用於治療腫瘤病的抗體結合物的製作方法

2023-06-25 22:24:21 1

專利名稱：用於治療腫瘤病的抗體結合物的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及免疫結合物領域，更具體地說是涉及免疫結合物在治療癌症中的用途。本發明也涉及用單克隆抗體(MoAbs)和細胞毒素部分的結合物來治療黑素瘤，這些細胞毒素部分是例如gelonin、核糖體抑制蛋白質、其它從植物中派出來的細胞毒素部分或是細胞毒素的或抑制細胞生長的生物應答修飾因子。
由於在治療腫瘤的足夠反應要視腫瘤內藥物濃度的釋放和保持而定，故癌症治療的精確定向必然是相當關鍵的。定位療法是採用單克隆抗體作為特定治療劑載體的一些研究者的目標。
癌症是西方社會中死亡率和發病率的一個主導原因。有許多類型的癌症，並各具特徵。但是，癌症至少有一個共同特徵，即細胞生長調節過程中存有缺陷。
黑素瘤，最致使的皮膚癌，是侵襲男女的高轉移性的疾病，在診斷後的五年中幾乎所有病人都難免一死。外科手術切除去局部惡性腫瘤僅在發病初期還未擴散時才有效。一旦疾病擴散後，外科手術必須附以其它一般方法作為補充以根除病變的細胞或惡性腫瘤細胞。大多數通常使用的補充療法諸如放射療法或化療，它們非局限於對腫瘤細胞的作用，雖然相對而言對惡性腫瘤細胞的殺滅作用較大，但常常會在一定程度上損傷正常細胞。
許多腫瘤表達一些正常細胞表達極微弱或根本不表達的抗原或抗原決定簇。一些腫瘤細胞表達胚胎類型細胞所表達的抗原，而這種抗原不被成熟動物的正常細胞所表達。這些異常表達的抗原被稱為腫瘤相關抗原。這些抗原的專一性在於儘管特定的抗原可能被多於一種腫瘤所表達，但它通常是被表達該抗原的特定腫瘤的所有或大多數細胞所表達。一個腫瘤細胞可以表達一種或多種腫瘤相關抗原。這些腫瘤相關抗原可在細胞的表面上表達(細胞表面抗原)也可以由腫瘤細胞分泌出來(分泌抗原)，或仍保留在細胞內(細胞內抗原)。
這些腫瘤相關抗原已被用來檢測、診斷並定位腫瘤。在某些情況下腫瘤細胞上腫瘤相關抗原的存在就允許了對腫瘤細胞有特異性的特殊藥物及其它治療手段的定向應用。
抗體通常是由動物免疫系統所產生的對外界抗原或抗原決定簇應答的蛋白質。抗體定向地連接在特定的抗原上。例如，對其它黑素瘤抗原的抗體在全身和腹膜內使用後被用來測定人體中特定的腫瘤位置。
隨著針對腫瘤細胞上抗原的特異單克隆抗體的發展，一種減少對正常細胞損害的靶向化療法已成為可能，因為腫瘤細胞上的抗原不會在正常細胞上出現。與特定抗原或抗原決定簇定向的單克隆抗體可以大量地製備。
為了讓抗體用來定位和治療惡性腫瘤，可給它進行標記。這類放射性同位素標記的單克隆抗體可附於腫瘤細胞表面抗原上，通過體外閃爍照像已成功地使病人體內腫瘤成象(Deland，Semin Nucl Med.19(3)158-65(Review)(1989);Juhl，Hepalogastroenterology 36(1)27-32(Review)(1989))。結合藥物的抗體可用作一個釋放系統，藥物通過它可以抗體所定向的特定腫瘤細胞為目標，這是因為全身使用了結合藥物的抗體後，抗體有到達腫瘤區域的獨特能力。抗體也可與毒素相結合，從而作一個釋放系統使毒素定向地運行到特定腫瘤細胞。
通常用於抗體結合物的細胞毒素劑大體分為三類物質毒素、放射核素和化療劑。與這三類中每類結合的抗體可作為具一定效力的治療劑但也存在一些特有的問題(Frankel，el al.Ann，Rev.Med.37125-142(1986)，Reimann et al.，J.Clin.Invest.82(1)129-138(1988).).含有植物毒素的免疫結合物與其它類型的抗體結合物相比有一個獨特的長處，因為1.抗腫瘤活性所需的免疫毒素的劑量一般要比抗體-藥物結合物所需的低得多。
2.毒素與抗體的結合不影響抗體的親和力。Gelonin是一種糖蛋白(分子量約為29-30，000Kd)，從Gelonium multiforum種子中純化而得。Gelonin屬於強核糖體失活植物毒素類。該類核糖體一失活植物毒素的其它組員是相思豆毒素、蓖麻蛋白和modeccin的鏈。與相思豆毒素和蓖麻蛋白一樣，Gelonin通過損傷哺乳動物核糖體的60s亞單位來抑制蛋白質合成。雖然相思豆毒素的A鏈(RTA)已廣泛用於免疫毒素，但gelonin對化學和物理處理比RTA穩定[Barbieri et al.，Comcer Swrv.1489-520(1982)]。此外，gelonin本身不與細胞結合，因而是無毒的(除了高濃度外)且在實驗室操作中是安全的。核糖體的失活是不可逆的，不涉及輔助因子並有揭示酶促作用的效能。
許多工作者建議或報告了將細胞毒素劑與抗體結合組成「免疫毒素」。單克隆抗體與細菌毒或諸如蓖麻蛋白或相思豆毒素的植物毒素的醇活性部分(A醇)b結合組成的免疫毒素有特殊的興趣。(Nevelle et al.，Immunol.Rev.，6275-92(1982);Ross et al.，European J.Biochem.104(1980);Vitteta et al.，Immunol.Rev.62158-183(1982);Ross et al.，Cancer Res.42(1982)457-464;Trowbridge and Domingo，Nature(Cond.)294171-173(1981)).以蛋白質重量為基礎，Gelonin和蓖麻蛋白是抑制蛋白質合成活性最大的毒素。Gelonin在抑制蛋白質合成中比蓖麻蛋白A鏈的活性大10-1000倍。像蓖麻蛋白和相思豆毒素的肽鏈包含兩條鏈，毒性單位A鏈及用來與細胞結合的B鏈。與蓖麻蛋白和相思豆毒素不同，gelonin只由一條鏈組成，由於它缺少用來與細胞結合的B鏈，極它本身對於完整的細胞是相對無毒的(Stirpe et al.，J.Biol Chem 2556947-6953(1980))。哺乳綱細胞明顯缺少與gelonin分子結合和/或使gelonin分子內在化的能力。gelonin與腫瘤靶向的單克隆抗體的配對物既提供了將gelonin連接至細胞上的特定方法又提供使gelonin-抗體複合物內在化的途徑。這種單克隆抗體諸如定向於特定的腫瘤細胞例如黑素瘤細胞抗原的單抗ZME。採用毒素gelonin比之採用諸如蓖麻蛋白A鏈毒素的優點之一是與蓖麻蛋白A鏈相比減少了對正常組織的毒性。gelonin與定向於抗-腫瘤相關抗原的單克隆抗體配對物，它們在腫瘤治療中是一種有活性。選擇性的免疫毒性劑。
以前的研究已闡述了許多含有gelonin的抗體一毒素結合物(Lambert et al.，J.Biol Chem.26012035-12038(1985);Thorpe et al.，Eur.J.Biochem 116447-454(1981);Singh et al.，J.Biol.Chem.2643089-95(1989);Scott et al.，J.Natl.Cancer Inst.791163-72(1987);Tedder et al.，J.Immunol.137(4)1387-91(1986)).最近Ozawa，et al(Int.J.Cancer 43152-157)已構思了一種由抗體B467組成的gelonin免疫毒素，該抗體B467與接受表皮生長因子(EGF)的細胞受體相結合。該B467-gelonin結合物對EGF受體表達的細胞毒素很高但對缺乏受體的細胞的無毒的。Sviam et al(Cancer Research 473169-3173(1987)製成了抗黑素瘤抗體9.2.2.7與gelonin結合物，並與相思豆素和蓖麻蛋白A鏈的9.2.2.7結合物比較其體內的體外殺細胞活性。這些研究證明gelonin結合物體外對抗原陽性細胞確有選擇性的細胞毒性效果。體內試驗證明直至總的抗體劑量為2mg/小鼠時gelonin結合物還是無毒的;多次靜脈注射gelonin免疫毒素足以延遲皮下人體腫瘤異體移植物在裸鼠中的生長。與以相思豆毒素和蓖麻蛋白的結合物相比較，gelonin結合物有相似的效力，在體內治療中選擇性更好且對腫瘤定位更準確。
由於連有藥物、毒素或放射性元素標記的抗體只與表達特定抗原的腫瘤細胞結合，故只有腫瘤細胞被殺死。相反的，採用放射療法，來自放射性同位素標記化合物的射線不只局限於接受射線的腫瘤細胞。例如，抗體的新陳代謝或酶促降解可釋放放射性標記物，使它們能到達諸如腎或骨髓的其它組織中，對這些器官造成不可接受的放射損傷。放射性同位素標記的抗體有這類問題，就限制了其在治療劑中的使用或使其在治療劑的中的使用複雜化。
本發明提供了一種抗體(這裡稱為ZME-018)的免疫結合物，該抗體可以識別在黑素瘤細胞上的GP240抗原。Wilson et al.，討論的一種抗體(22528S)可識別這個黑素瘤膜抗原(Wilson et al.，Int.J.Cancer 28293(1981))。該抗原在這裡定義為GP240。與GP240結合的抗體225.28s在這裡進一步定義為ZME-018。在一個具體實例中，抗體與選自由gelonin、蓖麻蛋白A鏈和相思豆素A鏈所組成組的一種毒素相連接。在另一個具體實例中，ZME抗體可與諸如阿黴素的殺細胞藥或諸如淋巴因子或細胞激動素的生物應答修飾劑相連接。在另一個實例中抗體可用諸如放射性同位素化學發光劑、螢光劑或酶標記物的可檢測標記物進行標記。通過給需要這類治療的個體使用這些殺細胞免疫結合物來治療腫瘤和預防帶有腫瘤相關GP240的腫瘤復發。應用該技術領域人員熟知的技術可檢測的標記ZME免疫結合物可用來診斷和定位腫瘤。這些標記的免疫結合物也可通過該技術領域熟知的方法用來測定生物樣品內存在的GP240並給體內的腫瘤位置定位。
本發明的一個目的是提供一種細胞毒性組合物，它將特異性結合併殺死腫瘤細胞提供一種特異性地與表達上述的GP240抗原的腫瘤細胞結合併殺死它的細胞毒性組合物也是特別作為本發明的一個目的。在Hybritech，Inc中用鹽分餾和DEAE色譜層析來製備抗體ZME-018並通過SDS PAGE(Wilson et al.，Int.J.Cancer 28 293-300(1981))來判斷是否均質。本發明的另一個方面是關於通過使細胞與殺細胞有效量的免疫毒素相接觸而殺死人體黑素瘤細胞或表達ZME(GP240)抗原的其它腫瘤細胞的方法。
本發明的進一步目的在於提供這樣的組合物，使之對腫瘤細胞有毒性但對正常器官的損傷最小。


圖1表明ZME-gelonin連接和純化的流程。
圖2表明用S-300凝膠滲透色譜層析對ZME-gelonin的純化。
圖3表明從S-300色譜層析出來的高分子量的物質在Cibachron一點瓊脂糖凝交柱上用線性鹽梯度洗脫(0-300mM NaCl)流出簡圖。顯示出兩個蛋白質峰一個徹底流出峰(餾份14-20)和一個用高鹽洗脫出的鄰接峰(餾份44-75)。
圖4表明gelonin和ZME gelonin結合物的電泳類型。
圖5表明ZME(空心圈)和ZME gelonin(滿圈)的比較的ELISA分析數據。
圖6表明ZME-gelonin和游離gelonin對對數期AAB-527細胞在72小時暴露後的毒性。
圖7表明ZME-gelonin和游離gelonin對對數期AAB-527細胞的毒性。
圖8表明ZME-gelonin對抗原陽性靶黑素瘤細胞(AAB-527)和抗原陰性T-24細胞在培養基中的毒性。
圖9表明游離抗體對ZME-gelonin細胞毒性的影響。
圖10表明IFN-α、IFN-γ和TFN對ZME-gelonin細胞毒性的作用。塗覆的圈表明對只有ZME-gelonin的劑量反應。空心的方塊表明對ZME-gelonin加上IFN-γ的劑量反應。空心的三角形表明在適當量TNF-α的存在下ZME-gelonin的劑量反應。帶有空白點的塗滿的圈表明在適當量IFN-α存在下，ZME-gelonin劑量反應曲線。
圖11表明ZME-gelonin對抗原阻性(A-375，塗覆的圈)及抗原陰性(CEM，空立方塊)細胞在人體腫瘤起源細胞分析中的作用。
圖12表明ZME-gelonin對從4個病人的新鮮活組織中得到的不同型起源細胞存活的細胞毒性作用。
圖13表明ZME抗體和ZME-gelonin結合物在帶有人體黑素瘤異體移值物的裸鼠中的組織分布。
這裡所用的術語「單克隆抗體」表示一種總體均勻的抗體組合物。它並不限定抗體的來源或製備抗體的方法。
黑素瘤細胞在其細胞表面上表達出240KD(GP240)抗原。已生產出這個抗原的抗體。抗體ZME-018(Hybritech Inc生產)是一種能識別存在於大多數人體黑素瘤細胞表面上240Kd糖蛋白的鼠的單克隆抗體IgG2a。可以生產出能識別這個240KD抗原的表位的IgG1、IgG2a和IgG2b同位素的單克隆抗體。用於本發明目的的ZME抗原的240Kd表位被稱為表位。因此，能識別該ZME表位的所有抗體在功能上是等同的。
這些具代表性的雜交培養的細胞分泌出相同的異型抗體，即所有分泌的抗體都能認出ZME表位，它們保藏在美國保藏中心(ATCC)，保藏號為_。
這些單克隆抗體可通過該領域技術人員熟知的方法來製得。已詳細地闡述了製備產生這些抗體的雜交細胞培養物的特徵及方法。(Wilson et al.，Int.J.Cancer 28293(1981);Imai et al.，Transplavt proc.12380-383(1980)).簡而言之，用鼠骨髓瘤細胞系Sp2/0-Ag-14和如Imai et al.，(1980)Transplant Proc.12380-383)所述的用黑素瘤細胞系M21免疫的鼠脾細胞來建立雜交系。分泌單克隆抗體(MoAb)225.28s和465.12的雜交系已被亞克隆並在體內和體外繁殖。兩種單克隆抗體都是IgG2a亞類，在使用前通過在蛋白質A瓊脂糖凝膠4B上(Pharmacia，Piscatawny，NJ，USA)吸附/洗脫而從小鼠腹水中進行純化。
雜交產生的抗體與人體黑素瘤細胞反應但不與人體正常細胞反應，這種抗體被進一步特異化。由ZME細胞系產生的抗體及雜交產生的功能上等同的抗體與人體黑素瘤細胞上的ZME抗原反應。它們也與70-80%隨機獲得的試驗黑素瘤反應，但是綜述在實施例4中表1的種種組織無反應。
這裡所用的關於例舉的鼠單克隆抗人體黑素瘤抗體方面，術語「功能上等同」表示一種單克隆抗體(a)橫向劃分例舉的單克隆抗體;(b)有選擇性地結合到諸如人體黑素瘤細胞的表達ZME抗原的細胞上;(c)具有G或M等型基因;(d)通過免疫沉澱或夾心免疫分析來測定與ZME抗原的結合;(e)當與gelonin結合，則顯示組織培養抑制劑量(TCID)，對AAB-527或A375系中至少一種最低抑制50%(所用劑量是80-100單位/ml)。
用N-琥珀醯亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPPP)或2-亞氨基硫羥烷(IT)作為連接劑使抗體ZME與gelonin結合。結合物在72小時組織培養分析中進行抗AAB-527和A375細胞試驗。這兩種細胞系的抗體結合物表現出可接受的抗增殖活性(TCID50%在少於100單位毫升時)。
下面實施例給出抗體的進一步詳細特徵，。
免疫化學劑本發明首要的免疫化學衍生物是免疫毒素(ZME抗體與細胞毒素部分或生物應答修飾劑的結合物)以及標記的衍生物(例如，放射性標記、酶標記或螢光標記的衍生物)，其中標記提供了識別包括標記了的抗體的免疫複合物的方法。
免疫毒素的細胞毒素部分可以是細胞毒素藥物或源於細菌或植物(gelonin)的酶活性毒素或是這類毒素的酶活性片段(「A鏈」)。酶活性毒素及其片段較為優選，其例子為gelonin、白喉菌A鏈、未結合的白喉毒素的活性片段、外毒素A鏈(從Pseudomonas aerugmosa中得到)、蓖麻蛋白A鏈、相思豆素A鏈、modeccin A鏈、α-次黃嘌呤、Aleurites fordii蛋白質、dianthin蛋白質、Phvtoiacca americana蛋白質(PAPI，PAPII和PAP-S)、苦瓜屬沙位提(momordica charamria)抑制劑、瀉果素、巴豆毒蛋白、藥用肥皂草屬抑制劑、絲裂吉菌素、局限麴黴素、酚黴素和伊諾黴素。首先的是與gelonin的結合物。
可與ZME抗體結合且用於本發明的生物應答修飾因子包括，但不局限於，諸如IL-1、IL-2幹擾素(α、β或γ)TNF、LT、TGF-β和IL-6的淋巴細胞激活素和細胞激活素。這些生物應答修飾因子對腫瘤細胞有種種作用。這些作用是通過直接作用增加腫瘤細胞殺死率及通過增加宿主體防禦調節機制而增加腫瘤細胞的殺死率。抗體ZME與這些生物應答修飾因子的結合使之在腫瘤內選擇性定位，因而增加了坑增殖作用，同時抑制了引起對非靶向細胞毒素性的非特異性作用。
在本發明中有用的細胞毒素藥包括，但不限於，阿黴素(及其衍生物)、順一鉑絡合物(及其衍生物)、爭光黴素和氨甲葉酸(及其衍生物)。這些細胞毒素藥有時對於臨床治療腫瘤復發特別是黑素瘤是有用的，但它們有嚴重的副作用並危及非靶細胞而使其使用複雜化。抗體ZME可作為這類藥物的有用載體，為藥物釋放至腫瘤並增加其進入腫瘤細胞提供了一種有效的手段。另外，將載有細胞毒素藥物的特定抗體釋放至腫瘤可以保護諸如肝臟、腎和骨髓敏感區域免受化療劑的毒性作用。由於所有藥物部分與在腫瘤內濃集的抗體結合，故採用藥物與抗體ZME結合的釋放系統可以降低藥物本身的劑量。
單克隆抗體的結合物可採用種種雙功能蛋白連接劑而製得。這類反應劑的例子是SPDP、IT、諸如膽影酸二甲酯的亞氨基酯·HCl的雙功能衍生物、諸如辛二酸二琥珀醯亞氨酯的活性酯、諸如戊二醛的醛、諸如雙(對-二氮鎓苯甲基)-己二胺的雙-二氮鎓衍生物、諸如雙(對-重氮基苯甲醯基)-乙二胺的雙重氮基衍生物、諸如2，6-二異氰酸苯亞甲酯的二異氰酸酯及諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯的二-活性氟化合物。
當結合物用來在體外治療或診斷目的下殺死人體黑素瘤細胞，典型地將結合物加至細胞培養基質中，濃度至少約10mM。體外使用的配方及給藥模式是不苛刻的。通常使用與培養基或灌注基能混溶的水液製劑。
用作診豆和治療帶有諸如黑素瘤ZME抗原的細胞毒素放射藥物可通過將高線性能量轉段(LET)的放射同位素結合至抗體上而製得。這裡所用的術語「細胞毒素部分」也包括這類同位素。
用來製備標記抗體的標記物包括可被直接檢測的部分，例如螢光鉻和放射標記物以及諸如酶的必須經反應或衍生化後而檢測的部分。這類標記物的例子是32P、12G、3H、14C螢光茨及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹醯、7-羥基香豆素、螢光素、2，3-dihydrophthalzainediones，辣根過氧化酶、鹼性磷酸酯酶、溶菌酶和葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶。抗體可通過已知方法用這類標記物標記。例如，諸如醛、碳化一亞胺、雙馬來醯亞胺、imidates、琥珀醯亞胺、雙-重氮化的苯啶等的連接劑可用來使抗體與上述的螢光、化學發光劑和酶標記物進行連接。
抗體和標記抗體可用於許多免疫成像或免疫分析方法中以檢測病人或監視已診斷出患有癌症者中表過ZME抗原的諸如黑素瘤的腫瘤的存在。當用來監測癌症的狀態時可採用定量免疫分析方法。這類監測分析定期地進行，比較結果以決定病人的腫瘤是否增加或減少。可用的普通分析技術包括直接和間接分析。直接分析包括將採自病人的組織或細胞樣品與帶有標記的抗體一起孵育。如果樣品細胞包括黑素瘤細胞ZME抗體帶有標記的抗體就與這些細胞結合。洗滌組織或細胞以除去未結合的標記抗體後，組織樣品即可測定標記免疫複合物的存在。
診斷用的抗體典型地為配套形式。這些典型的配套物包括在合適容器中標記形式的抗體、用來孵育和洗滌的試劑以及視標記物性質而定的基礎物質或派生劑。也可包括抗原ZME的對照物及指令。
給已診斷出帶有ZME抗原決定簇的腫瘤病人使用本發明的免疫毒素可以使細胞毒素劑定位並濃縮在殺死腫瘤細胞所需的部位。通過使細胞毒素劑如此定向，可以消除或減少其它器官、組織和細胞的非特定毒性。
當用於體內治療時，給病人使用治療有效量的免疫毒素(治療有效量即是消除或減少病人腫瘤的量)。它們通常是非腸道給藥，較好地是靜脈內給藥。劑量及療程視癌症的性質(初期或轉移性的)及其種類、特定免疫毒素的特徵(例如其治療指數)、病人及病史而定。所用免疫毒素量典型的範圍為0.1-10/ng/Kg病人的體重。
非腸道使用的免疫毒素輔以藥學上可接受的非腸道的賦形劑而配成單位劑量的注射劑(溶液、懸浮液、乳劑)。這類賦形劑本身無毒且無療效。這類賦形劑的例子是水、鹽水、Ringer's溶液、右旋糖溶液和5%血清白蛋白。也可使用諸如不揮髮油和油酸乙酯的非水性賦形劑。磷脂可用作載體。賦形劑可含有微量的諸如增加等滲性和化學穩定性的添加物，例如緩衝液和防腐劑。免疫毒素在這類賦形劑中典型地配成濃度為0.1mg/ml至10mg/ml。
通過Stirpe，et al的方法從gelonium muiltiflorum的種子中均化Gelorin。簡單地說，通過在緩衝鹽水溶液(pH7.4)中均化而使gelonin從種子中萃取出來。在5mM磷酸鈉(pH6.5)中滲析後濃縮上清液，gelonin再用如實施例1所述的離子交換色譜層析純化用高壓液相色譜(HPLC)和十二烷基硫酸鈉-聚乙醯胺凝膠電泳(SDS-Page)分析gelonin毒素的純度。Gglonin毒素遷移成一單區帶，其分子量為29-30，000道爾頓。
如實施例2所述通過在無細胞系統中的蛋白質合成抑制不測量Gelonin素素活性。
如實施例5所述的用SPDP修飾的抗體ZME-018與實施例3和6所述的亞氨基硫羥烷修飾的gelonin相結合。如實施例7所述通過在Sephadex G-75柱上的柱色譜層析純化結合抗體的gelonin。
通過蛋白質合成抑制來決定gelonin配對的抗體的毒性，用體外和體內試驗測定其抗增殖活性。
下列實施例詳細敘述了本發明免疫毒素單克隆抗體的製備、特徵及其使用。這些實施例不限制本發明。
實施例1gelonin的純化將Gelonium multiflorum的種子去殼，用8倍體積含5mM磷酸鈉的0.14M NaCl液(pH7.4)在均化器中研磨硬果。使均化物在4℃下過夜。在0℃下及冰冷卻和攪拌下以35，000次g速度離心20分鐘。除去上清液在5mM磷酸鈉液中滲析並用pm10濾器濃縮，樣品在用5mM磷酸鈉平衡的CM-52和離心交換柱上(20×1.5cm)分層。結合至離子交換樹脂上的物質用400ml 0-0.3M線性NaCl溶液梯度在4℃下以25ml/小時的速率洗脫。每次收集餾份5ml，在分光光度機上於280nm處觀察鎦份。gelonin約在55-70鎦份流出，是最後的流出高峰。收集鎦份55-70，在重蒸水中滲析，通過冷凍乾燥濃縮。在高壓效相色譜中用TSK3000凝膠滲透柱用50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)洗脫以及15%十二烷基硫酸鈉-聚乙醯胺凝膠電泳(SDS-page)來檢查每個製備產品的純度及分子量。Gelonin遷移成一個單一區帶，分子量約為29-30，000道爾頓。
實施例2Gelonin活性的分析在無細胞的質白質合成抑制分析中監測Gelonin的活性。在使用前馬上解凍免網狀細胞溶解物，並在50ml免疫網狀細胞溶解物中依次加入下列組分0.5ml 0.2M Tris HCl(ph7.8)、8.9ml乙二醇和0.25ml 1M HCl.每次加入後混合來進行無細胞蛋白質合成抑制分析。
取20微升組成為0.375MKCl、10mM Mg(CH3CO2)2、15mM葡萄糖、0.25-10mM胺基酸(亮氨酸除外)、5mM ATP、1mM GTP、50mM TMS-HCl(pH7.6)、10μl肌酸酐磷酸酯-肌酸酐磷酸酯酚、8μl14C亮氨酸(Amersham 348毫居裡/mmol)的鹽一胺基酸一能量混合物(SAEM)並加入含有不同濃度gelonin混合物的1.5μl溶液。使混合物在30℃下孵充60分鐘。通過在玻璃纖維過濾器上沉澱出所合成的蛋白質，用10%TCA和丙酮洗滌，在β-計數器上用Aguasol閃爍流體測定放射活性而測得與混合物成倍數關係的摻入的14C-亮氨酸。不低於4×109μ/mg的有特定活性的Gelonin用來與抗體結合。gelonin活性單位是在無細胞分析中引起摻入[14C]亮氨酸50%抑制的gelonin蛋白質的量。
實施例3用亞氨基硫羧烷修飾的Gelonin使在磷酸鹽緩衝鹽水中的Gelonin於Centricon 10微型濃縮器中濃縮至約2mg/ml。加入三乙醇胺氯化氫(TEA/HCl)、(pH8.0)和EDTA直至最後的TEA/HCl濃度為60mM及1mM EDTA，pH8.0。將2-亞氨基硫羥烷貯存溶液(20mM)加至最終濃度為1mM，使樣品在氮氣流下於4℃下孵育90分鐘。
在預先用含有50mM NaCl和1mM EDTA的雙-三乙酸鹽緩衝液pH5.8預平衡的Sephadex G-25柱上凝膠過濾而除去過量的亞氨基硫羥烷。用Badford染料結合分析在微滴定板上分析鎦份中蛋白質的含量。簡而言之，在每個坑中加入40μl樣品、100μl磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)和40μl樣品、100μl磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)和40μl染料濃縮物。在Dynatech Micritlisa自動讀出器中讀出600nm處的吸光度。Gelonin在空隙體積處流出(約在鎦份14-20)。收集這些鎦份並用Gentricin-10微濃縮器濃縮。
實施例4對ZME黑素瘤抗原的單克隆抗體的製備及特徵分泌抗體的雜交系用107人黑素瘤M21細胞腹腔內注入8周齡雌性BALB/C鼠(SCRF餵養繁殖La Jolla，Calif)，2周後再用5×106M21細胞增加腹腔內注射。對50周齡的雄性NZB/B鼠(SCRF餵養繁殖)先注入5×106BW5黑素瘤細胞，每隔一個分別再用5×106BW5、M51、Colo38、BW5和M21增加注射5次，增加注射後三天，殺死小鼠，取出脾臟，用手術刀分離出脾細胞而製成細胞懸浮液。用0.17NH4Cl在0.01M Tns pH7.2中處理脾細胞懸浮液10分鐘以溶去紅血球細胞。然後，如Gefter et al.(1977)Somat，Cell Genet 3731)所述用下列微小修飾使SP2/OAg14細胞與這些脾細胞融合5×107脾細胞和107SP2/OAg14細胞用0.3ml 30%(V/V)聚乙二醇1000(PEG)(Baker化學公司，phillipsburg N.J.)在MEM中進行雜交。用PEG孵育後洗滌細胞，在2×106細胞/每毫升D-MEN濃度中培養過夜。第二天使細胞懸浮液在40ml HAT基質中並吸進約微滴定板400克中(0.1ml/坑)(Costar ＃ 3596，Cambridge Mass)間隔一周如一滴(約25ml)MAT基質。2-3周後，選作進一步研究的雜交物在含10%FBS的D-MEN中培育。雜交物放在組織培養物中並在已注射0.5ml Pristane(Pfaltz和Bauer，Inc.Stamfofd，Conn)的BALB/C鼠的腹腔內生長。投入使用的培養基和腹水可用作抗體來源。
根據諸如Cotten et al，Eur，J.Immumol.3.136(1973)所述的組織培育技術在體外使雜交細胞的無性繁殖細胞系生長。
與人黑素瘤細胞反應但不與正常人細胞反應的產生抗體的雜交物被進一步特異化。
如表1所示，它們與大多數正常受試的組織不反應。由ZME細胞系產生的抗體及功能上相等的形成雜交物的抗體與諸如M-21的人黑素瘤上的ZME抗原反應。
表 1抗體ZME-018(225.285)＊的正常組織反應活性組織反應活性＊＊膀胱 0/3大腦皮層 0/2軟骨 0/2結腸 0/2乳頭 1/2十二指腸 0/1子宮內膜 0/1腎 0/2肝 0/1肺 0/4淋巴節 0/3乳腺 0/3卵巢 0/1胰臟 0/1外周血管淋巴細胞 0/4外周神經 0/1
前列腺 0/2唾液腺 0/3骨骼肌 0/1皮膚 0/5脾 0/1胃 0/3甲狀腺 0/2扁桃體 0/1睪丸 0/5＊ 來自P.Giacomini，et al.Cancer Research 441281-1287，1984＊＊陽性抗原樣品數/試驗樣品數實施例5用SPDP修飾單克隆抗體ZME-018將N-琥珀醯亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)在無水二甲基甲醯胺中製成3mg/ml的貯存溶液。由於結晶SPDP可進行水解，通過分析在260nm處雙束分光光度計的吸光度，用分光光度方法測定化學活性交聯劑的真正濃度。SPDP貯存的濃度用下式來計算(吸光度的改變(260nm))/(0.02×103ml/mmol) × (3.01)/0.01 ＝毫摩爾數/ml/SPDP將在1.0ml磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)中的1mg單克隆抗體ZME加至玻璃管中。不斷混合攪拌下;將5-倍摩爾過量SPDP貯存溶液(約10μl貯存溶液)的慢慢加入試管中。在室溫下使混合物孵化30分鐘，在孵化期間每5分鐘攪拌一次。
通過在用含0.5mM EDTA的100mM磷酸鈉緩衝液pH7.4(緩衝液A)預平衡的Sephdex G-25柱(1×24cm)上的凝膠過濾色譜層析從樣品中除去過量未反應的SPPP。收集組份(0.5ml)，用Bradford染料結合分析(Bradford Aral.Biochem.72248-254(1976)進行蛋白質含量分析。用Bio-TEK微板自動讀出器測出96-坑板上的吸光度(600nm)。抗體在空隙體積處流出(鎦份14-20)，匯集這些鎦份並保持在4℃下。使蛋白質在Centricon-30微濃縮器中濃縮蛋白質。用100mM含EDTA(0.5mM)的磷酸鈉緩衝液pH7.0洗Centricon的保留物。使抗體濃縮成最終體積0.5-0.75ml。
實施例6SPDP修飾的單克隆抗體ZME-018與亞氨基硫羥烷修飾的Gelonin結合如實施例3所述，將如實施例1所述的而製得的1mg純化gelonin(2mg/ml在PBS中)用亞氨基硫羥烷進行修飾。如實施例4所述同修飾的單克隆抗體ZME與等重量如實施例3所述的修飾的gelonin相混合。與抗體相比該部分過量5倍摩爾的gelonin通過加入0.05MTEA/HCl緩衝液pH8.9而將混合物調節至pH7.0，在氮氣下於4℃下使混合物孵化20小時。將碘代乙醯胺(0.1M)加至最後濃度為2mM以封閉任何剩餘的游離巰基。在25℃下繼續孵化1小時。使該反應混合物在4℃下貯存直至用凝膠過濾純化。
實施例7Gelonin-單克隆抗體15A8複合物的純化通過用PBS預平衡的Sephadex 3-300柱(1.6×31cm)上的凝膠過濾而從實施例6的反應混合物中除去未結合的Gelonin及低分子量產物。
在進入Sephadex柱前使實施例6的反應混合物在Centricon 30微型濃縮器中濃縮至1ml。柱用PBS洗滌。鎦份每次收集1ml，用Bradford染料結合分析(Badford，Anal.Biochem 72248(1976))分析50μl等分試樣的蛋白質。
如圖2所示，在空隙體積(約為鎦份28-40)中洗脫出遊離的抗體和結合gelonin的抗體，而來結合的gelonin在約鎦份45-65處洗脫出來。
為了除去未結合的ZME-018，用在用含0.1M NaCl的10mM磷磷酸鈉緩衝液(pH7.2)預平衡的蘭瓊脂糖凝膠Cl-6B(1×24m)和色譜柱上層析來自S-300柱的高分子量峰(鎦份28-40)。進樣後，用30ml緩衝液洗滌柱，徹底洗脫出來結合的抗體。用在10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.2)中的0.1-2M NaCl液的線性鹽梯度洗脫柱。用Bradford染料結合分析來測定鎦份的蛋白質含量。
圖2表明S-300柱的洗脫分布，它表明gelonin可從其與抗體的結合物和未結合的抗體中分離出來，而後二者都在第一個峰中洗脫出現(約為組份28-40)。該洗脫類型可通過如圖4所示的50μl等分試樣在5-20%梯度非還原SDS聚丙烯醯胺凝膠上的電泳來證實。連接的混合物負載於通路3。這裡顯示出遊離gelonin(通路2)、游離抗體(通路1)和一份子gelonin與一分子抗體連接的區帶及兩分子gelonin與一分子抗體連接的區帶。S-300柱的空隙體積峰含有游離抗體和抗體-gelonin結合物，它們負載在通路4上。
用含0.1M NaCl的10mM磷酸鈉緩衝液pH7.2預平衡蘭瓊脂糖凝膠CL-6B柱(1×24cm)在此柱上親和層析從gelonin結合的抗體中除去來結合的抗體。在S-300洗脫樣品進樣後，柱用30ml相同的緩衝液徹底洗脫出來結合的抗體。
gelonin結合的抗體結合至柱上並用0.1-2M NaCl在10mM磷酸鈉緩衝液pH7.2中的線性鹽梯度溶液洗脫。抗體-gelonin複合物在用約0.7M NaCl液時洗脫出來如圖3所示，圖3展示了蘭瓊脂糖凝膠柱的洗脫簡圖。用Bradford染料結合分析不測定洗脫鎦份中蛋白質的含量。匯集含蛋白質的組份，洗脫模式用在5-20%梯度非還原的聚丙烯醯胺凝膠上的電泳來證實。ZME-gelonin複合物的電泳模式如圖4所示。完全流出峰(鎦份14-20)只含游離抗體(圖4、通路5)，而用高鹽洗脫出的組鎦份(鎦份50-80)含有ZME-gelonin結合物而無未結合的gelonin或抗體(圖4，通路6)。最後的產物含有與1，2和3gelonin分子連接的ZME抗體。平均的gelonin含量是1.5分子/每抗體分子。
如實施例2所述在體外的免網狀細胞轉化系統被用來估算基本純淨的gelonin-ZME抗體複合物的gelonin活性。在此分析中的一個活性單位定義為與未處理對照物相比蛋白質合成50%抑制所需的蛋白質量，用此分析，天然gelonin和ZME-gelonin結合物的特異活性依次是2×108u/mg和8.2×105u/mg。在網狀細胞分析中基本純淨的gelonin-ZME抗體是活性的。原始樣品以11000釋釋可產生約50%蛋白質合成的抑制，即減少了50%14C-亮氨酸摻入蛋白質。這樣，原始製備物的活性是1000U/ml。
實施例8細胞培養方法將ZME抗原陽性的人膀胱癌(T-24)人頸癌或2ME抗原陽性的人轉移性黑素瘤腫瘤細胞A375M或AAB-527保存在添加了10%加熱失活的胎牛血清、100mM不必需的胺基酸、2mM L-穀氨酸、1mM丙酮酸鈉、維生素和抗生素的最小必需基質(MEM)培養物中。培養的細胞進行常規篩造，未發現真菌性感染。
A.細胞增殖分析在37℃下，將細胞系保存5%CO2-潮溼空氣孵化器中的完全基質內培育。在與TNF、免疫毒素、IFNα和IFNγ結合的分析中，洗滌培養物，並用依地酸分離，然後以25×103細胞/毫升的密度再懸浮於全基質。將200ml等分試樣分散配入96-坑的微滴定板中，然後讓細胞粘附。這引起了細胞的廣泛播種。24小時後該基質用含不同濃度的免疫毒素、TNF、IFNg或IFNa的基質所代替。讓細胞孵育72小時並通過結晶紫染色來分析相對細胞的增殖。
B.結晶紫染色用含有適量鈣和鎂的PBS洗滌細胞三次並用含0.5%(V/V)結晶紫的甲醇染色。用150μl sorenson's構櫞酸鹽緩衝液(0.1M構櫞酸鈉，pH4.2 50%(V/V)乙醇)在室溫下使結合的染料洗脫1小時。用Bio-Teck微板讀出計測量600nm處的吸光度。相對的增殖(RCP)由下式算出RCP＝ (平均吸光度(藥物處理過))/(平均吸光度(未經藥物處理)) ×100C.人體腫瘤克隆分析在臨床所指的活組織檢查過程中從黑素瘤病人中得到腫瘤組織檢查的樣品。在無菌操作下，製備腫瘤細胞懸浮液(Leibovitz，et al.，Int.J.Cell Coloning 1478-485(1983))。另外，也對來自美國保藏中心(馬裡蘭州洛克維爾)的A375P黑素瘤和CEM白血病細胞系進行試驗。採用標準化方法將腫瘤細胞平皿接種到含10%胎牛血清的全基質存在下的半固體基(瓊脂糖)上，對新鮮腫瘤而言每0.5ml培養板含100，000細胞，細胞系則含10，000細胞，這樣在HTCA中測定ZME-gelonin對新鮮腫瘤細胞懸浮液和細胞系的作用。(Hamburger，et a〕1.，Science 197461-463(1977);Salmon，et al.，N.Engl.J.Med.2981321-1327(1978);Salmon，et al.，J.Clin.Oncol.71346-1350(1989)).在腫瘤細胞平皿接種後將上述製得的ZME-gelonin馬上加至培養皿中進行試驗。平皿中加入ZME-gelonin，四個濃度0.025ng/ml至250ng/ml的每個一式三份。除了未處理對照平皿外，也對未結合的ZME-18單克隆抗體和游離gelonin進行對照試驗。在37℃含5%CO2的空氣潮溼孵育器中使細胞系和腫瘤細胞培養物培養平均10天，用生存染色和調節至最佳的自動分析計數儀來評估克隆形成(Shoemader，et al.Cancer Res.45 2145-2153(1985))(Salmon，et al.，Int.J.Cell Clouing 2142-160(1984)。在相同的實驗中測定相關於未處理對照物的ZME-018處理培養物的存活百分率。然後作圖畫出劑量一反應曲線。
實施例9連接Gelonin的和未連接Gelonin的ZME抗體與靶細胞結合的比較分析結合gelonin的和未結合gelonin ZME抗體與靶細胞結合的能力。通過ELISA分析來試驗ZME-gelonin免疫毒素與抗原陽性(AAB-527細胞)或抗原陰性(T-24細胞)的結合。
在微滴定板的每個坑中加入5萬個靶細胞(AAB-527)或非靶細胞(T-24)。在37℃下使細胞在板上乾燥過夜。然後細胞用冷PBS洗滌三次並通乾燥空氣過夜。處理後細胞表面抗原決定子的有抗原活性。
細胞貼住後，用洗滌緩衝液(9.68克Tris、64.8克Tris、64.8克氯化鈉、16ml吐溫20、800mg乙基汞硫代水楊酸鈉在8升重蒸水中)洗滌平板。將抗體樣品在含有1%牛血清白蛋白(W/V)的洗滌緩衝液(稀釋緩衝液)中稀釋，將0.02至50μg/ml各種濃度的結合或不結合ZME抗體的50μl物質加至坑中。在4℃下孵育1小時後，除去上清液，坑用洗滌緩衝液洗滌兩次。
將從Bio-Rad(生物放射)中所得的且在稀釋緩衝液中稀釋11000(V/V)的辣根過氧化酶結合的山羊抗鼠IgG(HPGAM)50μl加至每個坑中。在4℃將平板孵育1小時並用洗滌緩衝液將坑洗滌兩次。在室溫下於黑暗中將每坑50μl基質溶液(80mM枸櫞酸鹽磷酸鹽(pH5.0)，1mM2，2'-連氮基-雙(3-乙基苯-噻呋啉-6-磺酸)(ABTS)二銨鹽(SIGMA CHEMICAL CO)和4μl30%過氧化氫)的平板孵育30分鐘後，向每個坑中加入25μl 4N硫酸。在Elisa讀出計上測定492nm的吸光度。
如圖5所示，60分鐘暴露後天然的ZME和ZME gelonin結合物與靶細胞結合得均很好。令人驚奇地是，ZME-gelonin結合物與靶細胞的結合比天然的ZME好。這個結合性的增加並非歸功於SPOP對抗體的修飾，因為SPOP修飾的ZME和天然ZME行為一致。此結合性的增加也不是由於靶細胞對分子中gelonin部份的結合，因為用天然gelonin對靶細胞進行預先處理表明對抗體或免疫毒素與其結合均無影響。如ELISA試驗所估計，ZME和ZME-gelonin都不和抗原陰性T-24細胞結合。
實施例10Gelonin和Gelonin-ZME抗體複合物的細胞毒性在抗原陽性細胞連續(72小時)暴露於免疫毒素成天然gelonin後，進行ZME-gelonin結合物的細胞毒性研究。如圖6所示，當抗原陽性的AAB-527細胞暴露於約0.1/mM ZMEgelonin時，可觀察到50%細胞死亡。當細胞暴露於天然gelonin，要求100nM濃度gelonin不減少相對於未處理對照的50%細胞數。
然後用實施例2所決定的單位基礎，將靶細胞用種種濃度的ZME-gelonin或種種濃度的gelonin處理。如圖7所示，用50單位/mlZME-gelonin結合物可得到50%細胞毒性，而游離的gelonin要1×107單位/ml才能達到相同效果。
在對數相培養期中測定ZME-gelonin抗原-陰性T-24細胞的作用。如圖8所示，只用gelonin要100μg/ml濃度來產生在AAB-527細胞中的50%細胞毒性，這與AAB-S27細胞中所發現的相似。濃度為10μg/ml的ZME-gelonin在靶T-24細胞中產生50%細胞毒性。但是，ZME-gelonin免疫毒素對非靶T-24細胞即使在最高試驗濃度時也無細胞毒性。
為了進一步表明ZME-gelonin細胞毒素性是通過ZME細胞表面抗原傳遞的，將能達到80%細胞毒性的ZME-gelonin固定劑量加至存在有游離ZME抗體或一個不相關抗體(15A8，不與黑素瘤細胞結合的抗體)的靶對數期黑素瘤細胞培養物中。如圖9所示，ZME抗體存在量增加抑制了ZME-gelonin結合物的細胞毒性，而15A8抗體無此作用。因此，ZME-gelonin結合物的細胞毒性是直接通過ZME抗體結合至靶細胞上的ZME抗原而傳遞的。
實施例11用IFNα、IFNγ和TNF調節ZME-gelonin的細胞毒性為了表明種種生物應答修飾因子對免疫毒素細胞毒性的影響，將對數期的黑素瘤細胞用固定劑量的IFNα(200μ/ml)、IFNγ(20，000μ/ml)或γTNF-α(20，000μ/ml)處理24小時。預先確定這些劑量對這些細胞的細胞毒性效果最小(約20%)。然後用各種劑量ZME-gelonin處理細胞72小時。如圖10所示，用γIFNγ處理引起對ZME-gelonin免疫毒素的敏感性增加2倍。但是，用γIFNα和TNF預處理則均引起免疫毒素敏感性2-對數增加。向抗原陽性細胞中加入固定劑量的γIFNα、γIFNγ或γTNF導致ZME-gelonin毒素的細胞毒性增加。可產生免疫毒素細胞毒性的最大增加，其餘依次為γIFNα和γIFNγ。
用γIFNα和γTNF預處理但不用γIFNα觀察到ZME-gelonin細胞毒性作用的實際增長。儘管已觀察到IFNα和IFN-γ可以向上調節一些諸如p-97黑素瘤表面抗原，但它們對能被ZME認出的高分子量抗原(GP240)幾乎無作用。(Murray，et al.，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.27313(1986);Greiner，et al.，Cancer Res.443208-3214(1984);Greiner，et ak.，Cancer Res.464984-4990(1986);Groacomini，et al.，J.Immunol.1331649-1655(1984);Imai，et al.，J.Immunol.127505-509(1981);Murray，et al.，J.Biol.Res.Mod.7172-161(1988.).因此，TNFα和IFNα誘導的ZME-gelonin活性增加的機制是不清楚的，但可能涉及抗體內在化速率的改變、免疫毒素的細胞化過程的改變或任何一個幹擾一傳遞酶的調節。
由於只有表面含ZME抗原的細胞被gelonin ZME免疫毒素殺死，故該免疫毒素是高效的方法來定向並殺死ZME抗原相關的腫瘤細胞，同時最大限度地減少或防止對正常非腫瘤相關抗原細胞的損傷。
實施例12人體腫瘤克隆分析(HTCA)中ZME-gelonin免疫毒素的作用用人體腫瘤克隆分析，也可分析ZME-gelonin對四個黑素瘤病人活體取出的細胞的活性。
如實施例8C所述在HTCA中也分析對人體細胞在培養物中的體外細胞毒性。將各種劑量的ZME-gelonin免疫毒素加至抗原陽性(A-375黑素瘤)和抗原陰性CME細胞系中。加入後72小時分析克隆的存活率。如圖11所示，0.25和2500mg/ml間的免疫毒素劑量引起幾乎抗原陽性細胞系克隆存活的完全抑制(滿圈)。單獨的ZME-018和游離的gelonin或其兩者的結合物都無細胞毒性。甚至免疫毒素試驗的最高濃度對抗原陰性系(CEM)無作用(空心方塊)。
ZME-gelonin對4種不同的新鮮活體樣本的作用如圖12所示。在試驗的最高免疫毒素劑量(250ng/ml)時，在兩種樣本中發現黑素瘤克隆形成細胞的存活率減少80-90%。在此劑量下有一個病人顯示50%細胞生長抑制，而另一個病人不顯示出免疫結合物的細胞毒性。第三樣本僅顯示克隆數的少許減少。用最高細胞毒性劑量處理的第四個樣本則出現生長的增加。另外，低劑量時在一個樣本中觀察到生長的增加，而較高劑量則產生實際的細胞毒性。如同在細胞系實驗中，以試驗劑量加入未結合的ZME-018和游離的gelonin是無細胞毒性的。
既然HTSCA分析不是正確無疑的，在此試驗系統中約75%臨床活性抗腫瘤劑是陽性的。在HTSCA中無活性的試劑已經證明臨床上是非活性的。因此，在HTSCA中ZME-gelonin結合物的活性有75%的臨床陽性概率。
實施例13ZME抗體的組織分布將125I標記的ZME抗體的組織分布與相關的免疫毒素(ZME-gelonin)和不相關免疫毒素(158A-gelonin)相比較。給5隻有人體黑素瘤異體移植物的裸鼠的尾部靜脈靜注每個抗體或抗體結合物。每個動物接受用0.5μCi125I標記的在100μl總體積磷酸鹽緩衝的鹽水中的10mg總蛋白質。
如圖13所示，不相關15A8-gelonin結合物不是特定地至腫瘤組織內(J/B比率0.5)。相反，相關ZME和ZME-gelonin結合物表明特異地進入腫瘤組織(T/B比率依次為2.0和1.5)。在使用ZME或ZME-gelonin後，腫瘤對125I的吸收無統計學上的顯著差異。該技術領域的內行將欣然認為本發明可以很好地執行上述目的並得到結果和優點及其中利益。這裡所述的化合物、方法、過程和技術是優選的代表實例，只是例舉而不是來限制本發明的範圍。該技術領域人員所作出的改變及其它使用也包括於本發明精神中並被權利要求書所定義。
權利要求
1.一種組合物，其特徵在於它包括ZME抗體和選自由細胞毒素部分和可檢測標記的部分的結合物。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於其中所述的部分是選自由毒素、殺細胞劑、抑制細胞生長藥物、生物應答修飾因子及可檢測的標記所組成的組。
3.根據權利要求2所述的組合物，其特徵在於其中所述部分是gelonin。
4.治療細胞增殖疾病的方法，其特徵在於它包括給需要所述治療的個體使用殺細胞有效劑量的權利要求1組合物。
5.一種治療黑素瘤的方法，其特徵在於它包括給需要所述治療的個體使用定向ZME抗原的單克隆抗體-gelonin配對物。
6.一種防止黑素瘤復發的方法，其特徵在於它包括給診斷出帶有ZME腫瘤抗原的腫瘤個體使用gelonin配對的單克隆抗體ZME。
7.根據權利要求4-6所述的方法，其特徵在於其中所述的個體是人。
8.一種增加免疫毒素的細胞活性的方法，其特徵在於它包括在使用免疫毒素前使用生物應答修飾因子。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於其中所述的免疫毒素選自由gelonin結合單克隆抗體、蓖麻蛋白結合的抗體及TNF結合的抗體所組成的組。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於其中所述的抗體是選自由趨向於黑素瘤細胞的細胞表面抗原的抗體、乳房癌細胞的細胞表面抗原及頸癌細胞的細胞表面抗原所組成的組。
11.根據權利要求10所述的方法，其特徵在於其中所述抗體是ZME-018。
12.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於其中所述的生物應答修飾因子選自由IFNa和TNFa所組成的組。
13.一種增加免疫毒素細胞毒素活性的方法，其特徵在於它包括在使用免疫毒素的同時使用生物應答修飾因子。
全文摘要
本發明涉及製備與240KD黑素瘤相關抗原對應的抗體的免疫結合物。諸如ZME-018抗體結合物的細胞毒素免疫結合物在治療諸如黑素瘤及帶有ZME-018抗原的其它腫瘤的增殖性細胞疾病是有用的。這裡也揭示了將測定的標記組合物用於這類疾病的診斷。
文檔編號C07K16/30GK1055879SQ9110260
公開日1991年11月6日 申請日期1991年4月19日 優先權日1990年4月19日
發明者米歇爾G·羅森布侖 申請人:研究發展基金會