分布圖；A :MSN，B :H2N-MSN ;
[0013] 圖4為紅外光譜圖；
[0014] 圖5為反覆飽和吸附次數-重量變化曲線；(H2N-MSN-RES) i為載體吸附藥物飽和 溶液的吸附次數-載體重量變化曲線，（H2N-MSN) i為載體吸附空白溶液的吸附次數-載體 重量變化曲線，（H2N-MSN-RES) ^ (H2N-MSN) i為載入載體的藥物吸附次數-重量變化曲線， (H2N-MSN) ^ (H2N-MSN) η為載體吸附次數-重量損失變化曲線（i = 1，2, 3, 4, 5···);
[0015] 圖6為MSN和H2N-MSN對Caco-2細胞的毒性；
[0016] 圖7為體外釋藥曲線；
[0017] 圖8為跨Caco-2單層細胞轉運的藥物濃度-時間曲線；A為AP - BL，B為 BL - AP);
[0018] 圖9為大鼠灌胃後的血藥濃度-時間曲線（η = 6)。 (五）

【具體實施方式】
[0019] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於 此：
[0020] 實施例1 :
[0021] 1儀器與材料
[0022] I. 1 儀器
[0023] Waters高效液相色譜儀（Waters e2695四兀泵，2998 PDA檢測器，美國Waters公 司）；
[0024] Nano-ZS 90雷射粒度分析儀（英國Malvern儀器有限公司）；
[0025] Optima MAX超速低溫離心機（美國Beckman Coulter有限公司）；
[0026] Mill-Q超純水儀（美國Millpore公司）；
[0027] PH 酸度計（瑞士 Mettler-Toledo 公司）；
[0028] JEM-1200EX透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；
[0029] Vector 22傅立葉紅外光譜儀（德國BRUKER公司）；
[0030] TRISTAR II3020全自動比表面和孔隙分析儀（美國Micromeritics儀器公司）；
[0031] Rigaku D/max 2550PC全自動多晶X射線衍射儀（日本理學電機株式會社）；
[0032] Thermo Forma 超低溫冰箱（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；
[0033] TGL-16B高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；
[0034] KQ5200DE型數控超聲儀（崑山市超聲儀器有限公司）；
[0035] CP22?電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；
[0036] SCIENTZ- II D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；
[0037] DF-101S集熱式恆溫加熱磁力攪拌器（鄭州科創儀器有限公司）；
[0038] HZ-9212S恆溫振蕩器（太倉市科教器材廠）；
[0039] V0RTEX-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器製造有限公司）；等。
[0040] 1.2藥品與試劑
[0041] 白藜蘆醇（南京澤朗醫藥科技有限公司，純度>98% );
[0042] 白藜蘆醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，11535-200502);
[0043] 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)、正矽酸四乙酯（TEOS)、3_氨丙基三乙氧基矽烷 (APTES)(阿拉丁試劑@上海晶純生化科技股份有限公司）；
[0044] 0· 25%胰蛋白酶，D-Hanks緩衝液（美國Gibco公司）；
[0045] DMEM(含有4. 5g · Γ1葡萄糖、3. 7g · Γ1碳酸氫鈉、10%胎牛血清、1 %非必需氨基 酸、1 %穀氨醯胺、100U · mr1青黴素和100 μ g · mr1鏈黴素）（杭州吉諾生物醫藥技術有限 公司）；
[0046] 甲醇（美國Honeywell Burdick&Jackson公司），其他試劑均為分析純。
[0047] 1.3實驗動物與細胞
[0048] 清潔級SD大鼠18隻，雌雄兼用，體重（280±20)g(浙江中醫藥大學實驗動物中心 提供，SCXK滬2012-0002) ;Cac〇-2細胞（浙江中醫藥大學實驗動物中心凍存，原購於中國 科學院上海細胞研究所）；
[0049] 2 方法
[0050] 2. I H2N-MSN 的製備
[0051] 依據經典Stober法製備MSN,在此基礎上，本實驗改良了經典Stober法，並一步 合成4^]\^^1.(^〇^8溶解於4801^超純水中，加入3.51^21恥0!1溶液，801：恆溫攪拌 2h，然後快速加入3mL TE0S，30min後緩慢恆速滴入2mL APTES，控制5min滴畢，恆溫繼續反 應2h，反應結束後靜置熟化24h，15000r MirT1離心30min得到的白色固體。將離心得到的 白色固體分散於200mL NH4N03(10mg · ml/1)的乙醇溶液中80°C回流4h，經過6次反覆操作 去除模板劑CTAB，最後一次離心後真空乾燥，得到白色粉採用透射電鏡（TEM) 分別對MSN、H 2N-MSN進行觀察，粒徑儀測定粒徑及Zeta電位，傅立葉紅外光譜儀（FTIR)表 徵H2N-MSN上的修飾氨基。
[0052] 2. 2 H2N-MSN-RES 的製備
[0053] 本發明採用反覆飽和溶液吸附法來製備H2N-MSN-RES :稱取IOOmgH2N-MSN(記為 Wltl)分散到RES飽和乙醇溶液20mL中，常溫25°C避光攪拌，每隔30min短時超聲3min，攪 拌2h使H2N-MSN充分吸附RES飽和乙醇溶液，然後15000r · miiT1離心30min，將離心得到 的白色固體35°C減壓乾燥後稱重（記為W11)，然後重複分散、吸附、離心、乾燥、稱重，每重複 一次的稱重分別記為W 12、W13、W14……。同樣，稱取IOOmg H2N-MSN分散到乙醇溶液20mL中， 除了不加入RES外，其他同法操作，每次稱重分別記為W tll Jtl2 Wtl4……，按照相同的方法 製備對照組MSN-RES。
[0054]

【權利要求】
1. 載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化矽納米粒的製備方法，所述方法包括：（1)稱 取氨基修飾介孔二氧化矽納米粒，分散到白藜蘆醇飽和乙醇溶液中，氨基修飾介孔二氧化 矽納米粒與白藜蘆醇飽和乙醇溶液用量之比為lOOmg :20?25mL，常溫下避光攪拌，每隔 20?30min超聲處理3?5min，攪拌2?3h使氨基修飾介孔二氧化娃納米粒充分吸附白 藜蘆醇飽和乙醇溶液，然後15000?20000r 離心20?30min，將離心得到的白色固 體35?45°C減壓乾燥，得到載藥粉末；（2)重複步驟（1)操作7?8次，即得所述載白藜蘆 醇的氨基修飾介孔二氧化矽納米粒。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述氨基修飾介孔二氧化矽納米粒按如下方 法製備得到：將CTAB溶解於超純水中，加入適量2M NaOH溶液，80?85°C恆溫攪拌2?3h， 然後快速加入適量TEOS，30min後緩慢恆速滴入適量APTES，控制5min內滴畢，恆溫繼續反 應2?3h，反應結束後靜置熟化24h，15000?20000r ? mirT1離心20?30min得到白色固 體，將離心得到的白色固體分散於濃度為l〇mg 的NH4N03乙醇溶液中80°C回流4?5h， 經過6次反覆操作去除CTAB後，再經離心、真空乾燥，得到白色粉末，即為所述氨基修飾介 孔二氧化矽納米粒。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述CTAB :水：2M NaOH溶液：TEOS :APTES用 量之比為 1. 〇g :400 ?500mL :3 ?5mL :2 ?4mL :1 ?3mL。
【文檔編號】A61P29/00GK104367552SQ201410617866
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月5日 優先權日:2014年11月5日
【發明者】李範珠, 王國偉, 張蓉蓉, 阮葉萍, 郭曼曼, 徐駿軍, 費偉東, 韓順平, 劉洋洋 申請人:浙江中醫藥大學