檢測高血壓相關的線粒體dnaa4401g突變的試劑盒及應用的製作方法
2023-06-06 14:42:11
專利名稱:檢測高血壓相關的線粒體dna a4401g突變的試劑盒及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域：
，涉及用於檢測與原發性高血壓相關的線粒體DNA A4401G突變的試劑盒，還涉及一種與原發性高血壓相關的線粒體基因突變的檢測方法，特別涉及檢測線粒體tRNAeln/tRNAMrt A4401G突變的方法，以及上述方法或上述的試劑盒在檢測與原發性高血壓相關的線粒體DNA A4401G突變中的應用。
背景技術：
心血管疾病是全球範圍造成死亡的最主要原因，包括冠心病、高血壓、心臟病、中風、心肌病和心力衰竭等一系列涉及循環系統(主要是心臟和血管)的疾病。世界衛生組織(WHO)統計，2008年約有1730萬人死於心血管病，佔全球死亡人口的30%。《中國心血管病報告2011》顯示，目前我國心血管病患者高達2. 3億，其中高血壓患者1. 6億。每年約300萬人死於心血管疾病，其中冠心病死亡人數約100萬。心血管疾病已成為我國嚴重的健康安全問題，給國家和社會帶來巨大負擔。心血管疾病是一類複雜性疾病，由遺傳因素、環境因素或兩者相互作用所致。部分高血壓疾病呈母系遺傳特徵，提示mtDNA異常可能是這些高血壓疾病發病的分子基礎之一。近兩年來，我們課題研究組發現原發性高血壓與線粒體DNA (Mitochondria DNA, mtDNA)突變存在相關性。在世界上首次發現了由母系遺傳的線粒體基因功能缺陷造成原發性高血壓的致病機理。這些基因缺陷包括tRNAIle A4263G、tRNAGln/tRNAMet A4401G、tRNAMet A4435G等突變，詮釋了母系遺傳性高血壓的發病機制，為高血壓的早期診斷、幹預和防治提供了新的理論依據。
與線粒體相關的原發性高血壓在早期臨床症狀不明顯，早期的檢查常常會因此被耽誤，尤其在我國偏遠農村地區，這種情況普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中開展mtDNA突變篩查，對於預防和控制與線粒體相關的原發性高血壓的發生有著極其重要的作用。
自發現與mtDNA突變相關的疾病以來，檢測線粒體突變位點的檢測方法主要還是序列測定。直接測序法是鑑定突變的黃金標準，但該操作繁瑣，費用昂貴限制了它的廣泛應用。
近年來，國內相繼報導了檢測線粒體突變相關的技術，以滿足對線粒體突變進行廣泛篩查的需要，如戴樸等人研發的《母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A — G突變的檢測方法及其試劑盒》(公開號CN1490415)，《用於檢測母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變的探針及其用途》(公開號CN1987462)，《用於檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變的Taqman MGB探針及其用途》(公開號CN1987463)。這些檢測方法雖然在一定程度上降低了成本，但操作步驟還不夠簡便，不能同時檢測出mtDNA A1555G和C1494T突變；從某種程度上來說，檢測費用還是偏高，這對許多家庭濟困難的人來說仍是一筆不小的開支。2006年杭州優思達生物科技有限公司建立一種以單核苷酸多態性核酸試紙快速檢測LHON線粒體DNA中G11778A位點突變的方法(專利號200610003429.1)。在應用單核苷酸多態性(SNP)核酸檢測試紙條進行多態位點或突變位點的檢測時，需設計一特異性要求比較高的延伸引物，這條引物的3』端鹼基緊臨多態性鹼基或突變鹼基，其在DNA聚合酶的作用下開始延伸，此時利用帶有抗原標記與模板對應的雙脫氧單核苷酸(ddNTP)被連接到延伸引物上。雖然該方法能夠實現短時間內的檢測陽性位點，但PCR擴增條件嚴格，存在假陰性的機率大大增加。傳統上，獲得原發性高血壓患者基因組DNA的方法是從血液中提取，每人大約需要3 5ml。這種採血方法給很多被檢者尤其是嬰幼兒帶來了一些痛苦和傷害，而且在跨地區傳遞樣本時存在一定的風險和麻煩。因此，迫切需要一種對人體無傷害、無痛苦的獲取原發性高血壓患者基因組DNA的方法以及一種快速、簡便、準確、經濟的線粒體相關基因突變檢測方法，以滿足對線粒體基因突變進行廣泛篩查的需要。
發明內容
本發明的目的是針對目前檢測tRNAGln/tRNAMetA4401G突變的方法所存在的缺點，提供一種快速、簡便、準確、經濟的檢測原發性高血壓相關的線粒體DNAA4401G突變的試劑盒。
本發明提供的試劑盒，由引物序列、提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試齊U、陽性標本對照、陰性標本對照構成，其中，提取樣本基因組DNA的試劑主要由細胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)組成；PCR擴增反應試劑包括dNTP (脫氧單核苷酸)、
10X PCR緩衝液、MgCl2、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，所述的弓丨物序列外前向引物F: TGGCTC CTT TM CCT CTC CA(SEQ ID NO.1)，外反向引物R: MG GAT TAT GGA TGC GGT TG(SEQID NO. 2);內前向引物F: AGG ACT ATG AGA ATC GM CC(SEQ ID NO. 3)，內反向引物R: MTCAG TGC GAG CTT AGC G (SEQ ID NO. 4);限制性內切酶包括限制性內切酶I ;陽性標本對照是含有線粒體序列第4401位點發生A>G突變的酶切樣本、陰性標本對照是不含有線粒體序列第4401位點發生A>G突變的酶切樣本。
在上述試劑盒中，在PCR擴增反應試劑中添加用於提高延伸反應特異性的少許二甲基亞碸(O. 1-0. 2 μ I為宜)。
本發明的另一個目的是提供所述試劑盒在檢測與母系遺傳原發性高血壓相關的線粒體基因tRNAel7tRNAMrt A4401G突變中的應用。通過以下步驟實現
(1)基因組DNA的提取運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本、帶毛囊的毛髮、口腔黏膜刮片或唾液的樣本中提取基因組DNA ；
(2)特異性PCR擴增使用Primer5. O軟體和01 igo7. O軟體根據SEQ ID NO. 5所示的人類線粒體基因序列所設計的引物F#/R#、F#/Rdr增出包含上述原發性高血壓的線粒體突變位點的片段，F#/R#卜擴增出為線粒體DNA的核苷酸3777-4679，其序列為序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2 ;F內/R內擴增出為線粒體DNA的核苷酸4331-4548，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 ；
(3)酶切鑑定將上述PCR產物用限制性內切酶I對A4401G突變位點處進行酶切；
(4)突變檢測聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，直接根據酶切PCR產物產生的DNA片段數量及DNA片段大小，檢測mtDNA是否發生A4401G突變。
在上述檢測mtDNA A4401G突 變的方法中，可從血標本(如一滴血)、帶毛囊的毛髮、口腔黏膜刮片或唾液的樣本中快速提取基因組DNA，根據取樣方式或被測樣本形式不同，對不同樣本進行相應的預處理，處理方法如下
(1)血標本(如一滴血):取20 200μ I少量血標本(如一滴血,來源於血庫)或Icm2的血濾紙片放入1. 5ml EP離心管(Eppendorf管),加入900 μ I紅細胞裂解緩衝液(20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液，PH 7.6) (Tris-HCl緩衝液)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細胞，12000rpm離心Imin,收集白細胞沉澱；
(2)帶毛囊的毛髮用70%乙醇洗帶毛囊的毛髮I次，後再用蒸餾水衝洗毛髮2次。在1.5ml EP管中分別放入2 4根毛髮，毛囊置於EP管底部，用乾淨的剪刀剪去毛髮高於EP管的部分；
(3)口腔黏膜刮片或唾液收集唾液前，必須讓被收集者漱口。以除去口腔中過多的老化細胞、食物殘渣、牙膏、咖啡、煙等物質。半小時內不要喝水、進食、吸菸，然後開始收集口腔黏膜刮片或唾液，可視條件選擇如下方法收集唾液樣本①舌頭圍繞口腔刮取黏膜細胞，將約O.1ml唾液直接吐進EP管內生理鹽水漱口，吐進EP管內，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的EP管中，反覆吹打後，12000rpm離心5min，除去上清，重複該過程一次用棉拭子反覆刮拭面頰內壁6次，空氣中乾燥，然後用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面，放入EP管中將唾液吐在濾紙上，空氣中乾燥後形成唾液斑，再用乾淨的剪刀剪成大小約Icm2碎紙片置於EP管中。
然後用細胞裂解液和蛋白酶K對上述樣本進行消化裂解，利用鹽析法去除蛋白等雜質，異丙醇沉澱DNA，最後用高壓滅菌水或TE緩衝液溶解後於-20°C保存備用。
在本發明的實施方案中，引物設計的指導思想是，針對mtDNA A4401G位點存在的位置相鄰近，擴增在一條片段上，故應設計3』末端與4401位點野生型A和4401位點突變型G相對應的上遊引物；針對4401位點設計3』末端分別與4401位點野生型G和4401位點突變型A相對應的下遊引物。(參照圖1)
本發明針對特異性PCR擴增後，mtDNA A4401G位點形成了新的酶切位點。酶切位點是由mtDNA A4401G突變形成的，其中的限制性內切酶為及/ I，其位點處為序列表中的SEQID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 ；
用以上設計的引物，以相應的被檢測樣本的DNA為模板，通過PCR擴增後分別獲得明亮清晰的大小約903bp的恆定擴增帶，4401突變位點對應於擴增片段的第625位。
在上述檢測線粒體基因原發性高血壓突變的方法中，結合特異性PCR技術和酶切技術，每份DNA樣本分別用特異性引物即引物F/R於PCR反應管中進行普通PCR擴增，然後進行突變位點處的酶切，通過一次PCR便可在幾小時內檢出原發性高血壓相關的mtDNAA4401G 突變。
理論上，基因組DNA樣本經一次PCR反應，即體系中僅加入針對突變型位點A4401G引物F/R後，加入針對突變位點新形成的限制性內切酶/進行酶切，就可進行檢測。也就是說，同一基因組DNA樣本經一次PCR-酶切，從而使檢測結果更為準確、可信。
本發明還根據設計的引物序列，通過人工合成(委託生物公司)獲得引物，並將引物按一定的比例混合，與提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試劑、陽性標本對照、陰性標本對照以及使用說明書組合起來，製成了用於體外檢測母系遺傳原發性高血壓線粒體基因mtDNA A4401G突變的試劑盒，使得樣本DNA提取、特異性PCR擴增和酶切可以在試劑盒提供的試劑基礎上順利完成。其中，提取樣本DNA的試劑主要由細胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)組成；PCR擴增反應試劑包括dNTP、10 XPCR緩衝液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，限制性內切酶包括限制性內切酶I。
用本發明的方法及其製備的體外檢測原發性高血壓相關的線粒體基因mtDNAA4401G突變試劑盒具有以下特點1.傳統上獲得原發性高血壓患者基因組DNA的方法是從血液中提取，每人大約需要3 5ml。這種採血方法給很多被檢者尤其是嬰幼兒帶來了一些痛苦和傷害，而且在跨地區傳遞樣本時存在一定的風險和麻煩。本發明運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本(如一滴血)、帶毛囊的毛髮、口腔黏膜刮片或唾液等樣本中快速提取基因組DNA。該方法不僅解決了傳統上從原發性高血壓患者血液中提取DNA的問題，減輕被檢者的痛苦；而且還解決了跨地區傳遞樣本的問題，血濾紙片、毛髮以及口腔黏膜刮片(棉拭子)或唾液斑濾紙片等可以很容易的放在信封內，並可通過郵寄的方式跨地區傳遞。
2.目前國內外有幾種線粒體相關的母系遺傳性疾病基因診斷方法，如直接測序法螢光定量PCR檢測方法、基因晶片檢測方法等，由於其自身的缺陷，如費時費力、操作繁瑣以及檢測費用偏高而不易在臨床進行推廣。與這些方法相比較，PCR-酶切技術則結合了特異性PCR技術及酶切技術兩者的優點，每份DNA樣本用特異性引物即引物F/R於PCR反應管中進行特異性PCR擴增，通過一次PCR-酶切便可在幾小時內同時檢出mtDNA A4401G突變。另外值得一提的是，本方法所用的引物均經過仔細設計。首先，正常和突變等位基因間不同的鹼基在酶切過程中對特異性限制性內切酶形成的位點不同，因而大大提高了酶切的特異性；另外由正常對照和空白對照的產物可作為整個PCR反應的分子內控指標，從而避免假陰性結果的出現，提高檢測結果的穩定性。通過調整不同引物的濃度和比例以及對PCR反應條件進行優化， 以確保結果的特異性和穩定性。
3.應用本發明提供的試劑盒進行mtDNA A4401G突變檢測，成本較其他檢測方法更低；檢測流程簡便、快速，結果判讀直觀；對實驗設備及操作人員無特殊要求，適合在一般醫院、分子生物實驗室開展，便於在全國範圍內特別是欠發達地區實行原發性高血壓相關的mtDNA A4401G突變的大規模篩查和預防性檢查。
圖1是本發明的特異性巢式PCR引物示意圖。
圖2是本發明的特異性巢式PCR擴增方案示意圖。
圖3是攜帶tRNAeln/tRNAMetA4401G突變原發性高血壓家系系譜圖。
圖4是基因特異性巢式PCR擴增鑑定tRNAeln/tRNAMet A4401G的7%聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。
符號說明
圖1和2中F外為特異性巢式PCR第一次擴增的正向引物#外為特異性巢式PCR第一次擴增的反向引物，與F外配對使用；F內為特異性巢式PCR第二次擴增的正向引物，R內為特異性巢式PCR第二次擴增的反向引物，與F內配對使用；A4401G表示為線粒體DNA第4401位，野生型為A，發生基因突變後為G。
圖3中□為正常男性個體；〇為正常女性個體；■為發病男性個體；籲為發病女性個體；，為先證者；/為已死亡的個體；I為該家系的第一代成員；II為該家系的第二代成員；III為該家系的第三代成員；IV為該家系的第四代成員。
圖4中NI表示野生型位點檢測的PCR擴增產物的電泳圖(正常對照者)；N2為攜帶A4401G突變的DNA酶切後的電泳圖(陽性對照)；N3為攜帶A4401G突變的先證者父親；N4表示先證者攜帶A4401G突變位點檢測的PCR擴增產物酶切鑑定的電泳圖；N5為未攜帶A4401G突變的先證者兒子；N6攜帶A4401G突變的先證者母親；N7為母系成員攜帶A4401G突變並具有原發性高血壓的先證者弟弟；N8未攜帶A4401G突變位點進行酶切的電泳圖(陰性對照)；N9表示先證者攜帶A4401G突變位點檢測的PCR擴增產物(未酶切)的電泳圖。 具體實施方式
下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發明並能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。
實施例1攜帶線粒體基因A4401G突變的原發性高血壓家系的檢測，見圖1。
1.檢測樣本
選擇I個攜帶tRNAGln/tRNAMetA4401G突變的原發性高血壓家系。其家系圖見圖2。這個家系呈現典型的母系遺傳，發病者均以血壓升高為唯一的臨床症狀，但是家系中每個成員的血壓升高程度不等。這個家系總人數為18人，其中母系成員數為7人，患高血壓者有3人。
2.基因組DNA的提取
分別獲取4名受檢者的樣本(由於採集樣本的方式II1-3、I1-2和II1-3血濾紙片樣本、
I1-1為其口腔黏膜刮片含唾液)，將血濾紙片用乾淨的剪刀剪成大小約lcm2的碎紙片放入1.5ml EP管(Eppendorf管)，加入900μl紅細胞裂解緩衝液(20mmol/L Tris-HCl,pH 7.6)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細胞，12000rpm離心lmin，收集白細胞沉澱；口腔黏膜刮片或唾液樣本收集唾液前，必須讓被收集者漱口。以除去口腔中過多的老化細胞、食物殘渣、牙膏、咖啡、煙等物質。半小時內不要喝水、進食、吸菸，然後開始收集口腔黏膜刮片或唾液，舌頭圍繞口腔刮取黏膜細胞，將約O.1ml唾液直接吐進EP管內。然後加入600 μ I細胞裂解液，混勻後再加入溶液I，使得蛋白酶K的工作濃度為20 μ g/ml。充分混勻後55°C消化裂解，接著以鹽析法去除蛋白等雜質，異丙醇沉澱DNA，最後用高壓滅菌水或TE緩衝液溶解後於-20°C保存備用。
3.引物設計
使用Primer 5. O軟體和01igo7. O軟體協助設計改良引物,根據已公開的人類線粒體基因劍橋參考序列(SEQ ID N0:5)進行設計，引物的設計方案(見圖3)如下
針對mtDNA 4401位點，保證引物設計的特異性，我們設計巢式PCR兩對引物F外/R外，F內/R內；它們長度、退火溫度相近便於實驗條件穩定，以增強特異性。由此設計出的4401位點的巢式PCR引物為外前向引物F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物R: AAGGAT TAT GGA TGC GGT TG;內前向引物 F: AGG ACT ATG AGA ATC GAA CC，內反向引物 R:AAT CAG TGC GAG CTT AGC G。
4.基因特異性巢式PCR擴增 根據上述設計的4條引物序列，通過人工合成(委託生物公司)獲得2對引物，以上述提取的被檢樣本基因組DNA為模板，進行基因特異性巢式PCR擴增和7%的聚丙烯醯胺凝膠電泳酶切鑑定。
權利要求
1.一種檢測高血壓相關的線粒體DNA A4401G突變的試劑盒，其特徵在於，由引物序列、提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試劑、陽性標本對照、陰性標本對照構成，其中，提取樣本基因組DNA的試劑主要由細胞裂解液和溶液I組成；PCR擴增反應試劑包括脫氧單核苷酸、10 X PCR緩衝液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，所述的引物序列是外前向引物F:TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG;內前向引物F: AGG ACT ATG AGA ATC GAA CC，內反向引物R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC G ;限制性內切酶包括限制性內切酶及fa I ;陽性標本對照是含有線粒體序列第4401位點發生A>G突變的酶切樣本、陰性標本對照是不含有線粒體序列第4401位點發生A>G突變的酶切樣本；所述溶液I的主要成分是蛋白酶K。
2.根據權利要求
1所述的一種檢測原發性高血壓相關的線粒體DNAA4401G突變的試劑盒，其特徵在於，在PCR擴增反應試劑中添加用於提高延伸反應特異性的O. 1-0. 2μ I的二甲基亞諷。
3.根據權利要求
1或2所述的試劑盒在檢測與母系遺傳原發性高血壓相關的線粒體基因 tRNAGln/tRNAMet A4401G 突變中的應用。
4.根據權利要求
3所述的應用，其特徵在於，通過以下步驟實現 (1)基因組DNA的提取運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本、帶毛囊的毛髮、口腔黏膜刮片或唾液的樣本中提取基因組DNA ； (2)特異性PCR擴增使用Primer5. O軟體和Oligo7. O軟體根據SEQ ID NO. 5所示的人類線粒體基因序列所設計的引物F外/R外、F內/R內 擴增出包含上述原發性高血壓的線粒體突變位點的片段，F糹卜/R糹卜擴增出為線粒體DNA的核苷酸3777-4679，其序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2 ;F內/R內擴增出為線粒體DNA的核苷酸4331-4548，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 ； (3)酶切鑑定將上述PCR產物用限制性內切酶及faI對A4401G突變位點處進行酶切； (4)突變檢測聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，直接根據酶切PCR產物產生的DNA片段數量及DNA片段大小，檢測mtDNA是否發生A4401G突變，用以上設計的引物，以相應的被檢測樣本的DNA為模板，通過PCR擴增後分別獲得明亮清晰的大小約903bp的恆定擴增帶，4401突變位點對應於擴增片段的第625位。
5.根據權利要求
4所述的應用，其特徵在於，步驟(I)所述的從血標本、帶毛囊的毛髮、口腔黏膜刮片或唾液的樣本中快速提取基因組DNA，通過以下方法獲得 (1)血標本取20 200μ I少量血標本或Icm2的血濾紙片放入1. 5ml離心管，加入900 μ I紅細胞裂解緩衝液室溫靜置10分鐘，充分裂解紅細胞，12000rpm離心lmin，收集白細胞沉澱；紅細胞裂解緩衝液為20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液，pH 7. 6 ； (2)帶毛囊的毛髮用70%乙醇洗帶毛囊的毛髮I次，後再用蒸餾水衝洗毛髮2次，在1.5ml離心管中分別放入2 4根毛髮，毛囊置於離心管底部，用乾淨的剪刀剪去毛髮高於尚心管的部分； (3)口腔黏膜刮片或唾液收集唾液前，必須讓被收集者漱口，以除去口腔中過多的老化細胞、食物殘渣、牙膏、咖啡、煙等物質，半小時內不要喝水、進食、吸菸，然後開始收集口腔黏膜刮片或唾液，選擇如下方法收集唾液樣本①舌頭圍繞口腔刮取黏膜細胞，將約.O.1ml唾液直接吐進離心管內生理鹽水漱口，吐進離心管內，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的離心管中，反覆吹打後，12000rpm離心5min，除去上清，重複該過程一次用棉拭子反覆刮拭面頰內壁6次，空氣中乾燥，然後用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面，放入離心管中；④將唾液吐在濾紙上，空氣中乾燥後形成唾液斑，再用乾淨的剪刀剪成Icm2碎紙片置於離心管中； 然後用細胞裂解液和蛋白酶K對上述樣本進行消化裂解，利用鹽析法去除蛋白等雜質，異丙醇沉澱DNA，最後用高壓滅菌水或TE緩衝液溶解後於_20°C保存備用。
專利摘要
本發明提供一種檢測高血壓相關的線粒體DNAA4401G突變的試劑盒，由引物序列、提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試劑、陽性標本對照、陰性標本對照以及使用說明書構成。本發明試劑盒以少量的樣本(如一滴毛細血管靜脈血、帶毛囊的毛髮、口腔黏膜刮片或唾液)，通過蛋白酶K消化裂解法提取基因組DNA，通過設計引物進行分段巢式PCR擴增，然後通過特異性的限制性內切酶StyⅠ酶切鑑定的方法檢出高血壓相關的線粒體突變位點。本發明實現了無創傷檢測，較單獨進行線粒體DNAA4263G突變的檢測更快速、經濟、簡便，且對設備及環境要求低，利於推廣和應用，適用於高血壓相關人群的大規模篩查和預防性檢查。
文檔編號C12Q1/68GKCN103031379SQ201210546824
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月17日
發明者管敏鑫, 蔣萍萍, 冀延春, 肖雲 申請人:浙江大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan