細胞分裂素混合粉劑及其製造方法
2023-06-25 19:51:41 1
專利名稱：細胞分裂素混合粉劑及其製造方法
技術領域：
本發明屬於微生物發酵產生細胞分裂素混合粉劑的方法，該粉劑屬於一種植物生長調節劑。
1950-1953年，中國農科院尹莘耘教授在調查棉麥病害時，發現凡是種過三年紫花苜蓿的地塊上，換種棉花或小麥時，不僅植株高壯，而且棉花的黃枯萎病和小麥銹病的發生均較連種棉麥的地塊輕微。尹莘耘教授從苜蓿根部分離並測定各种放線菌對棉花黃萎和立枯病菌的拮抗性能。分析結果表明，自苜蓿根部分離的高效抗生菌的比率，較從其它作物根部或土壤中分離的高達5-10倍。其中，從陝西省涇陽縣苜蓿根上分離的「5406」號放線菌，在生長過程中能分泌數種植物生長刺激素及抗生素。具有刺激細胞分裂，促進作物葉綠素增加，促進早熟，保花保果，防病抗病，提高作物產量。資料證明，似「5406」號這樣多功能菌株，在國外屬罕見。
菌株5406號經過鑑定，屬於粉紅孢類群鏈黴菌的一個新種，定名為涇陽鏈黴菌(Streptomycesjingyangensisn.spTaoetal，1978)，並指定5406為這個新種的典型菌株，保存在中國科學院微生物研究所，編號為4.891。其分泌物經鑑定屬細胞分裂素類物質。
國內外文獻都曾報導過多種細菌和與植物共生的菌根真菌培養物中發現天然細胞分裂素及細胞分裂素類物質，但都未曾對如何提高這些菌株產生細胞分裂素活性以及如何工廠化生產細胞分裂素有過報導。
從50年代末到70年代末，5406的應用技術以抗生素肥料用於農業，簡稱5406菌肥，在全國各地應用中，對多種作物獲得良好的增產效果，但是5406菌肥是採用中國傳統固體發酵法生產，該方法雖然簡單，成本低廉，但仍有很多缺陷(1)由於未對5406菌種加以篩選，故菌種退化嚴重，菌肥的肥效減小;(2)由於生產品僅為菌肥，故受到施用方法及自然條件限制;(3)菌肥的有效成分少，效果慢。
本發明針對以上缺陷提出一種篩選高產「5406」菌株的方法，以及用5406菌株生產細胞分裂素混合粉劑的工藝。
以下對本發明進行詳細說明1、5406菌種分離與篩選鏈黴菌菌株5406是從我國陝西省涇陽縣苜蓿地的苜蓿根部分離到的，通過鑑定屬於粉紅孢類群鏈黴菌的一個新種，定名為涇陽鏈黴菌(Streptomycesjingyangensisn.spTaoetal，1978)。
2、形態和培養特徵基內菌絲體呈分枝狀，未觀察到菌絲斷裂現象。孢子絲單槎分枝，年幼時直或波曲，成熟時呈2-4圈松敞螺旋，有時可多至6-7圈。孢子長橢圓形到柱形，1.4-1.6×0.8-1.0微米。孢子表面光滑，形似稻種。無輪生枝，無遊動孢子，無孢束和菌核。菌株在瓊脂培養基上，生長淺黃，反面木瓜黃到虎皮黃。氣生菌絲淺玫瑰粉到落英淡粉，可溶性色素微黃到淺粉。在孢子層表面產生茶色小露珠，並放出清涼的冰片香味。
生理特性黑素反應，在葡萄糖酪氨酸瓊脂，酵母膏酪氨酸瓊脂和試驗所用其它有機培養基上，黑素均為負反應。水解澱粉強烈。液化明膠明顯。凝固並腖化牛奶。產生H2S明顯，使懸掛於培養液上的醋酸鉛紙條變黑。纖維素，生長。硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。利用葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇;不利用L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、棉籽糖和蔗糖。利用肌醇可疑。
3、菌種選育把退化的5406菌株接入苜蓿根系進行復壯處理，30-60天取苜蓿根，用0.05-0.15%升汞水消毒3-7分鐘，用滅菌蒸餾水洗苜蓿根2-4次，用無菌研缽磨成漿狀稀釋分離，分離培養基為高氏一號加1%苜蓿根煮汁。選擇標準菌落長的豐滿，中央突起的;菌落形狀較大的;菌落色澤較紅的;菌落生長快;菌落表面分泌露珠多的。根據這5個條件選擇菌落做刺激性試驗及拮抗性試驗。
(1)用黃化黃瓜子葉葉綠素合成法測定經選擇的菌株產生細胞分裂素活性。挑選大小均一的黃瓜種子(津研1號或2號)，用0.05-0.15%升汞水表面滅菌5-7分鐘，無菌蒸餾水衝洗數次，置於墊有溼潤濾紙的無菌平皿內，27-30℃下暗處發芽5-6天，在暗室綠光燈下，從每一個幼苗上切下子葉，切除全部下胚軸，選取大小均一的子葉，葉面朝上，放在事先已加好2.5ml無菌水及無菌濾紙的平皿中，每皿25片子葉，每片子葉上面貼一塊培養好的單菌落塊，27-30℃下暗處培養20-24小時，然後移至600-1000lux螢光燈下，距離10-30cm，光照2-4天。根據子葉的變綠及擴大程度，判斷單菌落產生細胞分裂素活性大小。另設KT0.1、1、10ppm溶液做標準品，蒸餾水做對照。
(2)將初篩選出的細胞分裂素活性較高菌株轉接「苜高」斜面，同時塗菌塊進行復篩把事先製成的「苜高」平皿(每皿10-20ml苜高培養基)，用金屬切刀分割成相互隔開的培養基塊4塊，每塊上塗接一個初篩選出的菌株，27-30℃下倒置培養4-6天。用圓形金屬打孔器，將長好的菌塊打成數個園柱形菌塊(直徑4-6mm，高2.0-2.5mm)。用上述黃瓜黃化子葉法復篩細胞分裂素活性，每個菌株設3片子葉重複，暗培養20-24小時，見光培養2-4天。凡是處理後3片子葉均比出發菌株、菌塊及KT純品1ppm的處理明顯綠且大的菌株，才屬於挑選對象。
(3)將復篩反映較好的菌株，測定對深紅酵母的拮抗性，取兩環深紅酵母的菌苔，放入8-10ml無菌水中，充分打散搖勻，製成均勻懸液。加到已溶化好、並涼至50-60℃的100ml測定培養基中，搖勻後倒入無菌平板內)，培養基鋪平、冷凝。用(2)的方法製成的園形菌塊，順序貼放在測定平板上，每行7塊，12行。每個菌株設3塊重複，27-30℃下保溫培養20-26小時，挑取復篩時刺激作用明顯優於出發菌株，而且拮抗作用較出發菌株也大的菌株。
(4)將上述過程得到的菌株進行搖瓶發酵，用發酵濾液測定對黃化黃瓜子葉的作用，驗證上述篩選結果。培養基裝量為每250ml三角瓶裝40-60ml，接種一滿環菌苔，在200-240轉/分搖床上，28℃±1℃培養72小時。用黃化黃瓜子葉葉綠素合成法測定其發酵液的細胞分裂素活性。按此法篩選出高產5406菌株。把選育優良菌株用砂土管保藏備用。
4、5406細胞分裂素混合粉劑生產(1)工藝流程附
圖1為本發明的工藝流程圖(2)培養條件A、斜面培養培養基為高氏一號，自然PH、27-32℃恆溫培養箱培養4-6天，孢子粉紅色，在3-5℃冰箱中保存20-40天。
B、一級種子罐培養培養基為澱粉(或玉米粉)1-3%、葡萄糖0.5-1.5%、黃豆餅粉(或花生餅粉或棉子餅粉或蠶蛹粉)1-3%、KH2PO40.04-0.05%、Nacl 0.2-0.4%(NH4)2SO40.4-0.6%，CaCO30.3-0.5%、泡敵0.01-0.05%(或消沫油 0.2-0.4%)。
接種量1-2支茄形瓶斜面用無菌水製成孢子懸浮液，在無菌條件下接種在一級種罐內。
通風量0-12小時1∶0.5v/v，12小時以後1∶1v/v
罐壓0.6-0.7公斤/cm2培養溫度27-32℃攪拌速度270-290轉/分移種標準鏡檢無雜菌，菌絲呈網狀。
C、二級種子罐培養基成分同一級種子罐培養基成分。
接種量8-10%，從一級種子罐移種到二級種子罐。
通風量0-12小時，通風量1∶0.5v/v，12小時以後1∶1v/v。
罐壓0.6-0.7kg/cm攪拌速度240-260轉/分培養溫度27-32℃移種標準鏡檢無雜菌，菌絲呈網狀，密度均勻，分枝多而大，染色深。
D、發酵罐培養培養基成分為澱粉(或玉米粉)1-3%、葡萄糖(或飴糖或蔗糖)0.5-1.5%、黃豆餅粉(或花生餅粉或棉子餅粉或蠶蛹粉)2-3%、(NH4)2SO40.3-0.5%、NaCl 0.2-0.4%、KH2PO40.03-0.05%、CaCO30.3 0.5%、泡敵0.01-0.05%(或植物油 0.2-0.4%)、酵母粉 0.2-1% 玉米漿 0.2-1%接種量10%，種令24-30小時。
通風量0-12小時1∶0.5v/v，12小時以後1∶1v/v，攪拌速度150-180轉/分，罐壓0.5-0.7kg/cm2。
培養溫度27-32℃鏡檢0-12小時菌絲呈團網狀12小時以後菌絲髮育成密封網狀菌絲。40-60小時放罐。
(3)後處理髮酵液加5-20%CaCO3經滾筒乾燥機烘乾，再加4-6%KCl，加5%微量元素(Zn2+、Cu2+)磨細分裝。
(4)測定方法發酵液中細胞分裂素(CTK)測定發酵液用0.1NHCl酸化至PH2-3上搖床搖2小時，過濾，濾液用1NNaOH調節PH8.0，取20ml用水飽和正丁醇萃取1∶1v/v三次，把三次正丁醇萃取液濃縮至幹，用1ml35%乙醇溶解其乾燥物(或用1ml95%乙醇溶解，上高壓液相色譜測定CTK含量)，樣品(用250-500ml)電薄板，再用水飽和正丁醇、異丙醇、氨水、水(2∶8∶1∶1)，25℃展開，2-3小時結束吹乾，將Rf值0.73-0.82的斑點刮下，用酪氨酸緩衝液(含有0.4%的酪氨酸的1/75克分子量的磷酸緩衝液)洗脫，用尾穗莧黃化子葉葉綠素合成法測定其洗脫液含量，具體方法如下精選已度過休眠期的尾穗莧種子，用0.1%升汞液消毒5分鐘，衝洗後，摘於培養皿中的溼潤濾紙上，在28℃黑暗中發芽76小時。在暗室微弱綠光燈下，選取子葉大小均一的黃化幼苗，剪取子葉和下胚軸的上半部，置於已放有2.5ml或3ml待測溶液的培養皿中，每皿30枚。在28℃暗室放置18小時。分別把幼苗切段，在重蒸餾水中洗滌，在濾紙上吸去多餘水分，移入盛有4ml重蒸餾水的有塞試管中，放置低溫冰箱(-15--20℃)冰凍過夜，移至25℃暗室中讓其融化，2小時後，再放入低溫冰箱冰凍。再融化，反覆一次，莧紅素即被浸提而出。在542nm和620nm處分別光密度，二者相減即為莧紅濃度的光密度。同時查標準激動素座標，查出其含量，洗脫液細胞分裂素含量，再換算每立升發酵液含量。一般每立升發酵液中含CTK80-150l(測定過程中回收率40-50%)。
產品檢驗目前採用高壓液相色譜儀測定將50克樣品浸泡在200ml80%乙醇中，搖振蕩2小時，過濾，50℃真空旋轉濃縮至20ml，用水飽和正丁醇1∶1v/v萃取三次，三次萃取液合併，真空濃縮至幹，用1-2ml95%乙醇溶解，上高壓液相色譜，Waters 244 柱u-Bondapak pheny (0.4×30cm) 流動相22%CH3CN PH＝4流速1.0ml/mm，檢測器UV254×0.1AUFS，標準品玉米素，異戊烯基腺嘌呤。 。
產品每500克中含CTK總量800-1000微克(回收率40-50%)苯乙酸測定方法發酵液2ml，加24N硫酸4滴，酸化之，加NaCl1.2克，加10%十五烷基溴代吡啶2滴，稍加振搖後，準確加入苯2ml，加塞振搖2-3分鐘，離心後，取苯層上HPLC機，填＃3011膠的柱子(250×2.6mm)作固定相，以CH3OH∶H2O＝87∶13作為流動相，流速0.4ml/min。220nm檢測。
產品檢測苯乙酸含量5克粉劑浸泡在20ml80%乙醇中，振蕩1小時，過濾，濾液真空濃縮2ml，加濃硫酸4滴，加NaCl1.2克，振蕩之，準確加苯2ml，加塞振搖，取上層苯相上高壓液相色譜儀測定。
以下是本發明的實施例1、菌種選育把退化的5406菌株接入苜蓿根系進行復壯處理，40天取苜蓿根，用0.1%升汞水消毒5分鐘，用滅蒸餾水洗苜蓿根3次，用無菌研缽磨成漿狀稀釋分離，分離培養基為高氏一號加1%苜蓿根煮汁。選擇標準菌落長的豐富，中央突起的;菌落形狀較大的;菌落色澤較紅的;菌落生長快;菌落表面分泌露珠多的。根據這5個條件選擇菌落做刺激性試驗及拮抗性試驗。
(1)用黃化黃瓜子葉葉綠素合成法測定經選擇的菌株產生細胞分裂素活性。挑選大小均一的黃瓜種子津研1號，用0.1%升汞水表面滅菌5分鐘，無菌蒸餾水衝洗數次，置於墊有溼潤濾紙的12cm無菌平皿內，28℃下暗處發芽6天，在暗室綠光燈下，從每一個幼苗上切下子葉，切除全部下胚軸，選取大小均一的子葉，葉面朝上，放在事先已加好2.5ml無菌水及無菌濾紙的9cm平皿中，每皿25片子葉，每片子葉上面貼一塊培養好的單菌落塊，28℃下暗處培養20小時，然後移至800lux螢光燈下距離20cm，光照3天。根據子葉的變綠及擴大程度，判斷單菌落產生細胞分裂素活性大小。另設KT0.1、1、10ppm溶液做標準品，蒸餾水做對照。
(2)將初篩選出的細胞分裂素活性較高菌株轉接「苜高」斜面，同時塗菌塊進行復篩，把事先製成的「苜高」9cm平皿(每皿20ml苜高培養基)，用金屬切刀分割成相互隔開的培養基塊4塊，每塊上塗接一個初篩選出的菌株，28℃下倒置培養5天。用圓形金屬打孔器，將長好的菌塊打成數個園柱形菌塊(直徑5mm，高2.2mm)。用上述黃瓜黃化子葉法復篩細胞分裂素活性，每個菌株設3片子葉重複，暗培養24小時，見光培養3天。處理後3片子葉均比出發菌株菌塊及KT純品1ppm的處理明顯綠且大的菌株，才屬於挑選對象。
(3)將復篩反映較好的菌株，測定對深紅酵母的拮抗性，取兩環深紅酵母的菌苔，放入9ml無菌水中，充分打散搖勻，製成均勻懸液，加到已溶化好、並涼至58℃的100ml測定培養基中，搖勻後倒入無菌平板內(20×30cm2)，培養基鋪平、冷凝。用(2)的方法製成的園形菌塊，順序貼放在測定平板上，每行7塊，12行。每個菌株設3塊重複，28℃下保溫培養24小時，取復篩時刺激作用明顯優於出發菌株，而且拮抗作用較出發菌株也大的菌株。
(4)將上述過程得到的菌株進行搖瓶發酵，用發酵濾液測定對黃化黃瓜子葉的作用，驗證上述篩選結果培養基裝量為每250ml三角瓶裝50ml，接種一滿環菌苔，220轉/分搖床上，28℃培養72小時。用黃化黃瓜子葉葉綠素合成法測定其發酵的細胞分裂素活性。接此法篩選出高產5406菌株。把選育優良菌株用砂土管保藏備用。
2、5406細胞分裂素混合粉劑生產(1)工藝流程見附圖1
(2)培養條件A、斜面培養培養基為高氏一號，自然PH、28℃恆溫培養箱培養4天，孢子粉紅色，保存1個月4℃冰箱。
B、一級種子罐培養培養基為澱粉2%、葡萄糖1%、黃豆餅粉2%、KH2PO40.045%、Nacl 0.3% (NH4)2SO40.5%，CaCO30.4%、泡敵 0.02%。
接種量2支茄形瓶斜面用無菌水製成孢子懸浮液，在無菌條件下接種在一級種罐內。
通風量0-12小時1∶0.5v/v，12小時以後1∶1v/v罐壓0.67公斤/cm2培養溫度28℃攪拌速度180轉/分移種標準鏡檢無雜菌，菌絲呈網狀。
C、二級種子罐培養基成分同一級種子罐培養基成分。
接種量8%，從一級種子罐移種到二級種子罐。
通風量0-12小時，通風量1∶0.5v/v，12小時以後1∶1v/v。
罐壓0.6kg/cm2攪拌速度250轉/分培養溫度28℃移種標準境檢無雜菌，菌絲呈網狀，程度均勻，分枝多而大，染色深。
D、發酵罐培養培養基成分為澱粉 2%、葡萄糖 1%、黃豆餅粉 2.5%、(NH4)2SO40.4%、Nacl 0.3%、KH2PO40.035%、CaCO30.4%、泡敵0.015%。酵母粉 0.2%、玉米粉0.2%。
接種量10%，種令24小時。
通風量0-12小時1∶0.5v/v，12小時以後1∶1v/v，攪拌速度180轉/分，罐壓0.6kg/cm2。
培養溫度28℃鏡檢0-12小時菌絲呈團網狀12小時以後菌絲髮育成密網狀菌絲。55小時後放罐。
本發明較已有技術具有明顯的優點用本工藝所生產的細胞分裂素混合粉劑每500克含細胞分裂素0.8-1.0毫克，苯乙酸1.0-1.5毫克，B族維生素2.5克，以及大量胺基酸。具有明顯增效作用。田間試驗示範證明5406細胞分裂混合粉劑對多種作物都具有良好的增產效果。
1、糧食作用稻麥上通過浸種及穗期噴灑能增產10-20%，玉米通過浸種，每畝投資0.12元，可增產80-100斤。
2、蔬菜白菜、黃瓜、茄子、西紅柿等噴3次，一般增產15-20%，每畝增收100-200元。
3、瓜果用於西瓜浸種並噴灑3-4次，一般增產15-20%，含糖量提高0.5-2.0度，並提前3-7天成熟。
每畝增收100-200元。在柑桔上噴灑2-3次，一般增產10-20%，每畝增收100-200元。對葡萄、桃、蘋果、草莓也能提高座果率及含糖量。
4、經濟作物在菸草上噴灑3次減輕花葉病50-83%，提高尼古丁含量，每畝增收70-100元，在人參上噴灑，一般增產10-20%，可減輕葉斑病提高人參皂甙12-33%，每畝增收2000-4000元，在茶葉上能增產10-15%，提高咖啡鹼含量25.8%，茶多酚3.4%，品質提高一級。
5、對菸草花葉病毒病防治效果比較突出對菸草花葉病毒病防效50-83%，西紅柿蕨葉病防效達51.2-61.5%，對青椒病毒病防效達50.7%以上，可使小麥黃矮病減輕。
5406細胞分裂素混合粉劑使用成本低，經濟效益高。經衛生部門毒性試驗LD50＞10g體重，屬相對元毒，無致突變，致畸作用，使用安全。
權利要求
1.一種細胞分裂素混合粉劑的製造方法，包括選用涇陽鏈黴菌(Streptom-ycesjingyangensis)菌株，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)菌種復壯與選育；(2)將選育好的菌種在27-32℃下分別經試管斜面和茄形瓶斜面培養4-6天，移至一級種子罐，在27-32℃培養24-30小時；(3)將通過一級種子罐培養後的菌種轉接於二級種子罐，在27-32℃下培養24-30小時；(4)將通過二級子罐培養的菌種轉接於發酵罐培養，在27-32℃下培養40-60小時；(5)發酵液加5-20%CaCO3烘乾，再加4-6%KCl，磨細分裝。
2.根據權利要求1所述的菌種復壯與選育，其特徵在於包括下列步驟(1)把退化的涇陽鏈黴菌(Streptomycesjingyangensis)菌株接入苜蓿根系復壯處理，30-60天，取苜蓿根，用0.05-0.15%升汞水消毒3-7分鐘，用蒸餾水洗苜蓿根2-4次，用無菌研缽磨成漿狀稀釋分離，加1%苜蓿根煮汁於高氏一號培養基培養，選擇菌落;(2)用黃化黃瓜子葉葉綠素合成法初篩經選擇的菌落;(3)將初篩出的菌株轉接在「苜高」斜面，同時塗菌塊進行復篩，用黃化黃瓜子葉法測定菌株活性;(4)將復篩出的菌株，測定對深紅酵母的拮抗性，取拮抗作用明顯的菌株;(5)將上述過程得到的菌株進行搖瓶發酵，用發酵液測定對黃化黃瓜子葉的作用，驗證上述篩選結果。
3.根據權利要求1所述的製造方法，其特徵在於一級種子罐的培養條件為培養基為澱粉(或玉米粉)1-3%葡萄糖0.5-1.5%黃豆餅粉(或花生餅粉或棉子餅粉或蠶蛹粉)1-3%KH2PO40.04-0.05% NaCl 0.2-0.4%(NH4)2SO40.4-0.6% CaCO30.3-0.5%泡敵0.01-0.05%(或消沫油0.2-0.4%)接種量1-2支茄形瓶斜面用無菌水製成孢子懸浮液，在無菌條件下接種在一級種罐內;通風量0-12小時1∶0.5v/v，12小時以後1∶1v/v罐壓0.6-0.7公斤/cm2攪拌速度270-290轉/分
4.根據權利要求1所述的製造方法，其特徵在於二級種子罐的培養條件為培養基配方同一級種子罐，接種量8-10%，通風量0-12小時1∶0.5v/v，12小時以後1∶1v/v。罐壓0.6-0.7kg/cm2攪拌速度240-260轉/分;
5.根據權利要求1所述的製造方法，其特徵在於發酵罐的培養條件為培養基配方澱粉(或玉米粉)1-3%葡萄糖(或蔗糖或飴糖)0.5-1.5%黃豆餅粉(或花生餅粉或棉子餅粉或蠶蛹粉)2-3%KH2PO40.03-0.05% Nacl 0.2-0.4%(NH4)2SO40.3-0.5% CaCO30.3-0.5%泡敵0.01-0.05%(或植物油0.2-0.4%)酵母粉0.2-1%玉米漿0.2-1%接種量10%通風量0-12小時1∶0.5v/v12小時後1∶1v/v攪拌速度150-180轉/分罐壓 0.5-0.7kg/cm2
6.根據權利要求1所述的製造方法，其特徵在於採用尾穗莧莧紅素合成法和高壓液相色譜法測定發酵液及產品的細胞分裂素含量和用高壓液相色譜法測定發酵液中苯乙酸的含量。
全文摘要
一種細胞分裂素混合粉劑的製造方法，該方法包括採用黃化黃瓜葉綠素合成法初篩及復篩涇陽鏈黴菌(Streptomyces jingyangsis n.sp Tao et al，1978)菌株和用篩後菌株工廠化生產細胞分裂素混合粉劑，用本發明製造出的產品富含細胞分裂素、苯乙酸、B族維生素及大量胺基酸。該粉劑價格低廉，試驗證明對多種農作物具有明顯的增產作用。
文檔編號C12N1/00GK1046350SQ8910210
公開日1990年10月24日 申請日期1989年4月11日 優先權日1989年4月11日
發明者尹莘耘, 梁光雲, 張震林, 張辛庚, 尹蔚莊, 丁鳳葆, 林德炘, 蔣炳生 申請人:中國農業科學院植物保護研究所