一種質譜兩用檢測試劑盒的製作方法

2023-06-12 12:33:41

本發明涉及一種用於飛行時間質譜檢測蛋白和核酸的兩用晶片，能質譜檢測蛋白和核酸分子，屬於質譜檢測領域。

背景技術：

蛋白質組學(proteomics)是從整體水平上研究細胞內蛋白質的組成、活動規律及蛋白質與蛋白質的相互作用，是功能基因組學時代一門新的科學。包括鑑定蛋白質的表達、修飾形式、結構、功能和相互作用等。根據研究目的，蛋白質組學可以分為表達蛋白質組學、結構蛋白質組學和功能蛋白質組學。表達蛋白質組學用於細胞內蛋白樣品表達的定量研究。以繪製出蛋白複合物的結構或存在於一個特殊的細胞器中的蛋白為研究目的的蛋白質組學稱為結構蛋白質組學，用於建立細胞內信號轉導的網絡圖譜並解釋某些特定蛋白的表達對細胞的作用[2]。功能蛋白質組學以細胞內蛋白質的功能及蛋白質之間的相互作用為研究目的，通過對選定的蛋白質組進行研究和分析，能夠提供有關蛋白質的磷酸化、糖基化等重要信息。

蛋白質組學研究的核心就是能夠系統的鑑定一個細胞或組織中表達的每一個蛋白質及蛋白質的性能。蛋白質組學的主要相關技術有雙向凝膠電泳、雙向螢光差異凝膠電泳、質譜分析等[2]。由於蛋白質的高度複雜性和大量低豐度蛋白質的存在，對分析技術提出了巨大挑戰，生物質譜技術則是適應這一挑戰的必然選擇，近期飛速發展的即為maldi-tof質譜。

基於maldi-tof質譜的蛋白質組學技術用於微生物鑑定和分類與傳統的方法以及現在主要在用的自動化儀器相比，具有以下特點：

①操作簡單、快速。可將單個微生物菌落或其它生物材料直接加到maldi樣品靶上並使用maldi-tof質譜儀進行分析，譜圖識別可以在幾分鐘內完成，且數據評估同測定直接連接。這種簡單且唯一的工作流程對於絕大多數微生物的鑑定是足夠的，且不需要進行革蘭氏染色、氧化酶測試或pcr引物和條件選擇。

②重複性好。在很寬的條件範圍內，maldi方法都被證明是很穩定的。生長培養基的不同組成對峰模式分布影響非常小，如在從4000到12000da的範圍內，幾乎沒有觀察到培養基的影響。同樣，細胞的生長狀態對峰模式也沒有影響，緩慢生長期的細胞與對數生長期、平臺期或者死亡期的細胞具有相似的模式。在標準條件下進行樣本製備和測量後，在不同的maldi-tof儀器上獲取的質譜譜圖具有很高的可比性，如在3個不同的儀器上，對同一樣本靶測量的譜圖實際上是一致的。因此，來自於不同maldi-tof質譜儀的譜圖可以用來建立真實可靠的資料庫。這種高重複性是建立在對穩定表達的高豐度的蛋白質測量基礎上的，如核糖體蛋白質。在很少出現代謝物的2000到20000da質量範圍內，波譜圖可被觀察到。與活細胞相比，細菌芽孢可以產生明顯不同的峰模式，而且這些「芽孢譜圖」也具有重複性。目前，儀器的高靈敏度可以檢測到低至100ng或105個細胞。而對於使用clin-tof儀器，25ng的生物材料就能滿足需求。

③準確度高。maldi-tofms獲得的蛋白指紋圖譜用作模式匹配，匹配分值用作鑑定結果的分級和歸類。maldi軟體對所得的圖譜進行分析統一化，這種校正和統計運算保證了鑑定的精確性，目前可鑑定背離了5000ppm的質譜圖。蛋白指紋主要集中在2-20kda受到微生物生長環境和狀態影響很小的持續高表達蛋白。

生物質譜以其無可比擬的優越性成為蛋白質組學研究中必不可少的技術平臺。隨著質譜的靈敏度、精確度和高通量的不斷發展，質譜在蛋白質組學研究中扮演者越來越重要的角色。它在蛋白質鑑定、序列分析、定量、翻譯後加工及蛋白質的相互作用等方面已得到了較廣泛的應用。同樣，maldi-tof質譜的高靈敏度、高精確度和高通量在基因組學檢測領域優勢也尤為突出。

基因組研究應該包括兩方面的內容：以全基因組測序為目標的結構基因組學(structuralgenomics)和以基因功能鑑定為目標的功能基因組學(functionalgenomics)，又被稱為後基因組(postgenome)研究，成為系統生物學的重要方法。

基因組dna測序是人類對自身基因組認識的第一步。隨著測序的完成，功能基因組學研究成為研究的主流，它從基因組信息與外界環境相互作用的高度，闡明基因組的功能。功能基因組學的研究內容：人類基因組dna序列變異性研究、基因組表達調控的研究、模式生物體的研究和生物信息學的研究等。

(1)基因組表達及調控的研究。在全細胞的水平，識別所有基因組表達產物mrna和蛋白質，以及兩者的相互作用，闡明基因組表達在發育過程和不同環境壓力下的時、空的整體調控網絡。

(2)人類基因信息的識別和鑑定。要提取基因組功能信息，識別和鑑定基因序列是必不可少的基礎工作。基因識別需採用生物信息學、計算生物學技術和生物學實驗手段，並將理論方法和實驗結合起來。基於理論的方法主要從已經掌握的大量核酸序列數據入手，發展序列比較、基因組比較及基因預測理論方法。識別基因的生物學手段主要基於以下的原理和思路：根據可表達序列標籤(sts)；對染色體特異性cosmid進行直接的cdna選擇；根據cpg島；差異顯示及相關原理；外顯子捕獲及相關原理；基因晶片技術；基因組掃描；突變檢測體系，等等。

(3)基因功能信息的提取和鑑定。包括：人類基因突變體的系統鑑定；基因表達譜的繪製；「基因改變-功能改變」的鑑定；蛋白質水平、修飾狀態和相互作用的檢測。

(4)在測序和基因多樣性分析。人類基因組計劃得到的基因組序列雖然具有代表性，但是每個人的基因組並非完全一樣，基因組序列存在著差異。基因組的差異反映在表型上就形成個體的差異，如黑人與白人的差異，高個與矮個的差異，健康人與遺傳病人的差異，等等。出現最多基因多態性就是單核苷酸多態性(snps)。

(5)比較基因組學。將人類基因組與模式生物基因組進行比較，這一方面有助於根據同源性方法分析人類基因的功能，另一方面有助於發現人類和其他生物的本質差異，探索遺傳語言的奧秘。

maldi-tof飛行時間質譜完成的snp檢測準確率可達99.9％，除了準確性高、靈活性強、通量大、檢測周期短等優勢外，最有吸引力的應該還是它的性價比。maldi-tof飛行時間質譜平臺是國際通用的基因單核苷酸多態性(snp)的研究平臺，該方法憑藉其科學性和準確性已經成為該領域的新標準。

雖然maldi-tof飛行時間質譜能夠用於檢測蛋白或核酸分子，但從應用角度來看，傳統的maldi晶片應用領域單一，如shimadzu生產的de1580ta鋼片靶板，只用於蛋白微生物鑑定，適用於shimadzu的maldi-tofaxima；agena生產的l24spectrochip晶片，只用於基因檢測，適用於agena的maldi-tofmassarry，目前未見到能同時覆蓋基因組學檢測或蛋白質組學鑑定兩種檢測領域的晶片。

從質譜晶片材質與表面特性角度來看，傳統的金屬晶片，反覆使用，有劃痕，且表面沒有化學改性處理，結晶形態差，質譜檢測樣本峰的準確度低，信噪比低，基線高。並且對於核酸樣品而言，微小核酸殘留會影響質譜結果。因此，金屬類晶片主要用於蛋白質譜檢測，不能跨界檢測核酸樣品。而核酸晶片主要使用矽片材質，但價格昂貴，並且基質配方被國外壟斷，並且採購的進口晶片，表面已經直接覆蓋基質，限制了其不能用於蛋白質譜。

因此，目前需要一種能用於飛行時間質譜檢測蛋白和核酸的通用晶片，以及晶片表面覆蓋的基質配方。

技術實現要素：

為了解決上述技術問題，本發明的第一目的是提供一種能用於飛行時間質譜檢測蛋白和核酸的通用晶片，包括：

(1)晶片主體：主體表面具有微整列排列的親水性點樣孔和疏水性孔外區；

(2)由金屬底板構成的晶片適配器，其中該適配器表面分布多個與晶片主體匹配的晶片卡槽；

其中，晶片主體選自質地堅韌、平面度佳的金剛石、單晶矽、石英晶體的晶片；

所述親水性點樣孔覆蓋150-800nm的親水性薄膜，疏水性孔外區覆蓋150nm-2μm疏水性薄膜，其表面水滴接觸角＞120°。

在一個實施方案中，所述親水性薄膜為二氧化矽氧化物薄膜、氧化鋅薄膜、氧化鋁薄膜等，疏水性孔外區通過矽烷偶聯劑進行處理形成疏水性薄膜。在一個具體實施方案中，所述矽烷偶聯劑選自乙烯基矽烷、氨基矽烷或二甲基二氯矽烷。

在另一實施方案中，所述晶片是單面拋光的矽晶片或石英晶片，所示親水性點樣孔層薄膜厚度為500nm，所述孔外區的接觸角為＞120°，優選約135°、155°。

在一個實施方案中，所述晶片上的親水點樣孔數量為24、40、70、384等孔，或根據實際臨床試驗或科研過程中生物樣本的檢測量設置，親水性點樣孔的形狀可以選擇圓形，正方形，三角形，多邊形等。在一個具體實施方案中，所述親水性點樣孔的孔徑範圍為0.5-2.8mm，所述晶片尺寸為20×30-83×125mm。在另一具體實施方案中，親水點樣區為圓形，直徑為0.7mm，依據圓孔直徑選擇適當的基質用量，如0.5μl，滴定生物標誌物樣本，結晶形態規則，晶向均一為最佳。

在其他實施方案中，所述晶片適配器可以根據晶片尺寸設計不同的卡槽，卡槽尺寸為20×30-83×125mm，以實現一個適配器保證不同規格的晶片進入檢測室。

在另一實施方案中，所述適配器上的微陣列晶片卡槽，可以根據需要設計不同的形狀，例如正方形，長方形等，每個卡槽尺寸為20×20mm-25×60mm。在一個具體實施方案中，晶片適配器的卡槽為2、4、6、8、12、16或20個。

在另外的實施方案中，所述晶片表面平面度小於10μm。在一個具體實施方案中，所述晶片預先通過化學機械拋光(chemicalmechanismpolish,cmp)被處理具有單面拋光鏡面效應。通過cmp方法，對晶片進行兩次拋光，粗拋與細拋。粗拋目的是去除晶片表面殘留的機械損傷，一般從表面除去30um範圍內的厚度。細拋目的是去除第一次拋光在晶片表面留下的輕微損傷和雲霧狀缺陷，一般從表面除去2～3um。經過兩次拋光的晶片表面具有鏡面效應，在質譜檢測過程中，通過照明、光路反射及攝像頭實時顯示，可以直接觀測晶片表面樣本被轟擊的情況，改變雷射轟擊的位置，得到最佳圖譜。在一個更具體實施方案中，所述晶片是單面拋光的矽晶片或石英晶片。

本發明第二目的是提供一種對親水性點樣孔的表面進行覆蓋基質預處理的兩用晶片，其中在上述方案的基礎上，預先使用覆蓋基質溶液對點樣孔進行預處理。

在一個實施方案中，當基質溶液選自用於蛋白質譜的基質溶液時，該晶片可用於質譜檢測蛋白。在另一實施方案中，當基質溶液選自用於核酸質譜的基質溶液時，該晶片可用於質譜檢測核酸。

在一個具體實施方案中，用於質譜檢測蛋白的基質選自α-氰-4-羥基肉桂酸(chca)、3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(sa)，用於質譜檢測核酸的基質是3-羥基-2-吡啶甲酸。

本發明第三目的是提供用於製備飛行時間質譜檢測蛋白和核酸的兩用晶片，包括：

(1)選用質地堅韌、平面度佳的晶片作為基底或晶片主體；

(2)對晶片表面進行親水處理；

(3)用光刻膠對親水性點樣孔的封閉處理；

(4)用矽烷偶聯劑處理晶片；

(5)對光刻膠封閉的點樣區進行恢復處理；

(6)將晶片與金屬晶片適配器進行匹配安裝。

在一個實施方案中，步驟(2)中通過氧氣流速60～140ml/min，功率100～300w，處理時間1～10min；再用高純水對基底表面超聲清洗2～3次，每次時間為2～5min，使表面徹底清潔並羥基化。

在另一實施方案中，步驟(3)中採用旋塗的方法將光刻膠旋塗於處理過的基底上，旋塗速度為1000～8000rpm，然後置於光刻掩膜板下，在390nm的紫外光下曝光20s～5min後用相應的顯影液洗脫後，從而構築出有序結構的點樣孔區。其中光刻膠使用耐酸性的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚苯乙烯。

在其他實施方案中，步驟(4)中包括：

(i)清洗晶片：將先後浸入丙酮、甲醇水溶液、氯仿，分別清洗後，取出乾燥；

(ii)在加熱條件下，將濃酸和雙氧水緩慢加入含有晶片的水溶液中，進行充分氧化反應後，分別在氯仿、超純水中進行清洗，該步驟可重複多次；

(iii)將晶片置於乾淨容器中，加入預先水解的矽烷偶聯劑溶液，並加入氨水催化，直至矽烷化反應充分完成；

(iv)取出晶片，分別置於乙醇、超純水、氯仿中，超聲清洗；

(v)將清洗後的晶片，測量並選擇接觸角＞120°的晶片，作為合格晶片；

在一個實施方案中，步驟(5)中包括：

(i)將矽烷化處理後的晶片，放入去膠液中，浸泡3小時；

(ii)晶片取出，放入丙酮溶液中，超聲處理2分鐘，

即可去掉光刻膠，恢復點樣區親水表面，形成有親疏水差異的微陣列晶片表面。

在一個具體實施方案中，去膠液為聚乙二醇單丁醚或聚二甲基矽氧烷溶液。

在另一個實施方案中，步驟(1)所述晶片是質地堅韌、平面度佳的金剛石、單晶矽、石英晶體的晶片。在一個具體實施方案中，所述晶片預先通過化學機械拋光(chemicalmechanismpolish,cmp)被處理具有單面拋光鏡面效應。通過cmp方法，對晶片進行兩次拋光，粗拋與細拋。粗拋目的是去除晶片表面殘留的機械損傷，一般從表面除去30um範圍內的厚度。細拋目的是去除第一次拋光在晶片表面留下的輕微損傷和雲霧狀缺陷，一般從表面除去2～3um。經過兩次拋光的晶片表面具有鏡面效應，在質譜檢測過程中，通過照明、光路反射及攝像頭實時顯示，可以直接觀測晶片表面樣本被轟擊的情況，改變雷射轟擊的位置，得到最佳圖譜。在一個更具體實施方案中，所述晶片是單面拋光的矽晶片或石英晶片。

在另一個實施方案中，步驟(4)所述矽烷偶聯劑選自乙烯基矽烷、氨基矽烷、二甲基二氯矽烷。其中，二甲基二氯矽烷生長疏水膜操作簡單，接觸較大，疏水性佳，疏水層厚度能達到納米至微米量級，因此矽烷偶聯劑優選是二甲基二氯矽烷。在一個具體實施方案中，被所述偶聯劑整體矽烷化的疏水表面，其接觸角＞120°，在一個優選的實施方案中，所述接觸角＞150°，以形成超疏水表面。在其他優選的實施方案中，所述疏水表面的厚度在納米到微米量級。

在一個實施方案中，所述晶片上的親水性點樣孔數量為24,、40、70、384等孔，或根據實際臨床試驗或科研過程中生物樣本的檢測量設置，親水性點樣孔形狀可以選擇圓形，正方形，三角形，多邊形等。在一個具體實施方案中，所述親水性點樣孔的孔徑範圍為0.5-2.8mm，所述晶片尺寸為20×30-83×125mm。在另一具體實施方案中，親水性點樣孔為圓形，直徑為0.7mm，依據圓孔直徑選擇適當的基質用量，如0.5μl，滴定生物標誌物樣本，結晶形態規則，晶向均一為最佳。

在其他實施方案中，所述微陣列晶片卡槽可以根據需要選擇正方形，長方形等，每個卡槽範圍為20×20mm-25×60mm。在一個具體實施方案中，晶片適配器的卡槽為2、4、6、8、12、16或20個，甚至更多。

本發明第四目的是提供製備飛行時間質譜檢測蛋白或核酸的晶片，包括：上述任一方案的步驟，以及，預先使用覆蓋基質溶液對點樣區進行預處理。在一個實施方案中，當基質溶液選自蛋白質譜的基質溶液時，該晶片可用於質譜檢測蛋白。在另一實施方案中，當基質溶液選自核酸質譜的基質溶液時，該晶片可用於質譜檢測核酸。

本發明第五目的是提供包括上述晶片的質譜兩用檢測試劑盒，包括：

真空包裝的多個兩用晶片以及金屬晶片適配器；

核酸和/或蛋白質譜基質溶液；

以及使用說明書。

在一個實施方案中，所述兩用晶片已經預先插入金屬晶片適配器中。

在另一實施方案中，所述晶片已經預先使用覆蓋基質溶液。在一個具體實施方案中，當基質溶液選自蛋白質譜的基質溶液時，該試劑盒可用於質譜檢測蛋白。在另一實施方案中，當基質溶液選自核酸質譜的基質溶液時，該試劑盒可用於質譜檢測核酸。

在一個實施方案中，所述晶片上的親水性點樣孔數量為24,、40、70、384等孔，或根據實際臨床試驗或科研過程中生物樣本的檢測量設置，親水性點樣孔可以選擇圓形，正方形，三角形，多邊形等。在一個具體實施方案中，所述親水性點樣孔的孔徑範圍為0.5-2.8mm，所述晶片尺寸為20×30-83×125mm。在另一具體實施方案中，親水點樣區為圓形，直徑為0.7mm，依據圓孔直徑選擇適當的基質用量，如0.5μl，滴定生物標誌物樣本，結晶形態規則，晶向均一為最佳。

在其他實施方案中，所述微陣列晶片卡槽可以根據需要選擇正方形，長方形等，每個卡槽範圍為20×20mm-25×60mm。在一個具體實施方案中，晶片適配器的卡槽為2、4、6、8、12、16或20個，或者更多。

本發明第六個目的是提供上述晶片或試劑盒在用於質譜檢測生物分子的用途。

在一個實施方案中，所述生物分子是核酸和/或蛋白分子。

本發明的效果包括：

1、本發明的應用領域覆蓋基因組學檢測與蛋白質組學鑑定，同一張晶片既可以做基因檢測，也可以做蛋白或多肽鑑定，覆蓋兩種檢測領域。

2、晶片表面具有親水疏水差異設計，能夠有效富集樣本，晶向均一生長，質譜檢測的樣本峰準確度高，信噪比高，基線低。

3、在晶片點樣區表面通過自動點樣覆蓋基質，特種的基質配方，使基質與樣品在晶片表面共結晶更均勻，檢測結果更佳。

4、本發明還提供了包含所述晶片的質譜檢測試劑盒，便於客戶根據需要隨時檢測核酸或蛋白樣品。

5、本發明還可根據用戶需要，提供包含表面覆蓋基質的晶片的試劑盒，以滿足個性化需要。

6、本發明的試劑盒，晶片主體為一次性材料，使用後即可替換新的晶片與適配器進行配合，避免現有的金屬靶板的清洗和樣品汙染。

7、本發明的晶片適配器，不同的卡槽設計，可放置多張晶片，能實現核酸與蛋白不同樣品同時進樣檢測，節省質譜開門關門時間。

附圖說明

圖1為微陣列晶片實物圖，其中1為親水性點樣孔、2為疏水孔外區。

圖2a、2b為微陣列晶片適配器示意圖，其中底板為金屬板，方形凹槽為微陣列晶片卡槽，內嵌有不同規格的微陣列晶片。

圖3為熱氧化裝置示意圖。

圖4為濃酸溶液中清洗基片示意圖。

圖5為微陣列兩用晶片與傳統晶片結晶對比圖。

圖6為微陣列晶片點樣孔進行表面覆蓋基質的點樣效果圖。

圖7為微陣列晶片質譜檢測基因樣品的譜圖結果。

圖8為微陣列晶片質譜檢測蛋白樣品的譜圖結果。

具體實施方式

現詳細說明本發明的多種示例性實施方式，該詳細說明不應認為是對本發明的限制，而應理解為是對本發明的某些方面、特性和實施方案的更詳細的描述。

應理解本發明中所述的術語僅僅是為描述特別的實施方式，並非用於限制本發明。另外，對於本發明中的數值範圍，應理解為具體公開了該範圍的上限和下限值以及它們之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述範圍內的中間值以及任何其他陳述值或在所述範圍內的中間值之間的每個較小的範圍也包括在本發明內。這些較小範圍的上限和下限可獨立地包括或排除在範圍內。

除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所述領域的常規技術人員通常理解的相同含義。雖然本發明僅描述了優選的方法和材料，但是在本發明的實施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。

疏水性(hydrophobicity)：在化學學科裡，疏水性指的是一個分子(疏水物)與水互相排斥的物理性質。疏水性分子偏向於非極性，並因此較會溶解在中性和非極性溶液(如有機溶劑)。疏水性分子在水裡通常會聚成一團，而水在疏水性溶液的表面時則會形成一個很大的接觸角而成水滴狀。舉例來說，疏水性分子包含有烷烴、油、脂肪和多數含有油脂的物質。

親水性(hydrophilicproperty)：指分子帶有極性基團的分子，對水有大的親和能力，可以吸引水分子，或溶解於水。這類分子形成的固體材料的表面，易被水所潤溼。具有這種特性都是物質的親水性。

接觸角(contactangle)：是指在氣、液、固三相交點處所作的氣-液界面的切線穿過液體與固-液交界線之間的夾角θ，是潤溼程度的量度。若θ90°，則固體表面是疏水性的，即液體不容易潤溼固體，容易在表面上移動。接觸角的測定方法很多，有角度測量法(液滴角度測量法)、長度/高度測量法、力測量法等。其中液滴角度測量法是最常用的，即在平整表面滴一小液滴，使用低倍顯微鏡的量角器即可測量角度大小。

基質，指對特定波長具有較強吸收並易於被激發，並且傳遞能量和電荷給待測分子發生氣化和離子化，從而使得所包含的待測分子一起進入質譜檢測通道的特殊溶液。

好的基質要具備下列幾種特點：a.基質最重要的功能就是吸收脈衝雷射的能量，既可以通過電離吸收紫外區雷射的能量，也可以通過分子的化學鍵振動吸收紅外區雷射的能量，這由所採用的雷射波長來決定。b.基質要能夠很好地分散樣品分子，防止其聚集，提高電離效率。c.固、液相的基質、樣品混合物在解吸時，基質分子不再產生額外的熱效應，不會破壞待測分子。d.基質必須能夠幫助樣品分子很好地電離。如果是液態基質，還必須具有很好的真空穩定性。

在蛋白質組分析中，經常會使用maldi-tof基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜儀來進行蛋白質的鑑定及翻譯後的修飾。maldi的優勢在於可以在短時間內對於多種樣品進行處理，maldi法是將樣本添加在一種被稱為基質(matrix)的化合物上，製成混合結晶，然後再用雷射照射其表面以實現離子化。用作基質的化合物可以是α-氰基-4-羥基肉桂酸、3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸、2,5-二羥基苯甲酸。根據樣本的不同，可選用不同基質。一般來說，α-氰-4-羥基肉桂酸(chca)適用於肽類樣品，3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(sa)適用於蛋白質樣品，而2，5-二羥基苯甲酸(dhb)則適用於肽、糖類及糖脂類樣品。

在基因組學檢測中，maldi方法適用的是3-羥基-2-吡啶甲酸基質，配製好的基質，由biodot自動點樣，覆蓋到微陣列晶片表面的樣品孔內，由於表面的親疏水微陣列結構，使基質結晶生長細緻，形態均勻。質譜檢測的樣本峰準確度高，信噪比高，基線低。

「表面覆蓋基質」，指根據待檢分子的種類，預先覆蓋在點樣區的蛋白或核酸基質，並乾燥形成結晶。通過將晶片的表面預先覆蓋基質，可製備成一次性或直接對樣品進行點樣和檢測的產品或試劑盒。

實施例一、微陣列晶片表面親水處理

晶片主體特徵是質地堅韌、平面度佳；金剛石，單晶矽，石英晶體等；劃隔成適合晶片適配器表面單元大小的片狀結構，晶片厚度0.5-1.8mm，為保證質量檢測精度，晶片表面平面度小於10μm。例如，微陣列晶片基底選擇單晶矽片，在矽片片結構表面可以燒制生長二氧化矽氧化物薄膜、氧化鋅薄膜、氧化鋁薄膜，厚度150-800nm，優選500nm，薄膜特徵是具有親水性，採用熱氧化工藝。

如圖3所示，使用熱氧化裝置燒制生長二氧化矽氧化物薄膜的步驟如下：

①將矽片置於用石英玻璃製成的反應管中；

②反應管用電阻絲加熱爐加熱一定溫度，常用的溫度為900～1200℃；

③氧氣或水汽以1釐米/秒氣流速度通過反應管，在矽片表面發生化學反應：

si(固態)+o2(氣態)→sio2(固態)或si(固態)+2h2o(汽態)→sio2(固態)+2h2(氣態)生成sio2層。

矽熱氧化工藝，按所用的氧化氣氛可分為：幹氧氧化、水汽氧化和溼氧氧化。幹氧氧化是以乾燥純淨的氧氣作為氧化氣氛，在高溫下氧直接與矽反應生成二氧化矽。

水汽氧化是以高純水蒸汽為氧化氣氛，由矽片表面的矽原子和水分子反應生成二氧化矽。水汽氧化的氧化速率比幹氧氧化的為大。

溼氧氧化實質上是幹氧氧化和水汽氧化的混合，氧化速率介於二者之間。

用高純氫氣和氧氣在石英反應管進口處直接合成水蒸汽的方法進行水汽氧化時，通過改變氫氣和氧氣的比例，可以調節水蒸汽壓，減少沾汙，有助於提高熱生長二氧化矽的質量。

實施例二、微陣列晶片表面疏水處理

1、親水性點樣孔區的封閉處理

清洗晶片表面殘留有機物：先通過氧氣流速60～140ml/min，功率100～300w，處理時間1～10min；再用高純水對基底表面超聲清洗2～3次，每次時間為2～5min，使表面徹底清潔並羥基化。

光刻膠技術封閉點樣孔區：採用旋塗的方法將光刻膠旋塗於處理過的基底上，旋塗速度為1000～8000rpm，然後置於光刻掩膜板下，在390nm的紫外光下曝光20s～5min後用相應的顯影液洗脫後，從而構築出有序結構的點樣孔區。其中光刻膠使用耐酸性的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)和/或聚苯乙烯。

2、微陣列晶片孔外區的表面疏水處理

以矽烷偶聯劑為主要原料對金屬或非金屬材料進行表面處理的過程。特徵是由化學表面改性的方式製作疏水區域，疏水膜層厚度範圍150nm-2μm，疏水區域表面水滴接觸角＞120°。

矽烷偶聯劑是一類具有特殊結構的有機化合物，含有有機官能團，無機官能團，同時與陰極、非極性物質產生結合力。矽烷偶聯劑的化學通式為y-r-six3，式中y是通過碳原子與矽相連的非水解性有機官能團，可與粘結劑機體中的樹脂發生反應從而提高相容性，如氨基、乙烯基、環氧基、巰基、丙烯醯氧丙基等；r為具有飽和和不飽和鍵的碳鏈，將y和si原子連接起來；x為水解性基團，如滷族、烷氧基、異丙烯氧基等。這些基團水解形成的矽醇能與金屬表面的氧化物或烴基反應，從而在金屬表面形成si-o-si三維網絡結構的矽烷膜，防止金屬的腐蝕，表面呈現疏水性。

具體步驟如下：

(1)用濃酸溶液清洗晶片:

①將晶片放置在乾淨的燒杯中，燒杯固定在支架上。

②準備水槽，裝滿水，放置在燒杯下方，加熱；(見圖4)

③將濃酸與雙氧水按照一定比例(1:5～1:20)緩緩加入裝有晶片的燒杯中，待不斷出現小氣泡，氧化反應開始，反應時間40min。

注意：濃酸很危險，需要在通風櫥通風的條件下小心處理。注意個人防護。

④將晶片取出，放在盛有氯仿的燒杯中，超聲2min；

⑤將晶片取出，放在盛有超純水的燒杯中，超聲2min。

⑥重複步驟④⑤；

⑦廢液處理：濃酸溶液中加入大量水，緩慢稀釋，並用naoh中和。

(2)矽烷化處理

將晶片放置在潔淨的燒杯中。

將矽烷偶聯劑進行水解，按照配比矽烷偶聯劑：水：乙醇＝1:1:8混合，其中矽烷偶聯劑為濃度5％～10％的二甲基二氯矽烷溶液，水採用去離子水，乙醇濃度為99％。

將水解後的矽烷化溶液取適量加入含有晶片的燒杯中；

加入一定量的氨水(13％～30％)催化，配比氨水:矽烷化＝1:5，加速反應進行；

放置，溶液表面產生白煙，反應正在進行，時間30分鐘(在通風廚中進行)。

(3)矽烷化後清洗

取出晶片，放置到盛有乙醇的新燒杯中，超聲，時間10min。

取出晶片，放置在成盛有超純水水的新燒杯中，超聲，時間10min。

取出晶片，放置在成盛有氯仿的新燒杯中，超聲，時間10min。

乾燥晶片後，在晶片表面滴1μl水滴，使用低倍顯微鏡的量角器測量水滴接觸角大小，分別得到接觸角約135°、155°的兩種晶片初品。

(4)對封閉的點樣孔去膠處理

將矽烷化處理後的晶片，放入去膠液中浸泡3小時，之後取出放入丙酮溶液中超聲2分鐘，即可去掉光刻膠，恢復點樣區親水表面。形成有親疏水差異的微陣列晶片表面。去膠液主要成分是聚乙二醇單丁醚或聚二甲基矽氧烷等。

實施例三、微陣列兩用晶片與傳統晶片結晶對比

選擇相同的蛋白或核酸樣品，與取適量相應基質溶液分別滴在兩用晶片以及傳統晶片上，待基質自然晾乾後，顯微鏡下觀察結晶形態。

如圖5所示，傳統生物檢測晶片結晶形態(左圖)不規則，厚度不均勻，呈咖啡環狀態，中間空，周圍厚。而本發明提供的微陣列晶片結晶形態(右圖)規則，厚度均勻，晶向生長細緻。

實施例四、對微陣列晶片點樣孔的表面進行覆蓋基質預處理

選用3-羥基-2-吡啶甲酸基質溶液，通過biodot儀，對親水性點樣孔進行自動點樣，以進行表面覆蓋基質預處理，待基質自然晾乾後，進行觀察。

如圖6所示，親水孔覆蓋基質後，該靶點結晶均勻，輪廓均勻圓滑，無溶液溢出，具有良好一致性。

實施例五、製備微陣列晶片的兩用質譜檢測試劑盒

如圖2所示，在無菌環境下，將製備的不同數量或規格的微陣列兩用晶片，根據需要，對晶片進行真空密封包裝。

同時，在試劑盒中分別附有基質溶液，以及使用說明書。

另外，可根據實施例四，將晶片表面用自動點樣方法進行表面覆蓋基質預處理，再抽真空密封包裝，並標註待檢樣品的分子類型。

試劑盒包裝後，於室溫避光下保藏。

用戶購買時，可以根據需要選擇表面覆蓋基質預處理的試劑盒或普通試劑盒。

實施例六、微陣列兩用晶片試劑盒用於基因檢測

使用微量移液器，吸取1ul純化的耳聾基因標準質粒樣品，直接點樣到表面覆蓋基質預處理的晶片上，並使用北京毅新博創生物科技有限公司生產的clin-tof型飛行時間質譜儀對點樣後的晶片進行檢測和結果判斷。

該標準質粒共20個質譜峰，質量範圍3000-9000da，同一質粒樣本做5個重複，分析檢測結果分型正確率。

參數設置：

turingmode:linear

massrange:3000-9000

maxlaserreprate:10.0

power:105

profiles:40

shots:10

分型結果：

結果如圖7所示，檢測出核酸樣本具有20重質譜峰，基線低，信噪比高，檢測範圍3000-9000da,5次重複的質譜曲線峰位置與峰強度一致性好，重複性佳，經北京毅新博創生物科技有限公司be-snp軟體分析，鑑定結果正確率100％。說明該試劑盒對於核酸樣品的質譜檢測具有優異的解析度。

實施例七、微陣列兩用晶片試劑盒用於蛋白檢測

使用微量移液器將基質chca加入晶片的點樣孔，然後點樣加入1ul純化的蛋白標準品bpb(分子量3000-40000da)的標準質粒樣品，並使用毅新興業(北京)科技有限公司生產的clin-tof型飛行時間質譜儀對點樣後的晶片進行檢測和結果判斷。

該標準蛋白樣品共6個質譜峰，共做20個重複，分析檢測結果譜圖cv值。

參數設置：

turingmode:linear

massrange:3000-40000

maxlaserreprate:30.0

power:65

profiles:100

shots:5

結果如圖8所示，20個重複均只出現20個質譜峰，峰線區分度好，無明顯幹擾，分布範圍3014-38384,所有重複試驗的峰線均具有一致對應性，譜圖重複性cv＜2.6％，與預設的檢測結果分型正確率完全一致，說明該試劑盒對於蛋白樣品的質譜檢測具有優異的解析度。

以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，本發明要求保護範圍由所附的權利要求書、說明書及其等效物界定。