基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片及其製備方法

2023-06-26 03:59:01 1

專利名稱：基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片及其製備方法
技術領域：
本發明屬微流控晶片技術領域，具體涉及一種基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片及其製備方法。
背景技術：
石墨烯(graphene)是由單層碳原子緊密堆積成二維蜂窩狀晶格結構的一種碳質新材料，是構建其他碳素材料(如零維富勒烯、一維碳納米管、三維石墨)的基本單元。自從2004年英國Manchester大學的Geim等人發現單層石墨烯以來石墨烯受到了全世界科學家的廣泛關注。石墨烯具有優異的電學、熱學和力學性能，可望在高性能納電子器件、電 池、電化學電容、複合材料、場發射材料、氣體傳感器及能量存儲等領域獲得廣泛應用[2]。由於其獨特的二維結構和優異的晶體學質量，石墨烯蘊含了豐富而新奇的物理現象，具有重要的理論研究價值。過去幾年中，石墨烯已經成為了備受矚目的國際前沿和研究熱點。目前，製備石墨烯的方法有機械剝離法、化學氣相沉積法、石墨化學氧化剝離法等，其中第三種方法是目前製備氧化石墨烯和石墨烯最常用也是最經濟的方法。將石墨用高錳酸鉀等強氧化劑氧化，然後通過超聲剝離得氧化石墨烯，其基本結構是表面帶有羧基、羥基、羰基和環氧基的碳的單原子層，其含有豐富的含氧官能團[3]，在水中分散良好，容易與其它水溶性材料複合。由於氧化石墨烯含豐富的官能團，可通過化學修飾的方法製備石墨烯衍生物，甚至可與酶和蛋白等生物大分子共價鍵結合，在構建微流控晶片生化微反應器方面具有得天獨厚的優勢，目前，尚未見有關報導。自從瑞士 Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer [4]首次提出微型全分析系統(M~TAS)以來，微流控晶片就以其高效、快速、試劑用量少、低耗以及集成度高等優點引起了國內有關專家的廣泛關注，在其方法學研究迅速發展的基礎上，微流控晶片在生物醫學研究、臨床診斷、藥物分析、環境監測、法醫和軍事等領域顯示了良好的應用前景&7]。微流控晶片以微機電加工技術為依託，以微管道網絡為結構特徵，以生命科學為目前主要應用對象，是當前微全分析系統領域發展的重點。微流控晶片是把生物、化學、醫學分析過程的採樣、稀釋、加試劑、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊幾個平方釐米大的晶片上，自動完成分析全過程。由於它在生物、化學、醫學等領域的巨大應用潛力，已經發展成為一個生物、化學、醫學、流體、電子、材料、機械等多學科交叉的嶄新研究領域。微流控晶片微流通道尺寸在微米級，是納升到微升級小體積樣品的理想操作和分析平臺，特別適用於生物醫藥分析和臨床檢測小體積樣品的酶法和免疫法分析和檢測。其中一個很重要的用途是用於蛋白質的酶解和分析。蛋白質酶解是蛋白組學中蛋白質分析的一個關鍵步驟，待測樣品中的蛋白通過電泳分離後用蛋白水解酶水解成肽，然後用質譜測定其分子量得肽質量圖譜，經檢索有關資料庫後完成蛋白鑑定。傳統的溶液酶解靈敏度低且耗時(12小時以上)，加上蛋白水解酶自身酶解產生的肽也會干擾目標蛋白的鑑定，所以溶液酶解時蛋白和酶的比例通常要求在20-40:1，以降低游離蛋白酶自身酶解的幹擾，但由於蛋白酶濃度低，酶解效率不高，所以建立高效快速的新型蛋白質酶解方法具有重要意義。解決上述問題的主要途徑就是使用固定化酶技術，通常使用的微流控晶片酶反應器是將蛋白酶如胰蛋白酶通過溶膠-凝膠包埋[8』9]技術固定在微流控晶片通道內表面。存在的問題是由於酶不是通過共價鍵固定，容易流失，影響酶解效果。參考文獻
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發明內容
本發明的目的在於提出一種能夠大幅降低酶解時間並提高蛋白酶解效率的基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片及其製備方法。本發明提出的基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片的製備方法，具體步驟為
(1)通過光刻和化學溼法刻蝕的方法，加工出用於複製帶有分離通道的微流控晶片基片的娃陽模；
(2)將少量熱引發劑偶氮二異丁腈和少量光引發劑安息香溶解在甲基丙烯酸甲酯中，於80-90°C水浴中加熱15-20分鐘，使其預聚成甘油狀清亮鑄模溶液，將此含光引發劑的鑄模溶液沿微流控晶片矽陽模凸出的分離通道澆在矽陽模上並成條狀，將一片有機玻璃片蓋在預聚的鑄模溶液上並壓緊，然後用紫外光通過有機玻璃片照射預聚的鑄模溶液，引發本體聚合，製作得含有微流通道的微流控晶片基片；將矽陽模用玻璃板代替，製作得微流控晶片蓋片；將所述基片和所述蓋片發生原位聚合的一面通過熱壓鍵合，製作得有機玻璃微流控晶片成品；
(3)將石墨粉分散在濃硫酸中並用冰浴冷卻，然後加入硝酸鉀和高錳酸鉀進行氧化，再加入雙氧水後用稀鹽酸洗滌得氧化石墨，然後將氧化石墨分散到水溶液中，用超聲波進行剝離，得氧化石墨烯水溶液；將正矽烷乙酯與乙醇和稀鹽酸混合水解，得矽溶膠；將矽溶膠與氧化石墨烯水溶液混合，得微流控晶片通道修飾溶液；
(4)將正矽酸乙酯注入有機玻璃微流控晶片微通道，2-4小時後正矽酸乙酯充分滲入微通道的表層；用水衝去通道內多餘的正矽酸乙酯，注入稀鹽酸水解1-3小時，得通道表面經矽凝膠化處理的有機玻璃微流控晶片，然後將矽溶膠和石墨烯水溶液混合製得的修飾溶液注入表面經矽凝膠化處理的有機玻璃微流控晶片通道內，然後移出修飾溶液，並乾燥，得修飾有矽凝膠氧化石墨烯複合膜的微流控晶片；(5)在通道內注入1-(3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二醯亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接著注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得蛋白酶解微流控晶片。本發明的步驟(2)中，所述有機玻璃微流控晶片通道的深度為20-50微米，底部寬度20-60微米，上部寬度50-200微米。本發明的步驟(2)中，有機玻璃蓋片對應於微流控晶片基片上通道的末端的位置鑽有直徑為1-3毫米的圓形小孔，用於進樣和收集蛋白酶解產物。本發明的步驟(2)中，所述熱壓鍵合的熱壓溫度為105-110°C，施加在兩片玻璃板上的微流控晶片上的熱壓壓力為0. 5-5公斤/平方釐米，熱壓時間為10-20分鐘。本發明的步驟(3)中，所述氧化石墨烯水溶液的濃度為1-10毫克/毫升，矽溶膠溶液的濃度為10-100毫克/毫升。
本發明的步驟(5 )中，水溶液中1- (3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二醯亞胺的濃度分別為0. 5-5毫克/毫升和0. 25-2. 5毫克/毫升，蛋白水解酶的濃度為0. 5-5暈克/暈升。本發明提出的基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片製備方法，進一步詳述如下
採用計算機輔助設計軟體設計晶片結構，典型的設計如圖1所示，由單十字交叉微通道2和7以及溶液連接孔1、5、6和酶解液收集孔4構成，採用高解析度(如3600 dpi)雷射照排系統在透明薄膜上列印成掩膜，微通道部分為黑色線條，寬度為20-100微米，其它部分為透明。在經氧化處理的矽片(P型，厚500微米，直徑4英寸，晶向〈100〉，表面二氧化矽氧化層厚800納米)通過旋轉塗膜技術塗覆一層正性光刻膠(Shipley S1813光刻膠，Shipley, Marlborough, MA，美國)，旋塗條件為 2000-4000 rpm，時間為 40-80 秒。然後在100-120 1烘烤處理40-80秒以提高光刻膠的附著並除出殘留的溶劑(暴光前烘)，然後蓋上掩膜(含設計的微流結構)，使用Karl Suss MA6/BA6光刻機(Karl Suss, Germany)進行接觸式紫外線曝光30-50秒後，浸入20% Microposit 351顯影劑(Shipley) 60-100秒，以洗去暴光部分的光刻膠層，然後於140-160 1烘箱中烘20-40分鐘使微通道和溶液連接孔部分未曝光的光刻膠硬化，然後以光刻膠和SiO2層為掩膜材料用60 1的40% KOH水溶液刻蝕裸露的矽片至深度為30-50微米，除去光刻膠後即製成矽片陽模。在甲基丙烯酸甲酯單體中加入少量熱引發劑偶氮二異丁腈(甲基丙烯酸甲酯單體質量的0. 1-0. 2%)和少量光引發劑安息香(甲基丙烯酸甲酯單體質量的0. 1-0. 2%),在50°C水浴加熱並搖動使其溶解，然後於80-90 °C水浴中加熱15-20分鐘，使單體預聚成甘油狀清亮鑄模溶液，沿微流控晶片矽陽模凸出的分離通道澆在矽陽模上並成條狀，將一片有機玻璃片直接蓋在預聚溶液上並壓緊，使預聚溶液充滿有機玻璃片與矽陽模間的縫隙，要求微流通道結構全部在有機玻璃片的下方，然後將工件水平放置。用20 W紫外燈(365nm，距離4-5釐米)通過有機玻璃片照射預聚溶液20-30分鐘引發表面原位聚合，聚合溫度15-35°C。當模具從微流控晶片基片脫去後，矽陽模凸出的微結構可以高保真的被複製為微流控晶片基片表面的微通道。將上述矽陽模用玻璃板代替可製作微流控晶片蓋片。將脫模後的微流控晶片基片通道末端鑽孔(溶液連接孔1、5、6和酶解液收集孔4見圖1，孔徑1-3毫米)用於連接溶液。將基片和蓋片用水衝洗，吹乾後立即將微流控晶片基片帶有開口通道的一面與一片相同大小的有機玻璃蓋片夾於兩片玻璃片後，通過熱壓鍵合得有機玻璃微流控晶片。熱壓封裝溫度為105-110°C，施加在兩片玻璃板上的壓力為0.5-5公斤/平方釐米，熱壓時間為10-15分鐘。將6克石墨與90-150毫升濃硫酸混合，得有金屬光澤的粘稠液體，用冰水冷卻後，加入硝酸鉀3-6克，在用冰水冷卻的情況下，分次加入10-25克高錳酸鉀，混合物在35°C加熱30分鐘，成粘稠的黑褐色糊狀液體，然後加水200-400毫升，立刻有大量氣體放出，繼續在98°C加熱40分鐘，加水到800-900毫升後加雙氧水15-30毫升，用濾布抽濾分離出氧化石墨，並用5%的稀鹽酸通過抽濾洗滌，用水進一步洗滌並乾燥得氧化石墨。準確稱取一定量氧化石墨分散在水中，通過超聲波進行剝離得氧化石墨烯水溶液，濃度為1-10毫克/毫升。取1. 8毫升正矽烷乙酯與2. 8毫升無水乙醇和0. 92毫升0. 25摩爾/升稀鹽酸混合水解2小時後，用無水乙醇稀釋到5-50毫升，得濃度為10-100毫克/毫升的矽溶膠，與氧化石墨烯水溶液等體積混合得微流控晶片通道修飾溶液&將正矽酸乙酯注入有機玻璃微流控晶片微流通道，使其在通道內停留2-4小 時，使正矽酸乙酯充分滲入微流通道的表層。通道內多餘的正矽酸乙酯用水衝去後，將0. 05-0. 2摩爾/升的稀鹽酸注入微流通道1-3小時，得通道表面經矽凝膠化處理的有機玻璃微流控晶片，然後將矽溶膠和石墨烯水溶液混合製得的修飾溶液注入表面經矽凝膠化經處理的有機玻璃微流控晶片通道內，1-10分鐘後移出修飾溶液並乾燥得修飾有矽凝膠氧化石墨烯複合膜的微流控晶片。然後，在矽凝膠氧化石墨烯複合膜修飾通道內注入含0. 5-5毫克/毫升1-(3- 二甲基氨丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和0. 25-2. 5毫克/毫升N-羥基丁二醯亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接著注入0. 5-5毫克/毫升胰蛋白酶等蛋白酶溶液，在室溫下反應3-5小時，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得蛋白酶解微流控晶片。本發明通過化學氧化和超聲分散由石墨粉製得氧化石墨烯水溶液，與由正矽烷乙酯水解製得的矽溶膠混合後注入表面經矽凝膠化經處理的有機玻璃微流控晶片通道內，一定時間後移出修飾溶液並乾燥得修飾有矽凝膠氧化石墨烯複合膜的微流控晶片。胰蛋白酶等蛋白酶水解酶通過氨基與通道表面氧化石墨烯的羧基形成共價鍵從而獲得固定，得蛋白酶解微流控晶片。由於酶通過共價鍵固定，其自身酶解被抑制，故可以使用較大的酶量，使酶解效率大幅提高。該反應器可將蛋白質的酶解時間從傳統的溶液酶解的12小時以上大幅度降低到10秒以內，大大節約了酶解時間，提高了工作效率。為蛋白組學中蛋白的高效酶解和高通量鑑定提供新的技術手段。本發明提出的基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片具有製作簡便、價格低廉和穩定性高的優點，可採用注射塗布的技術批量加工。通過更換固定的酶的種類還可在此基礎上開發其它更多用途的微流控晶片酶反應器。 本發明中使用的微流控晶片酶解反應器可採用注射塗布工藝批量加工，具有工藝簡單和價格低廉的特點，在蛋白質研究、臨床診斷、環境監測、生命科學研究和食品分析等領域有良好的應用前景。


圖1為本發明使用單十字交叉有機玻璃微流控晶片示意圖。
圖2為本發明中微流控晶片通道表面矽凝膠氧化石墨烯複合膜固定胰蛋白酶示意圖。圖3為本發明中(a)氧化石墨烯和(b)固定有胰蛋白酶的矽凝膠氧化石墨烯複合膜掃描電子顯微鏡照片。圖4為本發明中基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片實物照片。圖5為本發明中蛋白微流控晶片酶解裝置示意圖。圖6為使用本發明製備的微流控晶片酶反應器酶解牛血紅蛋白(a)和馬心細胞色素c (b)產物的基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜圖。流速2.0微升/分鐘，酶解時間〈10秒，蛋白質溶液濃度200納克/微升(溶於20毫摩爾/升碳酸氫銨水溶液(pH 8.1)中)，所有匹配的肽段用標出。圖中標號1、5和6為樣品溶液孔，2為微流控晶片主通道，3為微流控晶片，4為酶 解液收集孔，7為進樣微通道，8為注射泵，9為待酶解的蛋白質樣品溶液，10為矽橡膠連接管，11為蛋白酶解液收集孔，12為微流控晶片酶反應器，13為質譜點樣板，14為蛋白樣品酶解後獲得含肽段的酶解液基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜圖示意圖。
具體實施例方式下面通過實施例和附圖進一步描述本發明
實施例1、基於固定有胰蛋白酶的矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片採用計算機輔助設計軟體設計晶片結構，典型的設計如圖1所示，由單十字交叉微流通道2和7以及溶液連接孔1、5、6和酶解液收集孔4構成，採用高解析度(如3600 dpi)雷射照排系統在透明薄膜上列印成掩膜，微通道部分為黑色線條，寬度為40微米，其它部分為透明。在經氧化處理的矽片(P型，厚500微米，直徑4英寸，晶向〈100〉，表面二氧化矽氧化層厚800納米)通過旋轉塗膜技術塗覆一層正性光刻膠(Shipley S1813光刻膠，Shipley, Marlborough, MA，美國)，旋塗條件為3000 rpm,時間為60秒。然後在110。。烘烤處理60秒以提高光刻膠的附著並除出殘留的溶劑(暴光前烘)，然後蓋上掩膜(含設計的微流結構)，使用Karl Suss MA6/BA6光刻機(Karl Suss, Germany)進行接觸式紫外線曝光40秒後，浸入20% Microposit 351顯影劑(Shipley)60-100秒，以洗去暴光部分的光刻膠層後，於150 1烘箱中烘30分鐘使毛細管通道和溶液連接孔部分未曝光的光刻膠硬化，然後以光刻膠和SiO2層為掩膜材料用60 0C的40% KOH水溶液刻蝕裸露的矽片至深度為35微米，除去光刻膠後即製成矽片陽模。在甲基丙烯酸甲酯單體中加入少量熱引發劑偶氮二異丁腈(甲基丙烯酸甲酯單體質量的0. 15%)和少量光引發劑安息香(甲基丙烯酸甲酯單體質量的0. 15%),在50°C水浴加熱並搖動使其溶解，然後於85°C水浴中加熱15-20分鐘，使單體預聚成甘油狀清亮鑄模溶液，沿微流控晶片矽陽模凸出的分離通道澆在矽陽模上並成條狀，將一片有機玻璃片蓋在預聚溶液上並壓緊，使預聚溶液充滿有機玻璃片與矽陽模間的縫隙，要求微流通道結構全部在有機玻璃片的下方，然後將工件水平放置。用20 W紫外燈(波長365納米，距離4-5釐米)通過有機玻璃片照射預聚溶液約25分鐘引發表面原位聚合，聚合溫度為25 °C。當模具從微流控晶片基片脫去後，矽陽模凸出的微結構可以高保真的被複製為微流控晶片基片表面的微通道。將上述矽陽模用玻璃板代替可製作微流控晶片蓋片。將脫模後的微流控晶片基片通道末端鑽孔((溶液連接孔1、5、6和酶解液收集孔4見圖1，孔徑2毫米)用於連接溶液。將基片和蓋片用水衝洗，吹乾後立即將微流控晶片基片帶有開口通道的一面與一片相同大小的有機玻璃蓋片夾於兩片玻璃片後，通過熱壓鍵合得有機玻璃微流控晶片。熱壓封裝溫度為108°C，施加在兩片玻璃板上的壓力為2公斤/平方釐米，熱壓時間為10分鐘。將6克石墨與138毫升濃硫酸混合，得有金屬光澤的粘稠液體，用冰水冷卻，加入硝酸鉀3. 6克後，在用冰水冷卻的情況下，分次加入18克高錳酸鉀，混合物在35°C加熱30分鐘，成粘稠的黑褐色糊狀液體，然後加水276毫升，立刻有大量氣體放出，繼續在98°C加熱40分鐘，加水到840毫升後，加雙氧水18毫升，用濾布抽濾分離出氧化石墨，並用5%的稀鹽酸通過抽濾洗滌，然後用水洗並乾燥得氧化石墨。準確稱取一定量氧化石墨分散在水中，通過超聲波進行剝離得氧化石墨烯水溶液，濃度為4毫克/毫升。取1. 8毫升正矽烷乙酯與2. 8毫升無水乙醇和0. 92毫升0. 25摩爾/升的稀鹽酸混合水解2小時後，用無水乙醇稀釋到10毫升，得濃度約為50毫克/毫升的矽溶膠，與氧化石墨烯水溶液等體積混合得微流控晶片通道修飾溶液。 將正矽酸乙酯注入有機玻璃微流控晶片微流通道，使其在提通道內停留3小時，使正矽酸乙酯充分滲入微流通道的表面層。通道內多餘的正矽酸乙酯用水衝去後，將0.1摩爾/升的稀鹽酸注入微流通道2小時，得通道表面經矽凝膠化處理的有機玻璃微流控晶片，然後將矽溶膠和石墨烯水溶液混合製得的修飾溶液注入表面經矽凝膠化經處理的有機玻璃微流控晶片通道內，5分鐘後移出修飾溶液並乾燥得修飾有矽凝膠氧化石墨烯複合膜的微流控晶片。在矽凝膠氧化石墨烯複合膜修飾通道內注入含2毫克/毫升1-(3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和I毫克/毫升N-羥基丁二醯亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接著注入含2毫克/毫升胰蛋白酶的50毫摩爾/升的磷酸鹽緩衝溶液(pH 7. 4)，在室溫下反應4小時，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得蛋白酶解微流控晶片。本發明中微流控晶片通道表面矽凝膠氧化石墨烯複合膜表面共價鍵固定蛋白酶示意圖見圖2。本發明中氧化石墨烯和固定有胰蛋白酶的矽凝膠氧化石墨烯複合膜的掃描電子顯微鏡照片見圖3。圖4為本發明中基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片實物照片。基於固定有胰蛋白酶矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片12通過矽橡膠管10與注射泵8連接構成流動注射蛋白酶解系統，示意圖見圖5。蛋白樣品溶液在蛋白酶解微流控芯通道內的流速為2. 0微升/分鐘，根據流速估算酶解時間約為10秒。從蛋白酶解微流控晶片12流出的酶解液滴在質譜點樣板13上，通過基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜儀測定。其中酶解牛血紅蛋白和馬心細胞色素c的產物的基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜圖見圖6，可見在譜圖中出現了酶解肽段的質譜峰，通過檢索網上資料庫，發現對於牛血紅蛋白和馬心細胞色素c分別有14條和11條肽段匹配，得到鑑定的胺基酸分別有138個和80個，蛋白序列覆蓋度分別為95%和76%，而傳統溶液酶解的牛血紅蛋白的蛋白序列覆蓋度為75%，表明本發明中基於固定有胰蛋白酶矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片在10秒內的酶解效果優於溶液酶解12小時的結果。實施例2、基於固定有靡蛋白酶矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片 此外，採用本發明的方法，還製備了基於固定有靡蛋白酶矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片。除酶固定步驟外，其他同實施例1。具體方法為在矽凝膠氧化石墨烯複合膜修飾通道內注入含2毫克/毫升1-(3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和I毫克/毫升N-羥基丁二醯亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接著注入含2毫克/毫升靡蛋白酶的50毫摩爾/升的磷酸鹽緩衝溶液(pH 7. 4)，在室溫下反應 4小時，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得固定有靡蛋白酶矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片。通過更換固定的酶的種類(如葡萄糖氧化酶或脲酶)，還可在此基礎上開發新型微流控晶片酶反應器，如血糖和尿素測定用微流控晶片酶反應器等。
權利要求
1.一種基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片的製備方法，其特徵在於具體步驟為 (1)通過光刻和化學溼法刻蝕的方法，加工出用於複製帶有分離通道的微流控晶片基片的娃陽模； (2)將熱引發劑偶氮二異丁腈和光引發劑安息香溶解在甲基丙烯酸甲酯中，於80-90°C水浴中加熱15-20分鐘，使其預聚成甘油狀清亮鑄模溶液；將此含光引發劑的鑄模溶液沿微流控晶片矽陽模凸出的分離通道澆在矽陽模上並成條狀，將一片有機玻璃片蓋在預聚的鑄模溶液上並壓緊，然後用紫外光通過有機玻璃片照射預聚的鑄模溶液，引發本體聚合，製作得含有微流通道的微流控晶片基片；將矽陽模用玻璃板代替，製作得微流控晶片蓋片；將所述基片和所述蓋片發生原位聚合的一面通過熱壓鍵合，製作得有機玻璃微流控晶片成品; (3)將石墨粉分散在濃硫酸中並用冰浴冷卻，然後加入硝酸鉀和高錳酸鉀進行氧化，再加入雙氧水後用稀鹽酸洗滌得氧化石墨，然後將氧化石墨分散到水溶液中，用超聲波進行剝離，得氧化石墨烯水溶液；將正矽烷乙酯與乙醇和稀鹽酸混合水解，得矽溶膠；將矽溶膠與氧化石墨烯水溶液混合，得微流控晶片通道修飾溶液； (4)將正矽酸乙酯注入有機玻璃微流控晶片微通道，2-4小時後正矽酸乙酯充分滲入微通道的表層；用水衝去通道內多餘的正矽酸乙酯，注入稀鹽酸水解1-3小時，得通道表面經矽凝膠化處理的有機玻璃微流控晶片，然後將矽溶膠和石墨烯水溶液混合製得的修飾溶液注入表面經矽凝膠化處理的有機玻璃微流控晶片通道內，然後移出修飾溶液，並乾燥，得修飾有矽凝膠氧化石墨烯複合膜的微流控晶片； (5)在通道內注入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二醯亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯的羧基活化，接著注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得蛋白酶解微流控晶片； 步驟(2)中，所述有機玻璃微流控晶片通道的深度為20-50微米，底部寬度20-60微米，上部寬度50-200微米。
2.根據權利要求1所述的基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片的製備方法，其特徵在於步驟(2)中，有機玻璃蓋片上對應於微流控晶片基片上通道的末端的位置鑽有直徑為1-3毫米的圓形小孔，用於進樣和收集蛋白酶解產物。
3.根據權利要求1所述的基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片的製備方法，其特徵在於步驟(2)中，所述熱壓鍵合的熱壓溫度為105-110°C，施加在兩片玻璃板上的微流控晶片上的熱壓壓力為O. 5-5公斤/平方釐米，熱壓時間為10-20分鐘。
4.根據權利要求1所述的基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片的製備方法，其特徵在於步驟(3)中，所述修飾溶液中，氧化石墨烯水溶液的濃度為1-10毫克/毫升，矽溶膠溶液的濃度為10-100毫克/毫升。
5.根據權利要求1所述的基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片的製備方法，其特徵在於步驟(5)中，水溶液中1- (3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-輕基丁二醯亞胺的濃度分別為O. 5-5暈克/暈升和O. 25-2. 5暈克/暈升,蛋白水解酶的濃度為O. 5-5毫克/毫升。
6.由權利要求1-5之一製備方法所製備得到的基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片。
全文摘要
本發明屬微流控晶片技術領域，具體為一種基於矽凝膠氧化石墨烯複合膜的蛋白酶解微流控晶片及其製備方法。石墨粉通過化學氧化和超聲分散得氧化石墨烯水溶液，與正矽烷乙酯水解製得的矽溶膠混合後，注入表面經矽凝膠化處理的有機玻璃微流控晶片通道內，一定時間後移出修飾溶液並乾燥得修飾有矽凝膠氧化石墨烯複合膜的微流控晶片。然後，在通道內注入1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二醯亞胺的混合溶液，使通道表面氧化石墨烯上的羧基活化，接著注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，使蛋白酶通過共價鍵進行固定，得蛋白酶解微流控晶片。本發明製備的微流控晶片蛋白酶解反應器具有酶解時間短、樣品用量少和價格低廉等優點。
文檔編號C12M1/40GK103013824SQ201210561470
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月21日 優先權日2012年12月21日
發明者陳剛, 魏邦國, 包慧敏, 張魯雁 申請人:復旦大學