一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜和用途的製作方法
2023-06-06 04:18:26
專利名稱：一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜和用途。
背景技術：
人體在氧化代謝的過程中會產生了大量含氧自由基，自由基通過細胞運輸過程會破壞其他分子的結構，導致細胞受損，使人體各預防細胞機能下降、衰老，可誘發癌症、糖尿病、心血管疾病、腎臟病、動脈硬化、缺血性心臟病、神經系統疾病、眼睛疾病等百餘種疾病。研究表明，通過補充抗氧化物質能夠保持機體自由基的產生與消除的平衡，從而防止自由基對細胞和組織的損傷，是預防各疾病的有效措施之一，通過食用功能性的抗氧化食品也是一種即方便又有效的補充抗氧化劑的方法。青龍衣，即胡桃科植物胡桃楸Juglans mandshurica Maxim.的新鮮未成熟果皮，主要含有黃酮類化合物、萘醌類化合物、二芳基庚烷類化合物，同時還含有留體、萜類、脂肪酸等成分。青龍衣在中醫臨床上主要用於治療皮膚病、子宮脫垂、白細胞減少等症。現代研究發現青龍衣具有細胞毒性、抑菌抗炎、鎮痛作用以及顯著的抗癌活性，而其抗氧化活性目前還未見報導，另外，由於中藥的產地、來源、採收季節等情況複雜，如何採用科學、合理的方法控制其質量並與其活性緊密相關，是目前質量控制研究方法的新的思路和趨勢，對保證臨床用藥的安全有效是十分必要的。而指紋圖譜作為從整體上對中藥進行質量控制的一種技術目前已載入2010版中國藥典，其優勢比起單一組分甚至多組分定性定量更加明顯，關於青龍衣的指紋圖譜研究目前有少量文獻報導，現在沒有方法可以建立青龍衣抗氧化提取物的指紋圖譜，因此沒有青龍衣抗氧化提取物的標準指紋圖譜。
發明內容
本發明是要提供一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜和用途。本發明一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，是按以下步驟進行:一、供試品溶液的製備:a、取青龍衣藥材，加10倍質量的質量百分含量為95%乙醇,浸泡72h，過濾，分別收集固相物A和液相物A，將固相物A加入10倍質量的質量百分含量為95%乙醇中浸泡48h，過濾，分別收集固相物B和液相物B，將固相物B加入10倍質量的質量百分含量為95%乙醇中浸泡24h，過濾，收集液相物C，然後將液相物A、B和C混合，得到浸提液；b、將浸提液減壓濃縮至相對密度為1.10 1.14，得到濃縮液，再將濃縮液和水按體積比1:1混合，然後用質量百分含量為10%的鹽酸調節pH值至2，得到稀釋後的濃縮液；
C、用與稀釋後的濃縮液等體積的乙酸乙酯溶液對稀釋後的濃縮液進行萃取，收集有機相，重複萃取2次，然後合併有機相，再減壓濃縮至幹，得到乾燥的固體為青龍衣抗氧化活性提取物；d、將步驟c得到的青龍衣抗氧化活性提取物，用甲醇溶解成濃度為lmg/mL的溶液，用微孔濾膜進行過濾，濾液即為供試品溶液；二、指紋圖譜的製作:將步驟一得到的供試品溶液注入高效液相色譜儀，以甲醇為A相，質量百分含量為0.2%的磷酸水溶液為B相進行梯度洗脫；其中，高效液相色譜條件為:色譜柱填料Thermo C18，規格為250X4.6mm，5 μ m ;柱溫為35°C ;流動相為A相甲醇和B相質量百分含量為0.2 %磷酸水溶液，流速0.8mL/min，檢測波長250nm，進樣量20 μ L ；在此條件下分析供試品溶液，得到青龍衣抗氧化活性提取物的指紋圖譜。本發明採用一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法得到的青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜。本發明青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜的用途是指青龍衣抗氧化活性提取物指紋圖譜作為標準指紋圖譜用於青龍衣質量控制中。本發明提取了青龍衣中具有抗氧化作用的提取物，通過對DPPH自由基清除試驗，證明了該提取物具有優良的抗氧化活性，本發明青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法具有可重複性好、精密度好和穩定可靠的優點。本發明的青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜有4個共有特徵峰，這些共有特徵峰構成了青龍衣抗氧化活性提取物的指紋特徵， 可作為青龍衣抗氧化活性提取物的標準指紋圖譜。本發明的青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜作為標準指紋圖譜經多批樣品驗證後可用於青龍衣質量控制中，用於從整體上評價和控制青龍衣藥材的質量，既避免了因只測定一、二個化學成分而判定青龍衣整體質量的片面性,又減少了為質量達標而人為添加對照成分的可能性。
圖1為試驗I建立的11批青龍衣抗氧化活性提取物的指紋圖譜；圖2為試驗I提供的青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜；其中I至4為青龍衣抗氧化活性提取物的4個共有特徵峰。
具體實施例方式具體實施方式
一:本實施方式一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，是按以下步驟進行:一、供試品溶液的製備:a、取青龍衣藥材，加10倍質量的質量百分含量為95%乙醇,浸泡72h，過濾，分別收集固相物A和液相物A，將固相物A加入10倍質量的質量百分含量為95%乙醇中浸泡48h，過濾，分別收集固相物B和液相物B，將固相物B加入10倍質量的質量百分含量為95%乙醇中浸泡24h，過濾，收集液相物C，然後將液相物A、B和C混合，得到浸提液；b、將浸提液減壓濃縮至相對密度為1.10 1.14，得到濃縮液，再將濃縮液和水按體積比1:1混合，然後用質量百分含量為10%的鹽酸調節pH值至2，得到稀釋後的濃縮液；C、用與稀釋後的濃縮液等體積的乙酸乙酯溶液對稀釋後的濃縮液進行萃取，收集有機相，重複萃取2次，然後合併有機相，再減壓濃縮至幹，得到乾燥的固體為青龍衣抗氧化活性提取物；d、將步驟c得到的青龍衣抗氧化活性提取物，用甲醇溶解成濃度為lmg/mL的溶液，用微孔濾膜進行過濾，濾液即為供試品溶液；二、指紋圖譜的製作:將步驟一得到的供試品溶液注入高效液相色譜儀，以甲醇為A相，質量百分含量為0.2%的磷酸水溶液為B相進行梯度洗脫；其中，高效液 相色譜條件為:色譜柱填料Thermo C18，規格為250 X 4.6mm, 5 μ m ;柱溫為35°C ;流動相為A相甲醇溶液和B相質量百分含量為0.2%磷酸水溶液，流速0.8mL/min，檢測波長250nm，進樣量20 μ L ；在此條件下分析供試品溶液，得到青龍衣抗氧化活性提取物的指紋圖譜。本實施方式提取了青龍衣中具有抗氧化作用的提取物，通過對DPPH自由基清除試驗，證明了該提取物具有優良的抗氧化活性，本實施方式青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法具有可重複性好、精密度好和穩定可靠的優點。
具體實施方式
二:本實施方式與具體實施方式
一不同的是:梯度洗脫順序為:Omin — IOmin — 30min — 36min,甲醇 35%— 45%— 60%— 60%。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三:本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是:步驟一中的微孔濾膜過濾是採用0.45 μ m微孔濾膜進行過濾的。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四:本實施方式採用一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法得到的青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜。本實施方式的青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜有4個共有特徵峰，這些共有特徵峰構成了青龍衣抗氧化活性提取物的指紋特徵，可作為青龍衣抗氧化活性提取物的標準指紋圖譜。
具體實施方式
五:本實施方式與具體實施方式
四不同的是:青龍衣抗氧化活性提取物的指紋圖譜有4個共有特徵峰，以3號峰為對照峰，共有特徵峰的相對保留時間分別為
0.717 0.719min、0.819min, 1.0OOmin和1.189min,這些共有特徵峰構成了青龍衣抗氧化活性提取物的指紋特徵，可作為青龍衣抗氧化活性提取物的標準指紋圖譜。其它與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
六:本實施方式與具體實施方式
四或五不同的是:青龍衣抗氧化活性提取物的指紋圖譜的4個共有特徵峰，以3號峰為對照峰，共有特徵峰的相對保留時間分別為 0.717 0.719min、0.819±0.01% minU.0OOmin 和 1.189±0.02% min。其它與具體實施方式
四或五相同。
具體實施方式
七:本實施方式青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜的用途是指青龍衣抗氧化活性提取物指紋圖譜作為標準指紋圖譜用於青龍衣質量控制中。本實施方式的青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜作為標準指紋圖譜經多批樣品驗證後可用於青龍衣質量控制中，用於從整體上評價和控制青龍衣藥材的質量，既避免了因只測定一、二個化學成分而判定青龍衣整體質量的片面性，又減少了為質量達標而人為添加對照成分的可能性。通過以下試驗驗證本發明的有益效果:試驗1:1、試驗方法:本試驗青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，是按以下步驟進行:一、供試品溶液的製備:a、取青龍衣藥材250g，加10倍質量的質量百分含量為95%乙醇，浸泡72h，過濾，分別收集固相物A和液相物A，將固相物A加入10倍質量的質量百分含量為95%乙醇中浸泡48h，過濾，分別收集固相物B和液相物B，將固相物B加入10倍質量的質量百分含量為95%乙醇中浸泡24h，過濾，收集液相物C，然後將液相物A、B和C混合，得到浸提液；b、將浸提液減壓濃縮至相對密度為1.10 1.14，得到濃縮液，再將濃縮液和水按體積比1:1混合，然後用質量百分含量為10%的鹽酸調節pH值至2，得到稀釋後的濃縮液；C、用與稀釋後的濃縮液等體積的乙酸乙酯溶液對稀釋後的濃縮液進行萃取，收集有機相，重複萃取2次，然後合併有機相，再減壓濃縮至幹，得到乾燥的固體為青龍衣抗氧化活性提取物；d、將IOmg步驟c得到的青龍衣抗氧化活性提取物，用甲醇溶解成濃度為lmg/mL的溶液，用0.45 μ m的微孔濾膜進行過濾，濾液即為供試品溶液；二、指紋圖譜的製作:將步驟一得到的供試品溶液注入高效液相色譜儀，以甲醇為A相，質量百分含量為0.2%的磷酸水溶液為B相進行梯度洗脫；其中，高效液相色譜條件為:1、色譜柱填料 Thermo C18,規格為 250X4.6mm, 5 μ m ;柱溫為 35 °C ;流動相為A相甲醇和B相質量百分含量為0.2 %磷酸水溶液，採用梯度洗脫方式Omin — IOmin — 30min — 36min,甲醇 35 % — 45 % — 60 % — 60 % ;流速 0.8mL/min,檢測波長250nm，進樣量20 μ L ;2、試驗儀器:HITACHI L-2000高效液相色譜儀；HITACHI L-2400紫外檢測器；AT-130色譜柱柱溫箱；HITACHI D-2000色譜工作站。3、試驗材料:11批青龍衣藥材採自黑龍江、吉林兩地。 用質量百分含量為95%的乙醇溶液分別將本試驗製備的11組的青龍衣抗氧化活性提取物溶解成濃度為lmg/mL的溶液，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾，將所得的續濾液用於DPPH自由基清除法測定抗氧化活性。每組實驗重複三次，根據抑制率(％) = [1-(A1-A2)/AO] X 100%計算；A0為不含提取物的對照吸光度；A1為含提取物的吸光度；A2是不含DPPH的吸光度，試驗結果如表I所示。從表I中可知，青龍衣抗氧化活性提取物對DPPH自由基有不同程度的抑制作用。為比較青龍衣抗氧化活性提取物與Vc的抗氧化能力大小，對11批青龍衣活性提取物的EC50值進行了測定，即:清除50%原始DPPH 濃度所需抗氧化劑量的大小。EC5tl值越小，樣品清除自由基能力越強，抗氧化能力越強。具體操作如下:分別移取 1.0mg/mL 的樣品溶液 1.60mL、0.80mL、0.40mL、0.20mL、0.1OmL 與 2mL DPPH 溶液混合，再用乙醇溶液補至4mL，充分混合，暗處反應30min，517nm下測定吸光度值(A1)，同時將上述5個濃度的樣品溶液分別用乙醇溶液補至4mL，測混合液吸光值(A2)，2mL DPPH與2mL乙醇混合液的吸光值(A3),按公式計算抑制率。運用GraphPad Prim軟體進行曲線擬合得出11批青龍衣抗氧化活性提取物的EC5tl值。同方法測定Vc的EC5tl值做陽性對照。結果如表2所示:青龍衣抗氧化提取物的EC5tl在0.043 0.125mg/mL之間，作用最強的藥材的提取物抗氧化能力約為Vc的五分之一，顯示了較強的抗氧化能力。其中本試驗的DPPH溶液的製備方法:稱取8mg的DPPH粉末，用質量百分含量為95%乙醇定容至IOOmL,得初始濃度為2 X lOliol/L的DPPH溶液，放置於4°C下冷藏備用。按照本試驗的青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，對11批青龍衣抗氧化活性提取物建立了高效液相色譜指紋圖譜(見圖1)，得到的譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度計算軟體(中華人民共和國藥典委員會，2004年版)，確定了 4個共有特徵峰，以3號峰為對照峰，共有特徵峰的相對保留時間分別為；1號共有特徵峰相對保留時間為0.718 ± 0.16 %，2號峰相對保留時間為0.819 ± 0.0I %，3號峰相對保留時間為
1.000，4號峰相對保留時間為1189±0.02%，上述共有特徵峰構成了青龍衣抗氧化活性提取物的指紋特徵，可作為青龍衣抗氧化活性提取物的標準指紋圖譜。本試驗得到的青龍衣抗氧化活性提取物的標準指紋圖譜如圖2所示。由圖2可以看出，通過本方法可以清晰地得到具有4個共有特徵峰的青龍衣抗氧化活性提取物的標準指紋圖譜，為整體評價青龍衣的質量提供了良好的依據。4、方法學考察4.1方法重現性試驗取同一批青龍衣藥材6份，按照試驗方法中青龍衣抗氧化活性提取物供試品溶液的製備方法製備供試品溶液，進行指紋圖譜測定，分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行統計，結果如表3所示，RSD %均不超過3 %，顯示本發明的方法重現性良好。4.2指紋圖譜精密度試驗取方法重現性試驗用的供試品溶液一份，連續進樣5次，分別對共有峰的相對保留時間及相對峰面積進行統計，RSD%均不超過3% (表4)，結果顯示本發明的方法精密度良好。4.3指紋圖譜穩定性試驗取方法重現性試驗用的供試品溶液一份，進行指紋圖譜測定，考察供試品溶液48小時內的穩定性，分別對共有峰的相對保留時間及相對峰面積進行統計，RSD%均不超過3% (表5)，結果顯示供試品溶液在48小時內穩定。以上試驗結果顯示，該測定方法穩定可靠，指紋圖譜相對穩定。表I批青龍衣抗氧化活性提取物的抑制率
權利要求
1.一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，其特徵在於青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法是按以下步驟進行: 一、供試品溶液的製備:a、取青龍衣藥材，加10倍質量的質量百分含量為95%乙醇，浸泡72h，過濾，分別收集固相物A和液相物A，將固相物A加入10倍質量的質量百分含量為95%乙醇中浸泡48h，過濾，分別收集固相物B和液相物B，將固相物B加入10倍質量的質量百分含量為95%乙醇中浸泡24h，過濾，收集液相物C，然後將液相物A、B和C混合，得到浸提液； b、將浸提液減壓濃縮至相對密度為1.10 1.14，得到濃縮液，再將濃縮液和水按體積比1:1混合，然後用質量百分含量為10%的鹽酸調節pH值至2，得到稀釋後的濃縮液； C、用與稀釋後的濃縮液等體積的乙酸乙酯溶液對稀釋後的濃縮液進行萃取，收集有機相，重複萃取2次，然後合併有機相，再減壓濃縮至幹，得到乾燥的固體為青龍衣抗氧化活性提取物； d、將步驟c得到的青龍衣抗氧化活性提取物，用甲醇溶解成濃度為lmg/mL的溶液，用微孔濾膜進行過濾，濾液即為供試品溶液； 二、指紋圖譜的製作:將步驟一得到的供試品溶液注入高效液相色譜儀，以甲醇為A相，質量百分含量為0.2%的磷酸水溶液為B相進行梯度洗脫； 其中，高效液相色譜條件為: 色譜柱填料Thermo C18，規格為250 X 4.6mm, 5 μ m ;柱溫為35°C ;流動相為A相甲醇和B相質量百分含量為0.2%磷酸水溶液，流速0.8mL/min，檢測波長250nm，進樣量20 μ L ; 在此條件下分析供試品溶液，得到青龍衣抗氧化活性提取物的指紋圖譜。
2.根據權利要求1所述的一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法,其特徵在於梯度洗脫順序為:0min — IOmin — 30min — 36min,甲醇35% — 45%—60%— 60%。
3.根據權利要求1所述的一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，其特徵在於步驟一中的微孔濾膜過濾是採用0.45 μ m微孔濾膜進行過濾的。
4.採用權利要求1所述的一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法得到的青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜。
5.根據權利要求5所述的青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜，其特徵在於青龍衣抗氧化活性提取物的指紋圖譜有4個共有特徵峰，以3號峰為對照峰，共有特徵峰的相對保留時間分別為0.717 0.719min、0.819min, 1.0OOmin和1.189min，這些共有特徵峰構成了青龍衣抗氧化活性提取物的指紋特徵，可作為青龍衣抗氧化活性提取物的標準指紋圖譜。
6.青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜的用途，其特徵在於青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜作為標準指紋圖譜用於青龍衣質量控制中。
全文摘要
一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜和用途，它涉及一種青龍衣抗氧化活性提取物的高效液相色譜指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜和用途。本發明方法為一、製備供試品溶液；二、製作指紋圖譜，將供試品溶液注入高效液相色譜儀；本發明青龍衣抗氧化活性提取物的指紋圖譜有4個共有特徵峰，這些共有特徵峰構成了青龍衣抗氧化活性提取物的指紋特徵，可作為青龍衣抗氧化活性提取物的標準指紋圖譜。本發明青龍衣抗氧化活性提取物標準指紋圖譜的用途是指青龍衣抗氧化活性提取物指紋圖譜作為標準指紋圖譜用於青龍衣質量控制中。本發明應用於醫藥領域。
文檔編號G01N30/02GK103217491SQ20131009279
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月21日 優先權日2013年3月21日
發明者劉麗娟, 王豔秋 申請人:黑龍江大學