三股螺旋蛋白的穩定表達的製作方法

2023-06-25 19:55:36 4

專利名稱：三股螺旋蛋白的穩定表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過重組DNA技術進行的羥化三股螺旋蛋白的生產，所述蛋白如天然和合成膠原、天然和合成膠原片段、天然和合成膠原樣蛋白。具體地講，本發明涉及一種通過將編碼三股螺旋蛋白及脯氨醯4-羥化酶(P4H)的DNA序列導入合適的酵母宿主細胞中而在酵母宿主細胞中生產羥化三股螺旋蛋白的方法，其中，導入的方法為使所導入的DNA序列由該酵母宿主細胞穩定地保持和分離。
背景技術：
蛋白的膠原家族是哺乳動物體內含量最大的蛋白，它構成了大部分纖維成分，例如，皮膚、骨、腱、軟骨和血管。每一種膠原蛋白均由以(Gly-X-Y)n重複序列為特徵的三種多肽鏈(α鏈)組成，所述多肽鏈摺疊成三股螺旋蛋白構象。I型膠原(常見於皮膚、腱、骨和角膜)由被稱為α1(I)和α2(II)[即α1(I)2α2(II)]的兩種多肽鏈組成，而諸如II型[α1(II)3]和III型[α1(III)3]的其它類型的膠原具有三個相同的多肽鏈。這些膠原蛋白可自發地聚集成原纖維，這種原纖維被結合到胞外基質中，在成熟組織中，它起著結構作用，而在發育的組織中，它起著定向作用。所述膠原原纖維在交聯以後是高度不可溶的，並具有很高的抗拉強度。
膠原的生成不可溶原纖維的能力使其有希望用於多種醫學目的，包括生物移植體生產、軟組織增大和創傷/燒傷繃帶。迄今為止，已證實其用途的大部分膠原源於動物資源，主要是牛。儘管所述源於動物的膠原已被成功地利用，但是，仍存在某些問題這種膠原的使用會產生嚴重的免疫原性問題，並會傳播傳染病和海綿狀腦炎(例如，牛海綿狀腦炎(BSE))。因此，人們對開發利用重組DNA技術生產膠原或膠原片段的方法存有濃厚興趣。而且，重組DNA技術的利用還具有這樣的優點它帶來了生產合成膠原和膠原片段的潛在可能，例如，這種合成膠原可以包括外源生物活性域(即提供額外的蛋白功能)及其它有用特性(例如，改善的生物相容性和穩定性)。
膠原蛋白的體內生物合成是一個複雜的過程，涉及很多翻譯後過程。一個關鍵過程是由脯氨醯4-羥化酶(P4H)將位於重複的(Gly-X-Y)n序列的Y-位置上的脯氨醯羥化成4-羥脯氨酸。業已證實，這一羥化作用有利於三股螺旋蛋白摺疊的成核作用。就膠原而言，體溫下的穩定性是很重要的。因此，開發有商業價值的生產重組膠原的方法需要共表達P4H和所述α鏈。對於哺乳動物宿主細胞來說，P4H的共表達可自發地進行，因為這類細胞能自然地表達P4H。不過，對於酵母宿主細胞來說，出於成本、方便和效率考慮，更有希望用於表達重組真核蛋白，還需要用編碼P4H的DNA序列進行轉化。由於P4H由大約60kDa和60kDa的α亞基和β亞基組成，用於表達重組膠原的酵母宿主細胞需要用至少3個外源DNA序列(即編碼α鏈、P4Hα亞基和P4Hβ亞基)轉化，而且，如果克隆在3個獨立的載體上或均克隆在附加型載體上則預期會出現穩定性問題。事實上，即使在連續選擇壓力下，很多附加型載體都會遇到穩定性問題，如果這種載體大或以較低的拷貝數存在的話。因此，本發明的一個目的是提供一種由酵母宿主細胞表達重組膠原及其它三股螺旋蛋白的方法，其中，所導入的DNA序列不依賴連續的選擇壓力穩定地保持和分離。
發明概述因此，第一方面，本發明提供了一種在酵母中生產羥化三股螺旋蛋白的方法，該方法包括以下步驟將編碼P4Hα亞基的第一核苷酸序列、編碼P4Hβ亞基的第二核苷酸序列以及一個或幾個產物編碼核苷酸序列導入一種合適的酵母宿主細胞，所述產物編碼核苷酸序列編碼一種或幾種多肽或肽，這些多肽或肽在羥化以後生成所述羥化三股螺旋蛋白，所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的每一個均可操作地與啟動子序列連接；和在適於表達所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的條件下培養所述酵母宿主細胞，從而產生所述羥化三股螺旋蛋白；其中，該方法的特徵在於導入所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的步驟會導致所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列及其相應的可操作地連接的啟動子序列被攜帶在一個或幾個可複製的DNA分子上，該分子在所述培養步驟中由所述酵母宿主細胞穩定地保持並分離。
第二方面，本發明提供了一種能產生羥化三股螺旋蛋白的酵母宿主細胞，所述酵母宿主細胞包括一個編碼P4Hα亞基的第一核苷酸序列，一個編碼P4Hβ亞基的第二核苷酸序列以及一個或幾個產物編碼核苷酸序列，所述產物編碼核苷酸序列編碼一種或幾種多肽或肽，這些多肽或肽在羥化以後生成所述羥化三股螺旋蛋白，所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的每一個均可操作地與啟動子序列連接，其中所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列及其相應的可操作地連接的啟動子序列被攜帶在一個或幾個可複製的DNA分子上，該分子在所述培養步驟中由所述酵母宿主細胞穩定地保持並分離。
第三方面，本發明提供了一種按照本發明第一方面的方法生產的三股螺旋蛋白。
第四方面，本發明提供了一種含有按照本發明第一方面的方法生產的三股螺旋蛋白的生物材料或治療產品。
發明詳述本發明的方法需要以如下方式將所述編碼P4Hα亞基和β亞基的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列以及所述產物編碼核苷酸序列導入一種合適的酵母宿主細胞所述序列由一個或幾個DNA分子攜帶，這些分子在培養期間由所述酵母宿主細胞穩定地保持和分離。這樣，所有子代細胞都含有所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列，並因此可以確保在整個培養過程中無須使用連續的選擇壓力即可穩定而又有效地表達一種羥化三股螺旋蛋白產物。
本發明方法可以這樣實現(i)將一個或幾個外源核苷酸序列(即所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列中的一個或幾個)整合(例如，通過同源重組)到酵母宿主細胞的一個或幾個染色體中，或(ii)將所述外源核苷酸序列中的一個或幾個包含於一個或幾個含有一個著絲粒(CEN)序列的載體中。另外，可以採用上述技術的組合形式，或者將上述技術中的一種或兩種的使用與一種或兩種高拷貝數質粒的使用結合起來，所述質粒包括所述外源核苷酸序列的保持器(remainder)。例如，可將所述編碼P4Hα亞基和β亞基的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列整合到一個宿主染色體中，而使所述產物編碼序列包含於一個或幾個含有一個CEN序列的載體上或高拷貝數載體上。
優選地，本發明方法是通過將所述外源核苷酸序列包含於一個或幾個含有一個CEN序列的載體中而實現的。特別優選的是含有CEN序列的YAC(酵母人工染色體)載體(Cohen等，1993)和pYEUra3載體(Clontech，Cat.No6195-1)。可以通過將一個CEN序列克隆到任何合適的表達載體上生成其它含有CEN序列的載體。
當把一個或幾個外源核苷酸序列包含於高拷貝數載體上時，優選的是該高拷貝數載體選自那些以每個宿主細胞20-500(優選400-500)個拷貝出現的載體。特別優選的高拷貝數載體是YEp載體。
本發明的方法可以生產羥化三股螺旋蛋白。「三股螺旋蛋白」一詞被理解為是指由一種或幾種多肽或肽組成的同源或異源三聚體蛋白，所述蛋白包括至少一個具有如下肽通式的片段(Gly-X-Y)n，其中，Gly是甘氨酸，X和Y表示相同或不同的胺基酸(Gly-X-Y三聯體與Gly-X-Y三聯體之間X和Y可以不同)，不過，其中的X和Y通常為脯氨酸，其中的Y在修飾以後成為羥脯氨酸(Hyp)，n為2-1500(優選10-350)，該片段與兩個其它多肽或肽的相同或相似片段一起形成三股螺旋蛋白構象。因此，這一術語包括天然和合成膠原、天然和合成膠原片段、以及天然和合成膠原樣蛋白(例如，巨噬細胞消除受體和肺表面活性蛋白)，而且同樣包括有或沒有前肽、球狀域和/或間插非膠原序列、以及有或沒有源於人或其它物種的天然或變體胺基酸序列的一切前膠原和膠原(例如，I-XIX型)。「三股螺旋蛋白」一詞所包括的合成膠原和片段還可以包括位於其氨基和/或羧基末端或其它部位的非膠原、非三股螺旋域。
因此，適用於本發明方法的產物編碼核苷酸序列可以是多種多樣的。不過，所述產物編碼核苷酸序列優選選自編碼天然膠原及其片段的核苷酸序列，如COL1A1(D』Alessio等，1988；Westerhausen等，1991)，COL1A2(de Wet等，1987)，COL2A1(Cheah等，1985)和COL3A1(Ala-Kokko等，1989)及其片段和組合，和合成膠原及其片段。
編碼天然膠原或其片段的產物編碼核苷酸序列可以編碼包括或排除了N-前肽區、N-端肽、C-端肽或C-前肽的片段或其各種組合。
編碼合成膠原及其片段的產物編碼核苷酸序列優選編碼具有如下通式的多肽或肽(A)l-(B)m(Gly-X-Y)n-(C)o-(D)p，其中，Gly是甘氨酸，X和Y表示相同或不同的胺基酸，Gly-X-Y三聯體與Gly-X-Y三聯體之間X和Y可以不同，不過，其中的Y必須≥1個脯氨酸，A和D是多肽或肽結構域，它可以包括或不包括三股螺旋形成的(Gly-X-Y)n重複序列，B和C是間插序列，它不包括三股螺旋形成的(Gly-X-Y)n重複序列，n是2-1500(優選為10-300)，而l，m，o和p各自獨立地選自0或1。
所述產物編碼核苷酸序列可以包括一個編碼分泌信號的序列，以便分泌由所述產物編碼核苷酸序列表達的多肽或肽。
產物編碼核苷酸序列的表達可以由組成型酵母啟動子序列(例如，ADH1(Hitzeman等，1981，Pihlajaniemi等，1987)，HIS3(MahadevanStruhl，1990)，786(作者不詳，1996革新5，15)和PGK1(Tuit等，1982))啟動，不過，更優選的是由諸如GAL1-10(Goff等，1984)、GAL7(St.JohnDavis，1981)、ADH2(Thukral等，1991)和CUP1(Macreadie等，1989)的誘導型酵母啟動子序列。
所述編碼P4Hα亞基和β亞基的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可源於一切動物，不過，其優選源於禽類或哺乳動物，特別是人(Helaakoski等，1989)。還可以設想所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可源於不同的物種。另外，編碼P4Hβ亞基的第二核苷酸序列可包括一個編碼內質網(ER)保留信號(例如，HDEL，KDEL，KEEL)的序列，該序列有或沒有其它引導信號，以便所述P4H能在ER、細胞質或目標細胞器中表達，或者能被分泌。
所述第一和第二核苷酸序列的表達可以由上述組成型或誘導型酵母啟動子序列啟動。不過，據信用相同或不同的具有相同的誘導特性的啟動子序列，以協調的方式實現所述α亞基和β亞基的表達是有利的，但優選使用雙向啟動子序列。相應地，優選用GAL1-10酵母雙向啟動子序列表達所述第一和第二核苷酸序列，不過，其它雙向啟動子序列同樣適用。
可將多拷貝的第一、第二和/或產物編碼核苷酸序列導入酵母宿主細胞(例如，存在於YAC載體上或整合到宿主染色體中)。以多個拷貝提供所述產物編碼核苷酸序列可能是特別有利的，因此，優選將所述產物編碼核苷酸序列導入高拷貝數質粒(例如，YEp質粒)。
所導入的的第一、第二和產物編碼核苷酸序列可以攜帶在一個或幾個穩定保持和分離的DNA分子上。當由一個以上的DNA分子攜帶時，所述DNA分子可以是宿主染色體的組合和/或含CEN序列的載體與高拷貝數載體的組合。用以下DNA分子轉化適用於本發明方法的酵母宿主細胞的某些特例1.YEp-P3+pYEUra3-αβ，2.YEp-P3+pYACαβ3.YEpCEN-P3+pYEUra3-αβ4.YEpCEN-P3+pYACαβ5.pYAC-P3+pYACαβ6.pYAC-P3+pYEUra3-αβ7.pYACαβ-P3；其中，P3表示產物編碼核苷酸序列，α和β分別表示編碼所述P4Hα亞基和β亞基的核苷酸序列，CEN表示導入的著絲粒序列。所述pYEUra3和pYAC載體包括CEN序列。
可以從通過包括標準層析和沉澱技術在內的技術由培養的酵母宿主細胞中純化用本發明方法生產的三股螺旋蛋白產品(MillerRhodes，1982)。對膠原來說，可以使用胃蛋白酶處理和NaCl沉澱技術(MillerRhodes)。可將免疫親和層析用於純化含有合適的識別序列的結構，所述序列如能被M1或M2單克隆抗體識別的Flag序列，或三股螺旋表位，如能被抗體2G8/B1識別的表位(Glattauer等，1997)。
適用於本發明方法的酵母宿主細胞可選自某些屬，這些屬包括但不限於酵母屬、克魯維酵母屬、裂殖酵母屬、Yarrowia和畢赤酵母屬。特別優選的酵母宿主細胞可選自釀酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(K.lactis)、粟酒裂殖酵母(S.Pombe)、Y.Lipolytica和巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)。
如上文所述，特別優選的是通過用一個或幾個YAC載體轉化將所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列導入酵母宿主細胞，YAC載體是線形DNA載體，它包括酵母CEN序列，至少一個通常源於酵母的自主複製信號(例如，ars)，以及端粒末端(通常也是源於酵母)。它們通常還包括一個諸如URA3、TRP1、LEU2、或HIS3的酵母選擇標記，而且，在某些場合下還包括赭石抑制基因(例如，sup4-o)該基因可以在需要腺嘌呤的菌株(即由於赭石終止密碼子提前而產生的腺嘌呤基因突變)中進行紅色/白色選擇。更常見的是包括兩個酵母選擇標記，在人工染色體的每個臂上各有一個(每一個臂之間由CEN隔開)。這樣可以僅選擇到含有如下YACs的轉化宿主，在所希望的限制克隆位點上具有感興趣的導入序列。就是說，正確插入感興趣的序列(例如，表達盒)可重新連接被限制的YAC的兩臂，因此使得轉化體成為兩種標記的原養型。YACs被設計成能把大的外源核苷酸序列(即100kb或更大數量級的)導入酵母宿主細胞。本發明人將在下面證實所述YACs可用於多個外源核苷酸序列(例如，編碼天然膠原和P4Hα亞基和β亞基的核苷酸序列)的穩定表達。
在本發明的某些實施方案中，優選通過用一個或兩個YEp載體轉化將所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列中的一個或幾個(但不是全部)導入所述酵母宿主細胞。YEp載體帶有酵母2μ質粒的全部或部分，但至少具有複製起點(ori)。所述載體還包括諸如HIS3、LEU2、TRP1、URA3、CUP1或G418抗性的酵母選擇標記，而且，通常還含有一個用於在大腸桿菌(E.coli)中操作的獨立的ori，一般為ColE1，和諸如氨苄青素素抗性的標記。所述載體具有高拷貝數，例如每個細胞有20-400個拷貝，而且，通常能有效分離。在細胞分裂期間的穩定性取決於同樣含有源於所述2μ質粒的REP2/STB位點的質粒。不過，穩定性不如所述宿主的內源2μ質粒好，特別是在誘導異源基因表達時。穩定性還會隨著質粒大小的增加而下降(Wiseman，1991)。
在本說明書中，「包括」(comprise，comprises和comprising)一詞意在涵蓋特定的成分或特徵或成分或特徵組，包括或不包括其它成分或特徵或成分或特徵組。
下面將通過結合以下非限定實施例和附圖的方式說明本發明。
附圖的簡要說明

圖1圖解表示表達載體pYEUra3.2.12β#39α#5的構建(標記為pYEUra3-Mβα)。
圖2表示COLIII 1.6kb DNA的核苷酸序列。
圖3圖解表示通過PCR分離到的人膠原III基因片段。還示出了用於以下實施例的1.6kb DNA。應當理解，可用圖中示出的其它片段取代這些實施例中的COLIII 1.6kb DNA。
圖4圖解表示表達載體YEpFlagCOLIII 1.6kb(標記為YEpFlagC-3)的構建。
圖5圖解表示pYAC5βα的構建。
圖6圖解表示pYAC5βα-COLIII 1.6kb的構建。
圖7表示合成膠原製品的構建。
圖8提供了SYN-C3的核苷酸序列及其編碼的多肽的胺基酸序列。
實施例例1構建用於協同共表達脯氨醯-4-羥化酶的α和β亞基的酵母載體。
酵母表達載體的生產pYEUra3(Clontech)含有用於GAL1-10表達的雙向啟動子。在沒有葡萄糖的條件下，通過用半乳糖誘導，pGAL1可以高水平表達由以正確取向插入MCS(多克隆位點)[XhoI、SalI、XbaI或BamHI位點]的DNA編碼的一切蛋白，只要有一個ATG起始密碼子。對pGAL10來說，如果待表達的DNA序列是以符合GAL10的ATG密碼子讀框的形式插入，而且，待表達的DNA序列是插入EcoRI位點，則會發生由半乳糖誘導的表達。
為了將EcoRI位點用於克隆，使插入片段不必符合GAL10的ATG讀框的形式表達，必須修飾pYEUra3，以除去GAL10的起始密碼子。所述目的是這樣實現的。以pYEUra3作模板，並使用引物3465[5』CTG.TAG.Agg.atc.cCCGGG.TAC.GGA.GC-3』，其中，由小寫字母所表示的核苷酸編碼一個BamHI位點]和引物1440[5』TTA.TAT.Tga.att.cTC.AAA.AAT.TC3』，其中，由小寫字母所表示的核苷酸編碼一個EcoRI限制位點]製備PCR片段。引物1440將一個EcoRI位點導入pYEUra3，使其位於GAL10的起始ATG前面。用BamHI和EcoRI限制該PCR片段，並將其克隆到同樣用BamHI和EcoRI消化過的pYEUra3上，用缺少ATG的BamHI和EcoRI片段取代含有ATG起始密碼子的BamHI和EcoRI片段，以生成質粒pYEUra3.2.12。然後可將該EcoRI位點用作克隆位點，為此，必須通過使MCS位於啟動子的另一端而由插入的DNA序列提供一個起始密碼子，從而將其置於雙向啟動子pGAL1-10控制之下，並使其表達因DNA序列插入該啟動子另一端的MCS位點而能由半乳糖誘導。將DNA序列克隆到MCS和EcoRI位點在用半乳糖誘導時可由所述雙向啟動子進行協同表達。
提取編碼所述P4H的α亞基和β亞基的DNA分子使用引物1826[5』-TGT.AAA.ATT.AAA.gga.tcc.CAA.AG.ATG.TGG.TAT-3』，小寫字母編碼BamHI位點，ATG為α亞基的起始密碼子]和引物1452[5』-GCCG.gga.tcc.TG.TCA.TTC.CAA.TGA.CAA.CGT-3』，小寫字母編碼BamHI位點，TCA翻譯終止密碼子]由cDNA(Clontech Human KidneyQuik CloneTMcDNA Cat.#7112-1)PCR擴增P4H的α亞基。得到了兩種同種型，並將其克隆到貯藏載體pBluescriptII SK+[StratageneCat.#212205]的BamHI位點，以得到pSK+α1(I型)和pSK+α2(II型)。在編碼所述α亞基的DNA上無BamHI位點。用於分泌的信號序列存在於兩種形式的BamHI片段上。
將引物對2280[5』-AC.TGG.ACG.GAT.CCC.GAG.CGC.CCC.GCC.TGC.TCC.GTG.TCC.GAC.ATG-3』]和2261[5』-G.GTT.CTC.CTT.ggt.gac.cTC.CCC.TT-3』，其中，由小寫字母表示的核苷酸編碼BstEII位點]用於β亞基的氨基末端部分，將引物對2260[5』-GAA.GGG.GAg.gtc.acc.AAG.GAG.AAC-3』，其中，由小寫字母表示的核苷酸編碼BstEII位點]和1932[5』CC.TTC.AGG.ATC.CTA.TTA.GAC.TTC.ATC.TTT.CAAC.AGC-3』]用於β亞基的羧基末端部分由cDNA(Clontech Human Kidney Quik CloneTMcDNACat.#7112-1)PCR擴增P4H的β亞基[又被稱為PDI/蛋白二硫化物異構酶][Pihlajaniemi等，1987]。用BstEII消化β亞基的以上兩個PCR片段，然後再連接在一起，以生成編碼完整β亞基的單一片段。然後用引物2280[5』-AC.TGG.Acg.gat.ccC.GAG.CGC.CCC.GCC.TGC.TCC.GTC.TCC.GAC.ATG-3』，其中，ggatcc編碼BamHI位點，ATG為β亞基的起始密碼子]和引物1932[5』-CC.TTC.Agg.atc.cTA.TTA.GAC.TTC.ATC.TTT.CAC.AGC-3』，其中，ggatcc編碼BamHI位點，TTA為β亞基的翻譯終止密碼子]擴增該片段，再克隆到pBluescript SKII+的BamHI位點，以得到貯藏載體pSK+β。隨後，用引物2698[5』-CTA.GTT.gaa.ttc.TAC.ACA.ATG.CTG.CGC.CGC.GCT.CTG.CTG-3』，其中，gaattc編碼EcoRI位點，而ATG為β亞基的起始密碼子]和2699[5』-GCA.ATG.gaa.ttc.TTA.TTA.CAG.TTC.GTG.CAC.AGC.TTT-3』，gaattc編碼EcoRI位點，由TTA.TTA.提供兩個翻譯終止密碼子，而由GTG將賴氨酸[K]殘基換成組氨酸[H]殘基，以提供一個天然酵母ER保留信號HDEL(即His.Asp.Glu.Leu)，而不是哺乳動物KDAEL ER保留信號]擴增pSK+β的BamHI片段。然後將所得到的PCR片段平端克隆到pCRScript[Stratagene，Cat.#211190]的SrfI位點，以生成pCRScriptβ。通過EcoRI消化從pCRScriptβ中回收含有β亞基的EcoRI片段，然後再將該片段克隆到pCRScript的EcoRI位點，以生成pCRScriptβEcoRI#4。
構建包括編碼P4H的α亞基和β亞基的片段的酵母表達載體從pCRScriptβEcoRI#4的EcoRI消化產物中以EcoRI片段形式獲得所述β亞基的片段。將該EcoRI片段克隆到pYEUra3.2.12的EcoRI位點，以生成質粒pYEUra3.2.12β#39。用BamHI將源於pSK+α1的α亞基片段從pSKα1上重新切除，並克隆到pYEUra3.2.12β#39的BamHI位點，以生成pYEUra3.2.12β#39α#5(圖1)。所述β亞基片段是受pGAL10控制，而α亞基片段是受pGAL1控制。這是一種雙向啟動子，它使得脯氨醯-4-羥化酶的兩個亞基能夠進行誘導的協調表達。兩種片段均提供一個天然ATG翻譯起始密碼子。所編碼的β亞基具有自身的分泌信號和位於所述蛋白的羧基末端的HDEL內質網保留(ER)序列。儘管所編碼的具有其自身信號序列的α亞基沒有ER保留信號，不過它可以通過與β亞基的相互作用而得以保留。
例2膠原片段和脯氨醯-4-羥化酶(α和β亞基)在酵母中的協同共表達和III型羥化膠原的合成。
通過PCR製備1.6kbp的重組膠原片段，所使用的引物1989[正向引物5』-gct.agc.aag.ctt.GGA.GCT.CCA.GGC.CCA.CTT.GGG.ATT.GCT.GGG-3』]和1903[反向引物5』-tcg.cga.tct.aga.TTA.TAA.AAA.GCA.AAC.AGG.GCC.AAC.GTC.CAC.ACC-3』]與III型膠原αI鏈(COL3A1)的一部分同源。用於提取III型膠原α1鏈片段的模板是用獲自cDNA文庫[HL1123nλMaxl Clontech Lot#1245，人腎cDNA 5』-片段文庫]的Witzard純化DNA製備的。
所分離的1.6kbp片段的實際大小為1635bp，包括1611bp的COL3A1DNA，在其兩側各有一個源於所述引物的12bp片段。1611bp的COL3A1 DNA相當於全長編碼序列的核苷酸#2713-4826(即密碼子#905-1442)，因此，包括了α-螺旋片段的一部分，C-端肽的全部，C-前肽的全部和終止密碼子*1。在圖2中提供了COL3A1 DNA的核苷酸序列。在圖3中示出了由COL3A1 DNA覆蓋的片段。在所述1.6kbp片段的5』末端添加一個NheI[GCTAGC]位點和一個HindIII[AAGCTT]位點，在其3』末端添加一個XbaI[TCTAGA]位點和NruI[TCGCGA]位點[其中，其5』末端是沿該讀框的正向，即所衍生編碼序列的氨基末端，而3』末端源於所述反向引物，相當於該基因的3』末端以及所衍生胺基酸序列的羧基末端]。由此賦予所述膠原片段便攜性。
將所述1.6kbp片段克隆到YEpFlag1[IBI產品目錄#13400]的SmaI位點上，使其編碼序列融入載體表達Flag蛋白的讀框。這樣使得當生長於乙醇上時所導入的膠原基因片段可以融合蛋白形式符合讀框地表達。平端克隆是這樣進行的在20℃下，在有SmaI的條件下連接SmaI消化的載體序列[凝膠純化]和1.6kbp PCR片段[凝膠純化，非磷酸化]，以防止載體自身的重新環化，和降低假陽性轉化體的水平。在用於克隆的膠原DNA片段上沒有SmaI，NheI，HindIII，XbaI或NruI位點。
通過限制酶分析篩選源於大腸桿菌氨苄青黴素抗性菌落的DNA的小規模小量製備物[用Bio101柱及所介紹的該柱的使用方法製備]。為了製備供分析用的適量DNA，需要10ml培養物而不是1ml培養物，因為YEpFlag質粒在大腸桿菌中不是以高拷貝數出現。
所述融合蛋白為以下形式用於定向至ER並定型酵母分泌途徑的酵母α因子信號序列，具有kex 2-內肽酶裂解位點的酵母α因子前肽，導致所有α因子胺基酸殘基被切除，並生成一個由游離的Flag標記的氨基末端，用於檢測和標記融合蛋白(8個胺基酸殘基)、連接肽(4個胺基酸殘基)、膠原螺旋(255個胺基酸殘基)、膠原C-端肽[C-tel](25個胺基酸殘基)和C-前肽[C-pro](255個胺基酸殘基)的Flag肽(有助於三股螺旋的形成)。期望的Flag-標記蛋白由547個胺基酸殘基組成，期望分子量MW為約60kDa。
所述融合蛋白在YEpFlag1中的表達受ADH2啟動子的控制，該啟動子受葡萄糖抑制，但在有乙醇(葡萄糖代謝的副產品)的條件下有活性。由於在所述載體中存在酵母2μ質粒的複製起點，在單個的酵母轉化體中存在該載體的多個拷貝，這樣，在生長期間由於消耗而解除了葡萄糖抑制以後，會導致所述1.6kbp PCR膠原片段高水平表達。該克隆方案的特有特徵是，將所述1.6kbp PCR膠原片段以錯誤取向插入後就不會生成融合產物，因為終止密碼子前面的亮氨酸殘基是由AAT編碼的。反向插入就產生了一個終止密碼子TAA錯誤插入的結果是在該蛋白終止之前僅在Flag序列之後增加一個亮氨酸編碼密碼子[終止密碼子TAA反過來就是AAT]。
所述Flag-標記融合蛋白在融合點上的胺基酸序列為N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-[Flag]-Ala-Ser-Lys-Leu-[接頭]-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-[α-螺旋]。
通過用電擊或乙酸鋰轉化或原生質球再生將所述YEpFlag膠原結構[以下稱之為YEpFlagCOLIII 1.6kb；圖4]導入色氨酸原養型酵母菌株，例如，BJ3503[pep4∷HIS3 prb-1.6R HIS3 lys2-208 trp1-101 ura3-52gal2 can1]，BJ5462[αura3-52 trp1 leu2-1 his3-200 pep4∷HIS3prb-1.6R can1 GAL]，(YGSG)HRY1-5Dα[αhis4-519 ura3-52leu2-3 leu2-112 trp1 pep4-3]或KRYD1[BJ3505xBJ5462二倍體]。獲得色氨酸營養缺陷型轉化體，按照YEpFlag表達系統[IBI產品目錄#13400]中提供的方案轉入YPHSM，YEPM或YEPD或YEPGal，YEPE，然後在選擇性培養基[缺乏色氨酸]中生長至高細胞密度。在接種後生長至3-9天時製備1ml培養物等分試樣，並通過在臺式離心機上以13000rpm的速度離心分離沉澱和上清液。將所有酵母沉澱重新懸浮於含有PMSF
的100μl凝膠加樣緩衝液[5XSDS]中，劇烈渦旋2分鐘，並煮沸5分鐘。從所述沉澱中保留900μl上清液，向其中加入100μl 5XSDS/0.002M PMSF，並以處理沉澱的方式進行處理。通過Western印跡分析分析沉澱和上清液20μl等分試樣，該分析是在將酵母SDS-PAGE總蛋白或上清液(培養基)轉移到硝酸纖維素上並在印跡裝置中對該濾膜進行預雜交之後完成的。Western印跡分析是用α-Flag Mab M1[抗N-末端游離Flag](國際生物技術公司(Eastman Kodak)產品目錄號IB13001)或M2[抗Flag](國際生物技術公司(Eastman Kodak)產品目錄號IB13010)進行的。
Western印跡證實了一個大約60kDa的蛋白帶的存在。這是含有Flag-螺旋-C-tel-C-pro的蛋白融合體的預計大小。在遷延溫育以後，Flag效應抗體可在培養基中檢測到融合產物的存在。用M1抗體對沉澱和培養基上清液進行檢測證實α因子前導序列被完全切除了。未觀察到具有α因子前片段(糖基化或未糖基化)的前體形式。
獲自未轉化酵母宿主的蛋白未獲得能與M1或M2雜交的相當於60kDa的帶。在使用僅用YEpFlag(無插入片段)轉化的酵母時，在沉澱中得到了雜交帶，但只是用M2 Mab得到的。這些帶相當於未分泌的帶有C-末端Flag的α-前片段及其各種糖基化形式。在上清液中未檢測到Flag，但這是預料中的，因為它僅有8個胺基酸長。在有葡萄糖的條件下，未觀察到由ADH2啟動子啟動的任何結構的表達。
還可將YEpFlagCOLIII 1.6kb共導入(共轉化)諸如BJ5462和KRDY1的酵母菌株，該菌株可與pYEUra3[Clontech][pYEUra3及其衍生物含有雙向GAL1-10啟動子。ADH2和GAL1-10啟動子都受葡萄糖的抑制。GAL1-10啟動子受半乳糖誘導]或pYEUra3.2.12[所述Clontech親代載體的一種改進形式，它能將基因克隆到EcoRI位點，而且不必使所導入的基因處於正確讀框內]或pYEUra3.2.12β#39[其中，編碼β亞基(相當於脯氨醯-4-羥化酶的蛋白二硫化物異構酶)的DNA被克隆到pYEUra3.2.12的EcoRI位點，置於GAL10啟動子的控制之下]或pYEUra3.2.12β#39α#5[其中，編碼P4H的α亞基的DNA被克隆到pYEUra3.2.12β#39的BamHI位點，置於GAL10啟動子的控制之下]一起生長在半乳糖上。
在缺乏色氨酸或尿嘧啶或同時缺乏色氨酸和尿嘧啶的培養基上選擇轉化子。與處理上面所獲得的攜帶YEpFlag或YEpFlagCOLIII 1.6kb的色氨酸轉化體的方法一樣，先讓轉化體生長於選擇培養基中，再生長於YPHSM、YEPM、YEPD、YEPG或YEPE中，並在4天之後加入半乳糖，使其終濃度為2％、0.5％或0.2％。按上述方法通過Western印跡分析分析總酵母蛋白或上清液，所不同的是，還使用了第三種MAb[抗β亞基的5B5](Dako公司，產品目錄號M877)。
與上文處理由單質粒轉化獲得的轉化體的情形一樣，在用MAb M1或M2篩選時，Western印跡分析證實了在由YEpFlagCOLIII 1.6kb轉化的trp-或trp-ura-酵母中存在大約60kDa的帶，而YepFlag轉化子沒有該帶。
只有在用半乳糖進行誘導以後、而且只有當半乳糖的濃度為0.2-0.5％而不是2％的情況下，在用抗β亞基MAb 5B5篩選時，分析還證實了在由pYEUra3.2.12β#39或pYEUra3.2.12β#39α#5或由其加上YepFlag或YEpFlagCOLIII 1.6kb轉化的ura-或ura-trp-(但不是trp-)酵母中存在大約60kDa的帶。β亞基的預計大小也是60kDa。在單用pYEUra3.2.12β#39或pYEUra3.2.12β#39α#5轉化的尿嘧啶營養缺陷型酵母中，用M1或M2檢測不到該帶。
在實驗時，沒有用於檢測由存在於pYEUra3.2.12β#39α#5上的雙向啟動子GAL1、10啟動的α亞基表達的抗體，但由於GAL1和GAL10的啟動子通常是共誘導的，而且在酵母中是受同一個UAS(上遊激活序列)控制，因此，推測在已證實有β亞基表達的地方α亞基也會轉錄和表達。為了驗證這一推測，在用0.2％半乳糖進行誘導並在YPHSM上至少生長四天以後，檢測pYEUra3.2.12β#39α#5/YEpFlagCOLIII 1.6kb共轉化體產生功能性P4H的能力。在明確證實Flag膠原表達以後加入半乳糖，其表達是通過Western印跡中酵母蛋白與M1或M2的陽性反應和抗β亞基的MAb 5B5的反應的缺乏證實的。在用半乳糖誘導以後(16hr)，再次檢測了蛋白，分別證實了M1或M2效應帶和5B5效應帶的存在。在進行SDS-PAGE之後，將蛋白轉移到PVDF膜上，並將該膜切成條。對含有源於相應於60kDa效應部位的部分的膜條進行水解和胺基酸分析。胺基酸分析證實了在用0.2％半乳糖誘導以後，在用YEpFlagCOLIII 1.6kb和pYEUra3.2.12β#39α#5共轉化的酵母共轉化體材料中存在羥脯氨酸，在有或沒有半乳糖的條件下，在源於對照樣品的蛋白中均未檢測到羥脯氨酸。
所用的培養基含有源於牛蛋白水解物的腖，但在生長於該培養基上的全酵母或任何單一轉化(僅有一個載體)的酵母中均未發現羥脯氨酸。只有在酵母共轉化體的60kDa帶中，而且只有在加入半乳糖時才能檢測到羥脯氨酸。其中Flag檢測膠原得到表達的未誘導轉化體[無半乳糖]在轉移以後，在其從PVDF上切除的60kDa帶中不含任何羥脯氨酸。羥脯氨酸僅存在於60kDa部分，而不存在於該印跡的其它部分。
所述確切證據是，在用半乳糖誘導pYEUra3.2.12β#39α#5以後，在酵母中生成了一種產物，該產物能羥化共表達Flag-標記膠原片段上的脯氨酸殘基。上述活性不存在於未轉化的酵母或用pYEUra3.2.12β#39轉化的酵母[無α亞基]或生長於乙醇或葡萄糖上的未誘導酵母中。
上述在酵母中共表達生產羥化膠原的方法的一個突出優點是，在共轉化體中三個基因可以協調表達。另一個優點是，α和β亞基本身是協調表達的。第三個優點是，αβ表達載體(即pYEUra3.2.12β#39α#5)含有一個著絲粒序列，而且其行為如同一個微型染色體。因此，該載體是非常穩定的，而且不需要選擇壓力來保持其穩定性。在酵母中取消選擇壓力似乎不會影響YEpFlag膠原結構的穩定性，因為它具有很高的拷貝數量，但顯而易見的是，如果α、β和膠原片段被分別克隆在多拷貝載體上的話，僅有在缺乏選擇壓力的條件下保持單一質粒的能力是重要的，而不是平衡選擇壓力對三種獨立質粒的影響重要。另外，用一個雙向啟動子同步表達α和β亞基優於用不同啟動子、在不同質粒上、以不同量表達它們。所述α亞基可能需要合成等量或較大量的β亞基，以便正確組裝成功能性P4H(α2β2)酶，而且，協調表達似乎是確保上述目的實現的有效機制。
*1[III型膠原α1鏈的密碼子編號ATG，1號密碼子；1號密碼子-24號密碼子，信號序列；25號密碼子-116號密碼子，α-螺旋序列；117號密碼子-130號密碼子，N端肽序列；131號密碼子-1161號密碼子，α-螺旋序列；1162號密碼子-1186號密碼子，C-端肽；1187號密碼子-1441號密碼子，C-前肽；1442號密碼子，終止]和[III型膠原α1鏈的相應的核苷酸編號1-72號核苷酸，信號序列；73-348號核苷酸，N-前肽序列；349-390號核苷酸，N-端肽；391-3983號核苷酸，α-螺旋區；3984-4058號核苷酸，C-端肽；4059-4623號核苷酸，C-前肽序列；4824-4826號核苷酸，終止密碼子]。
例3用酵母人工染色體[YACs]進行脯氨醯-4-羥化酶[P4H]的α和β亞基的協調表達用BamHI消化pYAC5[11454bp](Kuhn和Ludwig，1994)，以釋放出位於2個端粒末端之間的HIS3基因[1210bp]，並用SalI-NruI消化以產生兩個片段[左臂片段1，5448bp和右臂片段2，4238bp]，對這兩個片段進行凝膠純化。片段1是BamHI-端粒末端-大腸桿菌起點-β-內醯胺酶基因[氨苄青黴素抗性]-TRP1-ARS1-CEN4-tRNAsup-o-SalI。片段2是BamHI-端粒末端-URA3-NruI。
用SalI-EcoRV消化pYEUra3.2.12β#39α#5，以生成SalI-XbaI-BamHI-α-ATG-BamHI-pGAL1-10-EcoRI-ATG-β-EcoRI-SmaI-EcoRV形式的P4H表達框片段[4864bp]，對其進行凝膠純化。將這一受半乳糖誘導型雙向啟動子控制的編碼P4H的α和β亞基的表達框片段與用BamHI-SalI-NruI消化pYAC5所產生的片段1和2連接在一起，並將連接混合物用於通過乙酸鋰轉化方法轉化以下酵母菌株BJ2407[a/αprb1-11222/prb1-1122 prc1-407/prc1-407 pep4-3/pep4-3 leu2/leu2trp1/trp1 ura3-52]，KRYD1[a/αura3-52/ura3-52 trp1-Δ101/trp1lys2-208/LYS2 HIS3/his3Δ200 gal2/GAL2 can1/can1pep4∷HIS3/pep4∷HIS3 prb1Δ1.6R/prb1Δ1.6R]，GY1[αleu2 ade1trp1 ura3]，JHRY1-5Dα[αhis4-519 ura3-52 leu2-3 leu2-112 trp1pep4-3]，和YPH150[α/a ura3-52/ura3-52 lys2-801a/lys2-801aade1-101o/ade1-101o leu2Δ1/leu2Δ1 trp1-Δ63/trp1-Δ63 his3Δ200/his3Δ200]。還用由BamHI消化過的pYAC5和未消化過的pYAC5轉化酵母菌株。
獲得所有菌株的Ura+Trp+共轉化體，其中，pYAC5的兩個片段各自攜帶TRP1[SalI-CEN4-TRP1-BamHI][片段1]或URA3[NruI-URA3-BamHI][片段2]作為轉化在YAC的每一個臂上的選擇標記，通過將P4H表達框插入SalI-EcoRV位點把這兩個片段連接在一起。該載體被命名為pYAC5βα(圖5)。該載體為如下形式BamHI-端粒-URA3-NruI/EcoRV[兩個位點均被破壞]-β-ATG-pGAL10-1-ATG-α-SalI-tRNAsup-CEN4-ARS1-TRP1-AMPr-起點-端粒-BamHI。CEN4序列的存在意味著該載體在複製期間的行為如同一個穩定的染色體，並且在有絲分裂和減數分裂時每個細胞至少分配一個拷貝[與pYEUra3.2.12β#39α#5的情況相同]。著絲粒末端意味著該載體是線形的和穩定的。
將轉化體和對照[僅有pYAC5(環狀)，用BamHI消化使pYAC5線形化]影印在覆蓋選擇培養基[缺乏尿嘧啶和色氨酸的SD完全培養基]或加富培養基[YEpD]的硝酸纖維素濾膜上，並在30℃下溫育2-5天，直到鋪滿。將濾膜轉移到含有半乳糖[2％]而不是葡萄糖的選擇培養基或含有半乳糖[2％]的加富培養基以及葡萄糖培養基平板上，並在30℃下生長2-72小時。在培養結束時，將菌落裂解於0.1％SDS-0.2N NaOH-0.1％β-巰基乙醇上，用水洗滌，並用Blotto封閉。通過讓處理過的濾膜與對α亞基專一的Mab[Mab 9-47H10](ICN生物藥品公司，產品目錄號631633)和對β亞基專一的Mab[Mab 5B5]雜交證實P4H的α亞基和β亞基的產生。用pYAC5βα轉化的並用半乳糖誘導的菌落被證實能與抗P4H亞基的MAb雜交，表明可由雙向GAL1-10啟動子協調產生α和β。對照濾膜和對照酵母不會對P4H MAbs產生反應。生長在葡萄糖[雙向GAL1-10啟動子的一種抑制劑]上的帶有pYAC5βα的酵母轉化體也不會產生陽性反應。
在含有缺少ura和trp選擇培養基的10ml液體培養基或加富培養基[含有葡萄糖、甘油或棉子糖]中鑑定上述篩選方法中的陽性轉化體。將等分試樣轉移到含有0.2-2％半乳糖的誘導培養基[選擇或加富培養基]中。其中的葡萄糖是碳源，在誘導之前在無菌水中洗滌細胞沉澱。在30℃下繼續生長2-20小時，然後收集細胞沉澱，懸浮於加樣緩衝液中，在SDS-PAGE上分離全酵母蛋白，並進行Western印跡。用blotto封閉濾膜，並與抗P4H的兩個亞基的MAbs雜交。只有含有pYAC5βα的並用半乳糖誘導過的酵母轉化體能產生預期的60kDaα和β亞基帶。這表明P4H表達框業已功能性插入到pYAC5裡。將P4H表達框插入到pYAC裡具有雙重優點[1]與pYEUra3.2.12β#39α#5的情形一樣，CEN序列的存在意味著在除去生長於加富培養基中的選擇壓力後該載體可穩定保持在該系統中，這可以通過提高細胞密度而提高產量，和[2]pYAC5βα結構可在隨後將多個不同的三股螺旋蛋白表達框插入。
例4膠原/三股螺旋蛋白片段在多拷貝質粒上的協調表達和P4H亞基在含有pYAC5βα的酵母轉化體中的表達。
用YEpFlagCOLIII 1.6kb或單用YEpFlag轉化含有pYAC5βα或pYAC5的酵母宿主菌株。所產生的含有膠原的載體是環狀的和多拷貝的。在這種情況下，由於YEpFlagCOLIII 1.6kb和pYAC結構均含有相同的選擇標記，通過用抗Flag的MAbs[M1或M2]與菌落雜交可以鑑定產生Flag標記的膠原的酵母轉化體。篩選菌落是否攜帶額外拷貝的bla基因[多拷貝]，該篩選是這樣進行的通過PADAC測定鑑定能產生大量β-內醯胺酶的菌落(Macreadie等1994)。在其它例子中所述多拷貝質粒可以使用除URA3或TRP1以外的不同選擇標記，這些標記存在於YAC的每一個壁上。按照例1所述方法對攜帶pYAC5βα和YEpFlagCOLIII 1.6kb的各種共轉化體類型進行分析，分析其膠原產生，P4H亞基產生，和P4H活性。然後對含有pYAC5βα+YEpFlagCOLIII 1.6kb的共轉化體按上面實施例的方法進行篩選，尋找羥化膠原，以確定Western印跡中的60kDa帶，該帶相當於抗α和β以及Flag的MAbs，以上操作是在誘導以後進行的。僅在用半乳糖誘導以後才鑑定到α和β亞基。僅在誘導P4H的α和β亞基之後才鑑定到羥化蛋白。
例5將膠原表達框導入pYAC5和pYAC5βα。
通過用ScaI消化將YEpFlag線性化，所述內切酶可以裂解β-內醯胺酶的氨苄青黴素抗性基因[bla]上的單一識別位點，在1.6kb的膠原插入片段上不存在ScaI位點，所以可將ScaI用於將YEpFlagCOLIII 1.6kb線性化。將線性DNA用於轉化含有pYAC5或pYAC5βα的酵母。通過同抗Flag的MAbs[M1或M2]進行的菌落雜交鑑定能產生Flag標記的膠原的酵母轉化體。還鑑定到了帶有額外拷貝bla基因[多拷貝]的菌落。通過PEDAC測定發現能產生較大量的β-內醯胺酶的菌落，已將一個拷貝的YEpFlagCOLIII 1.6kb插入到宿主菌株的pYAC5或pYAC5βα中，相當於對Mabs M1或M2呈陽性的菌落。提高了的β-內醯胺酶活性是由基因擴增所致，這種擴增是由於位於YEpFlagCOLIII 1.6kb上的線性化bla基因和位於pYAC上的bla基因之間的同源重組而產生的。通過插入YEpFlagCOLIII 1.6kb載體的pYAC5或pYAC5βα中所產生的新的質粒被命名為pYAC-COLIII 1.6kb和pYAC5βα-COLIII 1.6kb(圖6)。進行表達實驗，只有在YAC[pYACβα-COLIII 1.6kb上含有所有三個基因，並且用半乳糖誘導過P4H的菌株能產生羥化膠原。
例6合成膠原蛋白的克隆和表達。
披露了一種製備「合成/新型」膠原蛋白的方法，該方法包括在體外組建編碼肽GPP.GPP.GXY的寡核苷酸重複序列(其中XY＝LA，ER，PA或AP)。對合成膠原序列進行工程操作，使其含有高百分比的酪氨酸殘基，因為該殘基已被證實為能賦予膠原分子熱穩定性。對XY位置上的殘基對選擇是特定的(即LA，ER，PA或AP)，因為從統計學上看它們以較大的量出現在原纖膠原中。
可以把編碼GPP.GPP.GXY的合成寡核苷酸的混合物連接在一起，以形成不同長度的DNA片段，該DNA片段編碼具有不同分子大小和不同物理特徵的合成膠原蛋白。可將這些合成基因片段克隆到各種表達載體中，以便隨後在酵母中產生膠原產物。在圖7示出了構建編碼膠原的合成寡核苷酸的方法的簡圖，其中僅以說明的形式示出了XY為ER，LA，AP，PA。
通過將所述寡核苷酸連接在一起合成了所述合成寡核苷酸，並製備了含有各種長度基因片段的若干文庫(最大可見DNA長度大約為1000bp，編碼大約350個胺基酸殘基的多肽)。
例7構建在酵母中穩定表達的合成羥化三股螺旋蛋白根據其已知的結合和活化血小板的能力選擇一段III型膠原[通過靠近-Gly-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Leu-Arg的整聯蛋白結合位點進行]。在其N-末端一側包括一個由5個GXY-X-Y重複組成的片段，而在其C-末端一側包括7個GXY-X-Y重複，以產生包含在所述合成片段中的基本重複單位。該重複的序列為GGKGDAGAPGERGPP-GLAGAPGLR-GGAGPPGPEGGKGAAGPPGPP。這相當於COL3A1基因[Met＝1]裡的殘基637-681(核苷酸1909-2043)。在該DNA的5』末端包括一個EcoRI和NheI位點，以便由NheI位點形成一個起始甲硫氨酸。因此其氨基末端的序列為MGAPGAP，其中，GAPGAP是天然序列，該序列位於COL3A1中的重複序列旁側。通過接頭將所述重複與第二種重複連接，由此引入一個Bsp120I位點，供以後操作使用，並在第一和第二重複單位之間提供GGP序列。通過一個接頭將所述第二個重複和第三個重複連接，由此引入一個DssHII位點[也是為了以後的操作]並產生胺基酸序列GAR。第三個重複的旁側有兩個額外的GPP三聯體，一個GCC三聯體以及最終的GLEGPRG。這是包含能提供XhoI、SacI和NheI位點的序列的結果。包含這些位點使得在以後階段的克隆具有較大的靈活性。由NheI位點提供了一個符合讀框的終止密碼子。
所述合成片段是通過PCR由抗COL3A1的引物以三個片段形式開始的。片段1為EcoRI-NheI-Met-[GAP]2-[重複]1-Bsp120I。用於該目的的引物是5』-aattccatgggtgctccaggtgctcc-3』[上遊][引物U101]和5』-ggcc-acctggtggacctggtgg-3』][下遊][引物D101]。第二個PCR片段是使用引物5』-ggcccggtggtaagggtgacgc-3』[上遊][引物102]和5』-cgcgc-acctggtggacctgg-3』][下遊][引物D102]。第三個重複所使用的引物對是5』-cgcgc-ggtggtaagggtgacgctgg-3』[上遊][引物U103]和5』-acaaccctggtggacctggtggacctggtggacctgggtgg-3』[下遊][D103]。對來自PCR反應的以上三個片段進行凝膠純化，並連接在一起。將來自連接混合物的DNA用作另一輪PCR的模板，該PCR使用引物U101和位於3』末端的新的引物[5』-ctagccccgcggaccctcgagaccacaacaaccctggtgg-3』][下遊][引物D104]。產生一個大約為500bp的帶，並進行凝膠純化，用EcoRI-NheI消化，並同同樣用EcoRI-NheI消化過的pYX141(Ingenous產品目錄號MBV-025-10)[LEU2-CEN-p786]連接，然後轉入大腸桿菌。通過PCR篩選轉化體，使用用於第二個片段的引物，對源於陽性菌落的DNA進行少量製備，並通過用EcoRI-NheI消化進行篩選，尋找大約500bp插入片段的存在。這種貯存質粒被命名為pYX-SYN-C3-1。將該EcoRI-NheI片段轉入pYX243[2u-LEU2-pGAL](Ingenous產品目錄號MBV-035-10)中，以產生pYX-SYN-C3-2，並將該質粒導入酵母宿主細胞中，該細胞包括編碼攜帶的P4Hα和β亞基的核苷酸序列[pYEUra3.3.12β#39α#5或pYACαβ]。用半乳糖誘導以後的表達是通過使用MAb 2G8/B1(WerkmeisterRamshaw，1991)測定的，所使用的抗體能識別序列GLAGAPGLR。還要將源於pYX-SYN-C3-2的EcoRI-SacII片段導入YEpFlag的EcoRI-SacII片段，以產生YEpFlag-SYN-C3，該質粒也被導入酵母宿主細胞，該細胞在用半乳糖誘導時能表達P4H。通過Western印跡分析在用半乳糖誘導過的酵母中檢測到大約為18kDa的產物[SYN-C3的預期大小]。
在圖8中提供了SYN-C3的核苷酸序列，同時還提供了其編碼產物的胺基酸序列。
例8使用除釀酒酵母以外的酵母。
GAL1-10啟動子能在克魯維酵母中起作用，而ADH2啟動子能在粟酒裂殖酵母中以組成形式表達。通過將所述表達框轉移到合適載體中，其它的酵母宿主也可以使用。例如，已在某些場合下證實了乳酸克魯維酵母具有對重組產物的較弱的蛋白裂解活性。另外，巴斯德畢赤酵母可被用於將αβ的表達框多次整合到其染色體中。
為了在巴斯德畢赤酵母表達，將在前面的實施例中所披露的編碼合成三股螺旋蛋白[SYN-C3]的核苷酸序列插入巴斯德畢赤酵母載體pPIC9(Invitrogen，產品目錄號K1710-01)中的EcoRI-NotI位點[pPIC-SYN-C3]。用BglII或SalI消化該質粒，然後將其導入巴斯德畢赤酵母，在這裡它整合到分別相應於BglII或SalI的AOX1或HIS4位點。將編碼P4Hα和β亞基的核苷酸序列也導入巴斯德畢赤酵母，對於β亞基來說使用pHIL-D2(Invitrogen，產品目錄號K1710-01)的EcoRI位點，並整合到HIS4位點，對於α亞基來說使用pHIL-S1 Invitrogen，產品目錄號K1710-01)的MH1位點，隨後整合到HIS4。所有三個表達框都是受AOX1啟動子的控制，並由甲醇誘導。
例9通過利用具有不同背景的酵母由GAL1-10啟動子增強脯氨醯-4-羥化酶α和β亞基的表達，以便控制半乳糖誘導的表達。
可將質粒pYEUra3.2.12β#39α#5[編碼P4H的α和β亞基，受GAL1-10雙向啟動子的控制]導入具有以下基因型的酵母宿主細胞a或α，ura3trp1 egd1 btt1。在這些細胞中，EGD1和BTT1基因產物的缺乏，導致了由諸如GAL2、GAL4、GAL7、GAL1-10、MEL1的GAL4獨立型啟動子啟動的高水平半乳糖誘導表達(HuRonne，1994)。
用於增強表達的另一種機制是使用攜帶多拷貝GAL4正轉錄激活物的酵母宿主細胞(JohnstonHopper，1982)，由它本身控制半乳糖的誘導。這會導致增強的表達，因為不存在用於GAL1-10啟動子的轉錄激活物方面的限制。類似地，所述酵母宿主細胞可含有多拷貝的SGE1基因(Amakasu等1993)，這也會導致由半乳糖誘導啟動子進行的增強轉錄。
也可以使用所述背景的各種組合，即egd1 btt1 SGE1mc或egd1 btt1GAL4mc或egd1 btt1 SG1mcGAL4mc[其中mc表示多拷貝]。
例10用除ADH2以外的啟動子表達膠原。
可以Nh1I或HindIII-XbaI或NruI片段的形式切除YEpFlagCOL1.6kb的膠原編碼核苷酸序列，將其插入其它融合載體中，使其受其它啟動子的控制。另外，例如可以NaeI或SacI-BglII或XdaI或SpeI或SnaBI或NotI的形式切除pADH2α信號-A-前片段-Flag膠原表達框，並將其導入合適載體中，如YEplac181(GietzSugino，1988)或pMH158(Heuterspreute，1985)，以便以不同的拷貝數和宿主背景表達或導入具有CEN序列的載體中。另外，CEN序列本身可以導入YEpFlag載體。還可以用NruI將所述表達框以不帶有ADH2啟動子的形式切除，並導入合適載體的合適啟動子後面。
作為ADH2啟動子的替代物，可以使用CUP1啟動子在諸如pYELC5的載體中表達膠原編碼核苷酸序列(Macreadie等，1989)。該啟動子是通過添加銅(即硫酸銅)誘導的，並具有在共表達期間增強誘導環境和增強P4H活性的優點。可以使用的第二個啟動子是TIP1啟動子，該啟動子是通過冷休克誘導的。這裡，無需進行羥化即可提高表達膠原的穩定性，其做法是通過將生長的酵母從30℃轉移到18℃來誘導表達。
本發明方法提供了用酵母宿主細胞穩定表達三股螺旋蛋白的方式。本發明的產物可以是天然和合成膠原，天然和合成膠原片段以及天然和合成膠原樣蛋白。合成產物可能具有增強的或新的功能(例如，含有源於絲連蛋白(fibrorectin)和層粘連蛋白的RGD和/或YIGSR序列)。所述產物可用於多種目的，包括生物移植物生產，軟和硬組織增大，創傷/燒傷繃帶，用於尿失禁和胃回流的括約肌增大，牙周疾病，血管移植物，藥物輸送系統，用於天然因子的細胞輸送系統和神經再生中的導管。
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權利要求
1.一種在酵母中生產羥化三股螺旋蛋白的方法，該方法包括以下步驟將編碼P4Hα亞基的第一核苷酸序列、編碼P4Hβ亞基的第二核苷酸序列以及一個或幾個產物編碼核苷酸序列導入一種合適的酵母宿主細胞，所述產物編碼核苷酸序列編碼一種或幾種多肽或肽，這些多肽或肽在羥化以後生成所述羥化三股螺旋蛋白，所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的每一個均可操作地與啟動子序列連接；和在適於表達所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的條件下培養所述酵母宿主細胞，從而產生所述羥化三股螺旋蛋白；其中，該方法的特徵在於導入所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的步驟會導致所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列及其相應的可操作地連接的啟動子序列被攜帶在一個或幾個可複製的DNA分子上，該分子在所述培養步驟中由所述酵母宿主細胞穩定地保持並分離。
2.如權利要求1的方法，其中，所述產物編碼核苷酸序列是編碼天然膠原或其片的核苷酸序列。
3.如權利要求2的方法，其中，所述產物編碼核苷酸序列是選自COL1A1、COL1A2、COL2A1和COL3A1及片段。
4.如權利要求3的方法，其中，所述產物編碼核苷酸序列是COL3A1。
5.如權利要求1的方法，其中，所述產物編碼核苷酸序列是編碼具有如下通式的合成多肽或肽的核苷酸序列(A)l-(B)m-(Gly-X-Y)n-(C)o-(D)p，其中，Gly是甘氨酸，X和Y表示相同或不同的胺基酸，Gly-X-Y三聯體與Gly-X-Y三聯體之間X和Y可以不同，不過，其中的Y必須≥1個脯氨酸，A和D是多肽或肽結構域，它可以包括或不包括三股螺旋形成的(Gly-X-Y)n重複序列，B和C是間插序列，它不包括三股螺旋形成的(Gly-X-Y)n重複序列，n是2-1500，而l，m，o和p各自獨立地選自0或1。
6.如上述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述第一和第二核苷酸序列是由雙向啟動子序列表達的。
7.如權利要求6的方法，其中，所述雙向啟動子序列是酵母GAL1-10啟動子序列。
8.如上述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述第一和第二核苷酸序列是源於禽類或哺乳類。
9.如權利要求8的方法，其中，所述第一和第二核苷酸序列是源於人類。
10.如上述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述第二和產物編碼核苷酸序列編碼分泌信號，使所表達的P4H和產物多肽或肽是分泌性的。
11.如上述權利要求中任一項所述的方法，其中，將所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列導入酵母宿主細胞，使其出現在一個或幾個含有CEN序列的載體上。
12.如上述權利要求中任一項所述的方法，其中，將所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列導入酵母宿主細胞，使其出現在一種或幾種含有CEN序列的載體上以及一種或兩種高拷貝數載體上。
13.如權利要求11或12的方法，其中，所述一種或幾種含有CEN序列的載體選自YAC載體。
14.如權利要求12或13的方法，其中，所述一種或兩種高拷貝數載體選自YEp質粒。
15.如權利要求11的方法，其中，所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列存在於單一YAC載體上。
16.如上述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述酵母宿主細胞選自克魯維酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、Yarrowia和畢赤酵母屬。
17.一種能產生羥化三股螺旋蛋白的酵母宿主細胞，所述酵母宿主細胞包括一個編碼P4Hα亞基的第一核苷酸序列，一個編碼P4Hβ亞基的第二核苷酸序列以及一個或幾個產物編碼核苷酸序列，所述產物編碼核苷酸序列編碼一種或幾種多肽或肽，這些多肽或肽在羥化以後生成所述羥化三股螺旋蛋白，所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的每一個均可操作地與啟動子序列連接；其中，所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列及其相應的可操作地連接的啟動子序列被攜帶在一個或幾個可複製的DNA分子上，該分子由所述酵母宿主細胞穩定地保持並分離。
18.如權利要求17的酵母宿主細胞，其中，所述產物編碼核苷酸序列是編碼天然膠原或其片的核苷酸序列。
19.如權利要求18的酵母宿主細胞，其中，所述產物編碼核苷酸序列是選自COL1A1、COL1A2、COL2A1和COL3A1及片段。
20.如權利要求19的酵母宿主細胞，其中，所述產物編碼核苷酸序列是COL3A1。
21.如權利要求17的酵母宿主細胞，其中，所述產物編碼核苷酸序列是編碼具有如下通式的合成多肽或肽的核苷酸序列(A)l-(B)m-(Gly-X-Y)n-(C)o-(D)p，其中，Gly是甘氨酸，X和Y表示相同或不同的胺基酸，Gly-X-Y三聯體與Gly-X-Y三聯體之間X和Y可以不同，不過，其中的Y必須≥1個脯氨酸，A和D是多肽或肽結構域，它可以包括或不包括三股螺旋形成的(Gly-X-Y)n重複序列，B和C是間插序列，它不包括三股螺旋形成的(Gly-X-Y)n重複序列，n是2-1500，而l，m，o和p各自獨立地選自0或1。
22.如權利要求17-21中任一項所述的酵母宿主細胞，其中，所述第一和第二核苷酸序列是由雙向啟動子序列表達的。
23.如權利要求22的酵母宿主細胞，其中，所述雙向啟動子序列是酵母GAL1-10啟動子序列。
24.如權利要求17-23中任一項所述的酵母宿主細胞，其中，所述第一和第二核苷酸序列是源於禽類或哺乳類。
25.如權利要求24的酵母宿主細胞，其中，所述第一和第二核苷酸序列是源於人類。
26.如權利要求17-25中任一項所述的酵母宿主細胞，其中，所述第二和產物編碼核苷酸序列編碼分泌信號，使所表達的P4H和產物多肽或肽是分泌性的。
27.如權利要求17-26中任一項所述的酵母宿主細胞，其中，將所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列導入酵母宿主細胞，使其出現在一個或幾個含有CEN序列的載體上。
28.如權利要求17-26中任一項所述的酵母宿主細胞，其中，將所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列導入酵母宿主細胞，使其出現在一種或幾種含有CEN序列的載體上以及一種或兩種高拷貝數載體上。
29.如權利要求27或28的酵母宿主細胞，其中，所述一種或幾種含有CEN序列的載體選自YAC載體。
30.如權利要求28或29的酵母宿主細胞，其中，所述一種或兩種高拷貝數載體選自YEp質粒。
31.如權利要求27的酵母宿主細胞，其中，所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列存在於單一YAC載體上。
32.如權利要求17-31中任一項所述的酵母宿主細胞，其中，所述酵母宿主細胞選自克魯維酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、Yarrowia和畢赤酵母屬。
33.一種按權利要求1-16中任一項所述方法生產的三股螺旋蛋白。
34.一種含有按權利要求1-16中任一項所述方法生產的三股螺旋蛋白的生物材料或治療產品。
全文摘要
本發明涉及一種在酵母中生產羥化三股螺旋蛋白的方法,包括以下步驟:將編碼P4Hα亞基的第一核苷酸序列、編碼P4Hβ亞基的第二核苷酸序列以及一個或幾個產物編碼核苷酸序列導入一種合適的酵母宿主細胞,所述產物編碼核苷酸序列編碼一種或幾種多肽或肽,這些多肽或肽在羥化以後生成所述羥化三股螺旋蛋白,所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的每一個均可操作地與啟動子序列連接;在適於表達所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的條件下培養所述酵母宿主細胞,從而產生所述羥化三股螺旋蛋白;其中,該方法的特徵在於導入所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列的步驟會導致所述第一、第二和產物編碼核苷酸序列及其相應的可操作地連接的啟動子序列被攜帶在一個或幾個可複製的DNA分子上;該分子在所述培養步驟中由所述酵母宿主細胞穩定地保持並分離。還披露了用本發明方法生產的轉化酵母宿主細胞和三股螺旋蛋白。
文檔編號C12N15/53GK1242044SQ97181012
公開日2000年1月19日 申請日期1997年10月29日 優先權日1996年10月29日
發明者P·R·沃恩, M·加拉尼斯, J·A·M·拉姆肖, J·A·維爾克梅斯特 申請人:聯邦科學及工業研究組織